CN101541969A

CN101541969A - 蛋白质表达或阻抑的系统、方法和设备

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Publication number: CN101541969A
Application number: CNA2007800379891A
Authority: CN
Inventors: 理查德·E·瓦格纳; R·叙尔茨基; J·-D·罗谢克斯
Original assignee: Universite de Geneve
Current assignee: Fee Gene Engineering Ltd.; Fitla Bio; Kirchlo Bio; Solarvest BioEnergy Inc; Universite de Geneve
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-11
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2027-08-11
Also published as: KR20090069269A; EP2069511A2; CN107058370A; AU2007284676A1; EP2069511A4; US20190194675A1; KR101671394B1; WO2008021223A3; US9228193B2; KR20140088235A; EP2069511B1; BRPI0716440B1; CA2660513C; CA2660513A1; ZA200901713B; MX2009001565A; US10941408B2; KR101497160B1; BRPI0716440A2; CA3004949A1

Abstract

本发明涉及诱导和/或阻抑蛋白质表达的系统、方法和设备。更具体而言，本发明涉及在质体内诱导和/或阻抑蛋白质表达的系统、方法和设备。示范性实施方案涉及使用在此所述的方法、系统和设备调节涉及氢产生的蛋白质表达以刺激氢气产生。

Description

蛋白质表达或阻抑的系统、方法和设备

与相关申请的交叉引用

本申请按照35U.S.C§119(e)要求于2006年8月11日提交的美国临时申请系列号60/837,001的优先权，所述美国临时申请系列号60/837,001在此引用作为参考。

发明领域

本发明涉及诱导和/或阻抑蛋白质表达的系统、方法和设备。更具体而言，本发明涉及在质体内诱导和/或阻抑蛋白质表达的系统、方法和设备。

发明背景及概述

蛋白质(例如肽、寡肽和多肽)负责细胞的大部分活动，例如催化作用、通讯、防御、移动和转运。蛋白质生物学活性的根本基础是其氨基酸序列和/或其构象。因此，蛋白质的生物学活性部分应该保持基本完整并且处于其生物学功能性构象。蛋白质表达的基因工程技术的进步已致使在各种系统中以维持蛋白质生物学活性的形式受控表达天然和外来蛋白质的方法的发展。这种基因工程改造的受控表达系统可以由于正确折叠的稳定蛋白质的表达而导致更高蛋白质产量，其中由于能够控制蛋白质表达，所以蛋白质的失活和降解降低。

尽管众多不同类型的表达系统已得到发展，但在宿主细胞例如微生物、真核细胞(包括真菌、酵母和哺乳动物细胞、昆虫细胞等)的各种细胞器中，利用核起源的稳定性因子来调节质体中蛋白质表达的蛋白质受控表达的表达系统以前尚未得到开发。质体是负责光合作用的细胞器，并且通常分类为叶绿体、白色体、造粉体或色质体。质体可以在这些形式之间分化或再分化。

在一个实施方案中，提供了制备诱导细胞质体中蛋白质产生的表达系统的方法。该方法包括步骤为：将第一个核酸引入细胞核中，其中第一个核酸编码诱导型启动子，将第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，其中第二个核酸编码稳定性因子，其中引入诱导物或去除阻抑物诱导稳定性因子的表达，其中表达的稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合，该mRNA由该稳定性因子稳定并且由第三个核酸转录，其中所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质，且其中mRNA的表达导致该蛋白质的产生。

在另一个说明性实施方案中，提供了制备阻抑细胞质体中质体蛋白质表达的表达系统的方法。该方法包括步骤为：将第一个核酸引入细胞核中，其中第一个核酸编码阻抑型启动子，将第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，其中第二个核酸编码稳定性因子，其中引入阻抑物或去除诱导物阻抑稳定性因子的表达，且其中稳定性因子表达的阻抑导致mRNA表达的阻抑，该mRNA由该稳定性因子稳定并且由第三个核酸转录，其中所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质，且其中该蛋白质的表达被阻抑。

在另一个说明性方面，提供了在细胞质体中表达质体蛋白质的方法。该方法包括步骤为：将细胞与诱导物接触，或在导致阻抑物去除的条件下处理细胞，其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合，其中第一个核酸编码诱导型启动子，其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，且其中第二个核酸编码稳定性因子，表达该稳定性因子，将稳定性因子引入质体中，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中所述mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质，表达该mRNA，并在质体中生产该蛋白质。

在另一个实施方案中，提供了在细胞质体中阻抑质体蛋白质表达的方法。该方法包括步骤为：将细胞与阻抑物接触，或在导致诱导物去除的条件下处理细胞，其中阻抑物或诱导物在细胞核中与第一个核酸结合，其中第一个核酸编码阻抑型启动子，其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，且其中第二个核酸编码稳定性因子，阻抑该稳定性因子的表达，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中所述mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质，阻抑该mRNA的表达，并阻抑该蛋白质的表达。

在另一个实施方案中，提供了在重组宿主细胞质体中表达质体蛋白质的系统。该系统包括外源性加入的诱导核蛋白质表达的诱导物，重组宿主细胞，其中重组宿主细胞的核包括重组核酸，其中该重组核酸包括与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸的第一个核酸，其中第一个核酸编码诱导型启动子，且其中第二个核酸编码稳定性因子，和质体，该质体包括第三个核酸，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码表达的质体蛋白质，其中编码该质体蛋白质的mRNA的表达受稳定性因子控制。

在另一个实施方案中，提供了在重组宿主细胞质体中阻抑质体蛋白质表达的系统。该系统包括外源性加入的阻抑核蛋白表达的阻抑物，重组宿主细胞，其中重组宿主细胞的核包括重组核酸，其中该重组核酸包括与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸的第一个核酸，其中第一个核酸编码阻抑型启动子，且其中第二个核酸编码稳定性因子，和质体，该质体包括第三个核酸，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码表达的质体蛋白质，且其中编码该蛋白质的mRNA的表达受稳定性因子控制。

在另一个实施方案中，提供了通过在细胞质体中表达质体蛋白质而刺激氢气产生的方法。该方法包括步骤为：将细胞与诱导物接触，或在导致阻抑物去除的条件下处理细胞，其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合，其中第一个核酸编码诱导型启动子，其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，且其中第二个核酸编码稳定性因子，表达该稳定性因子，将稳定性因子引入质体中，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码蛋白质，表达该mRNA，在质体中产生该蛋白质，并产生氢气。

在另一个实施方案中，提供了通过在细胞质体中阻抑质体蛋白质表达而抑制氢气产生的方法。该方法包括步骤为：将细胞与阻抑物接触，或在导致诱导物去除的条件下处理细胞，其中阻抑物或诱导物在细胞核中与第一个核酸结合，其中第一个核酸编码阻抑型启动子，其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，其中第二个核酸编码稳定性因子，阻抑该稳定性因子的表达，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质，阻抑该mRNA的表达，阻抑所述蛋白质的表达，并抑制氢气产生。

在另一个实施方案中，提供了通过在细胞质体中诱导和阻抑质体蛋白质表达而刺激氢气产生的方法。该方法按序包括步骤i)将细胞与诱导物接触，或在导致阻抑物去除的条件下处理细胞以及ii)将细胞与阻抑物接触，或在导致诱导物去除的条件下处理细胞，其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合，其中第一个核酸编码诱导型启动子，其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，且其中第二个核酸编码稳定性因子，按序表达和阻抑该稳定性因子的表达，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码蛋白质，按序表达和阻抑该mRNA的表达，在质体中产生该蛋白质，并产生氢气。

在上述任一个实施方案中，将重组核酸引入核之前，第一个核酸可以与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，细胞可以具有第二或第三个核酸的无效拷贝，或失去第二或第三个核酸的拷贝或同源物，细胞可以是植物细胞或藻类细胞，质体可以选自叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体和色质体，诱导型启动子可具有与Cyc6启动子至少90％的序列相似性，且第三个核酸可以编码与psbD基因至少具有至少90％序列相似性的基因。

在上述任一个实施方案中，诱导物或阻抑物可以是化学药品或环境条件，其中化学药品可以是铜，且其中环境条件可以是氧浓度减少到预先确定的水平，可以将诱导物应用和去除多个循环，其中循环包括应用和去除诱导物，蛋白质可以是涉及光合作用或产生氢气的蛋白质，该蛋白质可选自药物试剂、工业酶、涉及叶绿体成熟或降解的酶、以及营养药，其中药物试剂选自抗体、疫苗抗原和抗微生物剂、或其他宿主细胞防御产物，而稳定性因子可选自Nac2和Mbb1。在另一个说明性实施方案中，第二个核酸可以编码翻译活化因子，例如Tbc2或Tca1。

在本发明的另一个实施方案中，提供了调节质体内天然或外来基因表达或阻抑的系统和方法。在一个实施方案中，本发明涉及采用核编码的叶绿体转录因子Nac2的表达系统，其中Nac2的表达受Cyc6基因的诱导型启动子调节。在另一个实施方案中，通过诱导物(即试剂或环境条件的变化)例如低水平的氧诱导Nac2表达，引起叶绿体中psbD基因的表达。在另一个实施方案中，试剂或环境条件，例如去除诱导Cyc6启动子的铜，也引起psbD基因的表达。在另一个说明性实施方案中，通过阻抑物(即试剂或环境条件的变化)例如高水平的氧阻抑Nac2基因，导致psbD基因不表达或表达降低。在有关实施方案中，阻抑诱导型Cyc6启动子的试剂或环境条件的变化也引起psbD基因表达的降低。

在另一个说明性实施方案中，本发明涉及外来基因在叶绿体中的诱导型表达或阻抑，由此以外来基因置换叶绿体中的psbD基因，通过调节Nac2表达而促进该外来基因在叶绿体中的诱导型表达或阻抑。

在另一个实施方案中，本发明涉及通过调节psbD基因而在叶绿体中产生氢气的方法，其中psbD基因的调节由Nac2的表达或Nac2表达的阻抑实现。在本发明的这个说明性方面，促进Nac2基因诱导和阻抑的环境条件(例如降低氧水平以诱导表达，以及升高氧水平以阻抑表达)，从而导致psbD基因表达的摆动性诱导和阻抑，导致光合作用速率的降低，以及结果氧浓度的降低。在本实施方案中，氧浓度的降低促进氢产生。因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过调节Nac2和psbD基因表达的摆动性诱导和阻抑而产生氢气的方法。

在另一个实施方案中，本发明涉及通过叶绿体中其他基因例如氢化酶的重组表达和其他重组或天然蛋白质例如磷酸核酮糖激酶的阻抑而增强氢气生成系统的方法。

在另一个实施方案中，提供产生氢的装置。该装置包括配置为在充分氧耗尽环境中保持细胞培养物的第一个容器、与第一个容器流体沟通并配置为以预先确定的速率将培养基抽吸入第一个容器的第一个泵、以及与第一个容器偶联并配置为测量细胞培养物产氢量的测量设备。

在该实施方案中，可以把第一个泵配置为以与细胞培养物生长速度基本相等的速度将一定量的培养基抽吸入第一个容器，第一个泵可以包括蠕动泵，细胞培养物可以包括cy6Nac2.49培养物，测量设备可以包括质谱仪，该装置可以另外包括与第一个容器偶联并且可操作以搅拌细胞培养物的搅拌设备，搅拌设备可以包括磁力搅拌棒，该装置可以另外包括配置为保持一定量的培养基的第二个容器，其中第一个泵与第二个容器流体偶联，并且配置为以预先确定的速率将培养基从第二个容器抽吸，该装置可以另外包括与第一个容器流体沟通、并配置为保持来自第一个容器的培养基溢出物的第三个容器，且该装置可以另外包括过滤器以及与第三个容器和第二个容器流体沟通的第二个泵，配置所述第二个泵以将一定量的培养基从第三个容器经过过滤器抽吸入第二个容器。

附图简述

参考下列附图更易于理解本发明，其中：

图1显示在需氧和厌氧条件下雷氏衣藻(C.reinhardtii)叶绿体内的氢和电子流图表(来自Kruse等人，2005)。

图2显示质体基因调节系统示意略图，其中在诱导物的存在下诱导核诱导型启动子。左阴影线框代表核诱导型启动子，而右阴影线框代表稳定性因子基因。实心框代表稳定性因子结合元件，在本实施方案中位于质体mRNA的5’非翻译区中。空心框代表由质体天然基因产生的mRNA。交叉阴影线框代表质体中由外来基因产生的mRNA。

图3显示质体基因调节系统示意略图，其中在不存在诱导物下阻抑核诱导型启动子。左阴影线框代表核诱导型启动子，而右阴影线框代表稳定性因子基因。实心框代表稳定性因子结合元件，在本实施方案中位于质体mRNA的5’非翻译区中。空心框代表由质体天然基因产生的mRNA。交叉阴影线框代表质体中由外来基因产生的mRNA。

图4显示质体基因调节系统示意略图，其中在阻抑物的存在下阻抑核阻抑型启动子。左阴影线框代表核阻抑型启动子，而右阴影线框代表稳定性因子基因。实心框代表稳定性因子结合元件，在本实施方案中位于质体mRNA的5’非翻译区中。空心框代表由质体天然基因产生的mRNA。交叉阴影线框代表质体中由外来基因产生的mRNA。

图5显示质体基因调节系统示意略图，其中在不存在阻抑物下诱导核阻抑型启动子。左阴影线框代表核阻抑型启动子，而右阴影线框代表稳定性因子基因。实心框代表稳定性因子结合元件，在本实施方案中位于质体mRNA的5’非翻译区中。空心框代表由质体天然基因产生的mRNA。交叉阴影线框代表质体中由外来基因产生的mRNA。

图6显示衣藻属(Chlamydomonas)叶绿体基因组示意图，psbD基因位置已示。箭标指示pSK108插入位点。

图7显示产氢装置流程图。

图8显示产氢装置。

图9显示核表达载体pSL17示意图，所述载体用于转化核Nac2突变体以及引入Cyc6启动子和Nac2基因。该图显示启动子、来自HSP70A启动子的增强子元件以及用于插入Cyc6启动子和Nac2基因的限制位点的排列。

图10显示cy6Nac2(paroR)示意图。

图11a-c显示Nac2 midi基因的基因组序列。起始密码子是第一个加下划线的ATG。推定的转运肽也加以下划线。

图12显示Cyc6基因组序列。用于与Nac2 midi基因产生融合构建体的基因组序列加以下划线。在cyc6Nac2构建体中产生NdeI限制位点的三个碱基对差别也被指出(双下划线)。

