CN101153285B - 一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类植酸酶重组表达载体以及由该表达载体转化受体农作物所得到的表达植酸酶的转基因植物，本发明还公开了该植酸酶重组表达载体和转基因植物的制备方法，该转基因植物作为动物饲料的应用。将本发明重组表达载体按照常规方法转化到受体农作物中，外源植酸酶基因可在植物器官中高效、定点表达，得到富含植酸酶的植物饲料新品种，可以大量、廉价的生产植酸酶。富含植酸酶的转基因植物可直接、方便而有效地应用于动物饲料中，以降解植物自身的植酸磷，满足动物对磷源的需求，无须在饲料中添加磷酸氢钙或添加通过发酵技术所生产的植酸酶添加剂，不仅提高了动物对饲料中磷的利用率，同时也有效缓解了动物高磷粪便对环境造成的污染。

Description

一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法

技术领域

本发明涉及植物重组表达载体、转基因植物，尤其涉及植酸酶重组表达载体以及由该表达载体转化受体农作物所得到的表达植酸酶的转基因植物，本发明还涉及该植酸酶重组表达载体和转基因植物的制备方法以及该转基因植物作为动物饲料的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

磷是动物生长、发育、繁殖所必需的重要矿物元素。植酸磷(六磷酸肌醇)，是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％，占植物中总磷的60-80％(Nelson T.S.et al.，Poultry Sci.47：1842-1848，1968)，是动物饲料中的重要成分。但是由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶，导致以植酸磷形式存在的磷不能被直接利用，其利用率仅有0-40％，从而在饲养过程中造成了许多问题：一、磷源浪费。首先是饲料中磷源不能得到有效利用；其次，为了满足动物对磷的需求，实际生产中要在饲料中额外添加无机磷，因此提高了饲料成本。二、形成的高磷粪便污染环境。饲料中85％左右的植酸磷不能被动物有效利用而直接排出体外，造成严重的土壤和水源磷污染，引发例如水环境的富营养和藻类过度生长等不良情况。三、植酸磷是抗营养因子，在动物胃肠道的消化吸收过程中与钙及其它多种金属离子、蛋白质和一些营养物质结合，形成不易被单胃动物吸收和利用的鏊合物，不但造成磷源浪费而且影响了这些营养物质特别是钙离子的吸收利用，不仅增加了饲料成本还降低了动物生产性能。

我国是世界上最大的禽畜养殖大国，每年产生禽畜粪便高达17.3亿吨，粪便磷排放量为363万吨。因高磷粪便带来的环境污染问题非常严重。同时，我国也是缺磷大国，磷是我国饲料业中仅次于蛋白质的第二大缺口资源。其实，饲料作物如谷物、玉米、大豆、油菜等的总磷含量一般在1％左右，其含量足以满足动物对磷的营养需求。如何通过品质改良来提高饲料作物中磷的可利用率，减轻高磷粪便造成的污染问题，是我国禽畜业需要解决的迫切问题。

植酸酶是一种能将植酸磷降解成肌醇和无机磷酸的酶，作为饲料添加剂它可使玉米等植物性饲料中磷的利用率提高60％，动物粪便中磷的排出量减少40％，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便造成的环境污染，还可降低植酸磷的抗营养作用。植酸酶作为新型单胃动物饲料添加剂，年销售额估计为1亿美元，且不断增长。主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物和水产养殖类动物，应用范围广、需求量大，其优良的饲喂效果在世界范围内得到确认，对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。(Ware J.H.et al.，US Patent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 101：1289-1294，1971)。

随着植酸酶的发现和应用，人们意识到通过基因工程手段来提高饲料作物中磷的可利用率是一更有效、更切实可行的思路，它的基本原理是在不降低作物中植酸磷本身含量的情况下，在植酸磷存在的同时也使作物含有植酸酶，在动物消化过程中自动将植酸磷降解成可利用的无机磷.

中国专利申请号为03137476.X的发明专利申请公开了一种利用基因工程方法在转基因植物中高效生产植酸酶的方法，但该方法存在如下几方面的不足，有待改进：(1)表达的外源蛋白没有定位到合适的细胞器中，因而酶蛋白不稳定，实际表达量减少，最终导致酶活性较低(仅300-2000U/Kg)；(2)使用的种子特异性启动子仅在胚中表达；(3)仅选用了一个植酸酶基因，该植酸酶最适pH中性，比活性为100U/mg，适用范围较窄。

发明内容

本发明目的之一是为了克服现有技术的不足，提供一类新的植酸酶植物重组表达载体，该植酸酶植物重组表达载体转化到受体植物中后，可在植物器官(种子、叶片、茎杆)中高效、定点表达，得到富含植酸酶的植物饲料新品种。

本发明目的之一是通过以下技术方案来实现的：

植酸酶植物重组表达载体，该重组表达载体主要含有以下序列：启动子序列，来源于微生物的植酸酶基因，信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列。

其中所述的启动子可以为单子叶植物组成型启动子，如Ubi启动子或CaMV35S启动子，也可以是单子叶植物诱导型启动子，还可以是单子叶植物组织特异性启动子；在一个优选的实施方案中，所述的启动子是玉米胚芽特异性启动子(SEQ ID NO：3)或玉米胚乳特异性启动子(SEQ ID NO：5)。所述的玉米胚特异表达的启动子和终止子可分别根据GenBank登记号L22344和L22345设计引物，分别扩增得到来自于玉米基因组DNA中玉米胚芽蛋白的启动子和终止子片段。所述的玉米胚乳特异表达的启动子和终止子序列可根据文献(Woo，et al.2001，Plant cell.Oct.13(10)：2297-317)来设计引物分离得到。

