CN109312296B - 重组酵母细胞 - Google Patents

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CN109312296B CN201780036565.7A CN201780036565A CN109312296B CN 109312296 B CN109312296 B CN 109312296B CN 201780036565 A CN201780036565 A CN 201780036565A CN 109312296 B CN109312296 B CN 109312296B
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Abstract

本发明描述了一种重组酵母细胞，其功能性表达一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码核酮糖‑1,5‑磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)，和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣，和一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中所述磷酸核酮糖激酶受启动子(“PRK启动子”)的控制，所述PRK启动子允许在厌氧条件下比在需氧条件下更高的表达。

Description

重组酵母细胞
技术领域
本发明涉及具有生产期望的发酵产物的能力的重组酵母细胞，异源肽在酵母细胞中的功能性表达，以及生产发酵产物的方法，其中使用所述酵母细胞。本发明还涉及CO2在酵母细胞中的用途。
背景技术
微生物发酵方法被应用于从可再生碳水化合物原料工业生产范围广泛且快速扩展的化学化合物。特别是在厌氧发酵方法中，辅因子对NADH/NAD+的氧化还原平衡可能对产物产率造成重要限制。该挑战的例子是在通过Saccharomyces cerevisiae工业生产例如燃料乙醇的过程中形成甘油作为主要副产物，这是需要将生物合成反应中形成的NADH再氧化的直接结果。通过Saccharomyces cerevisiae的乙醇生产目前是工业生物技术中单一最大的发酵工艺(按体积计)，但目前也在工业生物技术工艺中生产各种其它化合物，包括其它醇类、羧酸、类异戊二烯、氨基酸等。已经提出了各种方法以通过遗传修饰来改善工业生物技术中使用的生物体的发酵性质。与基于酵母的乙醇以及其它化合物的生产的化学计量有关的主要挑战是大量NADH依赖性副产物(特别是甘油)通常作为副产物形成，在厌氧条件和限氧条件下或在呼吸以其它方式受到限制或不存在的条件下尤为如此。据估计，在典型的工业乙醇方法中，高达约4重量％的糖原料被转化为甘油(Nissen等，Yeast 16(2000)463-474)。在厌氧生长的理想条件下，朝向甘油的转化率可以甚至更高，至多约10％。厌氧条件下的甘油生产主要与氧化还原代谢有关。在S.cerevisiae的厌氧生长期间，通过醇性发酵而发生糖异化。在该过程中，在糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成的NADH通过转化乙醛而被再氧化，乙醛是通过经由NAD+-依赖性醇脱氢酶将丙酮酸脱羧成乙醇而形成的。当代谢中的其它地方发生NAD+到NADH的净减少时，该氧化还原-中性异化通路的固定化学计量会引起问题。在厌氧条件下，S.cerevisiae中的NADH再氧化严格依赖于糖还原为甘油。通过将糖酵解中间体磷酸二羟丙酮(DHAP)还原成甘油3-磷酸(甘油-3P)(由NAD+-依赖性甘油3-磷酸脱氢酶催化的反应)来启动甘油形成。随后，在该反应中形成的甘油3-磷酸被甘油-3-磷酸酶水解，产生了甘油和无机磷酸盐/酯。因此，甘油是通过S.cerevisiae厌氧生产乙醇期间的主要副产物，这是不希望的，因为它降低了糖朝向乙醇的总转化率。此外，乙醇生产设备的流出物中甘油的存在可能会增加废水处理的成本。WO2014/129898描述了功能性表达异源核酸序列的重组细胞，所述核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；在本文中缩写为“Rubisco”)，和任选的Rubisco分子伴侣，和磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；在本文中缩写为“PRK”)。WO2015107496描述了功能性表达异源核酸序列的重组细胞，所述核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶单元RbcL、RbcS和RcbX，Rubisco、GroEL和GroES的分子伴侣。在实施例中，利用四环素-诱导型启动子TetO7表达PRK，参见表5。因此，该启动子需要过程辅助物，即在增殖中添加化合物，这增加了该方法的成本和复杂性。所述化合物是多西环素(一种抗生素)，其作为乙醇发酵过程中的添加剂不是优选的。虽然WO2014/129898中描述的方法是有利的，但仍需要改善，特别是经改善的有用的有机化合物如乙醇的生产。此外，期望提供这样的微生物，其中NADH依赖性副产物进一步减少。还期望这样的方法，其中不需要添加剂，例如抗生素。此外，期望菌株的增殖特征得到改善。这些均是本发明的目标。
发明内容
根据本发明实现了一个或多个上述目标，本发明提供了一种重组酵母细胞，其功能性表达一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)，和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣，和一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中所述磷酸核酮糖激酶受PRK表达比厌氧/需氧为2或更高的启动子(“PRK启动子”)的控制。有利地，这种重组酵母细胞具有改善的产物产率和/或减少的副产物形成和/或改善的增殖特征和/或发酵过程中不需要添加剂，例如抗生素，使得不需要改变常规发酵过程。
序列表
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<223> 6277 - cbbM cassette construction - O tag addition
<400> 29
atactccctg cacagatgag tcaagctatt gaacaccgag aacgcgctga acgatcattc 60
cgcgcagatt agcgaagc 78
<210> 30
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6289 - cbbM cassette construction - O tag addition
<400> 30
gaatgatcgt tcagcgcgtt ctcggtgttc aatagcttga ctcatctgtg cagggagtat 60
gcgataccct gcgatcttc 79
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7298 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 31
ttgttcaatg gatgcggttc 20
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4692 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 32
aagggccatg accacctg 18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4870 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 33
gccagaggta tagacatagc c 21
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3275 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 34
gtgcctattg atgatctggc ggaatg 26
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3847 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 35
actatatgtg aaggcatggc tatgg 25
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3276 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 36
gttgaacatt cttaggctgg tcgaatc 27
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4691 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 37
cacctttcga gaggacgatg 20
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3277 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 38
ctagcgtgtc ctcgcatagt tcttagattg 30
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3283 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 39
acgtctcacg gatcgtatat gc 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7226 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 40
atacatttct ccacgggacc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7225 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 41
gtcccgtgga gaaatgtatg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6629 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 42
acgagagatg aaggctcacc 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4184 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 43
atgaccggag cttccagcat g 21
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3842 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 44
ttctaggctt tgatgcaagg tc 22
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3843 Diagnostic primer cbbM integration
<400> 45
gatcagcagc cacgattg 18
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3840 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 46
atactccctg cacagatga 19
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3837 Diagnostic primer cbbM integration
<400> 47
gaatgatcgt tcagcgcg 18
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7228 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 48
tctacctgct tggacatctt c 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7227 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 49
atacgcgaag atgtccaagc 20
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3290 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 50
gtcacgggtt ctcagcaatt cg 22
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3291 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 51
ctctaacgcc tcagccatca tcg 23
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4229 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 52
tggtcgacag atacaatcct gg 22
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1370 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 53
gtttgatggt ccagctacag 20
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1371 - Diagnostic primer cbbM integration
<400> 54
aaatagcacc agcagcagga g 21
<210> 55
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7076 - groEL cassette construction - J tag addition
<400> 55
ggccgtcata tacgcgaaga tgtccaagca ggtagaacac atagtctgag catctcgtcg 60
cgaccatagc ttcaaaatgt ttc 83
<210> 56
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7077 - groEL cassette construction - H tag addition
<400> 56
gtcacgggtt ctcagcaatt cgagctatta ccgatgatgg ctgaggcgtt agagtaatct 60
gctcgacatt ttatgatgga atg 83
<210> 57
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7078 - groES cassette construction - H tag addition
<400> 57
agattactct aacgcctcag ccatcatcgg taatagctcg aattgctgag aacccgtgac 60
gggatctacg tatggtcatt tc 82
<210> 58
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7079 - groES cassette construction - SGA1 tag addition
<400> 58
tatatttgat gtaaatatct aggaaataca cttgtgtata cttctcgctt ttcttttatt 60
cgccctttta aacagttgat g 81
<210> 59
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7082 - LYS1p prk cassette construction
<400> 59
acgtctcacg gatcgtatat gccgtagcga caatctaaga actatgcgag gacacgctag 60
aacgctggtg tcctagagc 79
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7083 - LYS1p prk cassette construction
<400> 60
ttttgcggtt gtgtgaaaaa t 21
<210> 61
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7292 UBC6p prk cassette construction
<400> 61
acgtctcacg gatcgtatat gccgtagcga caatctaaga actatgcgag gacacgctag 60
gcccgcgatt tatccttctt 80
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7294 - UBC6p prk cassette construction
<400> 62
tactattgta cgtactttgt ttgca 25
<210> 63
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7293 - YEN1p prk cassette construction
<400> 63
acgtctcacg gatcgtatat gccgtagcga caatctaaga actatgcgag gacacgctag 60
ggaattcaag caatagcgtt tc 82
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7295 - YEN1p prk cassette construction
<400> 64
tttcttgtgc agtatccaga atat 24
<210> 65
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7930 - DAN1p prk cassette construction
<400> 65
tcacagaggg atcccgttac ccatctatgc tgaagattta tcatactatt cctccgctcg 60
agaatgcaag ggcaaacagg 80
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7931 - DAN1p prk cassette construction
<400> 66
tacttggggt atatatttag tatgc 25
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7084 - prk cassette construction (PGK1t)
<400> 67
attgaattga attgaaatcg atag 24
<210> 68
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7085 - prk cassette construction (PGK1t) - D tag addition (single
copy cbbm-prk-chaperone integration)
<400> 68
aatcactctc catacagggt ttcatacatt tctccacggg acccacagtc gtagatgcgt 60
gcttcaagct tacacaacac g 81
<210> 69
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7934 - prk cassette construction (PGK1t) - X-2 tag addition
<400> 69
gtcataactc aatttgccta tttcttacgg cttctcataa aacgtcccac actattcagg 60
gcttcaagct tacacaacac g 81
<210> 70
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7080 - prk amplification (LYS1p cassette)
<400> 70
aaacgcttta tttttcacac aaccgcaaaa atgtcacaac aacaaacaat tgtg 54
<210> 71
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7081 - prk amplification
<400> 71
attgatctat cgatttcaat tcaattcaat ctaggcttta gcagctgttg 50
<210> 72
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7296 - prk amplification (UBC6p cassette)
<400> 72
cgcaaattgc aaacaaagta cgtacaatag taatgtcaca acaacaaaca attgtg 56
<210> 73
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7297 - prk amplification (YEN1p cassette)
<400> 73
acttgtatat tctggatact gcacaagaaa atgtcacaac aacaaacaat tgtg 54
<210> 74
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7932 - prk amplification (DAN1p cassette)
<400> 74
ttgcagataa aagtgtagca gataaaagtg tagcatacta aatatatacc ccaagtaatg 60
tcacaacaac aaacaattgt g 81
<210> 75
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7086 - URA3 amplification - SGA1 tag addition (single copy
cbbm-prk-chaperone integration)