图13显示cy6Nac2.49转基因株的生长性质。

图14显示cy6Nac2.49转基因株的蛋白质印迹分析。

图15显示cy6Nac2.49转基因株的氢产生。

图16显示pSK108载体图。pSK108载体具有侧翼叶绿体DNA以将其指导到psbD基因周围的区域。

图17显示pcg12图。

图18显示叶绿体表达质粒pcg12 IBDV Flag图。

图19显示叶绿体表达质粒pcg12 VP28 Flag图。

图20显示叶绿体psbD DNA序列。加下划线的序列用于驱动在叶绿体中使用cyc6Nac2系统表达基因。

图21显示IND_aadA_X转基因株的分离以及在各种培养基上的生长。

图22显示从野生型及IND_aadA_117分离提取的总RNA的RNA印迹分析。

图23显示从野生型及IND_aadA_117提取的总和可溶性(α-Nac 2)的分析。

图24显示诱导三个外来蛋白质(DILP、IBVD和VP28)表达的转基因株的筛选。

图25显示使用Nac2诱导型叶绿体基因表达系统的的外来蛋白质(DILP)的诱导型产生。

图26显示psbD RNA、D2和Nac2蛋白质在cy6Nac2.49中的积累。

图27显示通过以peTA 5’UTR置换psbD 5’UTR恢复在cy6Nac2.49中的组成型PSII积累。

图28显示叶绿体psbD基因的诱导型表达。

图29显示cy6Nac2.49中铜介导的PSII合成阻抑的时程。

图30显示cy6Nac2.49中PSII积累的时程。

图31显示IND_aadA_117转化体中psbD-aadA基因表达由铜耗尽诱导并由铜阻抑。

图32显示cy6Nac2-49株的氢产生。

说明性实施方案详述

如此处所用的，短语“外来基因”或“外来核酸”(即转基因)指使用重组DNA技术插入到细胞核酸中的任何核酸，其中外来基因或外来核酸正常不存在于细胞中的该位置。外来基因或外来核酸可以包括编码和非编码核酸序列。外来基因或外来核酸可以包括使用重组DNA技术修饰并再引入细胞的天然核酸，或者可以包括在细胞内从一个位置移动到另一个位置的天然核酸。

如此处所用的，短语“天然核酸”或“天然基因”指在细胞中具有其天然序列(包括天然存在的突变)和位置的核酸。

如此处所用的，术语“诱导型”指能够受到调节从而产生mRNA转录物的启动子。确定mRNA转录物水平的方法包括RNA印迹和实时PCR。

如此处所用的，术语“表达”可以指DNA转录为RNA或RNA翻译为蛋白质。

如此处所用的，短语“稳定性因子”指可以表现出活性以增强叶绿体蛋白质表达或活性的核蛋白质，所述活性包括但不限于转录、转录后、翻译、翻译后、蛋白质靶向和蛋白质募集活性。

本发明涉及为了产生有用产物的目的调节细胞(例如藻类或植物细胞)内质体中基因表达的系统、方法和设备。通过以诱导型或阻抑型启动子转化细胞的核基因组而实现质体中基因表达的诱导或阻抑，所述诱导型或阻抑型启动子与编码叶绿体靶向蛋白质的基因可操作地连接。叶绿体靶向蛋白质与质体表达的mRNA的非翻译区直接或间接(例如通过辅助蛋白质)结合。叶绿体靶向蛋白质是质体表达的mRNA的稳定性和/或翻译以及由此的质体基因表达所必需的。

在一个实施方案中，核启动子是诱导型启动子，且化合物(例如铜、碳水化合物或蛋白质)的添加或去除，或环境条件的变化(例如低氧浓度，或光、温度或营养状态的变化)激活该启动子，从而导致叶绿体mRNA的表达，以及随后由该mRNA编码的蛋白质的表达。在另一个实施方案中，核启动子是阻抑型启动子，且化合物(例如铜、碳水化合物或蛋白质)的添加或去除，或环境条件的变化(例如高氧浓度，或光、温度或营养状态的变化)阻抑该启动子，从而导致稳定性因子表达缺乏和叶绿体mRNA表达及随后由该mRNA编码的蛋白质的表达受到抑制。

在一个实施方案中，本发明涉及在细胞质体中表达蛋白质的方法。该方法包括步骤为：将细胞与诱导物接触，或在导致阻抑物去除的条件下处理细胞，其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合，其中第一个核酸编码诱导型启动子，其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，且其中第二个核酸编码稳定性因子，表达该稳定性因子，将稳定性因子引入质体中，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质，表达该mRNA，并在质体中产生蛋白质。

在另一个实施方案中，提供了在细胞质体中阻抑质体蛋白质表达的方法。该方法包括步骤为：将细胞与阻抑物接触，或在导致诱导物去除的条件下处理细胞，其中阻抑物或诱导物在细胞核中与第一个核酸结合，其中第一个核酸编码阻抑型启动子，其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，且其中第二个核酸编码稳定性因子，阻抑该稳定性因子的表达，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质，阻抑该mRNA的表达，并阻抑蛋白质的表达。

在上述实施方案中，蛋白质在细胞质体中得到表达。作为说明，细胞可以是植物细胞或藻类细胞或含有质体的任何细胞类型。质体是经常以多拷贝含有质体基因组的细胞器。质体见于例如植物和藻类中，并包括叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体和色质体。

在此所述的方法和系统实施方案中，第三个核酸编码目的蛋白质。在一个说明性实施方案中，编码表达的蛋白质的第三个核酸可以是质体天然的或质体外来的(即转基因)。在本实施方案中，表达的蛋白质(例如肽、寡肽或多肽)可以是在诱导型或阻抑型启动子控制下表达的，并包括涉及光合作用的蛋白质，例如光合系统I或II的组分(例如psbA和psbD和光合系统II的D1和D2亚基)，涉及CO₂固定的蛋白质(例如磷酸核酮糖激酶)，氢化酶(例如HydA1和HydA2)以及调节这些蛋白质中任一个的活性的蛋白质(例如任何这些蛋白质的组装(例如HydEF和HydG))，或任何其他质体天然的蛋白质。可以在诱导型或阻抑型启动子控制下表达的示范性天然蛋白质包括图1中描述或暗示的涉及调节光合作用过程或碳同化过程的任何蛋白质、或任何质体天然的其他蛋白质。在可替代的实施方案中，可以通过调节质体天然的蛋白质的表达产生氨基酸，例如芳族氨基酸，或氨基酸前体，所述质体天然的蛋白质涉及氨基酸例如芳族氨基酸的合成途径。

在另一个说明性实施方案中，可以使用在此所述方法、系统和设备在诱导型或阻抑型启动子或两者的控制下表达涉及氢气产生的蛋白质。在本实施方案中，涉及氢气产生的蛋白质可以是在这个或前述段落中所述任何蛋白质，或可以是图1中描述或暗示的涉及调节光合作用过程或碳同化过程的任何蛋白质。在该实施方案中，可以将诱导物或阻抑物应用和去除多个循环，其中循环包括应用和去除诱导物或阻抑物。

在另一个实施方案中，编码表达的蛋白质的第三个核酸可以是质体外来的(即外来核酸或外来基因)。在该实施方案中，该蛋白质可以是药物试剂、工业酶、涉及叶绿体成熟或降解的酶或营养药。在本实施方案中，表达的蛋白质可以是例如抗体、疫苗抗原(例如在疫苗中使用)、抗微生物剂、或其他宿主细胞防御产物、生长激素、细胞因子、例如白细胞介素或干扰素、胰岛素、集落刺激因子、凝固因子、促红细胞生成素、生长因子、例如表皮生长因子、促生长素、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子等、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、戊聚糖酶(pentosanase)、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶、杀虫蛋白质、苯基氨(phenyl ammonia)裂合酶或其他任何药物试剂、工业酶或蛋白质营养药。

在另一个说明性实施方案中，可以在叶绿体中表达额外的编码表达的蛋白质的核酸(例如第四个核酸等)，且其可以是质体天然的或外来的(即外来核酸或外来基因)。在这些实施方案中，所述额外的核酸的表达可以由其自己的稳定性因子控制，所述稳定性因子由核中的额外核酸编码(即，与第二个核酸类似)，或这些额外的核酸的表达可以由第二个核酸编码的稳定性因子控制。在一个说明性实施方案中，一个稳定性因子与质体mRNA中稳定性因子结合元件结合，并刺激第三个核酸以及与第三个核酸可操作地连接的额外核酸(例如第四个核酸等)的表达。在这些实施方案中，表达的蛋白质可以是药物试剂、工业酶、涉及叶绿体成熟或降解的酶或营养药。在本实施方案中，表达蛋白质可以是例如抗体、疫苗抗原(例如在疫苗中使用)、抗微生物剂、或其他宿主细胞防御产物、生长激素、细胞因子、例如白细胞介素或干扰素、胰岛素、集落刺激因子、凝固因子、促红细胞生成素、生长因子、例如表皮生长因子、促生长素、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子等、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶、杀虫蛋白质、苯基氨裂合酶或其他任何药物试剂、工业酶或蛋白质营养药。

在表达的蛋白质为用作疫苗的疫苗抗原的实施方案中，表达的蛋白质或其部分可以位于细胞的细胞器上或细胞器中，所述细胞例如藻类或植物细胞。如果疫苗抗原至少部分源自病原生物，那么可以例如将藻类裂解，而疫苗抗原可用于在宿主细胞内诱导对病原体的免疫应答。

在一个实施方案中，将具有疫苗抗原的藻类作为食物施用。可施用疫苗的示范性动物包括但不限于哺乳动物、鸟类和水产养殖物种。具体而言，可以将该疫苗施用于水生脊椎动物，例如可以是硬骨鱼或软骨鱼的所有脊椎动物鱼，包括但不限于鲑亚目鱼(salmonids)(包括鳟鱼、鲑鱼和北极鲑(Artic char))、鲤鱼、鲇鱼、鲱(yellowtail)、海鳊和

鱼(seabass)。这种疫苗也可以施用于有壳的水生动物，包括但不限于蛤、龙虾、虾、蟹和牡蛎。示范性送递方法包括以干粉、正常饮食组分经口施用，以及将动物沉浸入含有该疫苗的悬浮液。

对于水生脊椎动物的情况，病原生物的实例包括但不限于沙氏肾杆菌(Rennibacterium salmoninarum)(鲑鱼、鳟鱼、红点鲑(char)和白鲑(whitefish)即鲑亚目鱼中细菌性肾病的病原体)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弧菌属(Vibrio)物种(包括鳗利斯顿氏菌(V.anguillarum)和奥氏弧菌(V.ordalii))、巴斯德氏菌属(Pasteurella)物种(包括杀鱼巴斯德氏菌(P.piscicida))、耶尔森氏菌属(Yersinia)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluria)、导致鲤鱼病毒性出血性败血症、传染性胰坏死、病毒血症的病毒、传染性造血器官坏死病毒、斑点叉尾

病毒(channel catfish virus)、草鱼出血性病毒(grass carp hemorrhagicvirus)、野田病毒科(nodaviridae)、例如神经坏死病毒(nervous necrosisvirus)或条纹鲹神经坏死病毒(striped jack nervous necrosis virus)、传染性鲑鱼贫血病毒、以及寄生物虹鳟角形虫(Ceratomyxa shasta)、多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifillius)、鲑隐鞭虫(Cryptobiasalmositica)、鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)、四膜虫属(Tetrahymena)物种、车轮虫属(Trichodina)物种和累枝虫属(Epistylus)物种，所述病原生物的抗原决定簇可以作为疫苗抗原使用在此所述的方法和系统表达在细胞表面。

在藻类内表达蛋白质的实施方案中，藻类可以是例如绿藻。例如，可以使用的藻类包括绿藻门(Chlorophyta)如Charoides(例如Charoides、丽枝藻属(Lamprothamnium)、拟丽藻属(Nitellopsis)和丽藻属(Nitella))、双星藻目(Zynematales)(例如双星藻属(Zygnema)、新月藻属(Closterium)和梭形鼓藻属(Netrium))、Codials(例如刺松藻(Codiumfragile)、Helimida opunta和蕨藻属(Caulerpa))、羽藻(Bryopsis plumosa)(例如羽藻属(Bryopsis)、假羽藻属(Pseudobryopsis)、Bryopsidella、德氏藻属(Derbesis)和拍道藻属(Pedobesia))、琉球伞藻(AcetabulariaRyukyuensis)(例如琉球伞藻、赖氏海棍藻(Halicoryne wrightii)、环蠕藻(Neomeris annulata)、Cymopolia van bossei、Bornettella ovalis和伞藻(Acetabularia calyculus))、管枝藻目(Siphonocladales)(例如法囊藻科(Valoniaceae)和棉絮藻科(Boodleaceae))、刚毛藻属(Cladophora)(例如Anadyomene writii、刚毛藻属、苏氏刚毛藻(Cladophora sauteri)和厚孢藻属(Chaetomorpha))、石莼属(Ulva)(例如石莼属和浒苔属(Fnteromorpha))、丝藻目(Ulotrichales)(例如顶管藻科(Acrosiphoniaceae)、胶衣科(Collinsiellaceae)、礁膜科(Monostromaceae)和Chlorocystidaceae)、溪菜属(Prasiola)、小球藻属(Chlorella)、绿球燥目(Chlorococcales)(例如盘星藻属(Pediastrum)和水网藻属(Hydrodictyon))、以及团藻目(Volvocales)(例如衣藻属(Chlamydomonus)、实球藻属(Pandorina)、杂球藻属(Pleodorina)和团藻属(Volvox))。

一般可用于在此申请中所述实施方案的任一种中的示范性藻类包括衣藻属物种，具体为雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻属物种和团藻属物种。雷氏衣藻，单细胞真核绿藻特别有利。可从例如Chlamydomonas Genetic Stock Center，Duke University(Durham，NorthCarolina)获得衣藻属株。可以从Chlamydomonas Genetic Stock Center容易地获得雷氏衣藻营养缺陷型突变体(与野生型不同之处在于需要一种或多种营养补充物而生长的突变体)，而且这种突变体可以通过转化DNA(即引入到细胞中的外源DNA)而遗传互补，这促进选择含有所需转基因的藻类。在其他实施方案中可以使用无能力藻类(disabled algae)。无能力藻类是经过基因工程改造的，从而使其不能增殖，除非它们处于非常特殊的受控制条件下(即，此种株将不在野生条件下生长或转移其基因)。在该公开内容上下文背景下，将这种藻类称为“无能力的”。使用这种无能力株抑制或限制用于本发明的转基因藻类向环境中的传播。

适用于在此所述的方法和系统中的示范性植物包括培养的植物细胞(原生质体和愈伤组织细胞)以及整个植物(单细胞和多细胞植物)。在各种实施方案中，植物细胞(即，培养的植物细胞或整个植物的细胞)可以来自包括燕麦、小麦、黑麦、大麦、稻、红花、玉蜀黍、豆科植物、例如苜蓿、大豆、番茄、甜菜和马铃薯植物的植物。其他有用的植物可以是例如产生果实的植物，例如产生苹果、梨、樱桃、葡萄、柑橘类果实、菠萝和香蕉的植物，和树木，例如落叶松。其他合适的植物包括油椰、茶、可可和咖啡灌木、烟草、棉花、亚麻、向日葵、牧草、草料谷类、饲料植物、以及花生和小扁豆植物。其他有用的植物包括鼠耳芥属(Arabidosis)、肥皂草属(Saponaria)、浮萍(Leminacea)、蕨类植物、藓类和苔类。在本实施方案中，通常用于植物基因工程中的载体可用于将本发明的核酸分子转移到植物细胞中。

在此公开的方法和系统中，将第一个和第二个核酸引入细胞中(例如藻类或植物细胞)。在本实施方案中，第一个核酸编码诱导型、阻抑型、或既诱导型又阻抑型的启动子，且第二个核酸编码调节质体mRNA表达的稳定性因子(即Nac2或Mbb1)。在另一个说明性实施方案中，第二个核酸可以编码翻译活化因子，例如Tbc2或Tca1。