所述来源于微生物的植酸酶基因优选自真菌Aspergillus niger(黑曲霉)(专利号为ZL 97121731.9)中的植酸酶基因(SEQ ID NO：1)或来源于细菌Escherichiacoli中的植酸酶基因(SEQ ID NO：2)。

所述的植酸酶基因可通过以下方法制备得到：

(1)来源于黑曲霉的植酸酶基因Seq ID No：1的制备：

菌株来源：真菌Aspergillusn niger963(黑曲霉)(专利号为ZL 97121731.9)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心的保藏登记号为：微生物保藏号为CGMCC：0332；根据该菌株基因序列设计引物：

上游引物：5’CAATTGATCAATGCTGGCAGTCCCCGCCT3’

下游引物：5’GCTCTAGACCTAGGCTAAGCAAAACACTCCGCCC 3’

用上述菌株的基因组DNA作为模板，扩增得到酸性植酸酶基因Seq ID No：1，因该基因来源于Aspergillus niger 963，因此简称为AO。

(2)来源于细菌Escherichia coli的APPA-m基因(GenBank M58708)序列(SeqID No：2)：将来源于细菌Escherichia coli的APPA基因(GenBank58708)经过密码子优化改造得到appA-m基因(GenBank DQ513832)，基因改造的具体方法见中国农业科学院硕士学位论文“高效表达高比活植酸酶-提高植酸酶发酵效价的新途径”(罗会颖，2003年)，因该基因来源于appA-m，因此简称为MO。

所述的信号肽和蛋白体定位序列优选为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列(引导基因产物分泌和定位的信号肽序列，控制基因产物的定位，该信号肽和蛋白体定位序列可以引导植酸酶定位到细胞的蛋白体中).

所述的终止子序列优选为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的序列。

作为最优选的实施方案，本发明所述的植物重组表达载体选自下述载体中的任意一种：PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO。

本发明目的之二是提供一种构建上述植酸酶植物重组表达载体的方法，该方法包括：将信号肽和蛋白体定位序列，来源于微生物的植酸酶基因和终止子序列连接在一起后，可操作的连接到启动子序列之后。

作为一种最优选的实施方案，本发明植酸酶植物重组表达载体PHP20723AO或PHP20723MO的构建方法如下：

1、构建表达载体PHP20723：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)按照现有技术分离得到Seq ID No：3所示的玉米胚特异表达的启动子序列；(c)按照现有技术分离得到Seq ID No：4所示的玉米胚芽蛋白终止子序列；(d)将Seq ID No：9和Seq ID No：3融合在一起后再与Seq ID No：4先后克隆到pSP72载体上，构建成表达载体PHP20723；

2、将植酸酶基因(Seq ID No：1)用BclI和XbaI酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20723相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20723AO；将植酸酶基因Seq ID No：2用Nco I和Sma I酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20723相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20723MO。

本发明植酸酶植物重组表达载体PHP20754AO或PHP20754MO的构建方法如下：

1、构建表达载体PHP20754：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)按照现有技术分离得到Seq ID No：5所示的玉米胚乳蛋白启动子片段；(c)按照现有技术分离得到分离得到Seq ID No：6所示的玉米胚乳蛋白终止子片段；(d)将Seq ID No：5和Seq ID No：9融合，将融合后的片段与Seq ID No：6先后克隆到pSP72载体上，构建表达载体PHP20754；

2、将植酸酶基因(Seq ID No：1)用BclI和SmaI酶切后的产物与经过同样酶切处理的表达载体PHP20754相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20754AO；将植酸酶基因Seq ID No：2用Nco I和Sma I酶切后的产物与经过同样酶切处理的表达载体PHP20754相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20754MO。

本发明为了提高所表达的外源蛋白的稳定性，特意将ZM-Proaleurain的信号肽序列和液泡定位序列分别构建在以上重组表达载体上，这两个序列将引导所表达的重组植酸酶定位到液泡的蛋白体中，从而显著提高所表达植酸酶的酶活。

本发明所构建的植物重组表达载体或含有这些载体的工程菌株转化到受体农作物中尤其是重要的饲料用农作物中，所得到的转基因植物可以在种子中高效表达植酸酶。

所述的植物重组表达载体转化受体农作物的方法可为本领域的常规转化方法，例如可以是农杆菌侵染法、基因枪法、PEG介导法、种质系统介导法、电击穿孔法或微注射法，本发明优选为农杆菌侵染法或基因枪法，更优选为基因枪法；所述的受体农作物优选为油菜、玉米、大豆或小麦，更优选为玉米。

为了便于筛选成功转化的作物同时为了更好的符合安全性要求，上述转化方法中还包括构建植物选择标记基因表达载体，将本发明植物重组表达载体与植物选择标记基因表达载体共同转化受体作物，选育得到表达植酸酶而不含筛选标记基因的转基因作物.为了选育得到表达植酸酶而且不含筛选标记基因的转基因植物，更符合安全性要求，通过共转化策略(Co-transformation)，将抗性选择标记基因和植酸酶基因分别构建于不同的表达载体上，这样在转基因植物后代选育中，可以利用后代分离，得到表达植酸酶且不含筛选标记基因的转基因植物.