<400> 75
tttacaatat agtgataatc gtggactaga gcaagatttc aaataagtaa cagcagcaaa 60
gatcccaata caacagatca cg 82
<210> 76
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7087 - URA3 amplification - C tag addition (single copy
cbbm-prk-chaperone integration)
<400> 76
ctagcgtgtc ctcgcatagt tcttagattg tcgctacggc atatacgatc cgtgagacgt 60
ctcgagagct cgttttattt agg 83
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4221 - Diagnostic primer single copy cbbm-prk-chaperone
integration
<400> 77
aaacttagat tagattgcta tgctttc 27
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2674 - Diagnostic primer single copy cbbm-prk-chaperone
integration
<400> 78
atagccaccc aaggcatttc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7376 - Diagnostic primer prk integration in X-2
<400> 79
ggtctaggcc tgcataatcg 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7377 - Diagnostic primer prk integration in X-2
<400> 80
tgcggcatca tgtctacttg 20
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2375 - Diagnostic primer prk integration in X-2
<400> 81
tgagccactt aaatttcgtg aatg 24
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2376 - Diagnostic primer prk integration in X-2
<400> 82
gcctttgagt gagctgatac c 21
<210> 83
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6967 - Repair fragment GPD1
<400> 83
tggtattggc agtttcgtag ttatatatat actaccatga gtgaaactgt tacgttacct 60
gcattatgtc atttctcata actactttat cacgttagaa attacttatt attattaaat 120
<210> 84
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6968 - Repair fragment GPD1
<400> 84
atttaataat aataagtaat ttctaacgtg ataaagtagt tatgagaaat gacataatgc 60
aggtaacgta acagtttcac tcatggtagt atatatataa ctacgaaact gccaatacca 120
<210> 85
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6969 - Repair fragment GPD2
<400> 85
gtattttggt agattcaatt ctctttccct ttccttttcc ttcgctcccc ttccttatca 60
aaccaattta tcattataca caagttctac aactactact agtaacatta ctacagttat 120
<210> 86
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6970 - Repair fragment GPD2
<400> 86
ataactgtag taatgttact agtagtagtt gtagaacttg tgtataatga taaattggtt 60
tgataaggaa ggggagcgaa ggaaaaggaa agggaaagag aattgaatct accaaaatac 120
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4398 - Diagnostic primer GPD1 deletion
<400> 87
tctcacctct caccgctgac 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4401 - Diagnostic primer GPD1 deletion
<400> 88
acggtgagct ccgtattatc 20
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2112 - Diagnostic primer GPD2 deletion
<400> 89
acggacctat tgccattg 18
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 - Diagnostic primer GPD2 deletion
<400> 90
ccaaatgcga catgagtcac 20
<210> 91
<211> 600
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Promoter ANB1
<400> 91
agatcggtga aaacatcttg atcttgctcc cgggaatttt agattcaggt aggaaattga 60
ttacatcaat actgttaccc tgaatcatat tcgacgatgt cgtctcacac ggaaatataa 120
ttcatttctt ggttttccaa aaaaattttc attttttttc acttttttgt ttcgtcctcc 180
tttttttttt ttttttttta ttttttttcc tgtgttcacc tttttttttt tcagttgaca 240
tctttctgca ttcttttctg tgtttttttt tttttttttc gtttttccat tgttcgttcg 300
ttgcctgttt tttcgcccta ttgttctcga gcctaaaaat tttttccttt cctgctttcc 360
tttcttcgtt caaagtttcc tattccattg ttctctttgg taaactcatt gttgtcggaa 420
ctcagatata ttcaggtcaa tttactgtac ttcaattgac ttttttcttg aaatttcaac 480
ttgccttttc aacttgttct tcttttttaa tcttattcta cactttagtt cccttacctt 540
gttcctaatt attgtctagc aaaaagaaaa catacaccta tttcattcac acactaaaac 600
<210> 92
<211> 825
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Promoter DAN1
<400> 92
agaatgcaag ggcaaacagg cctgaggtaa ctttaaaata taatgtacct tgaaaactat 60
gtatacattg catttattaa gcagtagggt attttgtttg caagaaaata aagctcaaaa 120
tatctttgga gtttgacaat agtatagaaa aaatagctca gcaaccttaa taaaaaaagg 180
gtcattgggc aaagcgtttt aaaaagattt aagtggtagt gtttaaagtg aaagagattg 240
atatagttaa aaattgttga gctcaattca cgctggattc ggcgatccgt tttcttcaat 300
cctcacgtgc tttcttcgtt tgagtgcaaa agttcatatg atgctatctc ccgcttatct 360
tattagtcga aaatggggag aatttcctat tttatctgtc gtttagcaca tacggccagg 420
aaaatacata agatttcgcc gaacgacggg gtcaattcgt cctttttgta cacatcgttt 480
aatttatgag gaaaaattga tgaacgtatc ctccgtagac gctcctctga aaagtttcat 540
gtttcctgcg cgttcctttg ataggcaata aaacaataca acgcgtgcct ttgaaaatgc 600
caagatctat acgaggcctc taacaaaaca tcgttcagga acagagaatg ctaaaaatgc 660
aaaagggtcc ctgggtactc attgaataga aatgattgaa aatactgcgt ataaaatagc 720
acgactaaat gatactattt ttatgtcgac acggtactat ttcttctttt gcagataaaa 780
gtgtagcaga taaaagtgta gcatactaaa tatatacccc aagta 825
<210> 93
<211> 1000
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_DAN1 promoter
<400> 93
gtttatggat gcacttaggg gtcctacaag ccttcgtatg aagttgcccc tcgcaagcac 60
actataaatt catgaacaat tgcgcagtca aagttagatt gtaagccgaa ttcaaacgat 120
ttcaacagtc gtagctaacg aggccttttg tctcacaccc ttacaaaggg actgtagaat 180
gcaagggcaa acaggcctga ggtaacttta aaatataatg taccttgaaa actatgtata 240
cattgcattt attaagcagt agggtatttt gtttgcaaga aaataaagct caaaatatct 300
ttggagtttg acaatagtat agaaaaaata gctcagcaac cttaataaaa aaagggtcat 360
tgggcaaagc gttttaaaaa gatttaagtg gtagtgttta aagtgaaaga gattgatata 420
gttaaaaatt gttgagctca attcacgctg gattcggcga tccgttttct tcaatcctca 480
cgtgctttct tcgtttgagt gcaaaagttc atatgatgct atctcccgct tatcttatta 540
gtcgaaaatg gggagaattt cctattttat ctgtcgttta gcacatacgg ccaggaaaat 600
acataagatt tcgccgaacg acggggtcaa ttcgtccttt ttgtacacat cgtttaattt 660
atgaggaaaa attgatgaac gtatcctccg tagacgctcc tctgaaaagt ttcatgtttc 720
ctgcgcgttc ctttgatagg caataaaaca atacaacgcg tgcctttgaa aatgccaaga 780
tctatacgag gcctctaaca aaacatcgtt caggaacaga gaatgctaaa aatgcaaaag 840
ggtccctggg tactcattga atagaaatga ttgaaaatac tgcgtataaa atagcacgac 900
taaatgatac tatttttatg tcgacacggt actatttctt cttttgcaga taaaagtgta 960
gcagataaaa gtgtagcata ctaaatatat accccaagta 1000
<210> 94
<211> 967
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_DIP5 promoter
<400> 94
gctctcttat caattatgta agtgcttgta tactatttac ctaagataag aaaaaaaaaa 60
aagcaattca aaattaagct tatcttgaca gcggggctgg tttgtttcta gaagacaaaa 120
agtggggaat catttttacg taactccccc tgataagaag gactcacatc cttataggta 180
cgataaagaa tggttgtatc tttcctattt ttcgaaatcg ttatcttata tagttgaact 240
actacggtta aaaagcttaa gcctcagccc tcttaatcaa acttcttttt tgaaggcacc 300
agggtgcata aaagtgcgtc tattgtttcc cagtggaact ctgttgagat agcgatgttt 360
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tctggccctt ttttgttatc atattcgtat acccaacaac atatcggttc caccggtcct 780
ttttatatat aaaagacgat gtgtagatgc actcgagtat tcttggagaa cgtgacttgt 840
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aattcttttg cactttcaac ataaggtaca actgaaaaca caggaaaaaa agaactaact 960
ctaagta 967
<210> 95
<211> 1000
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_TIR3 promoter
<400> 95
gttcgaggcc aaacaaaaac cgcagcacaa tggagtaaaa gtcgaaggca cgggccccaa 60
acgatagagt ggaagttgta ggaaacaaaa gtggccgtct atgtggcgct tctctgcggt 120
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tgcataaagg atgcccggca ctgtcctaga cggtgccttc ccttagagac taggagagac 240
ttgagtagga gaaactgagc aggaaaattc gagagataaa gtacatgtgc ctaggtaagc 300
tgtacttcga acagctaata ttagtaagat gcataaaggg gcgtcaaagt ggaaatataa 360
cgacaggaga atctcggtgt gtaagttgga atgtgtattg caccacttcc atgattgggc 420
ttttttcctg gcgcaaaatg ttgctttttc aacatttttc ttatacgcag agagagaatc 480
gtcagatagg tggtaaaact tggagcctaa ttagctcatt atttcatttg aacgagacat 540
tggcttctgc cctacatcac ccatacgaga cattggcctt atacgaggcg tacttcgcct 600
tgcgggaaaa aaaatttctt ttgtaagcga ggttactcag aaactgtgac tgaaggcaga 660
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cacacgtttc ttagatatgc gtgccttaag gcgacccatt gttcctgttt accatgattt 780
ctgtaggctt ttttttagaa ggccctagaa tggattgcag atttccgtct gagaaggcag 840
tatacgtaca tatgaatata tatatacata tattctttgg tggagagtat aagcgtttcg 900
tctcctcttc ctttctctac tgcagatttt cttgctggtt gtttgatttt ttctttttag 960
tgttccccag atccaattgt tcaaccgccc acacacaaca 1000
<210> 96
<211> 1000
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_TIR2 promoter
<400> 96
aaacttaaaa caatccatta cctgcctagt ataatttttt tagaccagaa tatgactcca 60
taaaacgtga agcagcagct agaaaaacga cgcctcggcg gagtttgcgt ttaactctca 120
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aaggagtgga caaaaaaggc gtgaatttta ctccactggc ggtagccgcc tataaagaaa 240
ttgataagag gcgtgcctct tatgcgatct tcggaccaac aacaaagcac acaatagcgc 300
aaagtataca caatagagag cctgtaggaa agcagtgggg aatgtcttgg ctttttttat 360
gcccagaaaa aaataaacgt aacgttgggg aactacgcgc aatcatattt catggcctcc 420
ccacggtgct tagagcagcg cgttgcctac agaaacatct ttataaaatc ttggccggcc 480
aagattccca aacgagactc acatttccca aaaaagacat ttctgtccaa aagtagaagg 540
caagaaaacc ctggaggaat cataggcaaa gaaagaaaag aagaagttca tctttaaaac 600
tacctttcaa gcctttattc gttcctcgta aaggacacac gaaaaaaata aacagtacct 660
tgcagaagga gtgcagagtt aggtcgcagg gaatccttga aagccaagag ttttttttcc 720
gtaatgatct cccaaagcaa ccatcaacat tgtggtgcaa agtttagtgt aagatgttct 780
actgaactat cttaatagct gagcatcatg tgagtaaacg agtaagcaag aaaacaacaa 840
agtaatgttc aactttcgta actacggaaa ataatatata agtagttaac gaaattcgaa 900
caatgagagc tctcacatat catcttcttt tccagtttag ccattatcag cacaataata 960
caaaacacac tcgtacactc gcttcaacta taacaaaaaa 1000
<210> 97
<211> 1000
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_HEM13 promoter
<400> 97
aaaggtagaa ggtattgcac cgattcctag tatcaattct tttcaaaacc acttattttg 60
caaaacatgc gtctaacctg ccatttcagc aacgtaaata ataattactt ccatatatat 120
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gaaaatcgta gaagtatgtc ttaatgtaga aggttgagaa caaccggatc ttgcggtcat 240
ttttcttttc gaggaaagtg caagtctgcc actttccaga aggcatagcc ttgccctttt 300
gttgatattt ctccccaccg taattgttgc attcgcgatc ttttcaacaa tacattttat 360
catcaagccc gcaaatcctc tggagtttgt cctctcgttc actgttggga aaaacaatac 420
gcctaattcg tgattaagat tcttcaaacc atttcctgcg gagtttttac tgtgtgttga 480
acggttcaca gcgtaaaaaa aagttactat aggcacggta ttttaatttc aattgtttag 540
aaagtgcctt cacaccatta gcccctggga ttaccgtcat aggcactttc tgctgagctc 600
ctgcgagatt tttgcgctga aagagtaaaa gaaatctttc acagcggctc cgcgggccct 660
tctactttta aacgagtcgc aggaacagaa gccaaatttc aaagaacgct acgctttcgc 720
cgtttctggt tctcccacca ataacgctcc agcttgaaca aagcataaga ctgcaaccaa 780
agcgctgacg gacgatccga agataaagct tgctttgccc attgttctcg tttcgaaagg 840
ctatataagg acacggattt tccttttttt ttccacctat tgtctttctt tgttaagctt 900
ttattctccg ggtttttttt ttgagcatat cgaaagcttt cttttcgcaa atcaaacata 960
gcaaaccgaa ctcttcgaac acaattaaat acacataaaa 1000