诱导型或阻抑型启动子控制稳定性因子的表达。在各种实施方案中，取决于使用的核启动子，可以使用任何合适类型的诱导物或阻抑物(例如化学药品或改变的环境条件)。适用于在此公开的方法和系统的示范性启动子是Cyc6启动子(见图12)。可以使用其他任何合适的启动子，包括与Cyc6启动子序列具有序列相似性的启动子，例如与Cyc6启动子具有60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％的序列相似性。也可以使用在严格杂交条件下能够与Cyc6启动子互补物杂交的序列。可以使用的其他合适的诱导型或阻抑型启动子包括对诸如环境条件(例如缺氧、热、干旱或光)、化学药品、营养物、激素、病原体、伤害、食植动物(herbivory)、发育阶段和组织类型的因子应答的启动子。此种启动子为本领域技术人员所公知。启动子可以对多于一个因子应答，且单个因子可以激活或阻抑多于一个启动子。

除了Cyc6之外，衣藻属内的其他诱导型启动子包括CO₂诱导的质膜蛋白质基因的启动子(Genbank添加号U31976)、受铁的可用性严格控制的FEA1基因的启动子(Sasaki等人，1998；Rubinelli等人，2002)以及在铵和谷氨酸存在下负阻抑并且在铵缺乏的培养基中被诱导的Nit1基因的启动子(Fernández 1989)。高等植物中诱导型启动子的实例包括核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亚基的光诱导型启动子、查耳酮合酶基因的紫外线(U-V)诱导型启动子、查耳酮合酶基因的香豆酸诱导型启动子、醇脱氢酶基因的低氧诱导型启动子、以及烟草、番茄、黄瓜和鼠耳芥(arabadopsis)的发病诱导的启动子(PR-1-14)。

在诱导型和/或阻抑型启动子的控制下表达稳定性因子，并将其引入质体中，稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区直接或间接(例如，通过辅助蛋白质)结合以稳定该mRNA。在各种实施方案中，mRNA非翻译区可以在mRNA的5’或3’末端。从编码表达的蛋白质的第三个核酸转录该mRNA。在另一个说明性实施方案中，可以从额外的核酸转录mRNA，所述额外核酸与第三个核酸可操作地连接或不与第三个核酸连接，且由其自己的稳定性因子控制。由此在稳定性因子控制下在质体中产生表达的蛋白质，所述稳定性因子的表达由诱导型和/或阻抑型核启动子控制。

在一个示范性方面，稳定性因子不仅可以在mRNA的5’或3’末端或两处直接或间接与该mRNA非翻译区结合，而且也可以与mRNA的编码区直接或间接结合。在另一个示范性方面，稳定性因子可以直接或间接与mRNA结合，例如，通过与复合体中的其他辅助蛋白质结合，其中所述其他蛋白质与mRNA非翻译和/或编码区直接或间接结合。

在一个实施方案中，使用例如整合或重组(例如同源重组或其他类型的重组)将第一个和第二个核酸整合到核DNA中。在另一个实施方案中，使用引入细胞中的表达载体表达第一个和第二个核酸。在本实施方案中，载体中的第一个和第二个核酸插入片段不与核DNA重组，而是使用存在于载体中的调节序列自主表达编码稳定性因子的第二个核酸，所述调节序列包括由第一个核酸编码的诱导型和/或阻抑型启动子。可以使用本领域技术人员所知的任何合适的载体，包括这里在实施例1-4中所述的载体。

在这些实施方案每一个中，第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸。在此所述的示范性重组核酸是与Nac2编码序列(即第二个核酸)可操作地连接的Cyc6启动子(即第一个核酸)。可以使用本领域技术人员所熟知的克隆方法将第一个核酸和第二个核酸彼此可操作地连接，包括用限制酶消化核酸、并用连接酶将第一个和第二个核酸相互连接并连接到消化的载体末端的方法。此种克隆方法描述于例如Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，(2001)，在此引用作为参考，或S.Surzycki，“Basic Techniques in Molecular Biology，”Springer-Verlag(2000)，在此引用作为参考。

在第二个核酸在第一个核酸编码的启动子控制下自主表达的实施方案中，表达载体(即载体插入构建体)一般包含转录终止子以终止第二个核酸中存在的编码序列的转录，并可以含有其他5’和3’调节序列。转录终止子一般存在于第二个核酸中，但是可以整合到载体中。

在第一个和第二个核酸稳定整合到核DNA中的实施方案中，转录终止子一般存在于第二个核酸中，但是可以是部分核DNA序列。额外的5’和3’调节序列可以存在于第一个或第二个核酸中、载体中、和/或核DNA中，例如转录增强子元件和涉及mRNA稳定化的序列。在本实施方案中，载体也可以含有核靶向序列，其促进重组核酸向核DNA中的整合。在一个实施方案中，核可以具有第二个核酸的无效拷贝，或可以失去第二个核酸的拷贝或同源物。

在此描述的各种实施方案中，用于自主表达稳定性因子或将重组核酸整合到核DNA中的载体具有细菌复制起点，用于复制载体构建体以进行所需载体的大规模制备以用于克隆，其中的所需载体含有或不含插入的重组核酸(即可操作地连接的第一个和第二个核酸)。载体通常也具有用于插入DNA片段的限制性内切核酸酶切割位点(例如多克隆位点)以及用于选择转化体的选择性遗传标记。选择性标记可以是例如aadA基因或nptII的标记，其允许转化细胞在补充抗生素的培养基上生长(Goldschmidt-Clermont，Nucl.Acids Res.，第19卷，第4083-4089页(1991))。天然基因(arg7、nit1)和外来基因(ble、aphVIII、aadA、nptII)选择性标记均被开发为核转化的报道基因。

通过本领域技术人员所公知的标准转化技术将含有重组核酸(即，包括第一个和第二个核酸的插入片段)的载体引入细胞(例如藻类或植物细胞)。示范性转化方法包括电穿孔、玻璃珠介导的DNA送递、使用聚乙二醇介导的转化、生物射弹等。

在一个实施方案中，为了转化藻类，在转化前使用自溶素分解细胞壁，所述自溶素是在交配期间释放并降解细胞壁的酶。在备选实施方案中，已产生缺乏细胞壁合成能力的突变株(例如cw15cw10)，并将其用于有效转化。

在一个说明性方面，可以通过PCR和DNA印迹检测转化体。也可以使用本领域技术人员已知的其他程序，例如添加抗生素、添加铜、抗体检测(例如ELISA和蛋白质印迹)和测序。此种程序的选择取决于所用的构建体。

如果要在质体中表达转基因，那么一般如上文关于第一个和第二个核酸的讨论可以将第三个核酸整合到载体中，且制备和复制所述载体构建体。作为说明，可以使用生物射弹实现质体转化，其中含有转基因的载体在被惰性气体(例如氦)加速的金或钨微粒上被引入细胞。该方法可以对细胞引起较小损伤。在相关说明性实施方案中，可以将待转化的细胞铺平板在选择性固体琼脂培养基上，且可以通过用氦气或火药将包被DNA的钨珠加速而将其送递到质体中。使用该技术，可以实现重组DNA向质体中的有效送递。

在一个实施方案中，可以依靠编码细菌氨基糖苷腺苷酸转移酶基因(adenyl transferase)(aadA)的异源DNA的表达检测第三个核酸在质体DNA中的整合。该实施方案使得应用抗生素壮观霉素或链霉素选择转化体的方法成为可能。使用此报道构建体，可能特异性地插入、破坏、修饰、突变或缺失质体中任何非必需基因或顺式作用元件。

在另一个说明性实施方案中，可以使用以同源叶绿体靶向序列为侧翼的转基因实现用转基因转化叶绿体，其中同源叶绿体靶向序列促进转基因向叶绿体DNA的整合。在一个实施方案中，通过载体侧翼叶绿体序列与其叶绿体基因组中的同源序列之间的两个同源重组事件，可以发生转基因的整合。在一个实施方案中，叶绿体可以具有第三个核酸的无效拷贝，或可以失去第三个核酸的拷贝或同源物。

使核酸变成外来的示范性核酸修饰包括但不限于修饰核酸以实现密码子最优化、将核酸连接到其他基因的5’或3’非翻译区、向核酸添加启动子或终止序列、连接用于同源重组的序列、以及向核酸添加例如基因表达、靶向或稳定所需的其他元件。另外的修饰包括将核酸与其他天然或转基因的核酸融合以形成融合蛋白质。

图2-5显示了在本发明范围内的质体基因调节系统的示范性示意略图。图1显示质体基因调节系统的示意略图，其中核诱导型启动子在诱导物的存在下得到诱导。在本实施方案中，诱导物(例如环境条件例如低氧水平)诱导调节稳定性因子表达的启动子，且稳定性因子得到表达。翻译后，稳定性因子靶向质体，它在质体中与特定mRNA结合，这取决于表达的稳定性因子，而且mRNA和其编码的蛋白质得到表达。

图3显示示例性质体基因调节系统的示意略图，其中核诱导型启动子在不存在诱导物时得到阻抑。在本实施方案中，不存在诱导物，诱导型启动子未被激活，且稳定性因子不表达。没有稳定性因子，质体中的mRNA降解或不得到翻译，且蛋白质不表达。

图4显示示例性质体基因调节系统的示意略图，其中核阻抑型启动子在阻抑物(例如培养基中的预先确定的铜水平)的存在下受到阻抑。在本实施方案中，在阻抑物的存在下，阻抑型启动子未被激活，且稳定性因子不表达。没有稳定性因子，质体中的mRNA降解或不得到翻译，且蛋白质不表达。

图5显示示例性质体基因调节系统的示意略图，其中核阻抑型启动子在不存在阻抑物(例如培养基中降低的铜水平或培养基中不存在铜)时得到诱导。在本实施方案中，不存在阻抑物时，调节稳定性因子表达的核启动子得到诱导，且稳定性因子表达。翻译后，稳定性因子靶向质体，它在质体中与特定mRNA结合，这取决于表达的稳定性因子，而且mRNA和其编码的蛋白质得到表达。

在需要分离和纯化使用在此所述方法和系统获得的表达的蛋白质的实施方案中，可以将蛋白质表达，然后使用常规技术纯化。例如，可以以约40％纯、约50％纯、约60％纯、约70-80％纯、约90％纯、约95％纯、或约98％纯的形式获得蛋白质。对于从细胞纯化，可以将裂解物进行例如硫酸铵沉淀、继之为DEAE琼脂糖柱层析。可以使用本领域技术人员所知的其他常规技术，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE琼脂糖柱层析、亲和层析(例如使用下文实施例2中所述的FLAG标记的系统)、溶剂-溶剂萃取、超滤和HPLC。备选地，可能不要求纯化步骤，因为蛋白质可能以如此高的浓度存在以致于蛋白质在裂解物中是基本纯的(例如70-80％纯)。可以通过例如超滤和切向流过滤的技术而浓缩表达的蛋白质。

在一个实施方案中，可以通过例如超声处理、热或化学处理裂解细胞，且将匀浆离心去除细胞碎片。上清液于是可以根据需要经历硫酸铵沉淀和另外的分级分离技术，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE琼脂糖柱层析、亲和层析、溶剂-溶剂萃取、超滤和HPLC，以纯化表达的蛋白质。应当理解，用于从培养基或细胞纯化表达的蛋白质的上述纯化方法是非限制性的，且本领域技术人员已知的任何纯化技术都可用于纯化表达的蛋白质，如果需要这种技术以获得充分纯的蛋白质的话。

可以使用多种技术培养细胞(例如藻类或植物细胞)以促进蛋白质表达。用于细胞(包括藻类和植物细胞)的培养基为本领域所公知，并且一般补加碳源(例如葡萄糖或乙酸盐)。例如，如下所述，以有利于产生氢气为例，可以使用用于产生氢气的培养系统和设备培养细胞以维持所需密度。

如上文所详细讨论的，在此所述的方法和系统可用于产生氢。因此，在另一个实施方案中提供了产生氢的装置。该装置包括配置为在充分氧耗尽环境中保持细胞培养物的第一个容器、与第一个容器流体沟通并配置为以预先确定的速率将培养基抽吸入第一个容器的第一个泵、以及与第一个容器偶联并配置为测量细胞培养物产氢量的测量设备。

图7说明可用于一些实施方案中产生氢的装置10。装置10包括新鲜培养基储存容器12、泵14、反应系统16和溢出容器18。新鲜培养基储存容器12可以具体化为能够在充分密封环境下储存一定量培养基的任何类型的容器，所述培养基例如TAP(乙酸盐)或HSM(基本)。在一些实施方案中，将一定量的气体24(例如氩气)通过导管26抽吸入新鲜培养基储存容器12以清除容器12的氧，以从而形成其中充分氧耗尽的环境。导管26可以具体化为能够促进流体(例如气体)传递进入新鲜培养基储存容器中的任何类型的管、线、或其他导管。

泵14通过导管28与新鲜培养基储存容器12流体偶联，并通过导管30与反应系统16流体偶联。导管28(以及导管26，如果包括的话)与容器12偶联，从而保持新鲜培养基储存容器12的充分密封环境。导管28、30可以具体化为能够通过泵14提供的抽吸作用促进流体传递的任何类型的管、线或其他导管。泵14可以具体化为能够以预先确定速率将一定量培养基从新鲜培养基储存容器12抽吸入反应系统16、而与新鲜培养基无不利相互作用的任何类型的泵。例如，在一个特定实施方案中，泵14具体化为蠕动泵，从而降低了抽吸过程中损害培养基的潜能。

反应系统16包括反应容器20和搅拌设备22。反应容器20与新鲜培养基储存容器12基本相似，并且可以具体化为能够在充分密封的环境下储存一定量培养基和藻类培养物或其他类型宿主细胞的任何类型的容器。将新鲜培养基通过导管28、30和泵14从新鲜培养基储存容器12抽吸至反应容器16。因为新鲜培养基储存在充分氧耗尽的环境中，所以将氧非有意地引入反应容器16的可能性被降低。导管30与反应容器20偶联，从而维持反应容器12的充分密封环境。

搅拌设备22与反应容器20可操作地偶联，并且可以具体化为能够维持储存于反应容器20中的培养物处于搅拌状态的任何类型的设备。例如，搅拌设备22可以具体化为自动搅拌设备例如磁力搅拌棒组合等。

导管32从反应容器20将任何培养物溢出物排出到溢流容器18中。溢流容器18可以与容器12、20基本相似，并可以具体化为能够在其中储存一定量培养物的任何类型的容器。导管32与导管28、30基本相似，并可以具体化为能够促进流体从反应容器20向溢流容器18传递的任何类型的管、线或其他导管。与导管30类似，导管28与反应容器20连接，从而维持反应容器20的充分密封环境。导管30可以与反应容器20在某一位置偶联，从而通过将部分培养物排出到溢流容器18中，反应容器20中含有的培养物水平保持在预先确定的水平(或之内)。

在一些实施方案中，测量设备34可以通过通讯线路36与反应容器20偶联，从而可以测量容器20中培养物产生的氢或其他气体量。测量设备34可以具体化为能够测量目的气体量的任何类型的设备。在一个具体实施方案中，测量设备34具体化为质谱仪，但是在其他实施方案中，可以使用其他类型的测量设备。通讯线路36可以是能够促进与测量设备24数据通讯的任何类型的通讯线路，例如任何数目的电线、电缆、光纤电缆、管、导管等。在一个具体实施方案中，通讯线路36包括置于反应容器20中的电极部分。电极部分可以是例如银电极。

