CN101451143A - 一种抗除草剂基因及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1或者与SEQ IDNO：1有90％以上的相同性。本发明还公开了上述抗除草剂基因编码的抗除草剂蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：2有90％以上的相同性。本发明的基因可用于制备对除草剂增加了抗性的转基因植物，或者获得利用除草剂选择性杀灭转基因玉米的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种基因和利用这种基因产生能够抗至少一种除草剂的转基因农作物以及利用这种基因产生能够被至少一种除草剂选择性杀灭的转基因玉米的方法。
背景技术
杂草防治是农作物种植中的一个重要问题。利用除草剂杀灭杂草是一种比较简单而经济的方法。但是除草剂常常不能选择性地杀灭杂草，特别是杀灭和农作物亲缘关系比较近的杂草。因此除草剂的使用受到了很大的限制。而利用转基因的方法发展抗除草剂农作物可以解除这种限制，从而更好地利用除草剂来防治杂草。
利用转基因方法可以将抗除草剂基因导入农作物，从而使该农作物获得高的抗除草剂能力，最终使除草剂能够选择性地杀灭杂草。例如，抗草甘瞵的转基因农作物目前已经大规模推广应用(Padgette et al.1996″New weed control opportunities：Developmentof soybeans with a Round UP Ready.)。但是针对另外一些广泛使用的高效除草剂，如磺酰脲类除草剂，目前还没有通过转基因的方法获得的高抗性转基因农作物。因此发展高抗磺酰脲类除草剂的转基因农作物可以更有效和更安全地防治农作物中的杂草。
细胞色素P450酶可能是许多除草剂的解毒酶(张山、李平、刘德立“细胞色素P450酶系与除草剂代谢”中国生物工程杂志2004年第24卷第10期)。细胞色素P450酶是一类利用NADPH所传递的电子去催化分子氧活化的血红素蛋白，在植物体内介导一序列的氧化反应，其功能涉及木质素、甾醇、类萜、生物碱、脂肪酸和许多起植保素功效的次生物质的合成代谢，以及天然和人工合成的许多外源抗生素如除草剂等成分的降解和脱毒代谢。研究表明，细胞色素P450酶是一个超级基因家族，植物中已命名的P450基因已超过1000个，例如水稻中就可能有528个P450基因。应用传统的反向遗传学手段包括EMS诱变、T-DNA和转座子插入等和基因过量表达技术、基因芯片技术及反义RNA或RNAi抑制技术来研究这类基因的生物学功能，往往因不同基因间大量错综复杂的同源序列的存在、单个基因表达丰度的偏低和基因表达产物在抽提液中的不稳定性而受阻。以至到目前为止，被确切验证其生物学功能的植物P450基因总共不到40个。因此发现和利用抗除草剂的细胞色素P450酶基因具有重要的应用价值。
另一方面，利用转基因玉米作为生物反应器生产药物蛋白质、工业用酶等也正在被广泛研究和开发。防止作为生物反应器生产的药物蛋白质、工业酶和其他可能对人和动物有不良作用的转基因玉米混入粮食和饲料用玉米是非常重要的。例如，大部分常规玉米和转基因玉米对烟磺隆有比较高的抗性。如果在转基玉米中在表达目的基因的同时抑制抗烟磺隆基因的表达，则由此产生的转基因玉米就对烟磺隆敏感。这样获得的转基因玉米就可以被烟磺隆选择性地杀灭，从而在需要时可以控制这些转基因玉米的意外传播、防止它们混入到食用玉米之中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗除草剂基因，利用该基因能获得对磺酰脲类除草剂有很高抗性的转基因农作物，还能获得可利用磺酰脲类除草剂选择性杀灭的转基因玉米的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列为SEQID NO：1或者与SEQ ID NO：1有90％以上的相同性。
本发明还同时提供了上述抗除草剂基因编码的抗除草剂蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：2有90％以上的相同性。
本发明还同时提供了一种DNA质粒，其含有上述基因并且与能够在植物有功能的启动子连接。
本发明还同时提供了另一种DNA质粒，其含有上述基因或者基因片断构建得到的反义RNA或RNAi的抑制表达框。
本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，其包含上述核酸。
本发明还同时提供了另一种转基因植物细胞，上述基因的表达被反义RNA、RNAi或者其他方法抑制。
本发明还同时提供了上述抗除草剂基因的用途。
作为本发明的抗除草剂基因的用途的改进：可用于制备对除草剂增加了抗性的转基因植物，或者获得利用除草剂选择性杀灭转基因玉米的方法。
作为本发明的抗除草剂基因的用途的进一步改进：上述除草剂为乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂、色素合成抑制类除草剂、原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂、光系统II抑制剂类除草剂或合成生长素类除草剂。
乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂包括烟磺隆(Nicosulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、噻磺隆(thifensulfuron)、氯磺隆(chlorsulfuron)和咪草烟(imazethapyr)等等。
色素合成抑制(pigment synthesis-inhibiting)类除草剂包括硝草酮mesotrione、tembotrione、topramezone和磺草酮(sulcotrione)等等。
原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂(PPO-inhibiting class ofherbicides)包括三氟羧草醚(acifluorfen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、磺酰唑草酮(sulfentrazone)、唑草酮(carfentrazone)、氟烯草酸(flumiclorac)和速收(flumioxazin)等等。
光系统II(PSII)抑制剂类除草剂包括symmetrical triazines、triazinones(asymmetricaltriazines)、取代脲类、脲嘧啶类(uracils)、嗪酮类(pyridazinones)、苯基-氨基甲酸酯类、丙烯腈类(nitriles)、苯并噻唑硫代乙酸甲酯类(benzothiadiazoles)和苯基邻二氮杂苯类(phenylpyridazines)等等。
本发明所提供的对植物进行改造的方法是：利用SEQ ID NO：1所述的基因转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成相应植株，从而使这些转基因植物获得抗至少为如上一种除草剂的能力。植物可选用水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草、大麦或牧草。
氨基酸序列相同性相当高的蛋白质一般具有相同的功能，因此与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有90％、95％以上相同性的基因都可以与SEQ ID NO：2有相似的功能。氨基酸的相同性可以通过现有的方法计算，例如Karlin和Altschul，1990，Porc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3364；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877.)。特别需要说明的是相同性是基于同源部分的比较，而不包括人工或天然融合基因中的不同源的部分。
抗除草剂蛋白质(SEQ ID NO：2)也可以用来人工引入一个或多个变异而获得保持有抗除草剂能力的变异分子。例如利用低保真PCR的方法可以产生很多变异分子，而这些变异分子可以通过筛选获得继续保持有抗除草剂能力的变异分子。
利用本发明的基因所编码的蛋白质序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。例如根据Campbell和Gowri(1990)的报道(Plant Physiol.92：1-11)。
本发明的抗除草剂基因的核酸片断可以进一步构建包含表达构件的植物转化质粒。这个表达构件包括启动子、抗除草剂基因和终止子。植物转化质粒是已知的和成熟的技术。例如，Plant Mol.Biol.25：989-994(1994)报道的载体(ACCESSION AF234296)。表达构件的构建是已知的和成熟的技术。在转化单子叶植物时启动子可以是禾本科植物的泛素(Ubiqutin)启动子、肌动蛋白(Actin)启动子、或者其他启动子(如CaMV的35S启动子)。而终止子可以是Nos终止子或者其他终止子。在转化双子叶植物时启动子可以是双子叶植物的泛素启动子，或者其他启动子。
这个抗除草剂基因表达构件可以通过植物的转化被整合到植物的基因组中，从而稳定遗传和表达。植物转化的技术和方法是已知和成熟的。表达构件转入植物的方法和步骤各种植物有所不同，同种植物不同的品种也可能有所不同。通常可以通过农杆菌(如Agrobacterium菌株LAB4404)或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。
通过上述方法获得的转基因农作物株系可以用如上至少一种除草剂进行测定，例如是烟磺隆(Nicosulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、噻磺隆(thifensulfuron)、氯磺隆(chlorsulfuron)、咪草烟(imazethapyr)、苯达松(Bentazon)、tembotrione、硝草酮(mesotrione)等。抗性的测定可以通过直接喷洒除草剂而实现。提高了抗性的株系可以进一步培育新的农作物品种。