<210> 98
<211> 1000
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_YHK8 promoter
<400> 98
acagcggtac caagtgacac attgcgtact gtgtagtatg cgccgtatat aacttttttt 60
ttctgaaggt actttgaatt acaatctatt ttttacagtt cctatggcag gggttgaaga 120
tatttgggtc tgaaccatag caggattagt gttatagtag gtatgtgaat agaagctaac 180
aaaatgagat gaacctcata caaagtcgta gagaaaactg ctaacagaag agctgcgcct 240
tgaaatcgta tctctaagct tataataaat tgaaaggaaa aaatacgtgg taaatgcaag 300
cgaccaaaag gctacggccc aacgctaacc cgccgatagg tgcataatct aatttacctc 360
caccagcagg agcccttttt ctaagtaata agcaaaccag ataacttaca tcttgctgta 420
ggaaacaaaa gccggaataa tggttcactc atattcttcg tgtgaaacac agaagaaatc 480
caatatttgc ttcagtattt atctctaaaa attggtccta cattggaaac cataaaccaa 540
ttataaccgg tgtacgaatt gtaagctagt tctggaaatg tcatgttgcg caggtaaaag 600
tggagctgaa ttgtatatct gttttgatca ttattatccc tctgggtgag tggaaatatc 660
aataaaatgc aatggcacat ttaatatcct tctcttaatt ccgtgattta taacatcttg 720
atgccagaaa cacctttcgg atccggcaat aaagcggaga ttagcacgct tttcgccggt 780
cctacggatt tagtgttggc tattgttgag attagtaata cgcagagaat ttttctaccg 840
gtgaagcgac catctcagat tattaggtca agcaataaca cttgttatta gatgcgttac 900
gttcacctgg accctatata aaggcatatt tgccttacat ttggtgtatg gtatcacctt 960
gtatactaag aacatatata tgcagatata acaacaggat 1000
<210> 99
<211> 1000
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_FET4 promoter
<400> 99
ctgtgcttgc tgttctaacc atacgtacta ctacgttgat tggattataa tgtcctttgg 60
gtattctccg attacgttgt cccatttttc ttttttgcct tgttgcgaag agcgttgttc 120
cgaaaaccgg gtgcactttt tgttcacttt atatatccca cgaggagact gcgcgaacat 180
gatatgtttg acctggcata gtgctattgt tcataaacaa taagccccct aaatacctgc 240
atgtacgaag gtgtacgtac ggtcattcgc atttccctag cattactttc agtactggac 300
aggttatttt tacccctcta gtttgcgact accactaaat gggccatttt tacgtgtcta 360
cgacatatcg caagggtttt tttcttttgt cttattcgag taattatata agcgcgcgta 420
gtcatttttt tagcgacacc ctagggtcct gtagcagtaa tttgaggttt tcatggctcg 480
aacaacgaca aaatattgag gaatcttgag ccttattggg gcgtaaatca cacaggtgtt 540
gaatgagctt ggagcttgtg cggttatgta ttagatatgg gcagtttcct ttaacgttgg 600
cgcctctttc tttcctaccc gtggggttgc tctcgaaact gattaggtca tgagcatttt 660
tgctgagtct ttttaggaag cagcattttt ctcaaacgaa aaaaaaaaaa accaaaaaaa 720
aaaataaaga caaaaaaact atataatgct actggccttg aacttgcttg gtagaagcct 780
tcttaattgc acccattagt ttagcatcta ccacatcttg attcgatgct cttcatttag 840
aaatacttgt ttatataaat atacttcaca cggcatgaat taattgatag gtaagtaagt 900
ttcttttatc ataagtcaaa cagtatcaga tataagaagg gaaaaggtag atatagaaac 960
ctaataagac ccttattatt aaacattcgt taatcaaata 1000
<210> 100
<211> 1000
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_TIR4 promoter
<400> 100
atgaagtaga cacgataaag ttcttgaaga aagattgtgg atgggtttgc tgaagcttag 60
aactaagaaa agaaacaagc acgcgcaaga aaaccgctac ggctaacttc taaggtgagg 120
atattgtgat tgtttatgcc tcatattttg ctttttatat gttcttcctt catacggcgt 180
gcaaattatc cgccggcgaa cagggtgcta ttctaagagg aactttgaaa ctgtaaacgc 240
ggtgtactga aggggtcatc tgaacgaaca atattttatg cttttgttag ccaaacggta 300
ctgataaggg actgtgaaaa aaaaagacaa tgtatggggt tcacggtttc ccagattcgt 360
gtgtgtgtaa taattcgttt acggcgcacg acagacactt caggaaattt aaagatcaga 420
ataggcatac actccacgca aggaaaacaa aagttgctac cgtaaccggc tcgtacgggg 480
aaagcaaggt catctagtgc tcacttacga actggcataa tcgagttgtg acttccaaac 540
ttaaccgtac tctcacagct gatgtgatcc gaagaaaacc ctgaagatac aacaatggca 600
accaaaggca acttaaaaag gcaaacgaag tacttttcaa caatagctta cactgaaact 660
cgcggagagg cgacgctgcg cgcgaattat cagtaaaaat ctcgtaacaa cccatctgcc 720
acttttagaa ggaatggaaa ttctcaaaaa atgacggaaa ataatagaac agggttccta 780
aacgatgcat ttctaacaag taggatagtc caaaagggag gatgcaaatt ctttgttttc 840
cacgcagtaa gatatgatcc caagctttcg aatataaaaa gggaaggatc gctaggacag 900
atcagttttt agcccgttta cttatctcgt tccctactct tgttctgata gaaaccagca 960
acaaaaacct attcactcgc ttattaatac cataaaaaaa 1000
<210> 101
<211> 600
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_AAC3 promoter
<400> 101
gatgcctatc gtagtttgca aggaagacgg cttccaactg acaccgccct agtctggcag 60
gattcgtgaa aggagtccat gccagctgct acccagggat tgccacggcc ccggccagcg 120
tatagtacac tgtcaggagc aattcgaaga ggcaaccaaa attatgctaa gcatcgcact 180
ctctctcagt ctggtgctaa gcggaagaca tgcttccaat ggcctcctca ccgagaacgg 240
atattaaacg aaacgaagaa aaaaaatctt cacggaaaat gcgtaatgtc tggatgacaa 300
aatgcatggg tgtaaaaaag gaaatgagac gaacttgtaa taaaccttag tgggttgacg 360
aattttgaaa taaagttttt cctttttttt tttttttttc tttttcattg tttggttgcc 420
ttcaaattac atataagatt tctcgagaag ggttttccat tgtccttttc attaggcgtt 480
gaagtgaatc taaagtgcgc ttgaatgatt tcagatagaa agactaaaga agtggtgtga 540
gtataattaa ctcaattgaa gacggtttac ctgaagtgat atactgtgcc ttgagaaaca 600
<210> 102
<211> 300
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Sc_PGK1 terminator
<400> 102
aattgaattg aattgaaatc gatagatcaa tttttttctt ttctctttcc ccatccttta 60
cgctaaaata atagtttatt ttattttttg aatatttttt atttatatac gtatatatag 120
actattattt atcttttaat gattattaag atttttatta aaaaaaaatt cgctcctctt 180
ttaatgcctt tatgcagttt ttttttccca ttcgatattt ctatgttcgg gttcagcgta 240
ttttaagttt aataactcga aaattctgcg ttcgttaaag ctttcgagaa ggatattatt 300
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligononucleotide primer Fw-PRK (DBC-15631)
<400> 103
ccccggtctc gaatgtcaca acaacaaaca attgtg 36
<210> 104
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligononucleotide primer Rv-PRK (DBC-15632)
<400> 104
ggggggtctc ctttaggctt tagcagctgt tgcag 35
<210> 105
<211> 486
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gBLOCK bearing sequence of SNR52p-gRNA.INT1-SUP4t
<400> 105
ctgcagcccg ggggatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcccgcgg tctttgaaaa 60
gataatgtat gattatgctt tcactcatat ttatacagaa acttgatgtt ttctttcgag 120
tatatacaag gtgattacat gtacgtttga agtacaactc tagattttgt agtgccctct 180
tgggctagcg gtaaaggtgc gcattttttc acaccctaca atgttctgtt caaaagattt 240
tggtcaaacg ctgtagaagt gaaagttggt gcgcatgttt cggcgttcga aacttctccg 300
cagtgaaaga taaatgatct attagaacca gggaggtccg ttttagagct agaaatagca 360
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtggtgctt 420
tttttgtttt ttatgtctcc gcggcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc 480
tccacc 486
<210> 106
<211> 5949
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pRN599
<400> 106
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc tgacagagta aaattcttga gggaactttc 240
accattatgg gaaatggttc aagaaggtat tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca 300
ttgagtgttt tttatttgtt gtattttttt ttttttagag aaaatcctcc aatatcaaat 360
taggaatcgt agtttcatga ttttctgtta cacctaactt tttgtgtggt gccctcctcc 420
ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct ttttccttat cacgttgagc cattagtatc 480
aatttgctta cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt 540
agattgcgta tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg 600
tttctattat gaatttcatt tataaagttt atgtacacct aggatccgtc gacactggat 660
ggcggcgtta gtatcgaatc gacagcagta tagcgaccag cattcacata cgattgacgc 720
atgatattac tttctgcgca cttaacttcg catctgggca gatgatgtcg aggcgaaaaa 780
aaatataaat cacgctaaca tttgattaaa atagaacaac tacaatataa aaaaactata 840
caaatgacaa gttcttgaaa acaagaatct ttttattgtc agtactgatt agaaaaactc 900
atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg 960
aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag 1020
atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc 1080
ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga 1140
gaatggcaaa agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc 1200
gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag 1260
acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg 1320
caggaacact gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac 1380
ctggaatgct gttttgccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg 1440
gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat 1500
ctcatctgta acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc 1560
atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc 1620
ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgaaacgtg 1680
agtcttttcc ttacccatgg ttgtttatgt tcggatgtga tgtgagaact gtatcctagc 1740
aagattttaa aaggaagtat atgaaagaag aacctcagtg gcaaatccta accttttata 1800
tttctctaca ggggcgcggc gtggggacaa ttcaacgcgt ctgtgagggg agcgtttccc 1860
tgctcgcagg tctgcagcga ggagccgtaa tttttgcttc gcgccgtgcg gccatcaaaa 1920
tgtatggatg caaatgatta tacatgggga tgtatgggct aaatgtacgg gcgacagtca 1980
catcatgccc ctgagctgcg cacgtcaaga ctgtcaagga gggtattctg ggcctccatg 2040
tcgctggccg ggtgacccgg cggggacgag gccttaagtt cgaacgtacg agctccggca 2100
ttgcgaatac cgctttccac aaacattgct caaaagtatc tctttgctat atatctctgt 2160
gctatatccc tatataacct acccatccac ctttcgctcc ttgaacttgc atctaaactc 2220
gacctctaca ttttttatgt ttatctctag tattactctt tagacaaaaa aattgtagta 2280
agaactattc atagagtgaa tcgaaaacaa tacgaaaatg taaacatttc ctatacgtag 2340
tatatagaga caaaatagaa gaaaccgttc ataattttct gaccaatgaa gaatcatcaa 2400
cgctatcact ttctgttcac aaagtatgcg caatccacat cggtatagaa tataatcggg 2460
gatgccttta tcttgaaaaa atgcacccgc agcttcgcta gtaatcagta aacgcgggaa 2520
gtggagtcag gcttttttta tggaagagaa aatagacacc aaagtagcct tcttctaacc 2580
ttaacggacc tacagtgcaa aaagttatca agagactgca ttatagagcg cacaaaggag 2640
aaaaaaagta atctaagatg ctttgttaga aaaatagcgc tctcgggatg catttttgta 2700
gaacaaaaaa gaagtataga ttctttgttg gtaaaatagc gctctcgcgt tgcatttctg 2760
ttctgtaaaa atgcagctca gattctttgt ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt 2820
ttgttttaca aaaatgaagc acagattctt cgttggtaaa atagcgcttt cgcgttgcat 2880
ttctgttctg taaaaatgca gctcagattc tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg 2940
catttttgtt ctacaaaatg aagcacagat gcttcgttaa caaagatatg ctattgaagt 3000
gcaagatgga aacgcagaaa atgaaccggg gatgcgacgt gcaagattac ctatgcaata 3060
gatgcaatag tttctccagg aaccgaaata catacattgt cttccgtaaa gcgctagact 3120
atatattatt atacaggttc aaatatacta tctgtttcag ggaaaactcc caggttcgga 3180
tgttcaaaat tcaatgatgg gtaacaagta cgatcgtaaa tctgtaaaac agtttgtcgg 3240
atattaggct gtatctcctc aaagcgtatt cgaatatcat tgagaagctg cagcgtcaca 3300
tcggataata atgatggcag ccattgtaga agtgcctttt gcatttctag tctctttctc 3360
ggtctagcta gttttactac atcgcgaaga tagaatctta gatcacactg cctttgctga 3420
gctggatcaa tagagtaaca aaagagtggt aaggcctcgt taaaggacaa ggacctgagc 3480
ggaagtgtat cgtacagtag acggagtata ctaggtatag tctatagtcc gtggaattaa 3540
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa tccggagcta gcatgcggcc gctctagaac 3600
tagtggatcc cccgggctgc aggaattcga tatcaagctt atcgataccg tcgacctcga 3660