在一些实施方案中，装置10可以包括过滤系统40和第二个泵38。过滤系统40通过导管42与溢流容器18偶联，并通过导管44与泵38偶联。泵38通过导管46与新鲜培养基储存容器12偶联。导管42、44、46与导管28、30、32基本类似，并且可以具体化为能够促进流体传递的任何类型的管、线或其他导管。泵38可以与泵14类似，并且可以具体化为能够以预先确定的速度将一定量的“用过的(spent)”培养物从溢流容器18抽吸到反应新鲜培养基储存容器12、而与新鲜培养基不具有不利相互作用的泵。例如，在一个具体实施方案中，泵38具体化为蠕动泵。过滤系统40可以具体化为任何数目和类型的过滤器，并且相互连接，其能够过滤储存在溢流容器18中的培养物。

在操作中，配置泵14以以预先确定的速度将新鲜培养基从新鲜培养基储存容器12抽吸入反应系统16的反应容器20。在一个具体实施方案中，配置泵14以以基本等于反应容器20中储存的藻类细胞生长速度的速率将新鲜培养基抽吸入反应容器20。如上文所详细讨论的，因为藻类或其他宿主细胞类型在充分氧耗尽环境中储存在反应容器20中，所需基因表达在藻类或其他宿主细胞类型中得到诱导，从而增加氢产生。在从新鲜培养基储存容器12引入新鲜培养基时，如上所述，因为这种新鲜培养基在容器12中也储存在充分氧耗尽环境中，所以反应容器20的充分氧耗尽环境得到维持。备选的，在其他实施方案中，储存在反应容器20中的藻类或其他宿主细胞类型可以自我诱导。无论怎样，应当理解装置10是单相装置。即，储存在反应容器20中的藻类或另一种宿主细胞类型在相同容器中增殖并得到诱导。

在将新鲜培养基引入反应容器20中时，配置搅拌设备22以将反应容器中储存的培养物保持在连续搅拌状态。另外，由于引入新鲜培养基，所以将部分现存培养物从反应容器去除到溢流容器18中。以这种方式，反应容器20中含有的藻类或另一种宿主细胞类型的量保持在基本恒定的值。在包括泵38和过滤系统40的实施方案中，泵38从溢流容器取出一定量的“用过的”培养物，并将该培养基在过滤系统40过滤以去除其中含有的任何藻类或其他宿主细胞类型之后，再引入新鲜培养基储存容器。

参照图8，在一个具体实施方案中，产氢装置50包括新鲜培养基储存容器52、蠕动泵54、反应系统56和溢流容器62。新鲜培养基储存容器52与新鲜培养基储存容器12基本类似，且说明性地具体化为0.25升容器。一定量的新鲜培养基64说明性地具体化为例如TAP(乙酸盐)或HSM(基本)储存在容器52中。帽66与容器52偶联从而将容器52的内腔68与外部环境基本密封。导管70与帽66偶联，并且含有置于容器52的内腔68中的末端部分72。将一定量的氩气74通过导管70引入内腔68中，从而基本清除内腔的氧。

蠕动泵54通过导管76与新鲜培养基储存容器52偶联，并通过导管78与反应系统56偶联。蠕动泵54说明性地具体化为型号IP4蠕动泵，其可以通过商业途径从瑞士Ismatec of Glattburg获得。配置泵54以以预先确定的速度将一定量的新鲜培养基从新鲜培养基储存容器52抽吸入反应系统56，所述预先确定的速度基本等于反应系统56中储存的藻类培养物或另一种宿主细胞类型的生长速度。

反应系统56包括反应容器88(说明性地具体为0.25升容器)和磁力搅拌棒系统90，配置该磁力搅拌棒系统90以连续搅拌储存于反应容器88中的一定量的培养基和藻类培养物94或另一个宿主细胞类型。磁力搅拌棒系统90说明性地具体化为型号KM02磁力搅拌棒，其可以通过商业途径从瑞士日内瓦Milian获得。帽92与反应容器88偶联，从而将容器88的内腔94与外部环境充分密封。导管78与帽92偶联，并且含有位于反应容器88内腔94中的末端部分96。

质谱仪100也通过通讯线路102与反应容器88偶联。质谱仪100说明性地具体化为型号MM8-80质谱仪，其可以通过商业途径从英国VG Instruments of Cheshire获得。通讯线路102含有位于容器88内腔94中的电极104。配置质谱仪100以测量反应容器88中储存的培养基和藻类培养物或另一个宿主细胞类型的产氢量(以及在一些实施方案中的氧量)。

另外，导管106与帽92偶联，并含有位于容器88内腔94中的末端部分108。导管106的远端110位于溢流容器62内腔中。这样放置导管106从而将一定量的培养基和藻类培养物或另一个宿主细胞类型从反应容器88取出，速度基本等于反应容器88中储存的藻类或另一个宿主细胞类型的细胞生长速度。

上述描述适用于在此所述所有方法和系统。下列实施例仅为了说明目的，而无意限制在附加权利要求中定义的本发明范围。本文件中引用的参考文献在此明确引用作为参考。

实施例1

天然基因的诱导型质体表达系统

使用本领域技术人员已知的分子克隆技术构建含有在Cyc6启动子控制下的Nac2基因的载体。克隆方法描述于例如Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，(2001)中，在此引用作为参考，或S.Surzycki，“BasicTechniques in Molecular Biology，”Springer-Verlag(2000)，在此引用作为参考。

为了将Nac2基因置于Cyc6启动子元件的控制下，使用对Cyc6启动子元件和Nac2基因组DNA特异的四个寡核苷酸，通过重叠序列延伸PCR产生包含与psbD编码序列融合的Cyc6启动子的嵌合DNA片段。产生的PCR片段由与Nac2基因组序列的833个碱基对的片段符合读框地融合的Cyc6启动子序列的428个碱基对的片段组成。将该PCR片段亚克隆并测序。然后使用独特的限制位点XbaI和AatII将PCR片段克隆到pNac2(midi)质粒中。质粒pNac2(midi)含有Nac2的5.1kb嵌合midi-基因，该基因以前由Boudreau等人(2000)描述，在此引用作为参考。该基因由与3’cDNA序列融合的Nac2的5’基因组序列组成，且导致得到编码整个Nac2蛋白质的可读框(ORF)，所述Nac2蛋白质在蛋白质C末端用三HA表位进行标记。用XbaI和AatII消化pNac2(midi)。然后将PCR片段定向连接到质粒中。产生的质粒pcy6Nac2(midi)含有与Nac2 midi基因符合读框地融合的Cyc6启动子序列的428个碱基对片段。

最后，使用pSL17多克隆位点中的独特限制位点(即EcoRI和XbaI；见图9)将5.8kb的cyc6Nac2转基因克隆到pSL17质粒中。pSL17含有aphVII盒，其为克隆赋予抗生素巴龙霉素抗性及多克隆位点。使用产生的10.8kb质粒pcy6Nac2(paroR)(见图10)转化nac2-26突变细胞。在图11和12中分别提供了用于构建载体的Nac2和Cyc6序列。

通过电穿孔将pcy6Nac2(paroR)载体引入nac2无效突变体nac2-26。藻类和植物转化方法为本领域技术人员所公知，并描述于例如Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第三版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，(2001)中，在此引用作为参考。

为了分离含有Cyc6诱导型Nac2基因的转基因衣藻属株，将nac2-26细胞首先用自溶素处理，然后通过电穿孔用pcyc6Nac2(paroR)转化。将产生的转化体铺平板在补加了抗生素巴龙霉素(20μg/ml)的TAP培养基上。针对在补加了150μM镍(II)(Cyc6转录诱导物)的基本培养基和缺乏铜的基本培养基(HSM-Cu⁺²；见图13)上的光-自养生长的能力筛选巴龙霉素抗性集落。然后对光-自养株测试在缺乏诱导物的基本培养基(HSM)上生长的能力/无能力。

使用这个方式，分离转基因株cy6Nac2.49(见图13)。该株能够在HSM-Cu⁺²上光自养生长，但是不能在补加了铜的HSM上光养生长。产生的株cy6Nac2.49以两种方式生长，包括1)在缺乏铜的培养基上光自养生长或2)在细胞缺乏PSII复合体的情况下当生长培养基中存在氧和铜时，厌氧生长培养物(见图1)。因此，在转基因株cy6Nac2.49中，通过核启动子控制光合氧的产生，其中核启动子对低氧作出反应。

另外，在非诱导条件下生长的cy6Nac2.49的密封培养物将迅速变得厌氧，因为光合氧未被释放但线粒体呼吸的氧消耗却保持恒定。在cy6Nac2.49的密封培养物中，存在反馈抑制环，其中低氧诱导光合氧产生，光合氧产生然后再阻抑PSII合成及光合氧的放出。

事实上，这正是当在完全培养基中培养cy6Nac2.49的密封照明培养物时所观察到的。最初，培养物氧含量以大气水平存在，然后氧被迅速消耗，导致厌氧(anaerobis)并诱导氢放出。一段时间段的厌氧生长后，容器内培养物氧返回到大气水平的2倍，从而抑制氢放出(数据未显示)。在常规密封容器内，仅仅观察到氧消耗和氢产生的一个循环，可能是因为当减少的碳被线粒体呼吸消耗而光合氧产生保持恒定时，氧消耗停止。

测试野生型nac2-26(cy6Nac2.49的亲本株)和cy6Nac2.49细胞在完全(TAP)培养基、补加了抗生素巴龙霉素的完全培养基(TAP+Paro)、基本培养基(HSM)和缺乏铜的基本培养基(HSM-Cu⁺²)上的生长能力(图10)。图14显示对在非诱导(TAP)和诱导条件(TAP-Cu⁺²和TAP-O₂)下生长的野生型和cy6Nac2.49细胞的全细胞提取物进行的蛋白质印迹分析。以识别α-HydA、α-D2和α-RbcL的抗体探测蛋白质印迹，其中识别α-HydA的抗体作为厌氧生活的对照。

图15显示测量氢放出的实验结果。将Cy6Nac2.49细胞密封在照明容器中，在其中可以使用质谱仪测量在培养基中的溶解气体(氧-虚线，氢-实线)，然后通过向生长培养基添加铜由诱导改变为非诱导条件(TAP-Cu⁺²到TAP)。在液相测量H2浓度，并表示为毫巴(mBar)。

常规密封容器不足以维持使用转基因株cy6Nac2.49的氢产生，所以设计密封的无氧系统，以以恒定速度向生长的cy6Nac2.49培养物提供新鲜的氧耗尽培养基，以将其维持在指数生长期(见图7和8)。假定将培养物保持在指数生长期将导致氧消耗/氢产生/氧产生循环的确立。当在该系统中培养cy6Nac2.49细胞时，我们观察到在培养物开始低氧后不久氢放出的诱导。伴随着容器中氧的轻微升高，PSII复合体的合成得到诱导。不同于常规的密封容器，释放的光合氧不抑制氢产生，估计是因为光合氧产生从不超过线粒体呼吸的氧消耗。在该系统中，氢产生直接与光能关联，且从而代表了氢产生的直接生物光解方法。使用此无氧系统，我们获得了氢放出达到气相的约0.5％的恒定速度。

氧作为光合作用的副产物放出。结果，使用光能维持藻类氢放出(有时也被认为是生物光解的过程)的中心挑战是克服氢化酶的氧灵敏度。与本发明人开发的直接生物光解方法形成对比，间接生物光解方法(或两阶段光合作用和氢产生)应用光合氧和氢产生的空间和时间分离以克服氢化酶的氧灵敏度(Benemann 1996；Melis 2000)。第一阶段涉及正常的生氧光合作用：氧的释放、CO₂的固定以及生物量的累积。在第二个阶段，通过消耗重要的营养物例如硫，生氧光合作用被生理性抑制。因为生氧光合作用速率在硫饥饿约22小时后剧烈降低，所以密封的培养物由于线粒体呼吸引起的氧的净消耗而变得厌氧(Melis 2000)。一旦确立厌氧菌(anaerobia)，氢化酶途径就得到诱导，且利用电子放出氢，所述电子主要衍生自水的剩余光氧化，但是也来自内源性底物例如蛋白质和淀粉的分解代谢(Ghirardi 2000)。

无氧系统(直接生物光解方法)和间接生物光解方法之间的区别揭示了使用无氧系统的几个重要优势。首先，无氧系统固有的是，仅仅因为氧和氢产生发生在单独的照明密封容器中，氢产生能力增加50％。两阶段光合作用和氢产生方法或间接生物光解意味着氧和氢产生阶段在空间和/或时间上的分离，且结果是需要两个容器，其中一个容器在氢产生期间不使用，损失50％的生产能力。第二，两阶段光合作用和氢产生方法依赖于硫的生理性耗尽以抑制生氧光合作用。严重的硫饥饿对多种细胞过程具有广泛作用。催化氢释放的氢化酶含有Fe-S簇，其组装是其功能所必需的(Posewitz等人，(2004))。另外，硫耗尽负面影响其他重要的叶绿体复合体例如PSI，所述叶绿体复合体对于氢放出是重要的。显然，硫的生理性耗尽严重影响氢放出机制的重要部分。相反，无氧系统不依赖于重要的微量营养物的耗尽来诱导氢产生。事实上，氢产生发生在最佳生理条件下(完全培养基中的指数生长培养物)。

最后，使用例如藻类大规模产氢的主要障碍是为大的密集培养物提供光能。在大的密集的藻类培养物中，集光复合体中的大量叶绿素可以阻止光能到达容器中央的细胞。在我们的直接生物光解方法中，氢产生发生在可为最大光吸收和氢产生确立最佳细胞密度的系统中。

实施例2

外来基因的诱导型质体表达系统

叶绿体转化载体。质粒pSK108含有叶绿体DNA的3kb片段，该片段包含psbD基因和5’侧翼序列以将其指导至psbD基因周围区域(图16)。该构建体也含有插入psbD基因上游的aadA盒。可以使用pSK108的NcoI和SphI位点将转基因符合读框地插入。一旦连接，新载体就将含有转基因(加上3bps)，其中atpA的5’末端驱动其表达且rbcL的3’序列作为终止子。atpA启动子驱动编码叶绿体ATP产生性质子泵的基因的表达，并从而不受制于D1修复机制。

将三个FLAG标记的外来基因wVP28、DILP和IBVD个别地亚克隆到叶绿体转化和表达载体pCG12中(图17)。该载体整合到atpB叶绿体基因座的下游。转基因由atpA启动子驱动，并且携带psbD的5’UTR的稳定性因子结合位点(图18和19)。

将这些载体与p228载体共转化入cyc6/Nac2诱导型株，其中p228载体携带衣藻属16S rRNA基因，并且将赋予壮观霉素抗性(Cyc6启动子为控制启动子，且Nac2为稳定性因子)。