本发明获得的基因的另外一个用途是获得可以用除草剂选择性杀灭转基因玉米的方法。本发明具体是通过这样的技术方案来实现的：
提供一种玉米细胞色素P450基因，它的核苷酸序列是SEQ ID NO：1。在转基因玉米中表达目的基因的同时，利用反义RNA或者RNAi的方法抑制玉米中这种细胞色素P450基因的表达，从而使转基因玉米对至少一种除草剂敏感。
利用反义RNA或者RNAi的方法抑制基因表达的技术是已有的技术(Kusaba 2004RNA Interference in crop plants，Current Opinion in Biotechnology，15：139-143)。
进一步，在本发明中，目的基因表达框与抑制P450基因(SEQ ID NO：1)表达的RNA干扰框连接在同一个DNA导入片断上，从而达到在转基因玉米中目的基因的表达和除草剂的解毒酶基因的抑制紧密连锁。特别是当上述目的基因是一种抗草甘膦基因时，获得的转基因玉米对草甘膦具有高抗性而对至少其他一种除草剂敏感。上述目的基因可以是抗虫等抗逆基因、工业酶基因、药物蛋白质基因以及其他有价值基因；目的基因可以是一个、二个或者多个。
上述RNA干扰抑制表达框可以由二个部分组成：一个是启动子，它可以是水稻或者玉米泛素启动子、或者水稻肌动蛋白启动子、或者是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、或者是其他在禾本科农作物中有活性的启动子。另一个部分与启动子功能性相联的是本发明的细胞色素P450基因(SEQ ID NO：1)的反义RNA或者RNAi。产生反义RNA的DNA模板可以是全长基因，或者仅仅是其中的一个或几个片断。产生RNA干扰的序列(RNAi)可以根据SEQ ID NO：1设计。
同时具有目的基因表达框和玉米抗除草剂P450基因抑制表达框的载体可以通过转基因的方法稳定导入玉米。这个方法包括基因枪方法和农杆菌介导方法，这二种方法都是成熟的已知的方法。
利用本发明的方法而获得的转基因玉米就能被至少一种除草剂选择性地杀灭。因此必要时可以通过使用这种除草剂防止转基因玉米的意外传播，消灭混入非转基因玉米中的转基因玉米，从而保证了目的基因能够被控制。特别当转基因玉米的目的基因是药物蛋白质基因、工业蛋白质基因时，防止这些转基因玉米的传播对食品和饲料安全非常重要。
本发明的优点在于：本发明可以大幅度简化农作物的杂草防治方法，扩大上述至少一种除草剂的应用范围。同时本发明可以用于发展可控性的转基因玉米，从而降低转基因玉米的食品和生态风险。
具体实施方式
本发明的以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology，和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning：ALabortory Manual，3rd ED.等文献均有详细的说明。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、对烟磺隆玉米敏感的玉米品系统的选择
收集10种不同的玉米品种，在5-6叶期喷洒烟磺隆(克有效成分/亩)。其中一个品种N-SS是对烟磺隆敏感，一次喷洒有效成分5g/亩就达到100％杀灭。N-SS分别和其中的2个抗性品种D001和D002杂交的后代仍然是抗性。N-SS、D001和D002等均由浙江大学农业与生物技术学院提供(可通过购买的方式获得)。
实施例2、对烟磺隆敏感玉米和抗烟磺隆玉米中P450基因的克隆和比较
根据玉米基因组数据库的序列，设计了5对PCR引物分别从抗性品系D001和敏感品系N-SS扩增可能参与抗烟磺隆的5个P450基因。
PCR的引物分别为：
基因1：
Azm-1-F：GGATCCACCATGGATAAGGCCTACATCGCCGCCC；
Azm-1-R：TCTAGATTCAGAGCCTCTTAAGAACACCACGC；
基因2：
Azm-2-F：GGATCCACCATGGATAAGGCCTACGTGGCCGTG；
Azm2-6R：TCTAGATTCAGAGCTCCAGAAGAAGATGGCGC；
基因3：
Azm-3-F：AGATCTACCATGGATCTGGCGGCCTACATCGCCA；
AZM-3-R：TCTAGATCATATCTTCTGAAGAACGTCATAC；
基因4：
Azm-4-F：GGATCCACCATGGACGACAAGTCCTGCTACGTGG；
Azm-4-R：TCTAGATCAGAGCTGCTGAAGAACATGACGC；
基因5：
Azm-5-F：GGATCCAACAATGGATAAGGCCTATGTCGCCG；
Azm-5-R：GGTACCCGTTCGCCGAAGATTAAATTTGCTAAAGCAC。
PCR扩增的条件是：95℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 2分钟，进行30个循环。PCR反应的产物被克隆到T载体(上海生工)中，并且进行全片断的测序。