gggggggccc ggtacccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattccg agcttggcgt 3720
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 3780
taggagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagg taactcacat 3840
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 3900
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 3960
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4020
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4080
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4140
tcggcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4200
caggactata aagataccag gcgttccccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4260
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4320
ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4380
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 4440
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 4500
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 4560
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 4620
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 4680
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 4740
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 4800
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 4860
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 4920
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact gcccgtcgtg tagataacta 4980
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5040
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5100
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 5160
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5220
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5280
catgatcccc catgttgtga aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5340
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 5400
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 5460
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 5520
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 5580
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 5640
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 5700
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 5760
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 5820
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 5880
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 5940
cctttcgtc 5949
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer INT1-5'flank (BOZ-783)
<400> 107
cggcattatt gtgtatggc 19
<210> 108
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer INT1-5 'flank with connector c (DBC-19944)
<400> 108
caacaggagg cggatggata tactgtggtc tggaagatgc cggaaagcgt catgttatgc 60
tcctcaatca cg 72
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer connector c to amplify anaerobic promoter-PRK-PGK1
terminator expression cassette (DBC-5799)
<400> 109
acgctttccg gcatcttcca g 21
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer connector d to amplify PRK expression cassette
(DBC-5800)
<400> 110
gcggaatatt ggcggaacgg 20
<210> 111
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer to amplify URA3 marker with flank connector d
(DBC-19947)
<400> 111
aacgttgtcc aggtttgtat ccacgtgtgt ccgttccgcc aatattccgc gctgtggttt 60
cagggtccat aaag 74
<210> 112
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer to amplify URA3 locus with flank connector e
(DBC-19949)
<400> 112
aggtacaaca agcacgaccg agcatatggg aaggatgttt gtggttattt cgagattccc 60
gggtaataac tg 72
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer INT1-3'flank with connector d (DBC-19946)
<400> 113
aactccatca aatggtcagg 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer INT1-3 'flank (BoZ-788)
<400> 114
aacaaaagct gggtaccggg 20
<210> 115
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer on backbone pRN599 (DBC-13775)
<400> 115
cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc agcttttgtt ccgcggtctt 60
tgaaaagata atg 73
<210> 116
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer on backbone pRN599 (DBC-13776)
<400> 116
aaaatacaac aaataaaaaa cactcaatga cctgaccatt tgatggagtt ccgcggagac 60
ataaaaaac 69
<210> 117
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer on gRNA cassette INT1 (DBC-13773)
<400> 117
cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc agcttttgtt ccgcggtctt 60
tgaaaagata atg 73
<210> 118
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer on gRNa cassette INT1 (DBC-13774)
<400> 118
aaaatacaac aaataaaaaa cactcaatga cctgaccatt tgatggagtt ccgcggagac 60
ataaaaaac 69
<210> 119
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer 7933 YEN1p prk cassette construction
<400> 119
tcacagaggg atcccgttac ccatctatgc tgaagattta tcatactatt cctccgctcg 60
ggaattcaag caatagcgtt tc 82
附图说明
图1：在合成培养基(20g L-1葡萄糖)中厌氧摇瓶培养物的指数生长期期间收获的IME324(图1左)和IMX774(图1右)的无细胞提取物中的PRK活性。值表示使用30μl、50μl或100μl无细胞提取物时活性的平均值和标准偏差。数据收集自单一培养物。
图2：S.cerevisiae菌株IME324和IMX774的厌氧生物反应器分批培养物中基于葡萄糖的甘油、生物质和乙醇的产率(Y)以及甘油形成与生物质形成的比值。使培养物在含有20g L-1葡萄糖(pH 5)的合成培养基上生长，并用N2/CO2(90％/10％)气体混合物喷雾。从指数生长期计算产率和比值。针对蒸发校正基于葡萄糖的乙醇产率。值表示来自独立重复培养的数据的平均值和平均偏差。
图3：来自针对prk的两种菌株的样品中来自S.oleracea prk的所选独特肽的峰面积的总和。峰面积指示蛋白质的量。
图4：厌氧启动子-PRK盒在INT1基因间基因座整合的图示。
图5：对于对照菌株IME324、IMX774、IMX765和引入了表达盒厌氧启动子-PRK的IMX765的转化体，以任意单位(AU)表达的MTP分批发酵结束时的平均甘油值。误差线指示平均值的标准误差。
图6：对于对照菌株IME324、IMX774、IMX765和引入了表达盒厌氧启动子-PRK的IMX765的转化体，以任意单位(AU)表达的MTP分批发酵结束时的平均乙醇值。误差线指示平均值的标准误差。
表1-序列表说明
Figure BDA0001902530090000031
Figure BDA0001902530090000041
Figure BDA0001902530090000051
Figure BDA0001902530090000061
发明详述
因此，本发明涉及一种重组酵母细胞，其功能性表达一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)，和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣，和一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中所述磷酸核酮糖激酶受PRK表达比厌氧/需氧为2或更高的启动子(在本文中是“PRK启动子”)的控制。
在一个实施方式中，PRK启动子是ROX1阻遏的。ROX1在本文中是一个或多个缺氧基因的血红素依赖性阻遏物；且介导缺氧诱导基因如COX5b和CYC7的需氧转录阻遏；通过响应于氧化应激而减少启动子占据来调控阻遏物功能；并含有负责DNA弯曲活性的HMG结构域；参与高渗胁迫抗性。ROX1受氧调控。
虽然不限制本发明的范围，但我们在此处发现ROX1的调控可以如下发挥作用：根据Kwast等[18]：“虽然Rox1以不依赖于O2的方式起作用，但其表达为氧(血红素)依赖性的，被血红素依赖性转录因子Hap1激活[19]。因此，当氧水平下降到限制血红素生物合成的水平时[20]，ROX1不再转录[21]，其蛋白水平下降[22]，且其调控的基因被去阻遏”。
在一个实施方式中，PRK启动子具有一个或多个ROX1结合基序。
在一个实施方式中，PRK受PRK表达比厌氧/需氧为2或更高的启动子(在本文中是“PRK启动子”)的控制，并且Rubisco受组成型启动子的控制。
在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含一个或多个NNNATTGTTNNN基序。
在一个实施方式中，PRK启动子是选自以下列表的基因的天然启动子：FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5、HEM13、YNR014W、YAR028W、FUN 57、COX5B、OYE2、SUR2、FRDS1、PIS1、LAC1、YGR035C、YAL028W、EUG1、HEM14、ISU2、ERG26、YMR252C和SML1；特别是FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5和HEM13。
在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含一个或多个基序：TCGTTYAG和/或AAAAATTGTTGA。
在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含一个或多个序列基序：TCGTTYAG和/或AAAAATTGTTG。
特别地，此类PRK启动子是DAN、TIR或PAU基因的天然启动子。在一个实施方式中，PRK启动子是选自以下列表的基因的天然启动子：TIR2、DAN1、TIR4、TIR3、PAU7、PAU5、YLL064C、YGR294W、DAN3、YIL176C、YGL261C、YOL161C、PAU1、PAU6、DAN2、YDR542W、YIR041W、YKL224C、PAU3、YLL025W、YOR394W、YHL046C、YMR325W、YAL068C、YPL282C、PAU2和PAU4，特别地，PRK启动子是选自以下列表的基因的天然启动子：TIR2、DAN1、TIR4、TIR3、PAU7、PAU5、YLL064C、YGR294W、DAN3、YIL176C、YGL261C、YOL161C、PAU1、PAU6、DAN2、YDR542W、YIR041W、YKL224C、PAU3和YLL025W。
PRK启动子的PRK表达比厌氧/需氧为2或更高，优选3或更高，4或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，10或更高，20或更高或者50或更高。换言之，PRK的表达在厌氧条件下比在需氧条件下高至少2倍。
“表达”是指基因转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)，随后翻译成蛋白质。
在一个实施方式中，通过测量在需氧条件和厌氧条件下生长的细胞的PRK蛋白的量来确定PRK表达比。PRK蛋白的量可以通过蛋白质组学确定，如实施例中所示。
在另一个实施方式中，通过测量在需氧条件和厌氧条件下生长的细胞的PRK活性来确定水平或PRK表达比，例如，在无细胞提取物中进行。测量PRK活性的方法例如实施例1中所述。
在另一个实施方式中，通过测量在需氧条件和厌氧条件下生长的细胞的PRK基因的转录水平(例如mRNA的量)来确定水平或PRK表达比。本领域技术人员知道如何使用本领域公知的方法(例如，Q-PCR、实时PCR、RNA印迹、RNA-seq)确定翻译水平。
在本文中使用时，“启动子”是指导(结构)基因、特别是一种或多种磷酸核酮糖激酶基因转录的DNA序列。启动子允许在厌氧条件下比在需氧条件下更高的表达。
在一个实施方式中，PRK启动子可以是合成的寡核苷酸。其可以是人工寡核苷酸合成的产物。人工寡核苷酸合成是合成生物学中的一种方法，其用于在实验室中产生人工寡核苷酸，例如基因。商业基因合成服务现在可以从世界各地的许多公司获得，其中一些公司已经围绕这项任务建立了他们的商业模式。目前的基因合成方法通常基于有机化学和分子生物学技术的组合，并且可以“从头”合成整个基因，而不需要前体模板DNA。
在一个实施方式中，启动子位于PRK基因的5'-区。在一个实施方式中，其位于PRK基因的转录起始位点附近。
本发明还涉及载体(如下文所定义)，其包含PRK和PRK表达比厌氧/需氧为2或更高的启动子。
本发明还涉及制备有机化合物、特别是醇的方法，所述方法包括：使用酵母细胞转化碳源，特别是碳水化合物或其它有机碳源，从而形成有机化合物，其中所述酵母细胞是根据本发明的酵母细胞。
除非另有说明，否则在本文中不使用数量词限定被定义为“至少一个/一种”。
提到单数名词(例如化合物、添加剂等)时，旨在包括复数在内。因此，除非另有说明，否则提到特定部分(例如，“化合物”)时，这是指“至少一种”该部分，例如“至少一种化合物”。在本文中使用时，术语“或”应被理解为“和/或”。
提到存在几种异构体(例如D和L对映异构体)的化合物时，该化合物原则上包括可用于本发明特定方法中的该化合物的所有对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体；特别地，提到例如化合物时，包括一种或多种天然异构体。
本文使用传统意义上的术语“发酵”、“发酵的”等，即指在厌氧条件下正在进行或已进行的工艺。厌氧条件在本文中被定义为没有任何氧的条件或在该条件下酵母细胞(尤其是酵母细胞)基本上没有消耗氧，通常对应于氧消耗小于5mmol/l.h，尤其是氧消耗小于2.5mmol/l.h，或者小于1mmol/l.h。更优选地，消耗0mmol/L/h(即，不能检测到氧消耗)。这通常对应于培养液中的溶解氧浓度小于空气饱和度的5％，特别是溶解氧浓度小于空气饱和度的1％，或小于空气饱和度的0.2％。
术语“酵母”或“酵母细胞”是指在种系发生上不同的一类单细胞真菌，其中大部分属于子囊菌亚门(Ascomycota)和担子菌亚门(Basidiomycota)。出芽酵母(“真酵母”)被归类于酵母菌目(Saccharomycetales)，其中Saccharomyces cerevisiae是最公知的物种。
在本文中使用时，术语“重组(细胞)”或“重组微生物”是指含有这样的核酸的菌株(细胞)，所述核酸是使用一种或多种重组DNA技术和/或一种或多种另外的诱变技术的遗传修饰的结果。特别地，重组细胞可包含相应的野生型细胞中不存在的核酸，所述核酸已使用重组DNA技术被引入该菌株(细胞)中(转基因细胞)，或者所述野生型中不存在的核酸是所述野生型中存在的核酸序列(例如编码野生型多肽的基因)中一种或多种突变(例如使用重组DNA技术或另外的诱变技术如UV辐射)的结果或者其中基因的核酸序列已被修饰以使多肽产物(编码它)靶向另外的细胞区室。此外，术语“重组(细胞)”特别涉及使用重组DNA技术从中移除DNA序列的菌株(细胞)。
在本文中使用时，术语“转基因(酵母)细胞”是指含有非天然存在于该菌株(细胞)中的核酸的菌株(细胞)，所述核酸已使用重组DNA技术被引入该菌株(细胞)中(即重组细胞)。
在本文中关于蛋白质或多肽使用时，术语“突变的”是指野生型或天然存在的蛋白质或多肽序列中的至少一个氨基酸已通过编码这些氨基酸的核酸的诱变而被不同的氨基酸替换，插入或从该序列中缺失。诱变是本领域公知的方法，包括，例如，借助于PCR或通过寡核苷酸介导的诱变的定点诱变，如Sambrook等,Molecular Cloning-A LaboratoryManual,第2版,第1-3卷(1989)中所述。在本文中关于基因使用时，术语“突变的”是指该基因或其调控序列的核酸序列中的至少一个核苷酸已通过诱变从该序列中缺失，或者已被不同的核苷酸替换，从而导致具有定性改变的功能的蛋白质序列的转录或该基因被敲除。
在本文中使用时，术语“基因”是指含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶II)的模板的核酸序列。基因被转录成mRNA，然后翻译为蛋白质。
在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸基本特性从而以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交的已知类似物(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调控基因的全长或子序列(subsequence)。除非另有说明，该术语包括所示出的序列及其互补序列。因此，为了稳定性或其它原因骨架被修饰的DNA或RNA是该术语在本文中所指的“多核苷酸”。另外，仅举两个例子，包含稀有碱基(例如肌苷)或经修饰的碱基(例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是本文所用的术语多核苷酸。应当理解，已对DNA和RNA进行了大量不同的修饰，所述修饰发挥了本领域技术人员已知的许多有用目的。在本文中使用时，术语多核苷酸包括这些经化学、酶促或代谢修饰的多核苷酸形式，以及病毒和细胞的特征性DNA和RNA化学形式，所述细胞尤其包括简单细胞和复杂细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的多聚体。该术语适用于下述氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。天然存在的氨基酸的这类类似物的关键特征是，当掺入蛋白质中时，蛋白质与下述抗体特异反应，所述抗体针对相同但是完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质结合、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。
