JP6486505B2 - 除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途 - Google Patents
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- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
- C12Y114/19002—Acyl-[acyl-carrier-protein] desaturase (1.14.19.2)
Description
(a)SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
(b)(a)中のアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は追加され、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有する(a)から誘導されたタンパク質を含む除草剤耐性タンパク質を提供する。
(a)前記除草剤耐性タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、又は、
(b)厳密条件で(a)に限定されたヌクレオチド配列と交雑し、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、又は、
(c)SEQ ID NO:1で示されるヌクレオチド配列を含む除草剤耐性遺伝子を提供する。
前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットを含むトランスジェニック宿主生物の細胞を取得することと、
除草剤耐性タンパク質の発生を許可する条件で前記トランスジェニック宿主生物の細胞を培養することと、
前記除草剤耐性タンパク質を回収することと、を含む除草剤耐性タンパク質を発生する方法を提供する。
さらに、前記第2種類のヌクレオチドは、グリホサート耐性タンパク質、グルホシネート耐性タンパク質、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、チトクローム類タンパク質又はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコーディングする。
(a)SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
(b)(a)中のアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は追加され、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有する(a)から誘導されたタンパク質を含む除草剤耐性タンパク質がフェノキシオーキシン類除草剤に耐える用途を提供する。
1、除草剤に対する耐性が強い。本発明の除草剤耐性タンパク質24DT22は除草剤に対する耐性が強く、特に、フェノキシオーキシン除草剤、2,4−Dに対する耐性が強い。
1、24DT22遺伝子配列の取得
24DT22除草剤耐性タンパク質のアミノ酸配列(292個のアミノ酸)は、配列表でSEQ ID NO:2で示すとおりである。植物の好みコドンに基づいて、前記24DT22除草剤耐性タンパク質に対応するアミノ酸配列(292個のアミノ酸)をコーディングするヌクレオチド配列(879個のヌクレオチド)を取得し、配列表でSEQ ID NO:1で示すとおりである。
前記24DT22ヌクレオチド配列(例えば、配列表でSEQ ID NO:1で示す)を南京金斯瑞生物科学技術有限会社で合成し、合成された前記24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)の5’末端にSpeI酵素切断部位が接続され、前記24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)の3’末端にKasI酵素切断部位が接続されている。
1、24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターDBN01−Tの構築
合成した24DT22ヌクレオチド配列をクローンベクターpGEM−T(Promega、Madison、USA、CAT:A3600)に接続し、その操作工程はPromega会社の製品pGEM−Tベクターの説明書に従って行い、組換えクローンベクターDBN01−Tを得て、その構築フローは図1に示す(ここで、Ampはアンピシリン耐性遺伝子を、f1はファージf1の複製起点を、LacZはLacZ開始コドンを、SP6はSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを、T7はT7 RNA ポリメラーゼプロモーターを、24DT22は24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)を、MCSは複数のクローン部位をそれぞれ示す)。
制限エンドヌクレアーゼSpeIとKasIとでそれぞれ、組換えクローンベクターDBN01−Tと発現ベクターDBNBC−01(ベクター骨格:pCAMBIA2301(CAMBIA機構が提供可能である))に酵素切断を行って、切断した24DT22ヌクレオチド配列断片を発現ベクターDBNBC−01のSpeIとKasIの部位間に挿入し、通常の酵素切断方法でベクターを構築することは当業者にとって周知なものであって、組換え発現ベクターDBN100301を構築し、その構築フローは図2に示す(Kan:カナマイシン遺伝子;RB:右境界;AtUbi10:シロイヌナズナUbiquitin(ユビキチン)10遺伝子プロモーター(SEQ ID NO:3);24DT22:24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1);Nos:ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ(SEQ ID NO:4);prCaMV35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(SEQ ID NO:5);PAT:グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子(SEQ ID NO:6);tCaMV35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネータ(SEQ ID NO:7);LB:左境界)。