所述的植物选择标记基因表达载体的构建可按照常规方法进行，所述的选择标记基因可选自Bar基因(除草剂抗性的选择性标记)、Npt-II基因(新霉素磷酸转移酶基因)、DHFR基因(二氢叶酸还原酶基因)、Gent基因(庆大霉素抗性基因)等，优选为Bar基因。作为本发明的一个最优的实施方案，所述的选择标记基因表达载体为用于单子叶植物转化的选择标记基因表达载体PHP17042Bar。

作为一种优选的转化实施方案，将本发明表达载体PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO分别与抗性选择标记基因表达载体PHP17042Bar等摩尔比混合后，用于基因枪微弹制备，转化外植体。更优选为将本发明表达载体PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO、PHP20754MO以及选择标记基因表达载体PHP17042Bar去除细菌骨架DNA后，分别得到植酸酶基因表达盒以及PHP17042Bar的Bar基因的表达盒，将Bar基因的表达盒分别与以上四种植酸酶基因表达盒等摩尔比混合，用于基因枪微弹制备，转化玉米外植体。

所述外植体优选为玉米幼胚或幼胚诱导形成的愈伤组织，大豆的子叶、油菜的具柄子叶。

本发明将来源于微生物并能耐受饲料制粒等高温加工的植酸酶基因转移到饲料用植物品种中，并在植物器官(种子、叶片、茎杆)中高效、定点表达，培育富含植酸酶的植物饲料品种，可以大量、廉价生产植酸酶。而且富含植酸酶的转基因植物可直接、方便而有效地应用于动物饲料中，以降解植物自身的植酸磷，来满足动物对磷源的需求，而无须在饲料中添加磷酸氢钙或添加通过发酵技术生产的植酸酶添加剂，不仅提高动物对饲料中磷的利用率，也缓解动物高磷粪便造成的环境污染。无论从经济角度还是从使用方便的角度来说，都更为优越。其优势如下：1、原材料通过农业方式获得生产成本低廉，而且通常这些植物材料是饲料的主要成分，可以直接饲喂动物或加工饲料；2、相对于发酵的方法，使用植物生物反应载体，无需发酵工艺必不可少的设备，大大降低了资本投资；3、使用植物生物载体生产规模可以迅速扩大。本发明的转基因植物种子作为磷源植物饲料可以得到广泛应用。

附图说明

图1PHP20723AO示意图(摘要副图)。

图2PHP20754AO示意图。

图3PHP17042示意图。

图4转基因玉米T2植株植酸酶基因PCR检测结果。1-10，16-25：阳性植株；11-12：阴性植株；13：100bp分子量标准；14：阳性对照；15：阴性对照。

图5转基因玉米事件49-11-01的T2代植株Southern-blot结果。

1：阳性对照；2、3：植株1EcoRI、EcoRV酶切；4、5：植株2EcoRI、EcoRV酶切；6、7：植株3EcoRI、EcoRV酶切；8、9：植株4EcoRI、EcoRV酶切；10、11：植株5EcoRI、EcoRV酶切；12：阴性对照植株；13：1Kb分子量标准.

图6玉米中植酸酶活性测定的流程图。

图7磷酸二氢钾标准曲线图(横坐标为OD值，纵坐标为磷酸二氢钾浓度nmol/L)。

图8PHP20754AO两个事件的Westem-blot结果。

1、阴性对照，2、蛋白marker，3、CK+未去糖基化，4、CK+去糖基化，5、1276-4的胚，6、1276-4的胚乳(事件B57-10-07)，7、1280-1的胚，8、1280-1的胚乳，9、1283-10的胚，1283-10的胚乳(事件B46-17-05)。

图9PHP20723AO两个事件的Western-blot结果。

1、阴性对照，2、蛋白marker，3、CK+未去糖基化，4、CK+去糖基化，5、1203-5的胚，6、1203-5的胚乳(事件B49-02-02)，7、1733-5的胚，8、1733-5的胚乳(事件B49-03-03)，9、CK-胚，10CK-胚乳。

本发明将进一步描述下列实施例，这些实施例不以任何方式对本发明的范围构成限制。

具体实施方式

实施例1：

1、材料的准备：

植酸酶基因：如前所述使用专利号为ZL 97121731.9的植酸酶基因和appA-m基因。

菌种：大肠杆菌E.coli DH5α、JM109。

工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶、修饰酶、pGEM5Zf质粒和pGEMT-easy载体购自Promega公司，New England Biolabs公司和Takara Bio公司。

化学试剂：酵母浸膏和胰蛋白胨购自OXOID公司，CHU(N6)大量盐购自Gibco公司，组织培养用的其它试剂和激素购自Sigma公司。其它化学试剂均为国产分析纯。引物及片段合成：由北京奥科生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司合成。测序：由上海申能博彩生物技术有限公司完成。基因枪及所用耗材：购自Bio-Rad公司。

2、植酸酶基因表达载体构建：

(1)载体PHP20723的构建：

片段1：合成信号肽(ZM-PROLEURAIN SP，signal peptide)和液泡蛋白体定位序列片段(ZM-PROLEURAIN VTS，vacuole targeting sequence)，在片段5’端和3’端分别包含Nco I和BamH I位点

CCATGGCCCCACGCCGCCTGCTCGTCCTCGCCGTCGTCGCCCTCGCGGCCACCGCCGCCGCGGCCAACTCCGGCTTCGCGGACTCGAACCCGATCCGCCCCGTCACCGACCGCGCGGCCTCCGCGCTCGAGGGATCC(Seq ID No：9)；