实施例3

HydA1、HydEF和HydG基因在雷氏衣藻叶绿体中的超表达

将要测试氢化酶是否可在雷氏衣藻中超表达以及这是否导致增强的氢产生。近来实验已显示，HydEF、HydG和HydA1在大肠杆菌(E.coli)中的共表达足以产生活性Fe氢化酶(Posewitz等人，(2004))。蛋白质在雷氏衣藻的核区室中的超表达鲜有成功，主要是因为转基因经常被沉默。因此，将使用生物射弹转化在叶绿体区室中表达这些基因。使用该策略具有几个优点。首先，基因沉默不发生在叶绿体中。第二，各个质体基因以80拷贝存在于雷氏衣藻中。第三，最近的实验已显示，如果这些基因由叶绿体启动子、5’和3’UTR驱动，而且如果使用偏倚的叶绿体密码子选择重新合成编码序列，那么外来蛋白质确实可能达到在叶绿体中的高表达水平(Mayfield等人.(2001))。叶绿体基因有强的AT偏倚。

考虑雷氏衣藻叶绿体密码子选择，首先重新构建HydA1、HydEF和HydG的各个编码序列。这将通过使用公开的方法而实现，所述方法已成功用于合成在叶绿体中表达的外来基因。例如，我们最近在雷氏衣藻叶绿体中成功超表达了两个病毒蛋白质(见下文)。转基因将插入叶绿体反向重复序列中，从而将其拷贝数增加两倍。将使用cyc6Nac2株作为宿主株。该株含有核nac2突变以及由Cyc6启动子驱动的Nac2基因，该启动子由铜耗尽或厌氧条件诱导。

这时尚未知HydA1p、HydEFp和HydGp蛋白质中哪一个蛋白质对于氢产生是限制性的。为了检测这一点，首先使用生物射弹转化将与psbD启动子和5’UTR融合的这三个基因中的每一个个别地插入叶绿体反向重复序列中以进行超表达。一种可能性是将基因插入在16S和23SrRNA基因之间的间隔区内的核糖体操纵子，该策略已被成功地应用于高等植物叶绿体内的高表达。因为转基因处于psbD 5’UTR的控制下，所述psbD 5’UTR通过Nac2由Cyc6启动子驱动，所以该转基因将仅在厌氧条件下表达。将通过RNA印迹杂交或实时RT-PCR监控表达。对于三个测试基因中的每一个，将通过在由管连接至充满水的倒置滴定管的封闭瓶中培养转化的细胞、并且通过从取代的水的体积直接测量气体体积而测定氢产生，如Zhang和Melis(2002)所述。如果氢产生相对于cyc6Nac2对照增加，那么这将提示超表达的蛋白质是限制性的。如果这些实验揭示多于一个这些蛋白质对于氢产生是限制性的，则使用相同的策略将两个蛋白质均表达。有可能这三个蛋白质在野生型细胞中的表达是经过调整的，从而每个蛋白质都需要超表达以增加氢产生的产量。在此情况下，将需要这三个蛋白质的超表达。多基因的表达已在高等植物叶绿体中实现(Quesada-Vargas等人.(2005))。如果用psbD 5’UTR表达不够，那么将测试其他强叶绿体启动子-5’UTR例如psbA、atpA和核糖体启动子。

实施例4

影响氢产生的基因的表达

除上述之外，将使用在质体中表达蛋白质的诱导型和/或阻抑型系统对其他几个基因测试增加的氢产生。两个实例是氧不灵敏氢化酶或缩小触角大小(antenna size)(Melias等人，(2004)；Ghirardi等人，(2005))。简而言之，前者涉及为了降低的氧灵敏度而克隆和表征来自衣藻属和其他生物的天然及诱变的氢化酶基因。后者即触角缩小(antenna reduction)的目的是减少由藻类细胞捕获的光子量，从而光可以更深入地穿透到光反应器中，因此更易于被正常受遮蔽的细胞利用。藻类细胞对捕获但不利用光是非常有效的，从而浪费高达80％的吸收的光子。通过DNA插入诱变已鉴定了调节触角大小(antenna size)的基因。突变体tla1的PSII和PSI触角大小为野生型株的50％和65％。最后，已鉴定了据具有推测增加的呼吸速率的突变株，其从而降低用于抑制氢化酶的可利用的氧水平(Krause等人，(2005))。将该基因插入cy6Nac2.49转基因株，并评价其对于该株增加氢产生的贡献。

氢产生的一个重要的限制性因素是与Calvin-Benson循环的竞争。增强到氢化酶的电子流的一种可能性是通过降低参与Calvin-Benson循环的酶量来降低Calvin-Benson循环活性。例如，可以利用磷酸核酮糖激酶(PRK)，因为存在PRK活性缺陷的两个衣藻属突变体F60和ac214。将PRK基因与诱导型Cyc6启动子融合，并将该构建体插入F60。该策略的优点是，PSII和Calvin-Benson循环将在不存在铜(或氧)时一起起作用，从而允许储存还原力。两个基因都将在铜(或氧)的存在下关闭。因此，在氢化酶受诱导的条件下，电子流将从Calvin-Benson循环转移到氢化酶，而氢产生将得到增强。

在另一个说明性实施方案中，将要筛选PRK温度敏感性突变体。在该方法中，可以在限制性温度下将Calvin-Benson循环关闭，而将电子转移到氢化酶。将用PCR产生的诱变PRK基因文库转化PRK突变体。将在许可温度下(24℃)在基本培养基上选择转化体。将集落在基本培养基上影印铺板，并将在限制性温度(32℃)下培养，且鉴定不能生长的突变体。为了验证PRK基因携带突变，将该基因通过PCR扩增并测序。也将可能通过荧光筛选突变体，因为Calvin循环的封闭可能增加这样突变体的荧光产量。

在另一个实施方案中，循环电子流代表电子从氢化酶转移的另一条路线，且我们将使用在状态1被封闭的状态转移缺陷突变体。状态转移涉及PSII(LHCII)和PSI的触角之间光激发能的再平衡，所述再平衡是在允许最佳光合作用产量的改变的光条件下，通过LHCII的可动部分从PSII向PSI可逆性取代而实现的。在状态1，LHCII的可动部分与PSII结合，而在状态2中，其与PSI结合。而且，在衣藻属中，状态1最喜好线性电子流，而状态2导致循环电子流(Finazzi等人，2002)。因此，在状态1封闭的突变体中没有循环电子流。将已知在状态1被封闭的stt7突变体(Depège等人，2003)与含有Cyc6-Nac2和Cyc6-PRK构建体的nac2-26杂交，且无论这在PSII活性受阻抑时是否导致氢产生的改进，都对其进行测定。备选的，一旦可获得温度敏感性PRK突变体，就将该突变体与nac2-26 stt7 Cyc6-Nac2株杂交。在上述条件下对这些株测试氢产生。

也将分析除了状态转移缺陷的stt7外的其他突变体。格外关注对这些突变体的分析，因为光合作用和线粒体电子流调节中的改变可以间接导致状态转移中的变化，所述调节中的改变可能改变线粒体呼吸相对于光合作用氧放出的比率。有报告称与WT细胞相比，这类突变已增加了氢产生(Kruse等人，2005)。

实施例5

外来基因的诱导型质体表达系统

将选择标记基因aadA用于诱导型叶绿体基因表达。可以将其以Nac2依赖的方式表达，易于使用抗生素壮观霉素筛选，而且已知其具有高比活性。即使是低aadA表达也导致一些抗生素抗性，并从而为Ind41_18(下述)中cy6Nac2调节的“紧密性(tightness)”提供了测量。已构建叶绿体整合载体，该载体携带驱动aadA基因表达的psbD启动子和5’UTR。

nac2-26突变株以前已经得到描述(Kuchka等人，EMBO J.7，319-324；Nickelsen等人，EMBO J.13，3182-3191)。cyc6Nac2.49株含有转基因，所述转基因由与Nac2 midi-基因融合的Cyc6启动子组成，其中Nac2 midi-基因插入nac2-26突变体的核基因组中(Δnac2::cy6proNac2)。用含有petA启动子和5’UTR的675片段置换psbD启动子和5’UTR，从cy6Nac2.49产生Ind41(Δnac2::cy6proNac2::5’petA-psbD)。除了在Ind41-18株中将aadA盒从叶绿体DNA完全切除、且该株因此对壮观霉素敏感之外，Ind41-18与Ind41株相关(Δnac2::cy6proNac2::5’petA-psbD[SpcS])。Ind_aadA_117来自Ind41-18，并且含有由psbD启动子和5’UTR驱动的aadA盒，所述psbD启动子和5’UTR插入atpB基因下游(Δnac2::cy6proNac2::5’petA-psbD::5’psbD-aadA)。

Ind_aadA转基因株的筛选

通过用pcg12叶绿体整合载体生物射弹转化铜饥饿的Ind41_18细胞，实现5’psbD-aadA盒向Ind41_18细胞叶绿体基因组中的整合(图21)。在含有100μg/ml壮观霉素的铜耗尽TAP培养基上选择转化体。挑取转化产生的集落，并在补加了100μg/ml壮观霉素的TAP-Cu+2培养基上再铺平板三次以保证5’psbD-aadA盒的完全分离。

图21显示该实验中使用的pcg12载体示意图示。使用psbD 5′UTR表达载体中的aadA盒。野生型、Ind41_18和Ind_aadA_X转基因株的生长也有显示。将这些株连续稀释，然后点样于固体TAP、铜耗尽的TAP培养基(TAP-Cu⁺²)、补加100-1000μg/ml壮观霉素的TAP(TAP-Cu⁺²+Spc)、以及补加100-1000μg/ml壮观霉素的TAP-Cu⁺²(TAP-Cu⁺²+Spc)上，并在100μE m^-2s^-1的光强度下培养7-10天。

通过在TAP+Spc100和TAP-Cu⁺²+Spc100固体琼脂培养基上影印铺板推定的诱导型aadA转基因系而实现转化体筛选。所有测试的集落在两种培养基上均生长的同样好，指示在这些株中Cyc6Nac2转基因的启动子控制的缺失(图21A)。然而，在测试高难度壮观霉素时，当在生长培养基中补加铜时，85％的测试株对壮观霉素敏感，但是在培养基中省去铜时却非如此(图21B)。选择几个这些株，命名为Ind_aadA，用于进一步表征。这些株的基因型为nac2::cy6proNac2::5’petA-psbD::5’psbD-aadA。

Ind_aadA转基因株的生长分析

从最初的筛选过程保留的几个诱导型株的生长分析通过连续稀释，然后将野生型、Ind41_18和Ind_aadA细胞点样在补加一系列壮观霉素浓度(0、100、250、500、750、1000、2000μg/ml)的TAP、TAP-Cu⁺²、HSM、HSM-Cu⁺²和固体琼脂培养基中任一个上来实现(图21B)。在以这种方式测试的11个株中，一个株即Ind_aadA_36能够在补加＞500μg/ml壮观霉素的TAP培养基上生长。另一方面，11个株中的6个能够在低壮观霉素浓度的铜耗尽的TAP培养基上生长，但是在壮观霉素浓度高于250μg/ml时不能生长(图21B)。命名为Ind_aadA_117的一个株在TAP+250μg/ml壮观霉素上培养时对壮观霉素敏感，但是在铜耗尽的TAP培养基上，能够在所有测试的壮观霉素浓度下生长。

从Ind_aadA_117提取的总RNA的RNA印迹分析

为了了解Ind_aadA_117中aadA表达的诱导，从在非诱导(TAP)或诱导条件(TAP-Cu⁺²，TAP-Cu⁺²+Spc，TAP-O₂，HSM-Cu⁺²)下培养的Ind_aadA_117细胞中分离总RNA。对这些样品的RNA印迹分析(Northern analysis)揭示，psbD转录物累积到与亲本株Ind41_18所述相同的水平，或接近野生型psbD RNA的25％。如预期的，Ind_aadA_117的psbD RNA大于野生型psbD转录物，提示真正的psbD基因(从亲本株Ind41_18继承的特征)不再存在于该株中(图22)。重要的是，在诱导Cyc6转录的所有培养物中均观察到aadA转录物的累积(图22)。在TAP培养的Ind_aadA_117培养物中存在少量aadA RNA，证实了Ind_aadA株的“泄漏”表型(图22)。令人惊讶的是，aadA转录物在Ind_aadA_117的厌氧生长培养物中比在铜饥饿培养物中更加丰富，这是未由关于psbD/D2表达与“祖本(grand-parental)”株cy6Nac2.49共享的特征(图22)。在图22所示测定中，从在TAP、TAP-Cu⁺²、TAP-Cu+2+Spc TAP-O₂₊Spc、HSM-Cu⁺²和HSM-Cu⁺²+Spc液体培养基中培养的野生型和Ind_aadA_117细胞中提取总RNA。探针示于图22左侧。

Ind_aadA_117蛋白质提取物分析

使用对几个重要的叶绿体编码蛋白质特异的抗血清通过免疫印迹分析从Ind_aadA_117细胞提取的总蛋白质。在检查的所有Ind_aadA_117培养物中，发现D2蛋白质水平约为野生型水平的约25％，低于累积50％D2蛋白质的亲本株Ind41_18(图23)。另一方面，在大多数测试的Ind_aadA_117蛋白质提取物中观察到D1和CP47蛋白质累积的完全恢复，而且在这种情况下，估计D2蛋白质累积降低了75％。因此，令人惊讶的是，D1和CP47累积不受D2蛋白质水平的调节。使用从多种条件下培养的Ind_aadA_117制备的可溶性提取物确定Ind_aadA_117中的Nac2蛋白质累积。尽管在TAP培养的Ind_aadA_117培养物中检测到少量Nac2，但在厌氧和铜饥饿的Ind_aadA_117可溶性提取物中观察到Cyc6Nac2的诱导(图23)。在Cyc6转录受到阻抑的条件下，TAP培养物中存在痕量Nac2，证明Ind_aadA株中该系统的轻微“泄漏”(图23)。因此，最初所观察到的TAP培养基上培养的Ind_aadA转基因株能够在低浓度壮观霉素存在下生长，是因为Cyc6Nac2的的一些泄漏。在图23中，从TAP、TAP-Cu⁺²、TAP-Cu+2+Spc TAP-O₂+Spc、HSM-Cu⁺²和HSM-Cu⁺²+Spc液体培养基中培养的野生型和Ind_aadA_117细胞提取总蛋白质，并且将总蛋白质大小分级分离并固定在PVDF膜上。探针示于图23左侧。

Ind_aadA_117的aadA测定

通过测量其活性而间接估计aadA的量(表1)。该测定基于aadA酶将ATP分子的腺嘌呤部分转移到壮观霉素、从而给壮观霉素分子添加正电荷的能力。带正电荷的壮观霉素分子可以结合携带负电荷的磷酸纤维素膜。因此，如果在壮观霉素和α³²P-标记的dATP存在下温育表达aadA的衣藻属粗提取物，那么经过将反应物点样并洗去非特异性产物后，存在于磷酸纤维素膜上的放射性的量为aadA酶活性提供了相对测量。使用在TAP、TAP-Cu⁺²、TAP-Cu⁺²+Spc的任一种液体培养基中培养的Ind_aadA_117细胞粗提取物，以测量该转基因株与亲本株和在野生型背景上表达传统aadA盒的其他株相比的aadA活性。几个独立测定的组合结果示于表1。在Ind41_18中没有检测到aadA活性，从而证明该盒从此株中的去除是完全的。另一方面，在表达传统aadA盒的野生型株及在TAP-Cu⁺²和TAP-O₂中培养的Ind_aadA_117中，aadA活性均与以前报导的表达aadA的转基因株类似(表1)。TAP培养基中培养的Ind_aadA_117的粗提取物中也存在微弱但却显著的aadA活性。该结果证实非诱导的Ind_aadA_117中存在少量的aadA活性，尽管该活性仅为Ind_aadA_117诱导的培养物活性的部分。