参考括号中的酶种类(EC)提到酶时，所述酶种类是以Nomenclature Committeeof the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)提供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见于http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其它合适的酶旨在包括在内。
除非另有说明，否则如果通过参考登录号在本文中提及蛋白质或核酸序列，例如基因，则所述登录号特别用于指具有可通过www.ncbi.nlm.nih.gov/找到的序列(2016年6月14日可获得)的蛋白质或核酸序列(基因)。
本文中编码多肽的每条核酸序列还通过遗传密码子描述了核酸的每种可能的沉默变异。术语“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸两种序列。涉及具体的核酸序列时，经保守修饰的变体表示下述核酸，所述核酸由于遗传密码子的简并性而编码相同的氨基酸序列或其经保守修饰的变体。术语“遗传密码子的简并性”是指大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定了丙氨酸的每个位置上，可以将密码子改变为所述任何相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其代表一类经保守修饰的变异。
在本文中使用时，术语具有特定序列(例如SEQ ID NO：X)的多肽的“功能同源物”(或简称“同源物”)是指包含所述特定序列的多肽，前提条件是一个或多个氨基酸被替代、缺失、添加和/或插入，并且所述多肽(定性地)具有用于底物转化的相同酶功能。该功能可以通过使用包含重组酵母细胞的试验体系进行检测，所述重组酵母细胞包含用于在酵母中表达同源物的表达载体，所述表达载体包含与在酵母中有功能的启动子可操作地连接的异源核酸序列，且所述异源核酸序列编码其在酵母细胞中的酶活性待被检测的同源多肽，并评估所述细胞中是否发生所述转化。可以通过使用计算机相似性分析来鉴定候选同源物。WO2009/013159的实施例2中描述了这种分析的详细实例。本领域技术人员能够从中知晓如何找到合适的候选同源物并任选地在密码子(对)优化后，能够使用如上所述的合适的试验体系检测这些候选同源物的所需功能。合适的同源物表示具有这样的氨基酸序列并具有所需的酶功能的多肽，所述氨基酸序列与特定多肽的相似性高于50％，优选60％或更高，特别地至少70％，更特别地至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％。关于核酸序列，术语功能同源物意在包括这样的核酸序列，其由于遗传密码的简并性而与另一核酸序列不同但编码相同的多肽序列。
序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在所比较的序列的全长上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，其根据情况通过这类序列的字符串之间的匹配测定。
当表现出某水平的相似性时，则称多个氨基酸序列或核苷酸序列是同源的。两个序列同源指示了共同的进化起源。由分别为高或低的“百分比同一性”或“百分比相似度”来指示两个同源序列关系近还是关系较远。虽然尚有争议，但是“百分比同一性”或“百分比相似度”、“同源性水平”或“百分比同源性”经常可互换使用。可使用数学算法来完成序列比较以及两个序列之间的百分比同一性的确定。本领域技术人员应认识到以下事实，可使用几个不同的计算机程序来比对两个序列，以及确定两个序列之间的同源性(D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编),Time warps,string edits and macromolecules:the theory andpractice of sequence comparison中的Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequencecomparison，第1-44页，Addison Wesley)。可使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。该算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。已经在计算机程序NEEDLE中实施了Needleman-Wunsch算法。对于本发明的目的而言，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于替代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可规定另一些矩阵。用于比对氨基酸序列的任选参数是间隔开放(gap-open)罚分10，以及间隔延伸(gap extension)罚分0.5。本领域技术人员应领会，所有这些不同参数将得到轻微不同的结果，但是当使用不同算法时，两个序列的总百分比同一性并不会显著改变。
全局同源性定义
同源性或同一性是两个全序列之间的针对包括任何间隔和延伸在内的总对齐区域的一致匹配百分比。如下计算两个经比对序列之间的同源性或同一性：比对中在两个序列中都示出相同氨基酸的对应位置数除以包括间隔的比对总长度。本文定义的同一性可从NEEDLE得到，并且在该程序输出中标记为“IDENTITY”。
最长同一性定义
按照以下计算两个被比对序列之间的同源性或同一性：比对中在两个序列中都示出相同氨基酸的对应位置数除以减去比对中的总间隔数后的比对总长度。本文定义的同一性可从NEEDLE通过使用NOBRIEF选项得到，并且在该程序输出中标记为“最长同一性”。
本文中公开的核苷酸或氨基酸序列的变体还可被定义为与本文中(例如，序列表中)具体公开的核苷酸或氨基酸序列相比具有一个或几个替代、插入和/或缺失的核苷酸或氨基酸序列。
任选地，在测定氨基酸相似性程度时，技术人员也可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，如本领域技术人员所明白的。保守性氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸的组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸的组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一个实施方式中，保守性氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中所公开的序列中至少一个残基被去除并在其位置中插入一个不同残基的变体。优选地，氨基酸改变是保守性的。在一个实施方式中，每种天然存在的氨基酸的保守性取代如下：Ala到ser；Arg到lys；Asn到gln或his；Asp到glu；Cys到ser或ala；Gln到asn；Glu到asp；Gly到pro；His到asn或gln；Ile到leu或val；Leu到ile或val；Lys到arg；gln或glu；Met到leu或ile；Phe到met,leu或tyr；Ser到thr；Thr到ser；Trp到tyr；Tyr到trp或phe；和Val到ile或leu。
本发明的核苷酸序列还可以通过它们分别在中度杂交条件下或优选地在严格杂交条件下与本文公开的特定核苷酸序列的部分杂交的能力来限定。严格杂交条件在本文中定义为下述条件，其允许至少约25个、优选地约50个核苷酸、75或100个和最优选地约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65℃的温度下，在包含约1M盐、优选地6x SSC的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中杂交，和在包含约0.1M盐或更少，优选地0.2x SSC的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中于65℃下洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，并优选地至少进行1小时洗涤并将洗涤溶液更换至少两次。这些条件通常会允许具有约90％或更多序列同一性的序列的特异性杂交。
中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选地约200个或更多个核苷酸在约45℃的温度下，于包含约1M盐、优选地6x SSC的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中杂交，并于室温下，在包含约1M盐、优选地6x SSC的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，并优选地至少进行1小时洗涤并将洗涤溶液更换至少两次。这些条件通常会允许具有至多50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能够修饰这些杂交条件，从而特异性鉴定同一性在50％和90％之间变化的序列。
在本文中关于核酸或蛋白质使用时，“异源的”是下述核酸或蛋白质，其来自于外来物种，或者如果来自于相同物种时，通过有意的人工干预在组成和/或基因组基因座上与其天然形式相比被大幅修饰。例如，与异源结构基因可操作地连接的启动子来自与结构基因所来源的物种不同的物种，或者如果来自于相同物种时，启动子或异源结构基因之一或二者与其原始形式相比被大幅修饰。异源蛋白质可来自于外来物种，或者如果来自相同物种时，通过有意的人工干预与其原始形式相比被大幅修饰。
术语“异源表达”是指异源核酸在宿主细胞中的表达。异源蛋白在真核宿主细胞系统如酵母中的表达是本领域技术人员公知的。包含编码具有特定活性的酶的基因的核酸序列的多核苷酸可以在这样的真核系统中表达。在一些实施方式中，经转化/转染的酵母细胞可被用作表达酶的表达系统。异源蛋白在酵母中的表达是公知的。Sherman,F.等,Methodsin Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是得到公认的作品，其描述了可用于在酵母中表达蛋白质的各种方法。两种广泛使用的酵母是Saccharomycescerevisiae和Pichia pastoris。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和流程是本领域已知的，并且可从商业供应商(例如，Invitrogen)获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，以及复制起点，终止序列等。
在本文中使用时，“启动子”是指导(结构)基因转录的DNA序列。典型地，启动子位于基因的5'-区，接近(结构)基因的转录起点。启动子序列可以是组成型、诱导型或阻遏型的。在一个实施方式中，不需要(外部)诱导物。
在本文中使用时，术语“载体”包括常染色体表达载体，和用于整合进染色体中的整合载体。
术语“表达载体”是指线性或环形的DNA分子，其包含编码感兴趣的多肽的区段，所述区段受支持其转录的额外的核酸区段的控制(即与之可操作地连接)。这类额外的区段可包括启动子和终止子序列，并可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记物、增强子、多聚腺苷酸化信号等等。表达载体一般来自于质粒或病毒DNA，或者可含有二者的元件。具体地，表达载体包含以5'到3'方向包含并且可操作地连接的核苷酸序列：(a)酵母识别的转录和翻译起始区，(b)感兴趣的多肽的编码序列，和(c)酵母识别的转录和翻译终止区。“质粒”是指自主复制的染色体外DNA，其不被整合进微生物的基因组中，并且通常天然是环状的。
“整合载体”是指线性或环状的DNA分子，其能够被掺入微生物的基因组中，并且提供编码感兴趣的多肽的基因的稳定遗传。整合载体一般包含一个或多个区段，所述区段包括编码感兴趣的多肽的基因序列，所述基因序列受支持其转录的额外的核酸区段的控制(与之可操作地连接)。这类额外的区段可包括启动子和终止子序列，和驱动感兴趣的基因掺入靶细胞基因组中的一个或多个区段，所述掺入通常通过同源重组过程实现。典型地，整合载体会是能够被转移进靶细胞的载体，但是其具有在所述生物中无功能的复制子。当区段中包含适当的标记物时，可以选择包含感兴趣的基因的区段的整合。
“宿主细胞”是指含有载体并支持载体复制和/或表达的细胞。
在本文中使用时，“转化”是指将外源多核苷酸插入宿主细胞中，而无论采用什么插入方法，例如直接吸收、转导、f-交配或电穿孔。外源多核苷酸可作为不整合的载体例如质粒被维持，或者可以被整合进宿主细胞基因组中。
重组酵母细胞优选选自Saccharomycetaceae，例如Saccharomyces cerevisiae，Saccharomyces pastorianus，Saccharomyces beticus，Saccharomyces fermentati，Saccharomyces paradoxus，Saccharomyces uvarum和Saccharomyces bayanus；Schizosaccharomyces，例如Schizosaccharomyces pombe，Schizosaccharomycesjaponicus，Schizosaccharomyces octosporus和Schizosaccharomyces cryophilus；Torulaspora，例如Torulaspora delbrueckii；Kluyveromyces，例如Kluyveromycesmarxianus；Pichia，例如Pichia stipitis，Pichia pastoris或pichia angusta，Zygosaccharomyces，例如Zygosaccharomyces bailii；Brettanomyces，例如Brettanomyces intermedius，Brettanomyces bruxellensis，Brettanomyces anomalus，Brettanomyces custersianus，Brettanomyces naardenensis，Brettanomyces nanus，Dekkera Bruxellis和Dekkera anomala；Metschnikowia，Issatchenkia，例如Issatchenkia orientalis，Kloeckera，例如Kloeckera apiculata；Aureobasisium，例如Aureobasidium pullulans。
在一个实施方式中，酵母细胞选自Saccharomycetaceae。特别地，用Saccharomyces cerevisiae细胞已获得了良好的结果。已经发现可以在制备醇(乙醇)的方法中使用根据本发明的这种细胞，其中与没有Rubisco和PRK的类似细胞相比，NADH依赖性副产物形成(甘油)减少了约90％，并且期望产物(乙醇)的产率提高了约10％。
Rubisco原则上可选自真核和原核Rubiscos。Rubisco优选来自非光养生物。特别地，Rubisco可以来自化学自养微生物。使用细菌Rubisco已获得了良好的结果。优选地，细菌Rubisco源自Thiobacillus，特别是Thiobacillus denitrificans，其是化学自养的。Rubisco可以是单亚基Rubisco或具有多于一个亚基的Rubisco。特别地，使用单亚基Rubisco已获得了良好的结果。特别地，使用II型Rubisco、更特别地使用CbbM已获得了良好的结果。根据本发明的合适的Rubisco由来自Thiobacillus denitrificans的cbbM基因编码。该Rubisco的替代物是该Rubisco的功能同源物，特别是这样的功能同源物，其包含与来自Thiobacillus denitrificans的cbbM基因具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。表2中给出了合适的天然Rubisco多肽，以及其与来自Thiobacillusdenitrificans的cbbM基因的同一性。
表2：适于表达的天然Rubisco多肽
来源 登录号 最大同一性(％)
Thiobacillus denitrificans AAA99178.2 100
Sideroxydans lithotrophicus ES-1 YP_003522651.1 94
Thiothrix nivea DSM 5205 ZP_10101642.1 91
Halothiobacillus neapolitanus c2 YP_003262978.1 90
Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 YP_002220242.1 88
Rhodoferax ferrireducens T118 YP_522655.1 86
Thiorhodococcus drewsii AZ1 ZP_08824342.1 85
未培养的原核生物 AGE14067.1 82
根据本发明，Rubisco在微生物中功能性表达，至少在用于制备感兴趣的化合物的工业过程期间如此。
为了提高本发明的经转化的(重组)宿主细胞中酶活性以足够水平并以活性形式表达的可能性，优选修改编码这些酶、以及Rubisco酶和本发明的其它酶(参见下文)的核苷酸序列，以将其密码子使用(codon usage)优化为所讨论的宿主细胞的密码子使用。编码酶的核苷酸序列相对于宿主细胞的密码子使用的适应性可被表示为密码子适应指数(CAI)。“密码子适应指数”在本文中被定义为：特定宿主细胞或生物体中一个基因的密码子使用相对高表达基因的密码子使用的相对适应性的度量值。每种密码子的相对适应度(w)指的是对于同一个氨基酸，该密码子相对于最高丰度密码子的使用率。CAI指数被定义为这些相对适应性数值的几何平均数。非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)被排除在外。CAI值在0-1之间，较高的值表示最高丰度的密码子的比例较高(参见Sharp和Li,1987,NucleicAcids Research 15:1281-1295；亦可参见:Jansen等,2003,Nucleic Acids Res.31(8):2242-51)。优选地，经修改的核苷酸序列的CAI为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9。在一个实施方式中，序列已经密码子优化以在所讨论的真菌宿主细胞(例如，S.cerevisiae细胞)中表达。
优选地，功能性表达的Rubisco具有的通过核酮糖-1,5-二磷酸依赖性14C-碳酸氢盐掺入细胞提取物的速率限定的活性为至少1nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，特别地所述活性为至少2nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，更特别地所述活性为至少4nmol.min-1.(mg蛋白质)-1。所述活性的上限并不关键。实际上，所述活性可以为约200nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，特别地25nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，更特别地15nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，例如约10nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低。用于测定该Rubisco活性的试验的条件如实施例中所见。
根据本发明的功能性表达的磷酸核酮糖激酶(PRK，(EC 2.7.1.19))能够催化以下化学反应：
Figure BDA0001902530090000191
因此，该酶的两种底物是ATP和D-核酮糖5-磷酸；其两种产物是ADP和D-核酮糖1,5-二磷酸。
PRK属于转移酶(特别是以醇基作为受体转移含磷基团的那些(磷酸转移酶))家族。该酶种类的系统名称是ATP:D-核酮糖-5-磷酸1-磷酸转移酶。其它常用名包括磷酸戊糖激酶、核酮糖-5-磷酸激酶、磷酸戊糖激酶、磷酸核酮糖激酶(磷酸化)、5-磷酸核酮糖激酶、核酮糖磷酸激酶、PKK、PRuK和PRK。该酶参与碳固定。PRK可以来自原核生物或真核生物。使用源自真核生物的PRK已获得了良好的结果。优选地，真核PRK源自选自Caryophyllales、特别地选自Amaranthaceae、更特别地选自Spinacia的植物。作为来自Spinacia的PRK的替代物，可以存在来自Spinacia的PRK的功能同源物，特别是包含与来自Spinacia的PRK具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的功能同源物。表3中给出了合适的天然PRK多肽。
表3：适于表达的天然PRK多肽以及与来自Spinacia的PRK的同一性
来源 登录号 最大同一性(％)
Spinacia oleracea P09559.1 100
Medicago truncatula XP_003612664.1 88
Arabidopsis thaliana NP_174486.1 87
Vitis vinifera XP_002263724.1 86
Closterium peracerosum BAL03266.1 82
Zea mays NP_001148258.1 78
在一个实施方式中，重组微生物还包含编码一种或多种异源原核或真核分子伴侣的核酸序列，其在表达时能够与微生物中的酶功能性相互作用，特别是与Rubisco和PRK中的至少一种相互作用。
伴侣蛋白是为其它蛋白的正确折叠提供有利条件，从而防止聚集的蛋白。新产生的蛋白质通常必须从线性氨基酸链折叠成三维形式。伴侣蛋白属于帮助蛋白质折叠的一大类分子(被称为分子伴侣)。折叠蛋白的能量由三磷酸腺苷(ATP)提供。Yébenes(2001)；“Chaperonins:two rings for folding”；Hugo Yébenes等,Trends in BiochemicalSciences,2011年8月,第36卷,第8期撰写了关于可用于本文的分子伴侣的综述文章。
在一个实施方式中，一种或多种分子伴侣来自细菌，更优选来自Escherichia，特别是E.coli GroEL，来自E.coli的GroE可特别地在根据本发明的微生物中被编码。在一个实施方式中，分子伴侣是来自Saccharomyces的分子伴侣，特别是Saccharomycescerevisiae Hsp10和Hsp60。如果分子伴侣在诸如线粒体的细胞器中天然表达(实例是Saccharomyces cerevisiae的Hsp60和Hsp10)，则可以实现重新定位到细胞质，例如通过修改分子伴侣的天然信号序列。在真核生物中，Hsp60和Hsp10蛋白在结构上和功能上分别与GroEL和GroES几乎相同。因此，预期来自任何重组酵母细胞的Hsp60和Hsp10均可以用作Rubisco分子伴侣。参见Zeilstra-Ryalls J,Fayet O,Georgopoulos C(1991)."Theuniversally conserved GroE(Hsp60)chaperonins".Annu Rev Microbiol.45:301–25.doi:10.1146/annurev.mi.45.100191.001505.PMID 1683763和Horwich AL,FentonWA,Chapman E,Farr GW(2007)."Two Families of Chaperonin:Physiology andMechanism".Annu Rev Cell Dev Biol.23:115–45.doi:10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123555.PMID 17489689。使用包含异源分子伴侣GroEL和GroES的重组酵母细胞已获得了良好的结果。作为GroES的替代物，可以存在GroES的功能同源物，特别是包含与GroES具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的序列的功能同源物。表4中给出了与GroES同源的合适的天然分子伴侣多肽。