片段2：分离用于玉米中胚特异表达的启动子：根据GenBank登记号L22344设计引物(上游引物：5’AAGCTTGCCGAGTGCCATCCTT 3’，下游引物：5’CCATGGGTTGGCTGTATGCAGAA 3’)，扩增(反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。)得到来自于玉米基因组DNA中玉米胚芽蛋白Globulin1的启动子(GLB1 Pro；Described byBelanger，F.C.and Kriz，A.L.(1991)″Molecular Basis for Allelic Polymorphism of theMaize Globulin-1 gene″Genetics 129：863-972.)，在片段的5’端和3’端分别包含HindIII和Nco I位点(Seq ID No：3)；

片段3：分离终止子片段：根据GenBank登记号L22345设计引物(上游引物：5’GAGCTCGCCAAAACGAGCAGGAA 3’；下游引物：5’GAATTCGTTTTATGAATAATAATAAT 3’)，扩增(反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。)得到来自于玉米基因组DNA中玉米胚芽蛋白Globulin1的终止子(GLB1 Term)，在片段的5’端和3’端分别包含Sac I和EcoR I位点(Seq ID No：4)；

将上述片段1和片段2融合，即HindIII-Nco I启动子元件和Nco I-BamH I定位序列元件融合后，得到HindIII-BamH I片段，将融合后的HindIII-BamH I片段与片段3Sac I-EcoR I片段分别先后克隆到pSP72载体上(购自Promega公司)，构建成表达载体PHP20723。

(2)载体PHP20754的构建：

根据文献(Woo，et al.2001，Plant cell.Oct.13(10)：2297-317)设计引物分离用于玉米中胚乳特异表达的Legumin1启动子(ZM-LEG1A PRO)和终止子(ZM-LEG1TERM)：

启动子片段：

上游引物：5’AAGCTTGATATCGAGTCAGGTCAA3’；

下游引物：5’CCATGGCAGCGCTGCCTCTGCTCGCT 3’。

终止子片段：

上游引物：5’CCCGGGAGATCCGCACAACCTCA 3’；

下游引物：5’GAATTCAGTATAACTATGCCGAGGTT 3’。

片段4：扩增(反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。)得到来自玉米基因组DNA中玉米胚乳蛋白的启动子片段，该启动子片段的5’端和3’端分别包含HindIII和Nco I位点(Seq IDNo：5)；

片段5：扩增(反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。)得到来自玉米基因组DNA中玉米胚乳蛋白的终止子片段，该终止子片段的5’端和3’端分别包含Sma I和EcoR I位点(SeqID No：6)；

将片段4和片段1融合，即HindIII-Nco I启动子元件和Nco I-BamH I定位序列元件融合后，得到HindIII-BamH I片段，将HindIII-BamH I片段再与片段5即Sma I-EcoR I片段先后克隆到pSP72载体上，构建成表达载体PHP20754。

(3)植酸酶基因表达载体的构建：

来源于真菌Aspergillus niger 963(黑曲霉)(专利号为ZL 97121731.9，在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心的保藏登记号为：CGMCC：0332)的植酸酶基因序列为Seq ID No：1，根据基因序列及载体上表达盒各元件的连接点序列，合成以下一对引物：上游引物序列为：CAATTGATCAATGCTGGCAGTCCCCGCCT(下划线所示为BclI位点)，下游引物序列GCTCTAGACCCGGGCTAAGCAAAACACTCCGCCC(下划线为酶切位点XbaI和SmaI).从上述黑曲霉基因组DNA中扩增(反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分半钟；35个循环；72℃延伸10分钟)植酸酶基因，经BclI和XbaI或BclI和SmaI酶切后的产物分别与经过BclI和XbaI酶切处理的载体PHP20723、或BclI和SmaI酶切处理的PHP20754连接，构建得到PHP20723AO，PHP20754AO，重组载体示意图见图1和2.

来源于细菌Escherichia coli的appA基因(GenBank58708)，经过密码子优化改造得到的appA-m基因(GenBank DQ513832，Seq ID No：2所示)，为便于进一步的克隆和在植物中表达，去除该基因N端的信号肽序列66个碱基(碱基1到碱基66)，根据该序列，由北京奥科公司制备合成appA-m基因与来自玉米的信号肽序列和液泡定位序列(Seq ID No：9)相连接的融合片段，5’端分别包括Nco I位点，3’端包括Sma I位点，用Nco I和Sma I酶切后将该片段与经过同样处理的载体PHP20723和PHP20754相连，得到PHP20723MO和PHP20754MO，二者的结构图除基因不同外与PHP20723AO，PHP20754AO一致。

3、选择标记基因表达载体构建

PHP17042Bar是为本发明构建的质粒，构建过程如下：

PHP17042构建示意图见图3，分别含有H2B(Histone B)启动子，H2B启动子序列在文献中有报道(Harvey，R.P.，Robbins，A.J.，and Wells，J.R.E.(1982)NucleicAcids Res.10，7851-7863)，根据文献合成序列(Seq ID No：7)，5’和3’端分别包含HindIII和Pst I位点。PIN II(Proteinase Inhibitor II)终止子来自马铃薯，根据文献(Ko，K.，Norelli，J.L.，Reynoird，J.-P.，Boresjza-Wysocka，E.，Brown，S.K.&Aldwinckle，H.S.(2000)Biotechnol.Lett.22，373-381)合成序列(Seq ID No：8)，5’和3’端分别包含SmaI和SacI位点。两个片段先后连接于载体pUC119(购买自Promega公司)。用Pst I酶切载体pAHC25(pAHC25按照以下文献构建而成Christensen AH and Quail HP(1996)Transgenic Res 5：213-218.)分离得到玉米Ubiquitin基因的5’端非翻译区和第一个内含子，以Pst I片段连结到上述H2B启动子和PINII终止子之间的PstI单切点，得到PHP17042。