使用cy6Nac2叶绿体诱导型基因表达系统筛选能够诱导aadA基因表达的株，持续导致具有“泄漏”表型的株的恢复。因为证实Cyc6Nac2转基因在亲本株中受到严格调节，所以经过推理，认为Ind_aadA中Cyc6Nac2转基因的脱阻抑是经受得住筛选程序的先决条件。对于此观察的一个可能的解释是，用于筛选程序各步骤中的铜耗尽培养基中，包括用于以pcg12生物射弹转化Ind41_18的培养基，最初有很少量的铜污染。如果的确是这种情况，则可以预测直到铜污染降低到低于2×10⁶离子/细胞的时候，将发生Cyc6转录的瞬时阻抑，而且作为结果，仅仅那些脱阻抑Cyc6Nac2的转化体将经受得住以pcg12质粒的最初转化。换句话说，假设Cyc6Nac2转录的阻抑足够长以负面影响细胞在补加壮观霉素的培养基中的存活；经受得住最初转化中的所有集落均由单个细胞产生，所述单个细胞不分裂，除非Cyc6Nac2已脱阻抑。培养基污染被看作是不可避免的，因为已充分记录到即使微小浓度的铜也阻抑Cyc6的转录。实际上，设计用于研究cy6Nac2.49中铜介导的阻抑动力学的实验揭示，将铜饥饿的cy6Nac2.49细胞重悬于铜耗尽培养基中，瞬时阻抑了Cyc6Nac2转录，并将真正Cyc6基因座的转录阻抑了1至2个分裂周期。

然而，Ind_aad_117转基因株显示，可能基于核编码的Nac2蛋白质为衣藻属设计诱导型叶绿体基因表达系统。转基因Ind41_18株可用于诱导任何由整合到叶绿体基因组中的psbD 5’UTR驱动的嵌合基因的表达，前提是psbD 5’UTR能够驱动目的基因的表达。

对于表1中的测定，在诱导和阻抑条件下测定Ind41_aadA-117中氨基糖苷腺苷酸转移酶的活性。测定WT-aadA、Ind41_18和Ind41aadA-117株提取物的aadA活性和总蛋白质含量。将活性显示为每μg蛋白质掺合的cpm。独立实验数显示于括号中。

表1

株	+Cu	-Cu
株	+Cu	-Cu	WT	1.4+/-2.0	nd
WT-aadA	207.0+/-49.5(3)	192.6+/-51.4(4)	WT	1.4+/-2.0	nd
WT-aadA	207.0+/-49.5(3)	192.6+/-51.4(4)	Ind41_18	9.2+/-4.1(4)	12.2+/-7.9(4)
Ind41_117	24.2+/-12.5(4)	274.3+/-90.6(7)	Ind41_18	9.2+/-4.1(4)	12.2+/-7.9(4)

VP28_FLAG、IBVD_FLAG和DILP_FLAG的诱导型表达

为了测试是否能够将在此所述的诱导型叶绿体基因表达系统应用于产生外来蛋白质，选择三个不同的外来蛋白质用于使用5’psbD驱动的转基因的异源表达：VP28、DILP和IBVD。使用IBVD(或VP2)产生疫苗，用于在家禽中控制传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal DiseaseVirus，IBDV)(Mundt 1995)。经证明，作为亚基疫苗喂饲时，斑节对虾(Penaeus monodon)白斑病综合征病毒主要结构包膜蛋白的23kD片段VP28保护虾免受感染(Witteveldt 2004)。

Stefan Surzycki博士(Indiana University，Bloomington)作为礼物提供了具有对雷氏衣藻叶绿体遗传机制最优化的密码子偏倚的三个FLAG标记的外来基因VP28、DILP和IBVD，将其个别地亚克隆到叶绿体转化和表达载体pcg12中，从而psbD的5’UTR驱动以rbcL 3’UTR为终止子的外来蛋白质的表达(图24A)。因为这些新构建体缺乏选择标记，所以转化体的形成需要与携带选择标记的另一个叶绿体整合载体共转化(图24A)。

图24A显示用于诱导果蝇属(Drosophila)胰岛素样肽表达的实验中使用的pcg12_DILP载体的示意图。黑色框代表DILP编码序列。箭标代表psbD基因的5’前导序列。星号显示3HA-11表位的插入。图24B中显示了以识别FLAG表位的抗体探测的、使用从Ind_VP28(左上)、Ind_IBVD(右上)或Ind_DILP(下图)提取的总蛋白质的免疫印迹。蛋白质的预测分子量为VP28-23kD、IBVD-49kD、以及DILP-12kD，且以星号指示。

将这些载体与携带ycf1基因和侧翼叶绿体序列以及赋予壮观霉素抗性的aadA盒的pY1_INT载体共转化入Ind41_18株。在用壮观霉素改善的TAP板上选择之后，使用PCR以扩增外来基因的寡核苷酸对推定的转化株测试该基因的存在。在通过PCR就转基因共插入测试的10个集落中，七个为VP28和DILP阳性，且五个为IBVD基因存在阳性。将这些系命名为IndVP28_x、IndDILP_x和IndIBVD_x，并且具有nac2.Cyc6_proNac2::5’petA-psbD::5’psbD-VP28/DILP/IBVD基因型。

对于叶绿体基因组中插入外来基因测试为阳性的集落，也在铜饥饿诱导基因后用

抗体使用免疫印迹分析测试蛋白质生产。在用该方法测试的22个转基因系中，由于23kD蛋白质在来自IndVP28的提取物中得到诱导，所以8个中的8个看起来累积VP28蛋白质，所述23kD蛋白质既不在野生型中、也不再非诱导对照中存在(图24B-左上)。当这些细胞得到诱导时，从在分析的6个IndDILP株中的4个中提取的总蛋白质也累积了＞25kD的蛋白质(图24B-下图)。用这种方法测定到50kD蛋白质在7个IndIBVD株的三个中累积(图24B-右上)。

图25基于从IndDILP株提取的总蛋白质的免疫印迹显示，DILP_FLAG的表达在最初的筛选实验中得到诱导。在补加50μg/ml壮观霉素的TAP(ui)或TAP-Cu⁺²(i)液体培养基中培养IndDILP株，并且在15％SDS-PAGE凝胶上大小分级分离。然后将得到的免疫印迹与识别FLAG表位的抗体温育。从表达FLAG标记的Alb3.1蛋白质的转基因株提取的总蛋白质用作实验中检测FLAG表位的阳性对照。星号指示插入pcg12_DILP载体的DILP_FLAG肽的预测大小。

当Cyc6转录相对于诱导受到阻抑时，通过比较从这些株提取的蛋白质，进一步表征提取自三个IndDILP系的的蛋白质，所述系显示表达DILP蛋白质。在测试的四个IndDILP株中，两个似乎正确诱导作为12kD蛋白质的DILP_FLAG的生产。因此，在此开发的叶绿体诱导型表达系统诱导DILP的表达。该发现特别引人注意，因为以前在雷氏衣藻叶绿体中以组成型方式表达DILP蛋白质的尝试从未导致高水平表达(StefanSurzycki，私人通信)。因此，诱导型叶绿体基因表达系统可以提供外来蛋白质、尤其是那些抵抗组成型表达的蛋白质的诱导型表达的商业相关工具。

实施例6

影响氢产生的基因的表达

株和培养基

nac2-26突变株以前已有描述(Kuchka等人，EMBO J.7，319-324；Nickelsen等人，EMBO J.13，3182-3191)。cyc6Nac2.49株含有由与Nac2midi-基因融合的Cyc6启动子组成的转基因，所述Nac2 midi-基因插入nac2-26突变体的核基因组中(Δnac2::cy6proNac2)。通过用含有petA启动子和5’UTR的675片段取代psbD启动子和5’UTR，由cy6Nac2.49衍生Ind41(Δnac2::cy6proNac2::5’petA-psbD)。除了在Ind41-18株中aadA盒被完全从叶绿体DNA切除、且该株因此对壮观霉素敏感之外，Ind41-18与Ind41株相关(Δnac2::cy6proNac2::5’petA-psbD[Spc^S])。Ind_aadA_117由Ind41-18衍生，并且含有受插入到atpB基因下游的psbD启动子和5’UTR驱动的aadA盒(Δnac2::cy6proNac2::5’petA-psbD::5’psbD-aadA)。所有株均于25℃暗淡光下维持在补加1.5％细菌培养用琼脂的TAP(Tris-乙酸盐-磷酸盐)上。在采用铜补加或铜缺乏(-Cu⁺²)固体琼脂和液体TAP和HSM培养基的实验中，依照Quinn和Merchant(Methods in Enzymol.297，263-279)制备培养基。需要时，给TAP和TAP-Cu⁺²培养基补加100μg/ml壮观霉素(Sigma-Aldrich)或20μg/ml巴龙霉素(Sigma-Aldrich)。在使细胞除尽氧的实验中，用N₂气以150rpm/分钟搅拌和持续光照(20μE/m^-1s^-2)使液体培养基起泡。使用血细胞计数器确定细胞密度。

质粒构建

使用标准技术操作并分析所有质粒构建体。使用BigDye终止子测序试剂盒(Applied Biosystems，La Jolla，CA)和ABI Prism 377自动测序机器(ABI)执行构建体的测序。用于在大肠杆菌中克隆的细菌宿主是DH10B(Amersham Biosciences)。所有寡核苷酸均订购自MicrosynthGmbH(Balgach，CH)。

衣藻属细胞的转化

基本按照Shimogawara等人Genetics 148，1821-8所述通过电穿孔实施雷氏衣藻株nac2-26的核转化。

叶绿素和氧放出速率测量

使用附着于X型光源的Clark型氧电极在25℃确定氧放出和呼吸速率(Hansatech Instruments Ltd.，Norfolk，UK)。

氢测量和计算

如下实施N₂、O₂、H₂和CO₂的所有液相和气相测量。使用可密封的恒温Clarks型容器进行溶解气体的连续监控，其中在连续搅拌和使用纤维光学照明装置(型号KL 1500，Schott，Mainz，德国)持续照明下，通过聚丙烯膜将其中气体注入质谱分光光度计离子源(型号MM 880；VGInstruments，Cheshine，英国)。在Cy6Nac2转基因转录受阻抑的实验中，将12μM铜加入容器中的生长培养基(TAP-Cu⁺²至TAP)。通过向离子源直接注射空气和纯氢气样品，实现所有气相时间点之前的质谱仪的校准。

aadA活性测定

除了使用³²P标记的dATP替代在起初实验中使用的放射标记的rATP外，基本按照Goldschmidt-Clermont，Nucleic Acids Res 19，4083-9中所述，在wt、Ind41-18和Ind_aadA_117株上进行aadA活性测定。

质粒构建-pRS1_rcy_aadA构建

使用质粒pKS-108#14构建质粒pRS1_rcy_aadA，pKS-108#14质粒含有雷氏衣藻叶绿体DNA EcoRI R3片段，其中aadA盒插入相对于psbD ATG起始密码子的-263碱基对的位置。为了用petA 5’UTR取代psbD 5’UTR，使用重叠序列延伸PCR以寡核苷酸RS1、RS2、RS3和RS4产生943bp的嵌合DNA片段，该DNA片段包含与psbD编码序列融合的petA 5’UTR(表2)。将得到的PCR产物用PvuII/ClaI限制性内切核酸酶消化，并连接到用相同酶消化的质粒pKS-108#14中，以产生pRS1质粒。叶绿体诱导型表达系统的设计涉及要求两个不同选择标记的两个连续的叶绿体转化。可选择地，可能使用修饰的aadA盒循环利用aadA，所述修饰的aadA盒侧接483bp的同向重复，从而允许在去除选择压后通过同源重组有效去除该盒。通过首先用ClaI和SphI切割pRS1，然后用T4 DNA聚合酶填补产生的6.3kb质粒的5’和3’末端，实现可循环利用的aadA盒向pRS1内的克隆。这导致与aadA编码序列融合的atpA启动子5’UTR从pRS1质粒切除，但是并没有去除rbcL的3’序列。通过首先用SacI和KpnI限制性内切核酸酶将可循环利用的aadA盒从pKS-483-aadA-483质粒切除，并用T4 DNA聚合酶和PNK激酶将两个末端平端化，实现可循环利用的盒向pRS1ΔaadA中的插入。完成2.8kb可循环利用的aadA盒的向pRS1ΔaadA中的平端连接，以产生pRS1_rcy_aadA(图27)。

pcy6Nac2(paroR)的构建

为了用与Nac2编码序列符合读框地融合的428bp的Cyc6启动子序列构建质粒，采用Nac2的5.1kb嵌合midi-基因。简而言之，质粒pKS(-)nac2(midi)含有3.0kb的5’Nac2基因组序列，该序列在Nac2编码序列内的SfrI限制位点结束，所述5’Nac2基因组序列与1.96kb的Sfr1/XhoI片段融合，所述Sfr1/XhoI片段含有用3HA、6His和9Myc表位进行标记的3’cDNA序列，所述表位正好在终止密码子的上游与Nac2编码序列符合读框地引入。为了将Nac2基因置于Cyc6启动子控制下，使用对Cyc6启动子元件和Nac2基因组DNA特异的4种寡核苷酸，通过重叠序列延伸PCR，产生包含与Nac2编码序列融合的Cyc6启动子的嵌合DNA片段。产生的PCR片段由与833bp的基因组Nac2片段符合读框地融合的428bp的Cyc6启动子片段组成。然后使用pKS(-)Nac2(midi)的独特限制位点XbaI和AatII，将PCR片段克隆到pNac2(midi)质粒中。最后，使用pSL17的独特位点EcoRI和XbaI，将5.8kB的Cyc6Nac2转基因克隆到pSL17质粒中。该质粒含有赋予巴龙霉素抗性的aphVII盒。将产生的10.8kb质粒pcy6Nac2(paroR)用于转化nac2-26突变细胞。

衣藻属细胞的转化

在TAP培养基中培养nac2-26细胞，并在对数中期(2-4×10⁶细胞/ml)收获，并用配子自溶素处理，然后重悬在TAP+40mM蔗糖培养基中。对于每次电穿孔，将10⁸个经过处理的细胞与2.5线性化pcyc6Nac2(paroR)或pSL17质粒DNA(以确定电穿孔效率)、加上50μg鲑精DNA温育，然后使用Biorad(SIC)在0.2ml电穿孔杯(Biorad，USA)中通过电穿孔转化，所述Biorad(SIC)设定为0.75kV、25μF及无阻抗(Biorad，USA)。在1ml新鲜TAP、40mM蔗糖、0.4％PEG-8000、20％淀粉培养基中将经过处理的细胞回收10分钟，并铺平板在补加抗生素巴龙霉素(20μg/ml)的TAP培养基上。就在强光下(45μEm^-2s^-1)，于25℃在缺乏铜的基本培养基(HSM-Cu⁺²)中光-自养生长能力筛选巴龙霉素抗性集落。然后对光-自养株测试在基本培养基(HSM)上生长的能力/无能力。