比较分别来自抗性(D001)敏感(N-SS)的P450基因序列发现，只有基因5在抗性和敏感品种中存在明显差别，而其他4个基因没有发现明显差别。基因5在D001中的序列为SEQID No：3，其mRNA序列为SEQ ID No：1。在N-SS中基因5增加了一个近1kb的插入片断，这样就造成该基因失去功能。
实施例3、玉米P450基因转水稻的转化载体的构建
为了进一步证明实施例2从抗性品种D001中获得的玉米P450基因的功能，这些基因的表达框被构建在植物转化载体中，然后转入水稻中表达以研究它们的功能。表达框中控制玉米P450基因表达的启动子是玉米泛素(Ubiqutin-1)启动子。它是通过PCR从玉米基因组中扩增获得的，所用的引物是ZmUbiF(GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC，(下横线是HindIII位点)和ZmUbiR(GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG，(下横线是BmHI位点)。玉米P450基因及其终止子直接从基因组中通过PCR获得(实施例2)。
5个转化T-DNA载体pCAMB1300Rice-G6-zm1/2/3/4/5是利用载体pCAMB1300-G6而构建的。pCAMB1300-G6是一个利用抗草甘膦基因作为选择基因的农杆菌转化T-DNA载体(Lin C，Fang J，Xu X，Zhao T，Cheng J，et al.2008 PLoS ONE 3(3)：e1818.)。这个载体用HindIII和KpnI酶切后，与玉米泛素(Ubiqutin)启动子(HindIII和BamHI双酶切获得)和实施例2获得的玉米中P450基因1(BamH1和KpnI双酶切获得)同时连接，得到转化T-DNA载体pCAMB1300-G6-zm1。利用同样的方法分别获得了表达其他4个P450基因的T-DNA载体pCAMB1300-G6-zm2/3/4/5。
实施例4、表达玉米P450基因的转基因水稻的获得
转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌龚祖埙1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的常规水稻种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含目的基因的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含1到4mM草甘膦的筛选培养基上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2—3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。
T-DNA的插入及其基因的表达可以通过PCR和western印迹分析检测。基因组DNA可以根据现有的方法从转化再生植株和非转化禾本科农作物中提取。
实施例5、转基因水稻抗除草剂能力的测定
获得的转化了pCAMB1300Rice-G6-zm1/2/3/4/5再生水稻植株和没有转化的水稻植株在温室中培养溶液中单株培养。每个转化株系的再生植株分为3个处理：处理1：喷20mM草甘膦(一次性有效成分为250克/亩)；处理2：一次性喷0.2克/L烟磺隆(一次性有效成分5克/亩)；处理3：喷水。处理后的10天记录转化株系的成活率。结果如下(表1)。
表1、转基因水稻抗除草剂能力的测定
| 草甘膦(成活率) | 烟磺隆(成活率) | 水(成活率) | |
| pCAMB1300Rice-G6-zm1(共25个转化株系) | 100％ | 0％ | 100％ |
| pCAMB1300Rice-G6-zm2(共18个转化株系) | 100％ | 0％ | 100％ |
| pCAMB1300Rice-G6-zm3(共15个转化株系) | 6.7％ | 0％ | 100％ |
| pCAMB1300Rice-G6-zm4(共35个转化株系) | 100％ | 8.6％ | 100％ |
| pCAMB1300Rice-G6-zm5(共20个转化株系) | 90％ | 75％ | 100％ |
| 非转化植株 | 0％成活 | 0％成活 | 100％成活 |
实施例6、转抑制玉米P450基因表达的转化载体的构建
用RNA干扰的方法可以抑制玉米的抗除草剂P450基因5在玉米中的表达，从而获得对除草剂敏感的转基因玉米。构建玉米P450基因5的RNAi片断是根据SEQ ID No：3设计的。首先，从玉米P450基因5通过PCR的方法扩增获得2个片断。一个片断是P450-5-1，PCR引物分别为P450-5F1：5’TACGCTCGAGAGCGAGTTGACGCGGATCTCC和P450-5R1：5’CATGGGATCCACTCACCCCGCACAGCGCCATGA；另一片断是P450-5-2，PCR引物分别为P450-5F1和P450-5R2：5’CATGAGATCTGTCTCCGTCCCGGCGCCAAAC。PCR扩增的条件为：PCR扩增的条件是：95℃ 1分钟，62℃ 1分钟，72℃ 1分钟，进行30个循环。基因片段P450-5-1代表SEQ ID No：3的637bp到930bp；基因片段P450-5-2代表SEQ ID No：3的637bp到1092bp。P450-5-1和P450-5-2连接后可以形成反向对称的序列。