Bar基因从载体pAHC25(pAHC25按照以下文献构建而成Christensen AH andQuail HP(1996)Transgenic Res 5：213-218.)上用酶切得到，pGEM5Zf经PstI酶切后，脱磷酸化，与Bar基因片段连接，连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定测序后得到pGEM5Zf Bar；Bam HI和EcoRV酶切pGEM5ZfBar，Bam HI和Sma I酶切PHP17042，按常规方法分别回收目的片段，将两片断按照常规方法连接。连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定后得到选择标记基因表达载体PHP17042Bar，重组载体图见图3。

实施例2转化受体农作物

1、基因枪介导的玉米转化

培养基的配制和玉米基因枪转化方法参照《植物细胞，组织和器官培养：基本方法》(Plant Cell，Tissue and Organ Culture：fundamental methods/O.L.Gamborg，G.C.Phillips eds.，Springer)一书中的方法进行。

选择培养：保持愈伤的培养基中加入3mg/k的BASTA作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次。

再生：经过两个月的选择培养后，抗性愈伤在选择性培养基上生长迅速，颜色新鲜。将抗性愈伤转到再生培养基上，两到三周后，即可得到成熟的胚状体。

将胚状体放到MS培养基上生根，即得到再生玉米苗。植酸酶表达盒PCR阳性的植物转到土壤中，于温室内生长。

实施例3再生基因玉米植株的分子检测

1、再生玉米植株基因组DNA的提取

1)在液氮中研磨0.1-0.2g植株叶片，转移至1.5ml的Eppendorf管中；

2)加入0.7mlCTAB(Tris100mM，NaCl 1.4M，20mMEDTA，CTAB2％，巯基乙醇0.1％)，60℃，45分钟，每隔10分钟，颠倒混匀一次。

3)加入0.7ml酚∶氯仿(1∶1)，颠倒几次，1000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，1000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管。

4)在离心管加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，1000rpm离心10分钟，弃去上清，70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μL的无菌水中，用于PCR检测。

2、再生玉米植株的PCR检测

植酸酶基因的检测

正向引物：AACACTCTCGATCCGGGCACCT

反向引物：ACCAAGACACGGACCAAAGGC

反应体系(20μL)：再生植株DNA 1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。反应条件：94℃，5分钟；94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。筛选出PCR阳性植株(如图4所示)。

Bar基因的检测：

正向引物：CCG AGG CGG ACA TGC CGG CG

反向引物：CAG CAT GCC GCG GGG GGC AT

反应体系同上，反应条件94℃，5分钟；94℃，45秒；62℃，45秒；72℃，45秒；35个循环；72℃延伸5分钟。

3、再生玉米植株的Southern-blot分析

参照Sambrook J，等编著的《分子克隆试验手册》，(科学出版社，1992年版)中的方法进行。

1)对植酸酶基因的为阳性的玉米植株，选取0.5-0.8g叶片组织，液氮研磨后提取基因组DNA，提取方法同PCR检测中所用。

2)得到的DNA经RNase和Proteinase K处理后，再用等体积的酚∶氯仿(1∶1)，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，用紫外分光光度计测定DNA的量。

3)每个样品取15μg DNA酶切过夜，50V，电泳6小时后转移至尼龙膜。

4)预杂交6小时后，以植酸酶基因的片段作模板，经放射性同位素32p标记探针，进行杂交。

5)洗膜完成后，尼龙膜压X光片，所得结果见图5。

Southern结果表明植酸酶基因已经整合到玉米基因组中。

实施例4转基因玉米后代种子中植酸酶的活性检测

转基因玉米T₀代植株经过分子检测，植酸酶基因为阳性的植株，作为母本，选择玉米自交系作为父本。杂交授粉结实后，所得种子为T₁种子。T₁种子播种后可以正常萌发、发育成T₁植株。对T₁植株进行PCR检测，继续用同一玉米自交系作为父本，杂交授粉，得到T₂种子。选择PCR检测植酸酶基因为阳性的T₁植株的种子用来进行植酸酶活性分析。未转基因的玉米种子作为阴性对照，内源植酸酶较高的小麦作为阳性对照。测定参照Wyss M.et.al.(1999)方法进行.

1)植酸酶活性定义。一个单位(U)的植酸酶为：在pH5.5，37℃的条件下，每分钟从底物植酸钾、镁(肌醇六磷酸钾、镁)释放出1μmol无机磷酸所需要的酶量。

2)试剂。提取缓冲液(Extraction buffer)：(0.05M pH＝5.5的NaAc缓冲液，含有1mMCaCl₂)；

0.4M pH5.5的NaAc缓冲液；50mM植酸钠；15％TCA；

显色液：(0.6M H₂SO₄-2％Vc-0.5％钼酸铵)，用前加Vc。

3)标准曲线制作。配制9mM KH₂PO₄贮液，按表1稀释度稀释KH₂PO₄贮液：

表1KH₂PO₄贮液稀释度

取1ml稀释液，加入1ml 15％TCA和2ml显色液，50℃保温20分钟，每个稀释度设3个平行样，分光光度计820nm测定OD值。以OD值为横坐标，测定的体系中无机磷的量(nmol)为纵坐标作标准曲线(图7)，并计算直线回归方程。