用氦驱动基因枪实施衣藻属的叶绿体生物射弹转化。将10⁸个TAP培养的cy6Nac2.49铺平板在补加100μg/ml壮观霉素的固体琼脂TAP(TAP+Spc100)上，并用包被1μg pRS1_rcy_aadA质粒DNA的钨粒子轰击。在暗淡光(5μEm^-2s^-1)中2周后，挑取单个集落，并在TAP+Spec100培养基上再克隆4次，然后在暗淡光(5μEm^-2s^-1)中于25℃培养，以确保这些株关于选择标记是同质的。为了测试光-自养生长，将细胞铺平板在固体HSM培养基上，并于25℃在中等光(45μEm^-2s^-1)中培养。对于转化Ind41_18的情况，将10⁸个TAP-Cu⁺²细胞铺平板在补加100μg/ml壮观霉素的固体TAP-Cu⁺²培养基(TAP-Cu⁺²+Spc100)上，并用包被1μg pcg12质粒DNA的钨粒子轰击。在暗淡光(5μEm^-2s^-1)中两周后，挑取单个集落，并在TAP-Cu⁺²+Spc 100培养基上再铺平板3次，且在暗淡光(5μEm^-2s^-1)中于25℃培养。

生长分析

为了wt、nac2-26、cy6Nac2.49株的生长分析，将细胞在TAP-Cu⁺²培养基中培养到2-4×10⁶细胞/ml的密度，然后稀释到1×10⁶细胞/ml的密度，随后为10倍连续稀释，从而估计最后的稀释物在铺平板时含有100个细胞。然后在合适的固体琼脂板上将各个稀释物的10μl等分试样点样，并于25℃在强光下培养10天。对于Ind41和Ind41-18株的情况，将10³个细胞铺平板在合适的培养基上，并于25℃在连续照明(100μEm^-2s^-1)下培养10天。对于诱导型aadA转基因系的生长分析实施实验。简而言之，在TAP-Cu⁺²或TAP液体培养基中培养wt、Ind41-18和Ind_aadA转基因系，然后向新鲜TAP-Cu⁺²或TAP液体培养基转移3次。将TAP和TAP-Cu⁺²生长培养物的连续稀释物铺平板在补加渐增浓度壮观霉素(0-1000μg/ml)的TAP培养基或TAP-Cu⁺²固体琼脂板上，并于25℃在连续照明(100μEm^-1s^-2)下培养10天。

荧光瞬变(Fluorescence transient)

实施荧光瞬变。在暗适应5分钟后，用植物效率分析仪(PlantEfficiency Analyzer)(PEA，Hansatech Instruments，UK)分析黑暗中生长于TAP琼脂上的细胞。

RNA分析

使用RNA Plant Mini RNA提取试剂盒，根据制造商说明书(QiagenGhmb，德国)从wt、nac2-26、cy6Nac2.49、Ind41_18和Ind_aadA_117株分离总RNA。对于在时程实验期间取得的RNA的情况中，将10⁸个细胞在3000g离心，并根据制造商说明书使用RNAeasy RNA保护溶液(Ambion，USA)处理。

实施RNA印迹分析。在1X MOPS缓冲液中，将RNA(2μg)在1.2％琼脂糖-4％甲醛凝胶中电泳，然后在20X SSC缓冲液中转移到HybondN+尼龙膜(Amersham，USA)上，并使用Stratalinker交联烤箱紫外线交联到膜上。在改良的Church’s杂交溶液(0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)、7％SDS(w/v)、10mM EDTA)中于65℃进行膜的预杂交和杂交。通过用AccI和StyI消化质粒pks-108#14分离psbD的380bp DNA片段以用作探针，并使用随机引发技术用[α³²P]dATP进行标记。使用随机引发技术，用[α³²P]dCTP标记Cyc6 cDNA的685bp DNA片段。通过消化pcg12质粒分离aadA编码序列的804NcoI/SphI片段以用作探针，并使用随机引发技术用[α³²P]dATP进行标记。通过用EcoRV和HpaII消化pcg12分离atpB的693bp的片段用作探针，并通过随机引发用[α³²P]dATP进行标记。杂交后，用高严格性洗涤缓冲液[0.1％SDS，0.1％SSC]在65℃将膜洗涤10分钟。

蛋白质分析

通过将3×10⁶个细胞收集在1.5ml Eppendorf管中，并将沉淀重悬在Sigma蛋白酶抑制剂混合物的2x溶液(Sigma-aldrech，USA)中，随后在37℃于等体积细胞裂解缓冲液(100mM Tris-HCl pH 6.8，4％SDS)中裂解30分钟，制备wt、nac2-26、cy6Nac2.49、Ind41_18和Ind_aadA_117衣藻属株总蛋白质提取物。将样品于10,0000g离心5分钟以沉淀细胞碎片，并将上清用作总蛋白质提取物。为了确定蛋白质浓度，使用Bradford方法(Bio-Rad蛋白质测定(Bio-Rad Protein Assay)，BioRad，USA)测定5μl上清液。

对于免疫印迹分析，在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离20μg总蛋白质，并转移到Protran 0.45μm硝酸纤维素膜(Schleicher和Schuell)。当采用Nac2抗体时，将80μg蛋白质上样于8％聚丙烯酰胺凝胶上。在Tris缓冲盐溶液(含有5％脱脂乳粉和0.1％Tween-20)(TBS-T)中将膜封闭。对于第一抗体反应，如下在TBS-T中稀释：D2抗体，1∶10,000稀释；D1抗体，1∶10,000；Nac2抗体，1∶10,000；PsaA抗体，1∶10,000；AtpB抗体，1∶10,000；核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-全(Holo)抗体，1∶50,000。在室温下实施1小时温育。随后，将膜在含有1％脱脂乳粉的TBS-T中洗涤5次，进行5分钟。对于第二抗体反应，在室温下将膜与连接过氧化物酶的抗兔IgG(在含有1％脱脂乳的TBS中)温育1小时，所述IgG的最终抗体稀度为1∶10,000。将膜在TBS中洗涤5次，进行5分钟，并通过增强的化学发光显现信号。

铜介导的阻抑及时程实验

为了随时间推移追踪cy6Nac2.49转基因株中铜介导的Cy6Nac2阻抑，将cy6Nac2.49细胞在TAP-Cu+2培养基中培养到4×10⁶细胞/ml的密度，在新鲜TAP-Cu+2培养基中稀释到5×10⁵细胞/ml的密度，然后分为两个独立培养物，其中一个保持未处理，而另一个在生长培养基中添加铜至终浓度6μM。然后每8小时从各个培养物取时间点，进行40小时。将两个独立样品用于FV/FM测量，并在所示时间点确定各培养物的平均值。

除了在TAP培养基中培养cy6Nac2.49的预培养物(pre-culture)，而且在TAP-Cu⁺²培养基中以5×10⁵细胞/ml浓度稀释之前将细胞在铜耗尽培养基中洗涤两次之外，如铜介导的阻抑实验所述进行测试cy6Nac2.49的铜介导的诱导的实验。为了开始时程实验，将细胞分为两个单独的培养物，并且向其中之一中加入铜至终浓度6μM。

氢测量

在硫除尽下将cy6Nac2.49株的氢产生与野生型的作比较。在图32中所用的cy6Nac2.49培养物中，一个周期过程中产生了20μmol H₂/L，相当于1mmol H₂mol^-1Chl s^-1的最大速率。这些速率在实验之间有变化，并在有些情况下达到3.1mmol H₂mol^-1Chl s^-1。在允许光合作用的条件下(Cu除尽培养基)，Cy6Nac2.49细胞中的氧放出净速率为23mmolO₂mol^-1Chl s^-1。该速率为野生型细胞的1.5-2倍。因此，氢产生的最大速率在净氧产生速率的4％到13％之间变化。对于经历硫饥饿100小时的培养物的情况，可以估计平均值为4mmol H₂mol^-1Chl s^-1。如果人们将由cy6Nac2.49细胞在一个周期中产生的20μmol H₂/L与硫饥饿野生型培养物在100小时过程中产生的4mmol H2/L比较，显而易见的是，为了获得类似的氢产生，cy6Nac2.49系统仍然需要进一步改进，无论是每循环更高的效率，还是循环的紧密束缚(close enchainment)。基因改造衣藻属以改进氢产生在理论上是可能的，例如通过使用阻断在状态1、不能进行循环电子流的状态转移突变体，或通过用Cyc6启动子驱动Calvin-Benson酶之一。在该方法中，在PSII活性和氢产生相期间电子竞争降低的同时，碳同化也将降低。

表2.寡核苷酸列表

名称	序列5’-＞3’[]	限制位点
名称	序列5’-＞3’[]	限制位点	RS1	5’GGATCGATGCAGGCAGTGGCGGTACC3’	EcoRI
RS2	5’GATATGTACCGATCGCAATTGTCATAATTTTATTAATCTTAAAAC3’	N/A	RS1	5’GGATCGATGCAGGCAGTGGCGGTACC3’	EcoRI
RS2	5’GATATGTACCGATCGCAATTGTCATAATTTTATTAATCTTAAAAC3’	N/A	RS3	5’GTTTTAAGATTAATAAAATTATGACAATTGCGATCGTACATATC3’	N/A
RS4	5’GGCAGCTGTTAAGAAGTTACAACCTTC3’	PvuII	RS3	5’GTTTTAAGATTAATAAAATTATGACAATTGCGATCGTACATATC3’	N/A
RS4	5’GGCAGCTGTTAAGAAGTTACAACCTTC3’	PvuII	Cy6Pro-1		XbaI
Nac2-Cyc6-1	5’CGGTAGAGCCCCCATATGGATGGAGTAGGT3’	NdeI	Cy6Pro-1		XbaI
Nac2-Cyc6-1	5’CGGTAGAGCCCCCATATGGATGGAGTAGGT3’	NdeI	Nac2-Cyc6-2	5’ACCTACTCCATCCATATGGGGGCTCTA3’	NdeI
Nac2(+1260)	5’ACCACAGAGCCCTGCCAG3’	N/A	Nac2-Cyc6-2	5’ACCTACTCCATCCATATGGGGGCTCTA3’	NdeI

对于衣藻属，不存在天然的诱导型叶绿体基因表达系统。这样的系统是通过利用核编码的叶绿体Nac2蛋白质的性质而开发的。该蛋白质是psbD mRNA加工和稳定累积所需的，所述psbD mRNA编码PSII的D2反应中心多肽。Nac2的靶位点包含在74个核苷酸的psbD 5’UTR中。该5’UTR与另一个编码序列的融合使得该基因的表达依赖于Nac2。Nac2编码序列已与细胞色素C₆基因的Cyc6启动子融合，所述细胞色素C₆基因的表达由铜耗尽、厌氧生活以及添加镍而诱导，但是在充分供应铜的条件下抑制。因为Nac2对psbD 5’UTR的特异性，原则上，可通过将其编码序列与psbD 5’UTR融合，将该系统用于任何叶绿体基因的诱导型表达。

如上所述，将Cyc6-Nac2构建体插入含有aphVIII基因的质粒中，所述aphVIII基因赋予巴龙霉素抗性(图28A)。使用巴龙霉素抗性用于进行选择，将该质粒用于转化衣藻属nac2-26突变体。在测试的55个转化体中，两个显示铜对Nac2表达的正确控制。上文讨论了这些转化体之一cy6Nac2.49、WT以及nac2-26突变体的生长特性(图28B)。如所预期的，所有这三个株在含有或不含有铜的TAP培养基上生长，而且转化体也在巴龙霉素的存在下生长，因为它们含有选择标记aphVIII。仅WT细胞在含有铜的基本培养基上生长。然而，cy6Nac2.49株的生长在缺乏铜的基本培养基上恢复。也可以通过添加镍而恢复生长，因为Cyc6启动子由该金属诱导。在不同生长条件下通过RNA印迹杂交确定psbD表达水平(图28C)。如所预期的，psbD RNA在nac2-26突变株中不可检测。与cy6Nac2.49株形成对比，psbD的表达在Cyc6表达之后，并在不存在铜或在厌氧条件下诱导(图28C)。使用D2抗血清通过免疫印迹检查psbD产物D2的水平(图28D)。在所有条件下，D2蛋白质在培养在TAP板上的nac2-26细胞中都不可检测。然而在cy6Nac2.49中，当细胞在不存在铜或在厌氧条件下时，它累积到野生型水平的20％(图26)。在基本培养基上，D2的诱导稍低。如所预期的，其他PSII蛋白质例如CP47遵循与D2类似的模式，因为已知这些蛋白质在D2蛋白质不存在时是不稳定的。相反，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶蛋白质水平(RbcL)不受nac2-26影响(图28D)。

为了评定在抑制Nac2合成后将细胞耗尽PSII所需的时间，首先将cy6Nac2.49细胞在铜耗尽TAP培养基上培养。在这些条件下，PSII合成并累积。将培养物分成两半，一个培养物维持在铜除尽下，而将铜加入另一个培养物。在各个时间点确定细胞密度和F_V/F_M比(可变/最大荧光)的时程，所述时程提供对PSII量子产额的估计(图29A)。在铜的存在下，F_V/F_M比在32小时内降低到最小值。在此时间段期间，在两种条件下，细胞都分裂了3-4倍，并达到稳定期。在各个时间制备细胞提取物用于RNA和蛋白质分析。Cyc6和psbD RNA水平在添加铜后8小时显著降低并从那以后不可检测(图29B)。其他叶绿体RNA(atpB、rRNA)在这些条件下稳定。免疫印迹揭示D2量在添加铜后减少，与其mRNA的降低相比存在滞后(图29C)，且另一个PSII核心蛋白质D1也降低。如所预期的，也观察到Nac2的降低。相反，来自PSI(PsaA)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的叶绿体蛋白质稳定(图29C)。

在相反实验中，将在铜存在下培养的细胞转移到缺乏铜的TAP培养基，并确定细胞密度和F_V/F_M的时程。F_V/F_M仅在25小时的滞后之后开始增加，推测所述25小时的滞后是耗尽内部细胞铜储备所需的时间(图30A)。通过RNA印迹分析和蛋白质免疫印迹测定不同时间点细胞提取物的RNA和蛋白质(图30B，C)。尽管16小时后可以检测到Cyc6 RNA，psbD RNA累积和PSII活性延迟，推测是由于psbD mRNA累积和D2合成需要Nac2阈水平的事实。