表4：与适于表达的GroES多肽同源的天然分子伴侣
Figure BDA0001902530090000211
Figure BDA0001902530090000221
Figure BDA0001902530090000231
作为GroEL的替代物，可以存在GroEL的功能同源物，特别是包含与GroEL的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的序列的功能同源物。表5中给出了与GroEL同源的合适的天然分子伴侣多肽。
表5：与适于表达的GroEL多肽同源的天然分子伴侣
Figure BDA0001902530090000241
Figure BDA0001902530090000251
Figure BDA0001902530090000261
Figure BDA0001902530090000271
在一个实施方式中，将表4中的10kDa分子伴侣与表4中的同一生物属或种的匹配的60kDa分子伴侣组合以在宿主中表达。例如：>gi|189189366|ref|XP_001931022.1|:71-168 10kDa分子伴侣[Pyrenophora tritici-repentis]与匹配的>gi|189190432|ref|XP_001931555.1|热激蛋白60,线粒体前体[Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP]一起表达。具有相同生物来源的类似地产生的来自表4和表5的所有其它组合也可供本领域技术人员用于表达。此外，可以将表4中来自一种生物的分子伴侣与表5中来自另一种生物的分子伴侣组合，或者可以将GroES与表4中的分子伴侣组合，或者可以将GroEL与表5中的分子伴侣组合。如上所述，本发明还涉及制备有机化合物的方法，该方法包括使用微生物转化碳源，从而形成有机化合物。该方法可以在需氧、限氧或厌氧条件下进行。
特别地，本发明允许NADH依赖性副产物(特别是甘油)的形成减少高达100％、高达99％或高达90％，这是与相应参照菌株中的所述生产相比。与相应的参照菌株相比，NADH依赖性副产物形成优选减少超过10％，特别地至少20％，更特别地至少50％。NADH依赖性副产物产生优选减少10-100％，特别地20-95％，更特别地50-90％。
在一个实施方式中，提供了发酵方法，其中使用Rubisco或能够催化从CO2(和另一种底物)形成有机化合物的另外的酶或催化CO2作为电子受体的功能的另外的酶，且二氧化碳存在于发酵液上方的气体混合物中且/或溶解在发酵液中。在一个具体实施方式中，二氧化碳或其部分由微生物原位形成。
如果期望，该方法还包括向反应体系中加入外部CO2的步骤，通常通过用CO2或含CO2的气体混合物(例如CO2/氮气混合物)通气来进行。如果原位没有形成CO2或形成的CO2不足，则添加外部CO2特别地用于将CO2(增加或)维持在期望的浓度范围内。
作为碳源，原则上可以使用微生物可以用作底物的任何碳源。特别地，可以使用有机碳源，其选自碳水化合物和脂质(包括脂肪酸)。合适的碳水化合物包括单糖、二糖和水解多糖(例如水解淀粉、木质纤维素水解物)。虽然可以存在羧酸，但不必包括羧酸如乙酸作为碳源。
如以下实施例中所示，本发明适用于生产醇，特别是乙醇。然而，预期CO2可在自然状态下不允许这种情况的微生物中用作电子受体的见解对于生产有机分子、特别是相对低分子量的有机分子、特别是分子量低于1000g/mol的有机分子的其它生物技术方法具有工业益处。本文提及以下项目作为根据本发明使用二氧化碳作为电子受体的实施方式。
关于乙醇的生产，当描述包含PRK和Rubisco的酵母细胞以及在实施例中时，可在上文中找到细节。优选通过发酵方法生产乙醇或其它醇。
对于一些有机酸(羧酸盐/酯)例如柠檬酸的生产，有氧方法是可用的。对于柠檬酸生产，可以使用例如Aspergillus niger、Yarrowia lipolytica或其它已知的产柠檬酸盐/酯的生物。
优选厌氧生产的有机酸的实例是乳酸。已被工程改造用于乳酸生产的各种产乳酸的细菌菌株和酵母菌株通常是本领域已知的。现在更详细地描述本发明的其它实施方式。
在一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的重组酵母细胞在生物燃料工业中的发酵中的用途。重组酵母细胞可以含有对于重组酵母细胞而言非天然的且/或允许重组酵母细胞转化一种或多种戊糖的戊糖代谢通路的基因。在一个实施方式中，重组酵母细胞可包含一种或多种木糖异构酶的一个或两个或更多个拷贝和/或一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的一个或两个或更多个拷贝，从而允许重组酵母细胞转化木糖。在其一个实施方式中，这些基因可被整合到重组酵母细胞基因组中。在另一个实施方式中，重组酵母细胞包含araA、araB和araD基因。然后其能够发酵阿拉伯糖。在本发明的一个实施方式中，重组酵母细胞包含xylA基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1基因，以允许重组酵母细胞发酵木糖；醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失；和/或GAL2的过表达和/或GAL80的缺失。因此，尽管包含上述基因，可以在重组酵母细胞中引入(野生型)重组酵母细胞中非天然的合适的戊糖或其它代谢通路。根据一个实施方式，以下基因可通过引入宿主细胞中而被引入重组酵母细胞中：
1)由PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1组成的组，所述PPP基因任选地受强组成型启动子的控制；
2)由受强组成型启动子控制的xylA基因组成的组；
3)包含受强组成型启动子控制的XKS1基因的组，
4)由受强组成型启动子控制的基因araA、araB和araD组成的组，
5)醛糖还原酶基因的缺失。
可以使用已知的重组表达技术构建上述细胞。辅因子修饰可以在修饰1)至5)中的任何之前、同时或之后进行。可以使根据本发明的重组酵母细胞经受进化工程以改善其性质。进化工程方法是已知的方法。进化工程是这样的方法，其中可以通过合理设置的自然选择过程使微生物(在本文中是重组酵母细胞)的工业相关表型与特定生长速率和/或对营养物的亲和力偶联。例如，Kuijper,M等,FEMS,Eukaryotic cell Research 5(2005)925-934、WO2008/041840和WO2009/112472中详细描述了进化工程。在进化工程之后，分离所得的发酵戊糖的重组酵母细胞。分离可以以任何已知的方式进行，例如，通过从进化工程中使用的重组酵母细胞培养液中分离细胞，例如通过取细胞样品或通过过滤或离心。
在一个实施方式中，重组酵母细胞不含标记物。在本文中使用时，术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，其允许选择或筛选含有该标记物的宿主细胞。不含标记物意指重组酵母细胞中基本上不存在标记物。当抗生素标记物已用于构建重组酵母细胞并随后被除去时，不含标记物是特别有利的。标记物的去除可以使用任何合适的现有技术(例如，分子内重组)进行。
在一个实施方式中，基于抑制剂耐受性宿主细胞构建工业重组酵母细胞，其中构建如下文所述进行。可以通过筛选菌株在含有抑制剂的材料上的生长来选择抑制剂耐受性宿主细胞，如Kadar等,Appl.Biochem.Biotechnol.(2007),第136-140卷,847-858中所述，其中选择了抑制剂耐受性S.cerevisiae菌株ATCC 26602。
重组酵母细胞还可包含将丙酮酸盐/酯转化为期望的发酵产物所需的那些酶活性，所述发酵产物例如乙醇、丁醇(例如正丁醇、2-丁醇和异丁醇)、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。
在一个实施方式中，重组酵母细胞来源于工业重组酵母细胞。工业细胞和工业重组酵母细胞可以如下定义。(重组酵母细胞)细胞在工业过程中的生存环境与在实验室中的生存环境显著不同。工业重组酵母细胞必须能够在多种环境条件下表现良好，所述环境条件在所述过程中可能会变化。这些变化包括营养源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等的变化，它们一起对Saccharomyces cerevisiae的细胞生长和乙醇生产具有潜在影响。在不利的工业条件下，环境耐受菌株应该允许稳健的生长和生产。工业重组酵母细胞菌株通常对于使用其的应用中(例如烘焙工业、酿造工业、酿酒和生物燃料乙醇工业中)可能发生的这些环境条件变化更稳健。在一个实施方式中，基于工业宿主细胞构建工业重组酵母细胞，其中构建如下文所述进行。工业酵母细胞(S.cerevisiae)的实例有Ethanol
Figure BDA0001902530090000301
(Fermentis)、
Figure BDA0001902530090000311
(DSM)和
Figure BDA0001902530090000312
(Lallemand)。
根据本发明的重组酵母细胞优选是抑制剂耐受的，即它们能经得起在使用常见预处理和水解条件时典型水平的常见抑制剂，使得重组酵母细胞能够具有广泛的应用，即其具有针对不同原料、不同预处理方法和不同水解条件的高应用性。在一种实施方式中，重组酵母细胞是抑制剂耐受的。抑制剂耐受是对抑制性化合物的抗性。木质纤维素中抑制性化合物的存在和水平可随着原料、预处理方法、水解过程的变化而广泛改变。抑制剂类别的例子是羧酸、呋喃和/或酚类化合物。羧酸的例子是乳酸、乙酸或甲酸。呋喃的例子是糠醛和羟基-甲基糠醛。酚类化合物的例子是香草醛(vannilin)、丁香酸、阿魏酸和香豆酸。抑制剂的典型用量对于羧酸而言是每升若干克到每升20克或更多，取决于原料、预处理和水解条件。对呋喃而言是每升数百毫克到每升数克，取决于原料、预处理和水解条件。对酚类而言是每升数十毫克到每升一克，取决于原料、预处理和水解条件。
在一个实施方式中，重组酵母细胞是天然能够进行醇性发酵、优选地能够进行厌氧醇性发酵的细胞。重组酵母细胞优选地具有对乙醇的高度耐受，对低pH(即能够在低于约5、约4、约3、或约2.5的pH下生长)和对有机酸的高度耐受，和/或对提高的温度的高度耐受。
在一个实施方式中，本发明的重组酵母的磷酸戊糖通路的非氧化分支的一个或多个基因被过表达，且/或甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因被缺失或破坏。在另一个实施方式中，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因被缺失或破坏。在另一个实施方式中，本发明的重组酵母的磷酸戊糖通路的非氧化分支的一个或多个基因被过表达，并且甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因被缺失或破坏。GPD基因可以是GPD1和/或GPD2基因。GPD1和GPD2基因都可以被缺失或破坏，但优选GPD2而不是GPD1被缺失或破坏。GPD基因编码具有至少EC号1.1.1.8的酶。WO2011/010923描述了缺失或破坏甘油-3-磷酸脱氢酶的方法。在一个实施方式中，过表达的磷酸戊糖通路的一个或多个基因编码选自转醛酶(EC 2.2.1.2)、转酮醇酶(EC2.2.1.1)、核糖-5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)和D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶(EC5.1.3.1)的酶。在另一个实施方式中，过表达的磷酸戊糖通路的一个或多个基因选自TAL1、TAL2、NQM1、TKL1、TKL2、RPE1和RKI1。
本发明还涉及在生物燃料工业中使用如本文所述的重组酵母细胞发酵底物以生产发酵产物的方法，其中甘油产率比使用相应的野生型重组酵母细胞的方法低至少5％、至少10％或至少10％、至少20％或至少30％。在这种方法的一个实施方式中，与使用相应的野生型重组酵母细胞的方法相比，乙醇产率没有提高或降低了。
重组酵母细胞的任何上述特征或活性可天然存在于细胞中，或可通过遗传修饰被引入或修饰。
重组表达
重组酵母细胞是重组细胞。也就是说，重组酵母细胞包含不天然地存在于所讨论的细胞中的核苷酸序列，或用所述核苷酸序列转化，或用所述核苷酸序列遗传修饰。用于在细胞中重组表达酶以及用于对重组酵母细胞进行其他遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。通常，此类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。此类方法例如从标准手册中获知，例如Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press或者F.Ausubel等人编,"Current protocols in molecular biology",Green Publishing andWiley Interscience,New York(1987)。转化和遗传修饰真菌宿主细胞的方法从例如EP-A-0635574、WO 98/46772、WO 99/60102、WO00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US6,265,186中获知。
生物制品生产
许多年来，已经建议引入多种生物体用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的重组酵母细胞作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度的酸、乙醇和渗透耐性，厌氧生长的能力，以及当然其高的醇性发酵能力。在一个实施方式中，作为宿主细胞的重组酵母细胞物种包括S.cerevisiae、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或K.fragilis。重组酵母细胞可以是适合生产乙醇的细胞。然而，重组酵母细胞可适用于生产除乙醇以外的发酵产物。这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如重组酵母细胞或丝状真菌生产的任何大宗化学品(bulk chemical)或精细化学品。
在一个实施方式中，用于生产非乙醇发酵产物的重组酵母细胞是下述宿主细胞，所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性的遗传修饰。
木质纤维素
可以被认为是潜在的可再生原料的木质纤维素通常包含多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用的不同酶的作用下。另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。
预处理
在酶处理之前，可对木质纤维素材料进行预处理。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械击打、粉碎、研磨或快速降压，或其中任何两种或更多种的组合。这种化学预处理通常与热预处理(例如150-220℃之间1到30分钟)组合。
酶促水解
通常使预处理的材料经受酶促水解以释放可根据本发明被发酵的糖。这可用常规方法进行，所述常规方法例如与纤维素酶，例如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和任选地其他酶接触。可在环境温度或更高温度下，在释放足够量的糖的反应时间下，进行利用纤维素酶的转化。酶促水解的结果是在本文中被命名为糖组合物的包含C5/C6糖的水解产物。
糖组合物
根据本发明使用的糖组合物包含葡萄糖以及一种或更多种戊糖，例如阿拉伯糖和/或木糖。在本发明中可以使用满足这些标准的任何糖组合物。糖组合物中任选的糖是半乳糖和甘露糖。在一种实施方式中，糖组合物是一种或更多种木质纤维素材料的水解物。此处木质纤维素包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可存在于以下列表中：果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，柳枝稷，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海草，树木，软木材，硬木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米棒，玉米粒，来自谷粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多种的组合。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖向发酵产物的转化具有巨大的经济重要性。甘露糖也在一些木质纤维素材料中存在，其通常比上述提到的糖以较低的量存在。因而甘露糖也被重组酵母细胞转化是有利的。预期可进一步操作处理本发明的重组酵母细胞，以实现其他期望的特征或甚至更高的总乙醇产率。通过在含有水解物的培养基上对重组酵母细胞传代选择改进的重组酵母细胞已导致具有增强的发酵率的改进的重组酵母细胞。使用本发明的教导，人们可容易地得到此类改进的菌株。含有戊糖的材料表示不管是液体还是固体的包含戊糖的任何基质。合适的含戊糖的材料包括木质纤维素生物质，比如玉米壳、木材、纸、农业副产物等等或多糖的水解物。
本文中使用的“水解物”表示已通过添加水被解聚而形成单糖和寡糖的多糖。通过含多糖的材料的酶促水解或酸水解，可产生水解物。
优选地，重组酵母细胞能在与工业戊糖来源中发现的那些条件类似的条件下生长。当含有戊糖的材料可用重组酵母细胞变体接种而没有过多的操作时，本发明的方法是最经济的。例如，制浆工业产生大量的纤维素废物。通过酸水解对纤维素糖化产生可用在发酵反应中的己糖和戊糖。但是，水解物或亚硫酸盐液含有天然存在于木材中的高浓度的亚硫酸盐和酚类抑制剂，所述抑制剂抑制或防止大多数生物生长。下文的例子描述了通过本发明的重组酵母细胞的硬木材和软木材的酸水解物(亚硫酸盐废液)中的戊糖的发酵。可以合理地预期：能在亚硫酸盐废液中生长的重组酵母细胞菌株预计在几乎任何其他生物质水解物中生长。
增殖
本发明还涉及有氧增殖重组酵母细胞的方法，特别是有氧增殖重组酵母细胞菌株的方法。本文中的增殖是导致起始重组酵母细胞群体增加的任何重组酵母细胞生长的方法。增殖的主要目的是利用重组酵母细胞作为活的生物体的自然繁殖能力来增加重组酵母细胞群体。可存在其它的增殖原因，例如，如果使用干重组酵母细胞，那么在使重组酵母细胞生长之前，利用增殖来使酵母再水化和适应。新鲜重组酵母细胞(活性干重组酵母细胞或湿饼(wet cake))可被加入以直接启动增殖。增殖条件对最佳的重组酵母细胞生产和随后的发酵(例如将木质纤维素水解物发酵为乙醇)很关键。它们包括适当的碳源、通气、温度和营养添加。增殖罐的尺寸通常在(木质纤维素水解物向乙醇)发酵器尺寸的2％和5％之间。在增殖过程中，重组酵母细胞需要碳源。在本文中，碳源可以包含甘油、乙醇、乙酸盐/酯和/或糖(C6和C5糖)。也可以使用其他碳源。细胞壁生物合成以及蛋白质和能量的生产需要碳源。增殖是有氧过程，因此增殖罐必须适当通气以维持一定水平的溶氧。通常通过在进入增殖罐的管道上安装空气引导器来实现适当的通气，所述引导器在增殖罐填充时和循环期间将空气引入增殖混合物中。增殖混合物保持溶氧的能力是加入空气的量和混合物的稠度的函数，这就是为什么经常以50:50至90:10之间的糊状物与水的比值加入水。“粘稠的”增殖混合物(80:20的糊状物与水的比值以及更高)经常需要加入压缩空气以弥补降低的保持溶氧的能力。增殖混合物中溶氧的量还是气泡大小的函数，因此一些乙醇工厂通过喷洒器加入空气，所述喷洒器与空气引导器相比产生较小气泡。伴随较低的葡萄糖，适当通气对促进有氧呼吸很重要，这与发酵的相对厌氧环境不同。通气不足或高葡萄糖浓度的一个标志是增殖罐中增加的乙醇生产。通常在增殖期间，重组酵母细胞需要舒适的温度来生长和代谢，例如增殖反应器中的温度在25-40℃之间。较低温度通常导致较慢的代谢和减少的增殖，而较高温度能够引起压力化合物(stress compounds)的产生和减少的增殖。在一种实施方式中，增殖罐在室内并被保护不受盛夏或寒冬温度的伤害，因此维持在30-35℃范围内之间的最适温度通常不是难题。可以在重组酵母细胞增殖正常进行时进行进一步增殖。
发酵
本发明提供了根据本发明的重组酵母细胞的发酵方法，例如，乙醇，其在生物燃料工业中是有利的。
在一个实施方式中，根据本发明的重组酵母细胞可以是发酵戊糖和葡萄糖的重组酵母细胞，包括但不限于能够同时厌氧消耗戊糖和葡萄糖的所述细胞。在该方法的一个实施方式中，含戊糖的材料包含木质纤维素材料的水解物。水解物可以是木质纤维素材料的酶促水解物。
发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为这样的发酵方法，其在不存在氧时运行，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出)，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能够被氧化性磷酸化反应氧化。为了解决这一问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD+。
因此，在厌氧发酵方法的一个实施方式中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并且被还原成发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸和乙烯。
发酵方法优选地在对细胞而言最适的温度下进行。因此，对大部分重组酵母细胞而言，发酵方法在低于约50℃、低于约42℃或低于约38℃的温度下进行。对重组酵母细胞或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28℃的温度且高于约20、约22或约25℃的温度下进行。
在所述方法中，基于木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％或约98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比。