4)玉米子粒中植酸酶活性的测定。取植株籽粒20粒，研磨机充分磨碎至细粉末，称取100mg粉末，加入1ml提取缓冲液(Extraction Buffer)，室温下在Gyrotory摇床上剧烈振荡1小时。3000g，离心10分钟。然后按图6所示的流程进行。每样品三次重复。

5)根据标准曲线计算出酶活性单位

计算公式：样品中植酸酶含量(U/ml)＝K×A×n×(1/0.1)÷15

其中：

K：标准曲线斜率。

A：样品相对OD值(A＝OD本底-OD反应液)。

n：稀释倍数。

1/0.1：将0.1ml的取样量换算成1ml。

15：反应时间(分钟)

n：稀释倍数。

1/0.1：将0.1ml的取样量换算成1ml。

15：反应时间(分钟)。

6)表2显示的是实施例1所构建的四个表达载体转化玉米得到10个转基因事件的不同世代玉米酶活测定结果，表明植酸酶基因在转基因玉米种子中有表达，且能够稳定遗传给后代；不同事件表达水平不一致，表2中测定结果是经过重复测定的。

表2转基因玉米T2种子植酸酶活测定结果

从表2中可以看出，本发明所获得的转基因玉米种子中植酸酶活性，低的达到2000U/Kg比未转基因对照提高80倍，最高可以达到97085U/Kg，是未转基因植株的3000倍。其活性比中国专利申请03137476.X中所公开的转基因玉米(活性仅为357.5U/Kg)相比，其活性提高了约5-271.5倍(表2)。

实施例5

转基因玉米后代种子中植酸酶的表达检测，选择PHP20723AO得到胚表达事件B49-02-01和B49-03-03，PHP20754AO得到的胚乳表达事件B46-17-05和B47-10-07四个事件的T3代种子进行该实验，同时，以AO基因在毕赤酵母中的表达产物及其用EndoH脱糖基化处理后的酶蛋白(EndoH购买自Biolabs公司，处理方法按照说明书进行)作为阳性对照(CK+)，以未转基因的玉米作为阴性对照(CK-)。

SDS-PAGE和Western-blot参照Sambrook J，等编著的《分子克隆试验手册》，(科学出版社，1992年版)中的方法进行。

1、将转基因玉米种子的胚与胚乳剥离，分别加入蛋白电泳的2×上样缓冲液研磨；

2、10,000rpm离心，后取出上清，移入新的离心管中；

3、配制SDS-PAGE，进行蛋白电泳，使用。

4、转膜，用六一仪器厂的转膜仪，按照说明书所示方法进行转膜。

5、Western-blot按照常规方法进行，使用的一抗为AO基因(Seq ID No.1)在酵母中表达产物(专利申请号ZL 97121731.9)按照常规方法免疫兔子制备的抗血清，二抗是碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG，购自鼎国生物技术有限责任公司。

试验结果表明，本发明使用的种子特异性启动子有在胚中表达，也有在胚乳中表达(图8、图9)；所表达的植酸酶能定位到合适的器官和细胞器中，因而酶蛋白非常稳定，导致所表达的植酸酶活性较高。

实施例6

筛选得到无选择标记Bar基因的转基因事件，Bar基因编码的产物可以赋予转基因植物对除草剂草胺膦的抗性。

对以上有酶活的事件逐代进行叶片Basta涂抹和子粒的酶活性测定，Basta涂抹的方法如下：

将除草剂Basta与凡士林或羊毛脂混合，使其有效成分的浓度为0.8-1.5％，涂抹叶片一周后，观察并统计叶片涂药处，如能保持与未涂药部位一致，表明该植株有Bar基因；如失绿、枯黄直至死亡，表明该植株没有Bar基因。

以上几个事件的筛选结果如下：

表3转基因事件中Bar基因的分离情况

上述结果表明：在转基因后代选育过程中，利用后代的分离，通过筛选可以获得只含有目的植酸酶基因并能够正常表达和遗传(酶活结果如表2所示)，不含筛选标记基因的转基因株系(表3中49-02-01、49-03-03、50-16-05、46-17-05、47-10-07等事件均为此类型)。与中国专利申请03137476.X中所公开的转基因玉米相比，该申请仅提出了构想，并没有实现最终去掉筛选标记基因。而本发明则实现了共转化策略的构想，得到的转基因株系不含筛选标记基因，更符合转基因生物的安全性的要求。

实施例7植酸酶酶学性质测定

本发明选用了两个植酸酶基因(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)。将所表达的植酸酶分别进行酶学性质测定，其中，来源黑曲霉的植酸酶(AO基因产物，SEQ IDNO.1)最适pH2.5-5.5，偏酸性，比活性为200U/mg(测定方法如专利号为ZL97121731.9所公开)；来源于大肠杆菌的appA-m(SEQ IDNO.2)，最适pH3.0-5.5，比活性3190U/mg(测定方法如中国农业科学院硕士学位论文“高效表达高比活植酸酶-提高植酸酶发酵效价的新途径”(罗会颖，2003年))，本发明及其产物的适用范围得到拓宽。

试验例1本发明转植酸酶基因玉米作为饲料添加剂的饲养试验

1试验材料

实验动物为AA商品代肉仔鸡，试验期从1～42日龄。转植酸酶基因玉米(本发明实施例所制备)为平均每公斤玉米含12000U的植酸酶；微生物来源的植酸酶(5000U/g)为市场所购。

2试验分组与日粮设计

试验共设一个对照组和两个试验组，每组三个重复，每个重复40只鸡，共360只.对照组磷水平以NRC(1998)推荐的非植酸磷含量为参考标准，以磷酸氢钙作为补充磷源；

