CN115948394B - Mdh2抑制剂在作为或制备用于降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种MDH2抑制剂在作为或制备用于降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂中的应用。本发明公开了MDH2基因在提高细胞对呕吐毒素和镰刀菌酸抗性中的应用，通过CRISPR基因编辑获得了两种MDH2突变细胞系，它们与野生型MDH2基因表达细胞相比，对呕吐毒素和镰刀菌酸有更强的耐受性，表现为细胞活力极显著提高。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种MDH2抑制剂在作为或制备用于降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂中的应用。
背景技术
呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)和镰刀菌酸(Fusaric acid，FA)是农产品及饲料中污染率很高的两种霉菌毒素，严重危害畜禽机体健康和动物食品安全。呕吐毒素和镰刀菌酸主要由禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌及雪腐镰刀菌等镰刀菌属真菌代谢产生，对谷物的污染程度居于镰刀菌毒素之首，广泛存在于小麦、大麦、玉米等农作物中，饲料以及原料中也有很高的检出率。在对我国饲料和饲料原料样品的检测表明，呕吐毒素的检出率和浓度较高，远远超过了国家标准规定的限量。此外，各种类型饲料均检出不同程度的镰刀菌酸污染，受污染的猪饲料和奶牛日粮及青贮饲料中普遍含有不同浓度的镰刀菌酸。
呕吐毒素属于剧毒或中等毒物的范畴，被欧盟分类标准定为三级致癌物，对人和动物可以产生广泛的毒性效应，能够引起任何动物中毒，症状表现为呕吐、消化道出血、炎症，甚至死亡。猪是对呕吐毒素最为敏感动物之一，呕吐毒素对猪卵巢颗粒细胞具有毒性作用从而影响其生殖系统。饲喂仔猪含呕吐毒素的日粮，其空肠和回肠出现损伤，肠道出现多灶性萎缩，影响正常肠道功能。镰刀菌酸具有中等毒性，影响畜禽采食和生长发育；不同剂量的呕吐毒素和镰刀菌酸均能引起猪的呕吐、拒食、生长缓慢等现象发生；当饲料中同时存在镰刀菌酸和呕吐毒素时，相互之间会产生协同和相加效应，混合物整体的毒性增强。
因此，一种可以降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂是有必要的。
发明内容
针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种可以降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂，该制剂是基于对MDH2基因进行抑制的制剂，抑制了MDH2基因表达可以有效降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性。
为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供了一种MDH2抑制剂在作为或制备用于降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂中的应用。
本发明另一方面提供了一种MDH2抑制剂在作为或制备用于提高呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性耐受性的药物中的应用。
本发明另一方面提供了一种MDH2抑制剂在选育对呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒素具有耐受性的植株品种或动物品种中的应用。
本发明有益效果至少包括：
(1)本发明对抑制MDH2基因表达与野生型MDH2基因的细胞，MDH2基因表达的细胞较野生型MDH2基因表达细胞在不同呕吐毒素浓度的条件下细胞活力均极显著提高，可以提高至27.01％，即对呕吐毒素具有明显的耐受性；
(2)本发明对抑制MDH2基因表达与野生型MDH2基因的细胞，MDH2基因表达的细胞较野生型MDH2基因表达细胞在不同镰刀菌酸浓度的条件下细胞活力均极显著提高，可以提高至38.23％，对镰刀菌酸的耐受性明显提高。
附图说明
图1为pSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0载体图谱；
图2为PX459(MDH2-sgRNA)质粒测序图谱；
图3为MDH2野生型IPEC-J2细胞系CRISPR靶位点测序峰图；
图4为MDH2突变型ⅠIPEC-J2细胞系(MDH2-KO1)CRISPR靶位点测序峰图；
图5为IPEC-J2细胞MDH2野生型与突变型Ⅰ单克隆细胞系(MDH2-KO1)序列比对图；
图6为MDH2突变型ⅡIPEC-J2细胞系(MDH2-KO2)CRISPR靶位点测序峰图；
图7为IPEC-J2细胞MDH2野生型与突变型Ⅱ单克隆细胞系(MDH2-KO2)序列比对图；
图8为不同浓度DON对IPEC-J2细胞MDH2野生型和突变型Ⅰ(MDH2-KO1)细胞活力影响；
图9为不同浓度FA对IPEC-J2细胞MDH2野生型和突变型Ⅱ(MDH2-KO2)细胞活力影响。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明中的术语“MDH2抑制剂”指的是可以使以MDH 2为靶标的在DNA、RNA或蛋白水平使MDH 2发生突变或被敲低、被抑制的制剂或基因编辑工具。
本发明一方面提供了一种MDH2抑制剂在作为或制备用于降低呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂中的应用。
本发明另一方面提供了一种MDH2抑制剂在作为或制备用于提高呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性耐受性的药物中的应用。