这二个片断分别被克隆到T载体(上海生工)中。P450-5-1片断是用XhoI和BamHI从T载体中酶切获得；P450-5-2用XhoI和BglII从T载体中酶切获得。然后，P450-5-1和P450-5-2被连接到预先用XhoI酶切除去抗潮霉素基因(hyg)的pCambia1300载体，获得载体pCamb1300-P450-5i。这个载体包含有一个CaMV的35S启动子控制下的能够干扰抗除草剂玉米P450基因5表达的抑制表达框。载体pCamb1300-P450-5i进一步用EcoRI和HindIII酶切，然后用含有抗草甘膦基因G6的DNA片断连接(G6基因见Li et al.，PloS ONE，e1818)，获得载体pCAMB1300-G6-P450-5i。
实施例7、转抑制玉米P450基因表达的转基因玉米的获得
取授粉后810天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)。将含有T-DNA载体pCamb1300-P450-5i.的农杆菌与未成熟胚共培育共培养23天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(含200mg/L的Timentin杀农杆菌)，28℃暗培养1014天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养23周。
转移所有的组织到新鲜草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养23周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养1014天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养1014天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养，开花后用生产品种D001授粉。
实施例8、抑制玉米p450基因的转基因玉米的选择性杀灭
获得的转化pCamb1300-P450-5i玉米的T1植株和常规(没有转化)玉米植株在温室中单株培养。每个转化系的植株分为3个处理：处理1：喷10mM草甘膦(一次性有效成分为250克/亩)；处理2：喷0.2克/升的烟磺隆(一次性有效成分5克/亩)；处理3：喷水。处理后10天记录植株的成活率，结果如表2所示。
表2、转化玉米植株在不同的除草剂下的成活率
| 草甘膦 | 烟磺隆 | 水 | |
| pCamb1300-P450-5i转化株系(14个) | 100％ | 14％ | 100％ |
| 非转化植株 | 0％ | 100％ | 100％ |
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO 1：
SEQ ID NO 2：
SEQ ID NO 3：
Claims (10)
1、一种抗除草剂基因，其特征是：该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1或者与SEQ IDNO：1有90％以上的相同性。
2、如权利要求1所述抗除草剂基因编码的抗除草剂蛋白质，其特征是：所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：2有90％以上的相同性。
3、一种DNA质粒，其特征是：含有权利要求1所述的基因并且与能够在植物有功能的启动子连接。
4、一种DNA质粒，其特征是：含有利用权利要求1所述的基因或者基因片断构建得到的反义RNA或RNAi的抑制表达框。
5、一种转基因植物细胞，其特征是：包含权利要求1所述的核酸。
6、一种转基因植物细胞，其特征是：权利要求1所述基因的表达被反义RNA、RNAi或者其他方法抑制。
7、如权利要求1所述抗除草剂基因的用途。
8、根据权利要求7所述的抗除草剂基因的用途，其特征是：制备对除草剂增加了抗性的转基因植物。
9、根据权利要求7所述的抗除草剂基因的用途，其特征是：获得利用除草剂选择性杀灭转基因玉米的方法。
10、根据权利要求8或9所述的抗除草剂基因的用途，其特征是：所述除草剂为乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂、色素合成抑制类除草剂、原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂、光系统II抑制剂类除草剂或合成生长素类除草剂。
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