试验I组在对照组日粮中把磷酸氢钙减半添加外源植酸酶(来源于微生物)剂量为500U/kg；试验II组氢钙用量为对照组的一半，用本发明转植酸酶基因玉米代替部分普通玉米，相当于每公斤日粮添加500U植酸酶。

3试验结果：试验结果见表4。

表4不同饲料处理对肉仔鸡生长性能的影响

从表4可以看出，利用转植酸酶基因玉米作为添加剂与发酵生产的添加剂和对照相比，都可以替代磷酸氢钙而不影响肉鸡成活率、日均。相反，其增重耗料增重比(每增加1公斤肉需要消耗的饲料量)在21日龄和42日龄分别为1.46和1.67，是三组中最低的，表明利用转植酸酶基因玉米作为添加剂能够提高饲料转化率。

表5肉鸡血清中的钙、磷含量

表6肉鸡胫骨中的钙、磷含量

表7肉鸡排泄物中磷含量

从上表可以看出，利用本发明转植酸酶基因玉米作为添加剂与发酵生产的添加剂和对照相比，都可以替代磷酸氢钙，肉鸡的血清钙、磷含量正常.在肉仔鸡日粮中添加转植酸酶基因玉米(相当于500U/kg水平)可以取得与添加外源植酸酶(500U/kg水平)一致的效果，降低肉仔鸡胫骨中磷含量，胫骨中磷含量降低，其硬度降低，韧度增加.饲喂试验结果表明在肉仔鸡日粮中添加转植酸酶基因玉米，能够降低肉仔鸡排泄物(粪尿)中磷的存留量，分别在21日龄和42日龄分别比不添加任何外源植酸酶的粪尿中磷存留量降低49.43％、55.17％和31.50％、32.28％.

以上结果表明，本发明转基因玉米能够取得与添加发酵生产的植酸酶同样的饲喂效果，可以替代磷酸氢钙并提高饲料中磷的利用率从而节省磷源，减少动物排泄物中磷的存留量，有利于环境保护。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>表达植酸酶的转基因植物、其制备方法及在饲料中的应用

<130>018

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1350

<212>DNA

<213>Aspergillus niger 963

<400>1

atgctggcag tccccgcctc gagaaatcag tccacttgcg atacggtcga tcaggggtat     60

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<210>2

<211>1299

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>2

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<210>3

<211>1403

<212>DNA

<213>Zeamays

<400>3

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<210>4

<211>1007

<212>DNA

<213>玉米

<400>4

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<210>5

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<210>6

<211>797

<212>DNA

<213>Zeamays

<400>6

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cttgtgccca tgattcgtct tgctcctttt ggggtttggt gcaatctcgc caacctcggc    780

atagttatac tgaattc    797

<210>7

<211>1597

<212>DNA

<213>Solanum tuberosum  L

<400>7

agcttcggcc ggggcccatc gatctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt     60

gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagctca    120

gatcagcttg gggctggtat cgataaatgt ttccacatag attttgcata tcataatgat    180

gtttgtcgtt ccgtatctat gtttcataca aaatttttac gcatatcgca acacatgggc    240

acatacctag tgactgtata actctgcatg tatgagtgta tgactatatg atgtagtaac    300

taataagaag ggtagacatt tgagtgattc ttttattcct ggacttgtaa gacttgacat    360

ttctgccttg agtgcgatac atcatatgga caggggttat gcatacactg cttgtttgtt    420

gtttatgttc taagagcatc tccaacaacg tgacatatga aaatgcccta caatttaaaa    480

atggttatat tttataaaat ttagggcata aataaaacat cccgctccaa cattaaagcc    540

ttaaatctat tatagggaag cccactatga tatagtatat ttgaggcact ttagagggtg    600

ccctataatt ttttgaccat ttttttatga aatgagacac tattggagta ttttttttcc    660

gtagagcacc atatttcaat ttgagacacc aatttaaggc attgttggag atgttctaaa    720

tgttggttta ttttgtctgt atcgttgtgg ttttgatagt ggtgcctttg caatgtacat    780

cttacattga caataataat aggtaaaact ctacaaattt tttatctaat ggactcttgt    840

atgaaacatt gtacttgcac acatctgatg taaacactgc atacttttaa cagtgacaag    900

attctgtttc attttagggc tagtttggga accaaatttt attagggttt ttattttcta    960

agaaaaagta atttatttta ccttgagaaa atataaatta cttgagaaaa tagagttcca   1020

aactagctct tatctttgtc gaatcctcct ctattcaaat gtgacatttc tggcacgtga   1080

caactggtga tgttgtagac tgtgttaagt aatacgtgtc attattacta aatgccattt   1140

tagtaaatgt tgagtatgta ctctactaca gtaagtatta ttggtgtatt tacactagac   1200

agttggcggc ctggcgggta aagttatcct gtagaaagtt gggccaggcc aaaaccaacc   1260

gccaaaggaa aggccttccg gcccgcccac ctttgcgcgc cgaaggtcag ttccttcagt   1320

ctcctcccgc ttcagactct gaccacgtcg acaatccggg ccgaaacaca tctgcaccgt   1380

ccacttgcga cagattgaac acaccacttc tatccacgtc agcgatccgt ggcactagcc   1440

cttccaccaa tcagcccaag ttgccccttt cctttaaatt cgccgcaccc attgctcttc   1500

tcacggccat agaaatcgac cgagcgaatc cctcgcatcg cattcgcagc ctttgctgca   1560

tcacaccacc gcgaaacccc agcagccgca tctgcag                            1597

<210>8

<211>453

<212>DNA

<213>Solanum tuberosum  L

<400>8

gggctattgc ggtgcaggct gccagagcgg cggctgtgac gctgtctttg ccggcgccat     60

caccgccaac tccactcttc tcgcagaatg atgatagatc caccatggtt aacctagact    120

tgtccatctt ctggattggc caacttaatt aatgtatgaa ataaaaggat gcacacatag    180

tgacatgcta atcactataa tgtgggcatc aaagttgtgt gttatgtgta attactagtt    240

atctgaataa aagagaaaga gatcatccat atttcttatc ctaaatgaat gtcacgtgtc    300

tttataattc tttgatgaac cagatgcatt tcattaacca aatccatata catataaata    360

ttaatcatat ataattaata tcaattgggt tagcaaaaca aatctagtct aggtgtgttt    420

tgcgaattgc ggccgccacc gcggtggagc tcg                                 453

<210>9

<211>137

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>9

ccatggcccc acgccgcctg ctcgtcctcg ccgtcgtcgc cctcgcggcc accgccgccg     60

cggccaactc cggcttcgcg gactcgaacc cgatccgccc cgtcaccgac cgcgcggcct    120

ccgcgctcga gggatcc                                                   137

Claims (12)

1.植酸酶植物重组表达载体，其特征是，该重组表达载体主要含有以下序列：启动子序列，来源于微生物的植酸酶基因，信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列；其中，所述的启动子序列是SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；所述的来源于微生物的植酸酶基因是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述的信号肽和蛋白体定位序列是SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；所述的终止子序列是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

2.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征是：所述的植酸酶植物重组表达载体是PHP20723AO；其图谱为图1所示。

3.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征是：所述的植酸酶植物重组表达载体是PHP20754AO；其图谱为图2所示。

4.权利要求1所述的植酸酶植物重组表达载体的构建方法，其特征在于包括：将信号肽和液泡蛋白体定位序列、来源于微生物的植酸酶基因和终止子序列连接在一起后，可操作的连接到启动子序列之后。

5.权利要求2所述植酸酶植物重组表达载体的构建方法，包括：

(1)、构建表达载体PHP20723：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)分离得到Seq ID No：3所示的玉米胚特异表达的启动子序列；(c)分离得到Seq ID No：4所示的玉米胚芽蛋白终止子序列；(d)将Seq ID No：9和Seq ID No：3融合在一起后再与Seq ID No：4先后克隆到pSP72载体上，构建成表达载体PHP20723；

(2)、将Seq ID No：1序列用BclI和XbaI酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20723相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20723AO。

6.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征在于：所述植酸酶植物重组表达载体是PHP20723MO，其包括以下方法构建得到：

(1)、构建表达载体PHP20723：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)分离得到Seq ID No：3所示的玉米胚特异表达的启动子序列；(c)分离得到Seq ID No：4所示的玉米胚芽蛋白终止子序列；(d)将Seq ID No：9和Seq ID No：3融合在一起后再与Seq ID No：4先后克隆到pSP72载体上，构建成表达载体PHP20723；

(2)、将Seq ID No：2用Nco I和Sma I酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20723相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20723MO。

7.权利要求3植酸酶植物重组表达载体的构建方法，包括：

(1)、构建表达载体PHP20754：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)按照现有技术分离得到Seq ID No：5所示的玉米胚乳蛋白启动子片段；(c)按照现有技术分离得到Seq ID No：6所示的玉米胚乳蛋白终止子片段；(d)将Seq ID No：5和Seq ID No：9融合，将融合后的片段与Seq ID No：6先后克隆到pSP72载体上，构建表达载体PHP20754；

(2)、将Seq ID No：1用BclI和SmaI酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20754相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20754AO。

8.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征在于：所述植酸酶植物重组表达载体是PHP20754MO，其包括以下方法构建得到：

(1)、构建表达载体PHP20754：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)按照现有技术分离得到Seq ID No：5所示的玉米胚乳蛋白启动子片段；(c)按照现有技术分离得到Seq ID No：6所示的玉米胚乳蛋白终止子片段；(d)将Seq ID No：5和Seq ID No：9融合，将融合后的片段与Seq ID No：6先后克隆到pSP72载体上，构建表达载体PHP20754；

(2)、将Seq ID No：2用Nco I和Sma I酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20754相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20754MO。

9.一种制备表达植酸酶的转基因植物的方法，该方法包括：将权利要求1的植酸酶植物重组表达载体按照常规转化方法转化受体农作物，培育、筛选再生植物，即得。

10.按照权利要求9的方法，其特征是：所述的转化方法为农杆菌侵染法或基因枪法；所述的受体农作物选自玉米、油菜、大豆或小麦。

11.按照权利要求9的方法，其特征是：将权利要求1植酸酶植物重组表达载体与植物选择标记基因表达载体共转化受体农作物。

11、按照权利要求11的方法，其特征是：所述的植物选择标记基因表达载体是PHP17042Bar，其中，PHP17042Bar的图谱为图3所示；所述的受体农作物是玉米。

12.按照权利要求11的方法，其特征是：将权利要求1所述的植酸酶植物重组表达载体以及选择标记基因表达载体PHP17042Bar去除细菌骨架DNA，分别得到植酸酶基因表达盒以及PHP17042Bar的Bar基因的表达盒，将Bar基因的表达盒分别与以上去除细菌骨架DNA后的植酸酶基因表达盒等摩尔比混合，用于基因枪微弹制备，转化玉米外植体。

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