本发明另一方面提供了一种MDH2抑制剂在选育对呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒素具有耐受性的植株品种或动物品种中的应用。
需要说明的是，苹果酸脱氢酶2(malate dehydrogenase 2，MDH2)也被命名为MDH和MMDH，存在于线粒体中，可催化苹果酸转化为草酰乙酸(苹果酸+NAD+→H++NADH+草酰乙酸)，作为关键酶参与柠檬酸循环中。
需要说明的是，上述应用中，MDH2抑制剂为可以抑制MDH2基因表达的试剂。在一些实施例中，MDH2抑制剂可以为用于敲除或敲低MDH2基因的CRISPR/Cas9系统；CRISPR/Cas9系统为本领域所已知的CRISPR/Cas9系统。
在一些实施例中，上述应用中，MDH2基因为NCBI Gene ID:397039；在一些实施例实施例中，可以针对MDH2基因的CDS序列设计gRNA来进行敲除或敲低MDH2基因，从而抑制MDH2基因表达，MDH2基因的CDS序列包括如SEQ ID No.1所示序列。
在一些实施例中，上述应用中，上述CRISPR/Cas9系统包括gRNA，其包括如SEQ IDNo.2所示的序列，可以精准敲低或敲除MDH2基因。
在一些实施例中，上述应用中，上述CRISPR/Cas9系统可以为双链gRNA探针，其包括如SEQ ID No.3所示序列和SEQ ID No.4所示序列。
在一些实施例中，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，建立目的基因敲除的IPEC-J2细胞系。对目的基因MDH2设计sgRNA，以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)为载体，将退火后的sgRNA连接到线性化pX459载体上，得到敲除载体。以瞬时转染的方式将构建完成的载体送至IPEC-J2细胞中，经嘌呤霉素压力筛选分别得到两种MDH2基因突变的IPEC-J2单克隆细胞系。研究发现MDH2基因突变体Ⅰ(MDH2-KO1)与对照组相比，在0.5、1、2和4ug/mL呕吐毒素浓度的条件下细胞活力分别极显著提高27.01％(****P<0.0001)、26.36％(****P<0.0001)、19.59％(****P<0.0001)和18.67％(****P<0.0001)，对呕吐毒素具有明显的耐受性。研究发现MDH2基因突变体Ⅱ(MDH2-KO2)与对照组相比，在25和50ug/mL镰刀菌酸浓度的条件细胞活力分别极显著提高38.23％(****P<0.0001)和13.10％(***P<0.001)，对镰刀菌酸的耐受性明显提高。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
实施例1
(1)敲除载体的构建
针对MDH2基因(NCBI Gene ID:397039)的外显子(开放阅读框ORF内)设计并合成sgRNA(SEQ ID No.2)，其中sgRNA作用位点位于猪MDH2基因外显子区域(9126..9203)，在sgRNA的5’端添加CACCG，形成正向Oligo DNA(MDH2-F)，在反向Oligo DNA(MDH2-R)的5’端添加C，3’端添加CAAA，Oligo DNA(MDH2-F)和Oligo DNA(MDH2-R)的序列如下表1所示；
表1Oligo DNA(MDH2-F)和Oligo DNA(MDH2-R)的序列
| Name | Sequence(5'to 3') |
| MDH2-F(SEQ ID No.3) | CACCG CCCGTCATTGGCGGCCACGC |
| MDH2-R(SEQ ID No.4) | CGGGCAGTAACCGCCGGTGCGCAAA |
将以上正链Oligo DNA(MDH2-F)和负链Oligo DNA(MDH2-R)退火形成dsDNA，反应体系如下表2所示；将下表2的反应体系混匀，离心后置于PCR反应仪中按照如下反应程序反应：37℃30min；95℃5min，梯度降至25℃，5℃/min；
表2Oligo DNA(MDH2-F)和Oligo DNA(MDH2-R)退火反应体系
| 反向Oligo(100uM) | 1uL(final 10uM) |
| 正向Oligo(100uM) | 1uL(final 10uM) |
| 10×T4连接缓冲液 | 1uL |
| H2O | 6.5uL |
| T4 PNK(10U/uL) | 0.5uL(final 5U) |
| Total: | 10uL |
将正反DNA链退火后形成反向互补的双链gRNA探针克隆到如图1所示的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0载体中，其中取退火后形成的dsDNA与pSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0载体连接的连接体系如下表3所示；将下表3的连接体系置于PCR反应仪中按照如下反应程序反应：37℃5min；23℃5min，25循环；按照上述方法构建同时表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒(PX459(MDH2-sgRNA)连接产物)，将构建好的载体送至擎科，使用U6启动子进行测序；
表3退火后形成的dsDNA与pSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0载体连接的连接体系
| PX459质粒模板 | 25ng |
| 退火后dsDNA | 1uL |
| 10×T4连接缓冲液 | 1uL |
| H2O | X uL |
| Bbs I(5U/uL) | 0.5uL(2.5U) |
| T4连接酶(400U/uL) | 0.5uL(200U) |