本发明还提供了用于生产发酵产物的方法。根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。在一种实施方式中，所述方法在微需气(micro-aerophilic)或氧受限的条件下进行。厌氧发酵方法在本文中被定义为这样的发酵方法，其在不存在氧时进行，或其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。氧受限的发酵方法是下述方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少约5.5、更优选地至少约6、如至少7mmol/L/h。本发明的方法可包括发酵产物的回收。在所述方法的一个实施方式中，细胞发酵木糖以及葡萄糖二者，优选地同时发酵，在这种情况下优选地使用下述细胞，所述细胞对葡萄糖阻遏不敏感从而防止二次生长(diauxic growth)。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外，发酵培养基还会包含细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如重组酵母细胞)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。发酵方法可以以分批、补料分批或连续的方式进行。也可以使用分离水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。也可以使用这些发酵方法模式的组合用于最佳生产力。这些方法在下文更详细地描述。
SSF模式
对同时糖化和发酵(SSF)的模式而言，液化/水解或预糖化步骤的反应时间取决于实现期望产率(即纤维素向葡萄糖的转化产率)的时间。这类产率优选地尽可能高，优选地为60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，甚至99.5％或更多或99.9％或更多。根据本发明，在SHF模式下实现了非常高的糖浓度，在SSF模式下实现了非常高的产物浓度(例如乙醇)。在SHF操作中，葡萄糖浓度是25g/L或更高，30g/L或更高，35g/L或更高，40g/L或更高，45g/L或更高，50g/L或更高，55g/L或更高，60g/L或更高，65g/L或更高，70g/L或更高，75g/L或更高，80g/L或更高，85g/L或更高，90g/L或更高，95g/L或更高，100g/L或更高，110g/L或更高，120g/L或更高，或者可以例如是25g/L-250g/L，30gl/L-200g/L，40g/L-200g/L，50g/L-200g/L，60g/L-200g/L，70g/L-200g/L，80g/L-200g/L，90g/L-200g/L。
SSF模式中的产物浓度
在SSF操作中，产物浓度(g/L)取决于生产的葡萄糖量，但因为在SSF中糖被转化成产物，所以这是不可见的，并且产物浓度可以通过与理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps最大)相乘而与潜在的葡萄糖浓度相关。发酵产物的理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps最大)可源自生物化学教科书。对乙醇而言，1摩尔葡萄糖(180gr)根据重组酵母细胞中正常的糖酵解发酵途径产生2摩尔乙醇(＝2x46＝92gr乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511gr乙醇/gr葡萄糖。对正丁醇(MW 74gr/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps最大＝74/180＝0.411gr(异)丁醇/gr葡萄糖。对乳酸而言，纯乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90gr/摩尔)。根据所述化学计量法，Yps最大＝1gr乳酸/gr葡萄糖。可以对C5/C6发酵进行类似的计算，其中除葡萄糖外还包括戊糖，例如木糖和/或阿拉伯糖。对其他发酵产物而言，可以进行类似的计算。
SSF模式
在SSF操作中，产物浓度为25g*Yps g/L/L或更高，30*Yps g/L或更高，35g*Yps/L或更高，40*Yps g/L或更高，45*Yps g/L或更高，50*Yps g/L或更高，55*Yps g/L或更高，60*Yps g/L或更高，65*Yps g/L或更高，70*Yps g/L或更高，75*Yps g/L或更高，80*Yps g/L或更高，85*Yps g/L或更高，90*Yps g/L或更高，95*Yps g/L或更高，100*Yps g/L或更高，110*Yps g/L或更高，120g/L*Yps或更高，或者可以例如是25*Yps g/L-250*Yps g/L，30*Yps gl/L-200*Yps g/L，40*Yps g/L-200*Yps g/L，50*Yps g/L-200*Yps g/L，60*Yps g/L-200*Yps g/L，70*Yps g/L-200*Yps g/L，80*Yps g/L-200*Yps g/L，90*Yps g/L，80*Ypsg/L-200*Yps g/L。因此，本发明提供了用于制备发酵产物的方法，所述方法包括：
a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；和
b.发酵所得到的材料，
从而制备发酵产物。
发酵产物
本发明的发酵产物可以是任何有用的产物。在一种实施方式中，其为选自以下的产物：乙醇，正丁醇，2-丁醇，异丁醇，乳酸，3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，衣康酸，马来酸，柠檬酸，己二酸，氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，1,3-丙二醇，乙烯，甘油，β-内酰胺抗生素和头孢菌素，维生素，药物，动物饲料补充剂，特种化学品，化学原料，塑料，溶剂，燃料包括生物燃料和沼气或有机聚合物，和工业酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。
发酵产物的回收
对发酵产物的回收而言，使用现有的技术。对不同的发酵产物而言，适用不同的回收方法。现有的从水性混合物中回收乙醇的方法通常使用分级和吸附技术。例如，可以使用发酵醪蒸馏器(beer still)加工在水性混合物中含有乙醇的发酵产物，以生产富集的含有乙醇的混合物，所述富集的含有乙醇的混合物随后进行分级(例如分级分馏或其他类似的技术)。接着，含有最高浓度乙醇的级分可以经过吸附剂，从乙醇中去除大部分(如果不是所有的话)剩余的水。在一个实施方式中，除了回收发酵产物之外，可以重复利用酵母。以下非限制性实施例旨在仅仅是示例性的。
实施例
实施例1：在来自CEN.PK谱系的表达Rubisco的菌株中表达DAN1p-prk维持菌株
在本实施例中使用源自CEN.PK谱系的菌株(表6)[1,2]。使培养物在补充有20g L-1葡萄糖的合成培养基[3]中增殖。在补充有100μg mL-1氨苄青霉素或50μg mL-1卡那霉素的LB培养基(5g L-1Bacto酵母提取物、10g L-1Bacto胰蛋白胨、5g L-1NaCl)中进行E.coliDH5a原种培养物的增殖。通过向生长的培养物中加入甘油(30％v/v终浓度)并随后在-80℃下储存来制备冷冻原种。
表6.本实施例中使用的S.cerevisiae菌株
Figure BDA0001902530090000411
质粒和盒构建
表7中给出了本实施例中使用的质粒列表。使用CRISPR/Cas9基因组编辑在所有构建的菌株中进行遗传修饰[5]。使用公众可得的列表鉴定靶向GPD1、GPD2、SGA1或X-2的独特CRISPR/Cas9序列[5]。为了进行GPD1和GPD2的无标记物缺失，构建了质粒pUDR240。使用引物组合5793-5793(双重结合)并使用pROS10作为模板来PCR扩增质粒骨架。使用引物组合6965-6966并使用质粒pROS10作为模板，获得了含有编码靶向GPD1和GPD2的独特20-bpgRNA序列的表达盒的质粒插入物。为了进行基因盒的无标记物基因组整合，构建了表达靶向SGA1基因座或基因间区域X-2的独特gRNA的质粒[6]。使用引物组合5792-5980并分别使用质粒pMEL11和pMEL10作为模板，通过PCR扩增获得了puDR119和pURD164的质粒骨架。对于SGA1使用引物组合5979-7023，对于X-2使用引物组合5979-7374，并分别使用质粒pMEL11和pMEL10作为模板，通过PCR扩增获得了含有编码分别靶向SGA1和X-2的独特20-bp gRNA序列的表达盒的pUDR119和pUDR164的质粒插入物。根据制造商的指南，在所有情况下均使用
Figure BDA0001902530090000412
Hot Start II高保真DNA聚合酶(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)构建质粒和表达盒。按照供应商的指南，使用Gibson
Figure BDA0001902530090000413
克隆试剂盒(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)在体外进行质粒pUDR119、pUDR164和pUDR240的组装。存在于PCR扩增的质粒骨架和插入物的5'端和3'端的同源序列使得能够实现组装。在每种情况下，使用1ul Gibson-组装混合物通过电穿孔进行E.coli DH5a转化，电穿孔在Gene PulserXcellElectroporation System(Biorad,Hercules,CA,USA)中进行。通过诊断PCR(
Figure BDA0001902530090000421
Thermo Scientific)或限制性消化确认质粒的正确组装。使用Sigma GenElute Plasmid试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)从经转化的E.coli培养物中分离构建的质粒pUDR119、pUDR164和pUDR240，并用于转化S.cerevisiae。
使用质粒pBTWW002作为模板，并使用引物组合7549-7550，通过PCR扩增获得cbbM的酵母表达盒。按照供应商的流程将所得片段连接到pJET/1.2平端载体(Thermo-Scientific)上并克隆到E.coli中。使用引物组合7074-7075(与prk、groES、groEL一起在SGA1基因座整合)、7548-6285、6280-6273、6281-6270、6282-6271、6284-6272、6283-6275、6287-6276、6288-6277、6289-7075(在SGA1基因座多重cbbM拷贝整合)，将所得质粒用作PCR模板以生成整合cbbM盒。除了在片段的5’端和3’端存在的不同悬突以允许体内同源重组之外，cbbM表达盒在遗传上是相同的。使用质粒pUD232和pUD233作为模板，并分别使用引物组合7076-7077和7078-7079，获得groEL和groES的酵母表达盒。分别使用引物组合7082-7083、7292-7294、7293-7295和7930-7931并使用IMX585的基因组DNA作为模板进行PCR扩增而获得对应于LYS1、UBC6、YEN1的组成型启动子和DAN1的厌氧活性启动子[7]的基因组序列。在于X-2基因座整合的情况下，引物组合7933-7295被用于扩增YEN1启动子区域。使用IMX585的基因组DNA作为模板，并使用引物组合7084-7085(与cbbM、groES、groEL一起在SGA1基因座整合)和7084-7934(在X-2基因座单独整合prk)，通过PCR扩增获得了PGK1的终止子。使用引物组合7080-7081(LYS1p盒构建)、7296-7081(UBC6p盒构建体)、7297-7081(YEN1p盒构建体)、7932-7081(DAN1p盒构建体)，并使用质粒pUDE046作为模板，通过PCR扩增获得了prk的ORF。各种引物组合导致prk-ORF片段，其具有与不同启动子序列和PGK1终止子同源的悬突。在于菌株IMX675的SGA1基因座目标整合(连同KlURA3片段、cbbM盒和groEL、groES分子伴侣一起)的情况下，通过分别组合作为模板的各自的启动子/prk/PGK1t片段以及引物组合7082-7085、7292-7085和7293-7085，使用融合PCR在体外组装表达盒LYS1p-prk-PGK1t、UBC6p-prk-PGK1t和YEN1p-prk-PGK1t。当单独整合prk盒(在X-2基因座整合)时，在转化到酵母中后通过体内同源重组组装完整的表达盒(YEN1p-prk-PGK1t和DAN1p-prk-PGK1t)，并通过诊断PCR验证正确的组装。使用质粒pUG72作为模板，使用引物组合7086-7087以获得KlURA3片段。
表7.本实施例中使用的质粒
名称 特征 来源
p426-TEF 2μm ori,URA3,空载体 [8]
pUG72 KlURA3,PCR模板 [9]
pMEL10 2μm ori,URA3,SNR52p-gRNA.CAN1-SUP4t [4]
pMEL11 2μm ori,amdS,SNR52p-gRNA.CAN1-SUP4t [4]
pROS10 URA3,gRNA.CAN1-2μm ori-gRNA.ADE2 [4]
pUD232 递送载体,TEF1p-groEL-ACT1t [10]
pUD233 递送载体,TPI1p-groES-PGI1t [10]
pUDE046 2μm ori,GAL1p-prk-CYC1t [10]
pBTWW002 2μm ori,URA3,TDH3p-cbbM-CYC1t [10]
pUDR119 2μm ori,amdS,SNR52p-gRNA.SGA1-SUP4t 本实施例
pUDR164 2μm ori,URA3,SNR52p-gRNA.X-2-SUP4t 本实施例
pUDR240 URA3,gRNA.GPD1-2μm ori-gRNA.GPD2 本实施例
菌株构建
乙酸锂转化方案被用于酵母转化[11]。将转化混合物涂布在合成培养基琼脂板[3](2％Bacto琼脂,BD,Franklin Lakes,NJ,USA)上，在用puDR164和pUDR240进行转化的情况下，琼脂板补充有20g L-1葡萄糖。在用质粒pUDR119进行的转化中，如前所述制备琼脂板[12]。为了构建菌株IMX765，将尿嘧啶另外补充到琼脂板(150mg L-1)(Sigma-Aldrich)中。在每种情况下，通过诊断菌落PCR进行期望基因型的确认。利用5-氟乳清酸(ZymoResearch,Irvine,CA,USA)反选择，按照供应商的指南，进行pUDR240的重复利用。如前所述进行pUDR119的重复利用[12]。通过(在从正确突变体重复利用质粒后)将表达双gRNA的靶向GPD1/GPD2的质粒pUDR240和修复寡核苷酸组合6967-6968和6969-6970共转化到表达Cas9的菌株IMX581中来构建菌株IMX675。将表达盒LYS1p-prk-PGK1t、UBC6p-prk-PGK1t和YEN1p-prk-PGK1t分别与单拷贝的cbbM盒、groEL、groES、URA3片段和表达gRNA的靶向SGA1的质粒pUDR119一起共转化到菌株IMX675中。存在于分子的5’端和3’端的悬突被设计为允许通路在SGA1基因座中的完整组装。通过(在从正确突变体重复利用质粒后)将pUDR119、9个拷贝的cbbM表达盒以及groEL和groES的表达盒共转化到IMX581中获得了菌株IMX765。存在于分子的5’端和3’端的悬突允许整个构建体(11个片段)的体内组装以及在SGA1基因座的整合。通过用表达gRNA的靶向X-2的质粒pUDR164和DAN1p、prk ORF、PGK1t片段转化菌株IMX765获得了菌株IMX774，所述片段在体内组装成完整构建体并随后整合在X-2基因座。通过用pUDR164和YEN1p、prk ORF、PGK1t片段转化菌株IMX765获得了菌株IMX773，所述片段在体内类似地组装并随后整合在X-2基因座。通过用空载体p426-TEF转化IMX581获得了对照菌株IME324。
培养基和分析方法
在具有1-L工作体积的2-L生物反应器(Applikon,Delft,The Netherlands)中的厌氧分批培养中进行S.cerevisiae菌株的生理学表征。通过在120℃下高压灭菌20分钟对盐溶液进行灭菌。将葡萄糖溶液在110℃下单独高压灭菌20分钟，随后加入无菌盐溶液中。所有发酵均在合成培养基[3](20g L-1glucose葡萄糖)中进行，该培养基补充有厌氧生长因子麦角甾醇(10mg L-1)和吐温80(420mg L-1)的无菌溶液，以及0.2g L-1无菌消泡剂C(Sigma-Aldrich)。通过以0.5L min-1的速率喷射N2/CO2(90％/10％,<10ppm氧)的气体混合物来维持厌氧条件，并通过自动添加2M KOH将培养物pH维持在5。所有培养均在800rpm的搅拌速度和30℃的温度下进行。通过为生物反应器配备Norprene管和Viton O形环，使生物反应器中的氧扩散最小化。在含有100mL合成培养基(20g L-1葡萄糖)的500mL烧瓶中有氧地进行预培养物摇瓶培养。通过加入KOH将初始烧瓶pH调节至6。使培养物在30℃下生长并以200rpm摇动。在每种情况下，从冷冻的S.cerevisiae原种培养物中接种预培养烧瓶。孵育8-12小时后，将来自这些烧瓶的培养物用于接种新鲜的预培养烧瓶以用于生物反应器接种物增殖。将生物反应器接种至起始OD660为约0.2。如前所述进行生物反应器实验中的废气分析、生物质干重测量、培养物上清液的HPLC分析和针对乙醇蒸发的校正[13]。使用LibraS11分光光度计(Biochrom,Cambridge,UK)在660nm处测定光密度。如前所述，从在中指数期采集的样品(最少5个样品)计算每种培养中产物的产率[14]。为了计算所进行的发酵中的还原程度(电子)平衡，使用了关于生物质、CO2、NH4 +和细胞外代谢物(葡萄糖、乙醇、甘油、琥珀酸盐/酯、丙酮酸盐/酯、乳酸盐/酯、乙酸盐/酯)报告的还原程度值[15]。为了测定PRK的体外酶活性，收获来自合成培养基中指数生长的厌氧摇瓶培养物的细胞，并如前所述制备无细胞提取物[16]。收获和超声缓冲液含有100mM Tris-HCl、20mM MgCl2·6H2O和5mM DTT(pH 8.2)。在1ml总体积中，PRK试验含有50mM Tris-HCl(pH 8.2)、40mM KCl、10mM MgCl2·6H2O、0.15mM NADH、1mM ATP、3mM磷酸烯醇丙酮酸盐/酯、1mM 1,4-二硫苏糖醇、5U丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)、6U L-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)和30μl、50μl或100μl无细胞提取物。通过加入D-核酮糖-5-磷酸(2.5mM终浓度)开始反应，并通过在340nm下随时间监测NADH氧化，在Hitachi 100-60分光光度计上在30℃下测量PRK活性。如前所述(Lowrey蛋白质试验)进行无细胞提取物中的蛋白质含量测定[17]。
菌株的生理学表征
先前已显示cbbM和prk在S.cerevisiae中的表达导致在与工业乙醇生产相关的厌氧条件下副产物甘油的形成减少[10]。然而，在该先前研究中，prk在半乳糖诱导型GAL1-启动子的控制下表达。对存在半乳糖和低水平葡萄糖的要求是使用该启动子的缺点。本实施例研究了共表达Rubisco的菌株中受不同启动子控制的prk的表达。基于具有不同表达强度的三种组成型启动子序列(其中LYS1p最强，YEN1p最弱)以及仅在厌氧条件下有活性的弱启动子(DAN1p)构建表达盒[7]。首先，根据[10]，用受LYS1p、UBC6p和YEN1p控制的prk盒和cbbM、groEL、groES的拷贝进行转化。在使用LYS1p-prk-PGK1t盒的情况下，不可能获得正确的突变体菌落。在使用UBC6p-prk-PGK1t的情况下，获得了菌落但生长不一致并受到严重影响，未获得稳定的菌株，参见表9。然而，在YEN1p-prk-PGK1t(检测到的最弱组成型启动子)的情况下，有可能获得正确的突变体菌落(表9)。这些结果可能指示，在有氧条件下S.cerevisiae中prk的高组成型表达和中等组成型表达(生物质增殖期)导致抑制作用，并且与文献中可获得的数据一致[10]。基于上述，构建表达多拷贝cbbM的菌株，其中prk受YEN1p的控制(IMX773，低prk表达菌株)。另外，构建了这样的菌株，其中使用了DAN1p-prk-PGK1t盒代替。DAN1的启动子(或任何其它类似的启动子)特别令人感兴趣，因为它在生物乙醇生产的工艺条件(在这种情况下为厌氧条件)中具有活性，并且不需要使用特定的碳源(像GAL1p那样)或对常用生产工艺进行任何其它改变。该启动子(或任何其它类似的启动子)应在有氧条件下(无转录)减轻prk表达的毒性。该菌株被命名为IMX774(高prk表达菌株)。图1显示了在含有20g L-1葡萄糖的合成培养基上指数生长的摇瓶培养物的无细胞提取物中的PRK活性。左：IME324，右：IMX774。为了确定DAN1的启动子是否能够驱动S.cerevisiae中prk的表达，使用菌株IME324(参照)和IMX774(9*cbbM,DAN1p-prk)的厌氧生长培养物的无细胞提取物在体外进行PRK酶活性测定。IMX774中的PRK活性为约0.8μmol(mg蛋白质)-1min-1(图1)。为了定量分析引入的Rubisco通路的表达的影响，在生物反应器中的基于葡萄糖生长的厌氧分批培养物中比较菌株IME324(参照)、IMX773(9*cbbM,YEN1p-prk)和IMX774(9*cbbM,DAN1p-prk)。工程菌株IMX773和IMX774分别以参照菌株IME324的比生长速率的82％和61％生长。菌株IMX773和IMX774的基于葡萄糖的甘油产率分别为0.098g/g和0.058g/g。这对应于：与IME324相比，IMX773的甘油产率为96％，表明其中prk在弱组成型启动子YEN1p的控制下表达的设计中Rubisco通路的影响有限(表8)。相比之下，对于IMX774，观察到与参照菌株IME324相比甘油产率降低43％(表8，图2)。此外，与参照菌株相比，菌株IMX774的甘油产量/g形成的生物质的比值降低了41％，而对于IMX773，该比值维持在IME324水平的97％，从而指示效果有限。当NAD+通过Rubisco通路再生时，可以预期甘油产量的降低。因此，这些发现与其它地方关于基于半乳糖生长的表达Rubisco的菌株报道的结果一致[10]，并显示：当prk在DAN1的启动子控制下表达但不在弱组成型启动子如YEN1p的控制下表达时，该通路对基于半乳糖生长的培养物的影响可以在基于葡萄糖生长的培养物中复制。甚至，IMX765中在更强的组成型启动子控制下的prk表达甚至不产生活菌落，从而指示这些prk特异性表达盒的转化导致细胞毒性。菌株IME324和IMX774显示基于葡萄糖的乙醇产率分别为0.356g/g和0.409g/g(针对蒸发进行校正)。这意味着甘油产量的降低、经由Rubisco通路的CO2固定和工程化的表达Rubisco的菌株IMX774的生物质产率的降低的组合(图2)导致：在本实施例中进行的实验中，基于葡萄糖的乙醇产率提高约14％。
表8.S.cerevisiae菌株IME324、IMX773和IM3X774的厌氧生物反应器分批培养物中的最大比生长速率(μ)，基于葡萄糖的甘油、生物质和乙醇的产率(Y)以及甘油形成与生物质形成的比值。
Figure BDA0001902530090000471
*对于独立重复培养的每个单独实验给出还原度平衡。在指数取样阶段计算平衡。给出了取样点上的平衡的平均值和标准偏差值。
使培养物在含有20g L-1葡萄糖的合成培养基(pH 5)上生长，并用N2/CO2(90％/10％)的气体混合物喷射。从指数生长期计算产率和比值。针对蒸发校正基于葡萄糖的乙醇产率。值表示来自独立重复培养的数据的平均值和平均偏差。
表9.需氧生长性质和甘油减少
PRK的启动子 启动子强度 活性条件 需氧增殖 甘油减少
LYS1p 强 组成型 无菌落形成 n.a.
UBC6p 中等 组成型 无菌落形成 n.a.