与PSII无关的叶绿体基因的诱导型表达

尽管Nac2系统可用于以可逆方式耗尽PSII，但我们测试了是否可以将其扩展到任何其他叶绿体基因。这在理论上是可能的，因为Nac2蛋白质特异性作用于psbD 5’UTR，并且可以驱动嵌合psbD 5’UTR报道基因。因此它应该足够与目的基因的psbD启动子和5’UTR融合。然而，在那些条件下，由于nac2-26突变导致丧失psbD RNA，PSII不再累积。为了避免这种情况，将petA启动子和5’UTR与psbD编码序列融合，并将该构建体引入p108-14叶绿体转化载体的改良形式中。在该载体中，可循环利用的aadA盒插入到psbD基因上游，所述psbD基因由petA启动子盒5’UTR驱动(图27A)。使用aadA盒作为选择标记，通过生物射弹转化将该DNA插入叶绿体基因组。在该方法中，用petA-psbD构建体取代内源性psbD基因，且因此其转录物的累积不再依赖于Nac2。将转化体在壮观霉素板上重复划线三次，并通过DNA印迹和PCR分析测试同质性(homoplasmicity)，且转化体之一Ind41得到选择。所用的aadA盒侧接两个重复序列。为了允许该盒的切除，将同质转化体Ind41重复铺平板在缺乏壮观霉素的培养基上。以这种方法获得对壮观霉素敏感的Ind41_18株，因为它缺乏aadA盒。在不同培养基上测试Ind41、Ind41_18和cy6Nac2.49的生长性质(图27B)。Ind41在壮观霉素存在下如期生长，与对抗生素敏感的Ind41_18形成对比。此外，Ind41和Ind41-18都在含有或不含铜的HSM基本培养基上生长。RNA印迹分析揭示Ind41_18中嵌合petA-psbD RNA在所有条件下累积，这不依赖于Cyc6RNA水平(图27C)。psbD RNA较大，因为petA 5’UTR的大小超过psbD5’UTR的大小。免疫印迹分析揭示D2和D1蛋白质在所有测试的条件下都累积到相同水平，尤其当Nac2不表达时(图27D)。

接下来，通过使用cg12载体转化将与psbD启动子和5’UTR融合的aadA盒引入该株(图31A)。在含有渐增量的壮观霉素、含有或不含铜的TAP板上测试转化体Ind aadA-117和Ind41_18的生长(图31B)。所有株在铜不存在(图31B)或存在下生长。如所预期的，Ind_aadA-117仅在不存在铜时在250μg/ml或更高浓度的壮观霉素板上生长。在含有100μg/ml壮观霉素的板上，也在铜存在时观察到微弱生长。RNA印迹分析揭示aadA RNA仅在Cyc6启动子的诱导条件下累积(图31C)。D2、D1、CP47和RbcL的蛋白质水平很大程度上不受影响，但是仅在诱导条件下检测到Nac2(图31D)。因为缺乏可靠的aadA抗体，所以通过测量氨基糖苷腺苷酸转移酶活性测定该蛋白质的量。在Nac2表达的条件下，该活性显著升高(表3)。

表3.诱导和阻抑条件下Ind41_aadA-117中的氨基糖苷腺苷酸转移酶活性。

株	+Cu	-Cu
株	+Cu	-Cu	WT-aadA	207.0+/-49.5(3)	192.6+/-51.4(4)
Ind41_18	9.2+/-4.1(4)	12.2+/-7.9(4)	WT-aadA	207.0+/-49.5(3)	192.6+/-51.4(4)
Ind41_18	9.2+/-4.1(4)	12.2+/-7.9(4)	Ind41_117	24.2+/-12.5(4)	274.3+/-90.6(7)

如上所述，对WT-aadA、Ind41_18和Ind41_aadA-117株提取物测定aadA活性和总蛋白质含量。将活性表示为与每μg蛋白质掺合的cpm。独立测量数显示于括号中。

诱导型叶绿体基因表达系统可用于触发氢产生。

衣藻属能够在厌氧条件下在光中诱导氢化酶并产氢。因此，对于诱导型Nac2系统是否可用于关闭PSII活性和O₂放出进行了测试，由此呼吸作用将导致适于诱导氢产生的厌氧条件。在缺乏铜的TAP培养基上培养cy6Nac2.49细胞至2×10⁶细胞/ml的浓度。加入铜并将细胞转移到与质谱仪连接并以白光照明(250μE m^-2s^-1)的室内。在该系统中，室底部用聚丙烯膜密封，该膜允许溶解的气体直接扩散到质谱仪的离子源。在该方法中，可以在不连续的时间间隔测量O₂和H₂的丰度。因为该室是封闭的，而且因为铜阻抑PSII合成，所以O₂放出减少。在200分钟时间段内，O₂被呼吸作用消耗。达到了导致活性氢化酶合成和H₂产生的厌氧状态(图32A)。氢产生的最大速率在1到3.1mmol H₂mol^-1Chl sec^-1范围内变化，比在硫饥饿细胞中获得的略低，并且持续时间短得多(约1.5小时对3-4天)。

Cyc6启动子的有趣的特点是，即使存在铜时，它也在厌氧条件下得到诱导。因此预期一旦已达到厌氧条件而cy6Nac2.49细胞中的氢化酶得到诱导，Nac2合成就重新开始，PSII得到合成，且氧水平升高，由此灭活氢化酶并阻断氢产生。这些观察到了。在厌氧氢产生阶段，伴随O₂放出及氢化酶失活的PSII合成开启，从而氢水平保持恒定(图32A)。作为对照，不添加铜检查相同的细胞培养物。在这些条件下，没有像在铜处理细胞中观察到的那样伴随O₂的恒定产生和CO₂的逐渐降低而产生氢(图32B)。因为预期Cyc6启动子在充分供应铜的培养基中在需氧条件下被关闭，所以将预期新的氢产生循环。为了测试该可能性，在密封容器中将进一步的cy6Nac2.49细胞在缺乏铜的TAP培养基中培养50小时，并用质谱分析法实施氢和氧的测量。该结果提示发生了氢和氧产生的两个连续阶段。

尽管已参照某些优选的实施方案对本发明进行了详细描述，在在本发明范围和精神内存在变化和修改，如下列权利要求中所述并定义。

Claims

1.制备诱导细胞质体中蛋白质产生的表达系统的方法，该方法包括步骤

将第一个核酸引入细胞核中，其中第一个核酸编码诱导型启动子；

将第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，其中第二个核酸编码稳定性因子；

其中引入诱导物或去除阻抑物诱导该稳定性因子的表达；

其中表达的稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合，所述mRNA由该稳定性因子稳定并且由第三个核酸转录；

其中所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质；且

其中mRNA的表达导致该蛋白质的产生。

2.权利要求1的方法，其中在把重组核酸引入核中之前将第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸。

3.权利要求2的方法，其中细胞具有第二个核酸的无效拷贝或失去第二个核酸的拷贝或同源物。

4.权利要求1的方法，其中细胞具有第三个核酸的无效拷贝或失去第三个核酸的拷贝或同源物。

5.权利要求1的方法，其中细胞是植物细胞或藻类细胞。

6.权利要求5的方法，其中质体选自叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体和色质体。

7.权利要求1的方法，其中诱导型启动子具有与Cyc6启动子至少90％的序列相似性。

8.权利要求1的方法，其中第三个核酸编码具有与psbD基因至少90％的序列相似性的基因。

9.权利要求1的方法，其中诱导物是化学药品或环境条件。

10.权利要求9的方法，其中化学药品是铜，且铜耗尽诱导mRNA表达及蛋白质产生。

11.权利要求9的方法，其中环境条件是将氧浓度降低到预先确定的水平。

12.权利要求1的方法，其中将诱导物应用和去除多个循环，其中循环包括应用和去除诱导物。

13.权利要求1的方法，其中蛋白质是涉及氢气产生的蛋白质。

14.权利要求1的方法，其中蛋白质选自药物试剂、工业酶、涉及叶绿体成熟或降解的酶和营养药。

15.权利要求14的方法，其中药物试剂选自抗体、疫苗和抗微生物剂。

16.权利要求1的方法，其中稳定性因子选自Nac2和Mbb1。

17.权利要求1的方法，其中在质体中表达额外核酸，所述额外核酸与第三个核酸可操作地连接或未与第三个核酸连接。

18.权利要求14的方法，其中蛋白质选自宿主细胞防御产物、涉及氨基酸合成的酶、以及蛋白酶。

19.制备阻抑细胞质体中质体蛋白质表达的表达系统方法，该方法包括步骤

将第一个核酸引入细胞核中，其中第一个核酸编码阻抑型启动子；

其中引入阻抑物或去除诱导物阻抑稳定性因子的表达；且

其中稳定性因子表达的阻抑导致mRNA表达的阻抑，其中该mRNA由该稳定性因子稳定并且由第三个核酸转录；

其中该蛋白质的表达被阻抑。

20.在细胞质体中表达质体蛋白质的方法，该方法包括步骤：

将细胞与诱导物接触，或在导致阻抑物去除的条件下处理细胞；

其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合；

其中第一个核酸编码诱导型启动子；

其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸，且其中第二个核酸编码稳定性因子；

表达该稳定性因子；

将稳定性因子引入质体中，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质；

表达该mRNA；且

在质体中生产蛋白质。

21.权利要求20的方法，其中在把重组核酸引入核中之前将第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸。

22.权利要求20的方法，其中细胞具有第二个核酸的无效拷贝或失去第二个核酸的拷贝或同源物。

23.权利要求20的方法，其中细胞具有第三个核酸的无效拷贝或失去第三个核酸的拷贝或同源物。

24.权利要求20的方法，其中细胞是植物细胞或藻类细胞。

25.权利要求24的方法，其中质体选自叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体和色质体。

26.权利要求20的方法，其中诱导型启动子具有与Cyc6启动子至少90％的序列相似性。

27.权利要求20的方法，其中第三个核酸编码具有与psbD基因至少90％的序列相似性的基因。

28.权利要求20的方法，其中诱导物是化学药品或环境条件。

29.权利要求28的方法，其中化学药品是铜，且铜耗尽诱导mRNA表达及蛋白质产生。

30.权利要求28的方法，其中环境条件是将氧浓度降低到预先确定的水平。

31.权利要求20的方法，其中将诱导物应用和去除多个循环，其中循环包括应用和去除诱导物。

32.权利要求31的方法，其中蛋白质是涉及氢气产生的蛋白质。

33.权利要求20的方法，其中蛋白质选自药物试剂、工业酶、涉及叶绿体成熟或降解的酶和营养药。

34.权利要求33的方法，其中药物试剂选自抗体、疫苗和抗微生物剂。

35.权利要求20的方法，其中稳定性因子选自Nac2和Mbb1。

36.权利要求20的方法，其中在质体中表达额外核酸，所述额外核酸与第三个核酸可操作地连接或未与第三个核酸连接。

37.权利要求33的方法，其中蛋白质选自宿主细胞防御产物、涉及氨基酸合成的酶、以及蛋白酶。

38.在细胞质体中阻抑质体蛋白质表达的方法，该方法包括步骤：

将细胞与阻抑物接触，或在导致诱导物去除的条件下处理细胞；

其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合；

其中第一个核酸编码阻抑型启动子；

其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸；且

其中第二个核酸编码稳定性因子；

表达该稳定性因子，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中所述mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质；

阻抑该mRNA的表达；且

阻抑该蛋白质的表达。

39.在重组宿主细胞质体中表达质体蛋白质的系统，包括

外源性加入或去除的诱导核蛋白质表达的诱导物；

重组宿主细胞，其中重组宿主细胞的核包含重组核酸；

其中该重组核酸包含与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸的第一个核酸；

其中第一个核酸编码诱导型启动子，且其中第二个核酸编码稳定性因子；和

质体，该质体包含第三个核酸，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码表达的质体蛋白质，其中编码该质体蛋白质的mRNA的表达受稳定性因子控制。

40.权利要求39的系统，其中细胞具有第二个核酸的无效拷贝或失去第二个核酸的拷贝或同源物。

41.权利要求39的系统，其中细胞具有第三个核酸的无效拷贝或失去第三个核酸的拷贝或同源物。

42.权利要求39的系统，其中细胞是植物细胞或藻类细胞。

43.权利要求42的系统，其中质体选自叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体和色质体。

44.权利要求39的系统，其中诱导型启动子具有与Cyc6启动子至少90％的序列相似性。

45.权利要求39的系统，其中第三个核酸编码具有与psbD基因至少90％的序列相似性的基因。

46.权利要求39的系统，其中诱导物是化学药品或环境条件。

47.权利要求39的系统，其中蛋白质是涉及氢气产生的蛋白质。

48.权利要求39的系统，其中蛋白质选自药物试剂、工业酶、涉及叶绿体成熟或降解的酶和营养药。

49.权利要求48的系统，其中药物试剂选自抗体、疫苗和抗微生物剂。

50.权利要求39的系统，其中稳定性因子选自Nac2和Mbb1。

51.权利要求39的系统，其中在质体中存在额外核酸，所述额外核酸与第三个核酸可操作地连接或未与第三个核酸连接。

52.权利要求48的系统，其中蛋白质选自宿主细胞防御产物、涉及氨基酸合成的酶、以及蛋白酶。

53.在重组宿主细胞质体中阻抑质体蛋白质表达的系统，包括

外源性加入的阻抑核蛋白质表达的阻抑物；

重组宿主细胞，其中重组宿主细胞的核包含重组核酸；

其中第一个核酸编码阻抑型启动子，且其中第二个核酸编码稳定性因子；和

质体，该质体包含第三个核酸，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码表达的质体蛋白质，且其中编码该蛋白质的mRNA的表达受稳定性因子控制。

54.通过在细胞质体中表达质体蛋白质而刺激氢气产生的方法，该方法包括步骤为

其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合；

其中第一个核酸编码诱导型启动子；

表达该稳定性因子；

将稳定性因子引入质体中，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码蛋白质；

表达该mRNA；

在质体中产生该蛋白质；且

产生氢气。

55.通过在细胞质体中阻抑质体蛋白质表达而抑制氢气产生的方法，该方法包括步骤为

其中阻抑物或诱导物在细胞核中与第一个核酸结合；

其中第一个核酸编码阻抑型启动子；

其中第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸；

其中第二个核酸编码稳定性因子；

阻抑该稳定性因子的表达，其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，且其中所述第三个核酸编码蛋白质；

阻抑该mRNA的表达；

阻抑该蛋白质的表达；且

抑制氢气产生。

56.通过在细胞质体中诱导和阻抑质体蛋白质表达而刺激氢气产生的方法。该方法按序包括步骤

i)将细胞与诱导物接触，或在导致阻抑物去除的条件下处理细胞以及ii)将细胞与阻抑物接触，或在导致诱导物去除的条件下处理细胞；

其中诱导物或阻抑物在核中与第一个核酸结合；

其中第一个核酸编码诱导型启动子；

按序表达和阻抑该稳定性因子的表达；

其中稳定性因子在质体中与mRNA非翻译区结合以稳定mRNA，其中mRNA由第三个核酸转录，所述第三个核酸是质体天然的或质体外来的，其中所述第三个核酸编码蛋白质；

按序表达和阻抑该mRNA的表达；

在质体中产生该蛋白质；且

产生氢气。

57.权利要求56的方法，其中在把重组核酸引入核中之前将第一个核酸与第二个核酸可操作地连接以形成重组核酸。

58.权利要求56的方法，其中细胞是植物细胞或藻类细胞。

59.权利要求58的方法，其中质体选自叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体和色质体。

60.权利要求56的方法，其中诱导型启动子具有与Cyc6启动子至少90％的序列相似性。

61.权利要求56的方法，其中第三个核酸编码具有与psbD基因至少90％的序列相似性的基因。

62.权利要求56的方法，其中诱导物是化学药品或环境条件。

63.权利要求62的方法，其中环境条件是将氧浓度降低到预先确定的水平。

64.权利要求56的方法，其中将诱导物应用和去除多个循环，其中循环包括应用和去除诱导物。

65.权利要求56的方法，其中稳定性因子选自Nac2和Mbb1。

66.权利要求56的方法，其中在质体中表达额外核酸，所述额外核酸与第三个核酸可操作地连接或未与第三个核酸连接。