| Total: | 10uL |
转化及筛选鉴定PX459(MDH2-sgRNA)阳性克隆：取2μL上述连接产物加入感受态细胞中，冰上放置30min；42℃水浴热击90秒；冰上放置冷却5min，向管中加入500μL不含Amp的LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的Amp抗性基因；取上述100μL菌液均匀涂布于含Amp的LB固体培养平板上，正面放置直至菌液被培养基完全吸收，倒置培养皿于37℃培养16h；用灭菌枪头挑取若干单菌落，接种至1mL含Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养2h-3h；设计引物，如下表4所示；PCR鉴定阳性克隆后，送至擎科，使用U6启动子进行测序，测序结果见图2，成功构建了MDH2的基因编辑敲除载体。
表4ZT-MDH2PCR引物
| Name | Sequence(5'to 3') |
| ZT-MDH2-F(SEQ ID No.5) | GATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATT |
| ZT-MDH2-R(SEQ ID No.6) | AAACGGGCAGTAACCGCCGGTGCGC |
(2)MDH2基因缺失细胞系的构建
使用电转仪进行瞬时转染，将上述构建的敲除载体转入细胞核中；用含4μg/mL嘌呤霉素的完全培养基连续筛选7d，每两天更换新鲜的含嘌呤霉素完全培养基；后续进行单克隆稀释，将获得的单克隆细胞从96孔板中转移至24孔板中进一步扩大培养，提取不同单克隆细胞的基因组DNA，对包含sgRNA区域设计引物，并进行高保真PCR，将PCR产物送至生工进行测序；野生型IPEC-J2细胞系的MDH2基因CRISPR靶位点区域的测序结果见图3，通过测序我们确定了2种CRISPR/Cas9基因编辑的MDH2基因突变型，MDH2基因突变型Ⅰ(MDH2-KO1)测序结果和序列比对见图4和图5，与野生型相比，缺失了5个碱基；MDH2基因突变型Ⅱ(MDH2-KO2)测序结果和序列比对见图6和图7，MDH2-KO2缺失了MDH2-KO2中597-605位碱基缺失，592位碱基G突变成C(G592C)。
(3)单基因编辑细胞活力鉴定
正常IPEC-J2细胞和MDH2基因突变型Ⅰ(MDH2-KO1)细胞系以每孔2×104的密度接种96孔培养板，过夜培养；第二天每孔加入100μL分别含不同浓度DON的细胞生长液，每个浓度复5孔，充分混匀板中各孔的液体；第3d更换一次4ug/mL、2ug/mL、1ug/mL和0.5ug/mL DON浓度的细胞生长液，每天观察细胞状态，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养5d；
正常IPEC-J2细胞和MDH2基因突变型Ⅱ(MDH2-KO2)细胞系以每孔2×104的密度接种96孔培养板，过夜培养；第二天每孔加入100μL分别含不同浓度FA的细胞生长液，每个浓度复5孔，充分混匀板中各孔的液体；第3d更换一次50ug/mL和25ug/mL FA浓度的细胞生长液，每天观察细胞状态，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养9d；
用CCK8试剂测定细胞活力(细胞活力％＝(处理组发光值-背景发光值)/(对照组发光值-背景发光值))，在96孔板中选取5个无细胞孔，每孔加入100μL DMEM/F12完全培养基，以获得背景发光值；向96孔板中有液体的每个孔中加入10μl CCK8溶液，将培养板放在37℃细胞培养箱中孵育1小时，使用酶标仪测量450nm处的吸光度；
MDH2基因突变体Ⅰ(MDH2-KO1)的细胞活力情况如图8所示，MDH2基因突变体Ⅰ(MDH2-KO1)与对照组相比，在0.54ug/mL、14ug/mL、24ug/mL和4ug/mL呕吐毒素浓度的条件下细胞活力分别极显著提高27.01％(****P<0.0001)、26.36％(****P<0.0001)、19.59％(****P<0.0001)和18.67％(****P<0.0001)，对呕吐毒素具有明显的耐受性；
MDH2基因突变体Ⅱ(MDH2-KO2)细胞活力情况如图9所示，MDH2基因突变体Ⅱ(MDH2-KO2)与对照组相比，在25ug/mL和50ug/mL镰刀菌酸浓度的条件细胞活力分别极显著提高38.23％(****P<0.0001)和13.10％(***P<0.001)，对镰刀菌酸的耐受性明显提高。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (4)
1.MDH2抑制剂在制备用于降低猪呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性的制剂中的应用；MDH2抑制剂包括用于敲除或敲低MDH2基因的CRISPR/Cas9系统；CRISPR/Cas9系统包括gRNA，gRNA的序列如SEQIDNo .2所示。
2.MDH2抑制剂在制备用于提高猪呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒性耐受性的药物中的应用；MDH2抑制剂包括用于敲除或敲低MDH2基因的CRISPR/Cas9系统；CRISPR/Cas9系统包括gRNA，gRNA的序列如SEQIDNo .2所示。
3.MDH2抑制剂在选育对呕吐毒素和/或镰刀菌酸毒素具有耐受性的猪品种中的应用；MDH2抑制剂包括用于敲除或敲低MDH2基因的CRISPR/Cas9系统；CRISPR/Cas9系统包括gRNA，gRNA的序列如SEQIDNo .2所示。
4.根据权利要求1至3中任一项权利要求所述的应用，其特征在于，MDH2基因包括如SEQID No .1所示序列。
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