YEN1p 弱 组成型 生长 -3％
DAN1p 弱 厌氧的 生长 -41％
实施例2：S.oleracea prk蛋白仅在厌氧条件下在IMX774中表达
摇瓶培养菌株
在需氧条件和厌氧条件下在摇瓶中补充有20g L-1葡萄糖和0.05g L-1尿嘧啶的矿质培养基(根据Luttik等，2000)中一式两份地培养IME324和IMX774。在YePhD上过夜需氧增殖后，将75mg L-1酵母接种到上述培养基中，所述培养基在装入25mL培养基、然后用棉塞封闭以重现有氧培养条件的100mL摇瓶中，或在装入25mL培养基(留出有限的顶部空间用于通气)、然后用水锁封闭以重现接种和关闭后不久容器中变为厌氧的条件的25mL摇瓶中。在32℃和250rpm(对于需氧培养)和150rpm(对于厌氧培养)下培养24小时后，通过离心从八个摇瓶中的每一个收获10个OD 600单位/mL细胞，并用冰冷的脱矿质水洗涤细胞。将细胞沉淀物储存在-80℃下用于进一步处理。
蛋白质提取和蛋白质组学
在冷甲醇(Sigma)环境中，借助于VK05玻璃珠和Precellys 24匀浆器(BertinTechnologies)，使用基于机械的破碎方法裂解冷冻细胞。使用Qubit 2.0荧光计(Invitrogen，Life Technologies)测量破碎的细胞悬浮液的蛋白浓度。从每种甲醇悬浮液中取出250μg总蛋白质，并将10μg BSA掺入所有样品中用于质量控制。使用氯仿(Sigma)和20％TCA(Sigma)从破碎的细胞悬浮液中提取蛋白质。将获得的蛋白质沉淀物溶解在pH为7的100mM NH4HCO3缓冲液(Sigma)中至终浓度为0.5ug/uL。通过添加5ul 500mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(TCEP，sigma)来还原蛋白质，并在热循环仪中于55℃下孵育30分钟以促进二硫化物还原。通过添加5ul 550mM碘乙酰胺进行烷基化，并在暗处于25℃下孵育30分钟。蛋白质水解在恒温混匀仪中于37℃下利用Trypsin Gold(Promega)进行过夜，酶与底物之比为1:25，Trypsin Gold特异性地切割赖氨酸和精氨酸的C-末端。在与QExactive Plus(Thermo Scientific)偶联的Ultimate3000上分析胰蛋白酶消化物。肽的梯度洗脱在C18(Acquity UPLC CSH C18柱,
Figure BDA0001902530090000491
1.7μm,2.1mm X 100mm)上进行。利用以下梯度分离20μL注射的肽：从流动相A(99.9％水和0.1％甲酸；VWR)经20分钟达到20％B(99.9％乙腈和0.1％甲酸；VWR)，并经30分钟达到50％B，最终长度为60分钟。qExactive MS上的数据采集使用数据依赖性方法进行。在HCD碎裂后，选择前15种前体用于串联-MS/MS(MS2)分析。以70000(m/z为200)的分辨率获得了覆盖质量范围400至1600的全MS扫描，最大填充时间为75毫秒，自动增益控制(AGC)目标值为3e6。以17500(m/z为200)的分辨率获得了MS2扫描，最大填充时间为75毫秒，AGC目标值为1e5。在所有实验中应用2.0m/z的隔离窗，其具有110.0m/z的固定第一质量。对于所有肽，利用(NCE)归一化碰撞能量27诱导HCD片段化。充电状态排除被设置为忽略未指定的1次充电。启用同位素排除并且优选肽匹配。使用ProteomeDiscover 1.4Sequest HT(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)上的SequestHT，针对其中手动添加了异源引入酶的氨基酸序列的S.cerevisiae蛋白质数据库检索所有LC-MS/MS结果。使用胰蛋白酶的切割偏好，允许至多2个漏掉的切割(C-Term K/R限制P)。动态修饰被设定为脲甲基(C)、脱酰胺(N/Q)和氧化(M)。前体质量公差被设定为10ppm，碎片质量公差被设定为0.6Da。在肽鉴定之后，基于具有1％错误发现率(FDR)的靶诱饵方法计算它们的q值，并在过滤器中过滤。
分析结果
在每个样品中鉴定出了约1000种独特的蛋白质。为了量化S.oleracea PRK的量，在所有样品中，选择丰度最高的独特肽。合计了所有肽的峰面积。通过针对通过LC-MS/MS测定的β-肌动蛋白(S.cerevisiae Act1p)量进行归一化，该值最终给出了关于所有样品中蛋白质的量的指示。如图3所示，在有氧条件和厌氧条件下，对于不表达prk的阴性对照菌株IME324，没有检测到独特的prk肽。对于IMX774，仅在厌氧条件下检测到了prk肽，指示DAN1p仅在厌氧条件下诱导prk表达。
实施例3：在更厌氧上调的启动子控制下的S.oleracea prk的表达导致IMX765中的甘油减少
发现在厌氧上调的DAN1启动子控制下表达的S.oleracea prk的引入有益于甘油副产物形成的减少和乙醇产率的提高(实施例1)。与DAN1p相比，用其它组成型活性启动子(UBC6、LYS1、YEN1)将prk引入S.oleracea prk上游没有产生能存活的正确转化体(UBC6、LYS1)或没有显示出通过实施Rubisco通路而对甘油减少(YEN1p)有影响。这使我们得出结论：厌氧诱导/去抑制的prk有益于Rubisco通路通量并通过减少甘油导致乙醇产率提高。DAN1受抑制剂ROX1调控，ROX1在厌氧条件下不存在，从而减轻对DAN1启动子的阻遏。更多这样的启动子受ROX1调控，ROX1显示差异表达模式，在厌氧条件下比在有氧条件下更高水平地表达(Kwast等，1998)。在本实施例中，将这些启动子中的一些置于S.oleracea prk的上游并引入菌株IMX765中，之后对所得菌株进行厌氧生长培养。在表10中，列出了实施例3中检测的启动子。
表10.厌氧PRK启动子
Figure BDA0001902530090000501
Figure BDA0001902530090000511
材料与方法
表达盒构建
在DNA2.0(Menlo Park,CA 94025,USA)合成启动子(列于表10中；SEQ ID NOs：91和93-101)和终止子，即Sc_PGK1.ter(SEQ ID NO：102)序列。使用pUDE046作为模板，使用引物组合DBC-15631(SEQ ID NO：103)和DBC-15632(SEQ ID NO：104)通过PCR扩增获得S.oleracea prk ORF序列(Sole_PRK.orf)。如Engler等(2011)和其中的参考文献所述，通过使用Golden Gate技术重组启动子、ORF和终止子序列。将表达盒克隆到标准亚克隆载体中。将表10中列出的启动子连接到Sole_PRK ORF和Sc_PGK1终止子，从而得到了表11中列出的表达盒。
表11：由Golden Gate克隆得到的表达(启动子-ORF-终止子)盒的列表，所述表达盒包含启动子变体、S.oleracea PRK ORF和S.cerevisiae PGK1终止子；在5'端和3'端，列出了与相邻通路块相容的连接子序列。
盒 5’连接子 启动子 ORF 终止子 3’-连接子
cDAN1 C Sc_DAN1 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cDIP5 C Sc_DIP5 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cTIR3 C Sc_TIR3 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cTIR2 C Sc_TIR2 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cHEM13 C Sc_HEM13 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cYHK8 C Sc_YHK8 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cFET4 C Sc_FET4 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cTIR4 C Sc_TIR4 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cAAC3 C Sc_AAC3 Sole_PRK Sc_PGK1 D
cANB1 C Sc_ANB1 Sole_PRK Sc_PGK1 D
菌株构建
方法
专利申请PCT/EP2013/056623和PCT/EP2016/050136中描述了所遵循的菌株构建方法。PCT/EP2013/056623描述了允许以这样的方式从各种感兴趣的基因构建表达盒的技术：这些盒在转化酵母后组合成通路并整合到该酵母基因组的特定基因座中。PCT/EP2016/050136描述了CRISPR-Cas9系统用于将表达盒整合到宿主细胞(在这种情况下是S.cerevisiae)基因组中的用途。在IMX765的构建中，S.pyogenes Cas9表达盒已整合在CAN1基因座。在引入体内组装的表达gRNA的质粒和修复DNA片段后，进行预期的修饰。首先，选择酵母基因组中的整合位点。使用将连接子引入所产生的PCR产物的引物，通过PCR扩增整合基因座的上游和下游部分的约500bp DNA片段。这些连接子(大小为50bp)允许在酵母中转化后通路的正确体内重组。然后，通过PCR扩增感兴趣的基因，在每个侧翼并入不同的连接子(与相邻生物块上的连接子相容)。在用DNA片段转化酵母细胞后，体内重组和整合到基因组中发生在期望的位置。该技术有助于平行检测多种遗传设计，因为来自该通路的一个或多个基因可以被一个或多个其它基因或遗传元件替换，只要允许同源重组的连接子保持恒定并且与设计中的前后生物块相容即可(专利申请PCT/EP2013/056623)。
gRNA表达质粒
整合位点：表达盒靶向INT1基因座。INT1整合位点是位于S.cerevisiae的XV染色体上的NTR1(YOR071c)和GYP1(YOR070c)之间的非编码区。靶向INT1的向导序列是使用gRNA设计工具(https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input)设计的。gRNA表达盒(如DiCarlo等,Nucleic Acids Res.2013；第1-8页所述)在Integrated DNA Technologies(Leuven，Belgium)作为合成DNA盒(gBLOCK)订购(INT1 gBLOCK；SEQ ID NO：105)。然后通过共转化来源于酵母载体pRN599的线性片段来完成gRNA表达质粒的体内组装。pRN599是多拷贝酵母穿梭载体，且含有功能性kanMX标记盒，从而赋予对G418的抗性。该质粒的骨架基于pRS305(Sikorski和Hieter,Genetics 1989,第122卷,第19-27页)，包括功能性2微米ORI序列和功能性kanMX标记盒(SEQ ID NO：106)。
用组装后包含厌氧启动子PRK盒的指定DNA片段转化IMX765
用以下片段转化菌株IMX765，从而导致厌氧启动子PRK的组装，如图4所示：
1)使用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板，利用引物BoZ-783(SEQ ID NO：107)和DBC-19944(SEQ ID NO：108)产生的PCR片段(5'-INT1)；
2)使用表7中列出的任一质粒作为模板，利用引物DBC-5799(SEQ ID NO：109)和DBC-5800(SEQ ID NO：110)产生的PCR片段(厌氧.pro-PRK)；
3)使用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板，利用引物DBC-19947(SEQ IDNO：111)和DBC-19949(SEQ ID NO.112)产生的PCR片段；该PCR产生1.2kb标记盒conD-URA3-conE(侧翼是连接子D和E的URA3标记物)。
4)使用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板，利用引物DBC-19946(SEQ IDNO：113)和BoZ-788(SEQ ID NO：114)产生的PCR片段(3'-INT1)；
5)使用pRN599(SEQ ID NO：106)作为模板，利用引物DBC-13775(SEQ ID NO：115)和DBC-13776(SEQ ID NO：116)产生的PCR片段(BB-599)；
5)使用INT1gRNA(SEQ ID NO：105)作为模板，利用引物DBC-13773(SEQ ID NO：117)和DBC-13774(SEQ ID NO：118)产生的PCR片段(gRNA-INT1)。
在矿质培养基(根据配方Luttik等,2000,Journal of Bacteriology 182,24:501-517)上选择转化体，所述矿质培养基补充有1.5％细菌用琼脂，并补充有20g L-1葡萄糖和0.2mg G418mL-1。进行诊断PCR以确认在PRK表达盒的INT1基因座的正确组装和整合。
微量滴定板分批发酵实验
将每种转化设计6到9个正确的转化体和9倍对照菌株IME324、IMX765和IMX774以微量滴定板方式接种到240μl补充有20g L-1葡萄糖和0.05g L-1尿嘧啶的矿质培养基(根据Luttik等，2000)。将经接种的微量滴定板在30℃下培养2天。随后，借助于针状工具将琼脂培养基上生长的培养物转移到补充有20g L-1葡萄糖和0.05g L-1尿嘧啶的液体350μl矿质培养基(根据Luttik等，2000)至第二微量滴定板中用于生物质增殖。将微量滴定板用允许需氧培养条件的透气性密封物密封，并在32℃、以750rpm振荡、80％湿度的条件下孵育2天。2天后，将5μl生长的液体培养物转移到补充有20g L-1葡萄糖和0.05g L-1尿嘧啶的270μl矿质培养基(根据Luttik等，2000)至第三微量滴定板用于主发酵。270μl的大体积在孔中留出很小的顶部空间体积，以及用铝密封物密封微量滴定板允许主要在厌氧条件下进行筛选。使培养物在32℃、250rpm、80％湿度下生长48小时。48小时后，采集样品以测量残留的葡萄糖、甘油和乙醇。
分析葡萄糖、乙醇和甘油
为了定量葡萄糖、乙醇和甘油，将150μl上清液样品精确转移到合适的小瓶中。随后加入100μl内标溶液，该内标溶液在D2O中含有马来酸(20g/l)、EDTA(40g/l)、DSS(4,4-二甲基-4-硅杂戊烷-1-磺酸)(0.5g/L)，用NaOH调整至pH为6.40。用400μl D2O进一步稀释样品。在Bruker Avance III HD光谱仪上记录澄清溶液的1D 1H NMR谱，所述光谱仪在500MHz质子频率运行，配备有He冷却的低温探针，使用具有水抑制的脉冲程序(ZGCPPR)，溶剂抑制能力为8Hz，温度为300K，使用90度激发脉冲，采集时间为2.0秒，弛豫延迟为5秒。扫描次数被设置为8，未使用虚拟扫描。基于以下信号(相对于DSS的δ)计算分析物浓度[以g/L计]：
·葡萄糖：α-H1葡萄糖信号(d,5.21ppm,0.38H,J＝4Hz)
·乙醇：(t,1.17ppm,3H,J＝7Hz)
·甘油H1/H3信号：(dd,3.55ppm,2H,J＝7Hz,12Hz)
·用于标准品的信号：
·马来酸：(s,6.05ppm,2H)。
微量滴定板发酵实验的结果
通过转化体和对照菌株的所有重复，葡萄糖在培养基中完全耗尽。关于具有不同厌氧启动子-PRK盒的转化体以及对照菌株IME324、IMX765和IMX774检测到的平均甘油水平(以任意单位表示)列于表11中并示出于图5中。在该MTP发酵设置中，IMX774再次显示出与参照菌株IME324(如实施例1所示)相比降低的甘油水平(87％，降低13％)。cDAN1转化体(其为IMX774的重构)显示出与IMX774相似的甘油减少(IME324甘油水平的85％)。与IME324相比，所有检测的厌氧启动子设计都显示出降低的甘油水平。还可以发现使用厌氧启动子的设计导致转化体平均比cDAN1甚至更多的甘油水平降低，例如cTIR3、cHEM13、cAAC3和cANB1分别平均产生IME324甘油水平的76％、68％、82％和80％。从表12和图6中可以观察到，与IME324相比，这些甘油产率降低反映在至少相似的，通常更高的乙醇滴度中，如关于cDAN1(102％)、cTIR3(103％)、cHEM13(104％)、cAAC3(101％)和cANB1(103％)所见。
表12.在基于补充有20g L-1葡萄糖和0.05g L-1尿嘧啶的矿质培养基(根据Luttik)的微量滴定板发酵实验中测定的平均甘油产率，以每种厌氧启动子设计的转化体和参照菌株IME324、IMX774、IMX765(转化对照)中每g葡萄糖的任意单位表示。N.A.，不适用。
Figure BDA0001902530090000551
Figure BDA0001902530090000561
表13.在基于补充有20g L-1葡萄糖和0.05g L-1尿嘧啶的矿质培养基(根据Luttik)的微量滴定板发酵实验中测定的平均乙醇产率，以每种厌氧启动子设计的转化体和参照菌株IME324、IMX774、IMX765(转化对照)中每g葡萄糖的任意单位表示。N.A.，不适用。
Figure BDA0001902530090000562
实施例4.PPP基因的过表达和GPD2基因的缺失。
通过用受如待决的欧洲专利申请EP16194660.3中所述的组成型启动子控制的上述基因的表达盒转化IMX774使戊糖-磷酸通路的非氧化分支的基因(TKL1、NQM1、TKL1、TKL2、RPE1、RKI1)过表达。通过将向导RNA表达质粒与靶向GPD2的序列共转化，将表达盒整合在GPD2基因座，从而废除gpd2的编码序列。得到的菌株被命名为IMX1443。如实施例1中所述，在分批发酵实验中将菌株IMX1443与IME324和IMX774进行比较。结果列于表14中。
表14.使用具有PPP基因和GPD2基因缺失的酵母菌株的结果
Figure BDA0001902530090000571
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Claims (4)

1.一种重组酵母细胞，其功能性表达一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)，和一种或多种Rubisco分子伴侣，和一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中所述磷酸核酮糖激酶受PRK启动子的控制，所述PRK启动子是选自以下基因的天然启动子：ANB1、DAN1、TIR3、HEM13或AAC3。
2.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述Rubisco属于组成型启动子。
3.根据权利要求1或2所述的重组酵母细胞，其中磷酸戊糖通路的非氧化分支的一个或多个基因过表达且/或所述酵母细胞包含甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏。
4.一种制备乙醇的方法，所述方法包括：使用根据权利要求1-3中任一项所述的重组酵母细胞转化葡萄糖，从而形成所述乙醇。
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