本発明の第2実施例中の1に記載の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターDBN01−Tを構築する方法に従って、対照配列(SEQ ID NO:8)で対照配列を含有する組換えクローンベクターDBN01R−Tを構築した。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターDBN01R−Tに挿入された対照配列は配列表でSEQ ID NO:8で示されるヌクレオチド配列であって、即ち、対照配列が正確に挿入された。
1、組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム
既に正確に構築した組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)を、液体窒素法でアグロバクテリウムGV3101に転化し、その転化条件は、100μLアグロバクテリウムGV3101、3μLプラスミドDNA(組換え発現ベクター)である。液体窒素中に10分放置し、37℃温度で10分水浴する。転化後のアグロバクテリウムGV3101をLB試験管に接種し、温度28℃、回転速度が200rpmである条件で2時間培養し、50mg/Lのリファンピシン(Rifampicin)と50mg/Lのカナマイシンを含有するLB板に陽性モノクローナルが出るまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ SmaIとPstIでDBN100301を酵素切断した後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ SmaIと BglIでDBN100301N(対照配列)を酵素切断した後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)の構造は完全に正確であった。
野生型シロイヌナズナ種子を0.1%(w/v)アガロース溶液に懸濁させる。懸濁した種子を4℃で2日保存して休眠の需要を満たし、種子の同期発芽を保証する。バーミキュライトを馬糞と混合し、湿るまで水で地下灌漑し、土壌混合物を24時間排出する。前処理後の種子を土壌混合物に植えて、保湿カバーで7日覆う。種子が発芽し、恒温(22℃)、恒湿(40〜50%)、光強度が120〜150μmol/m2秒である長日照条件(16時間光照射/8時間暗所)で温室で植物を培養した。初期はホーグランド栄養溶液で植物を灌漑し、その後はイオン交換水で灌漑し、土壌の湿りは保持するもののずぶぬれにしない。
24DT22遺伝子で第1回のシロイヌナズナ転化を行った。まず、グルホシネート選択方案で、未転化種子背景からT1転化体を選択した。約20000個のT1種子を選別し、314株T1陽性形質転換体(PAT遺伝子)を鑑定した結果、約1.6%の転化率であった。24DT22ヌクレオチド配列に移入したシロイヌナズナT1植物、対照配列に移入したシロイヌナズナT1植物、野生型シロイヌナズナ植物(栽培した18日後)それぞれの2,4−Dジメチルアンモニウム塩とMCPAに対する除草剤耐性効果を検出した。
1、組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム
既に正確に構築された組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)を、液体窒素法でアグロバクテリウムLBA4404(Invitrgen、Chicago、USA、CAT:18313−015)に転化し、その転化条件は、100μLアグロバクテリウムLBA4404、3μLプラスミドDNA(組換え発現ベクター)である。液体窒素中に10分放置し、37℃温度で10分水浴した。転化後のアグロバクテリウムLBA4404をLB試験管に接種し、温度28℃、回転速度が200rpmである条件で2時間培養し、50mg/Lのリファンピシン(Rifampicin)と50mg/Lのカナマイシンを含有するLB板に、陽性モノクローナルが成長するまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ SmaIとPstIでDBN100301を酵素切断した後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ SmaIと BglIでDBN100301N(対照配列)を酵素切断した後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)の構造は完全に正確であった。
通常に利用されるアグロバクテリウム侵入法で、無菌培養した大豆種類中の黄13の子葉節組織を本実施例中の1に記載のアグロバクテリウムと共同培養し、第2実施例中の2と3で構築した組換え発現ベクターDBN100301やDBN100301N中のT−DNA(シロイヌナズナUbiquitin10遺伝子のプロモーター配列、24DT22ヌクレオチド配列、対照配列、Nosターミネータ、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネータを含む)を大豆染色体組に移入し、24DT22と対照ヌクレオチド配列に移入された大豆植物を得て、同時に、野生型大豆植物を対照物とした。
24DT22ヌクレオチド配列に移入した大豆植物と、対照ヌクレオチド配列に移入した大豆植物の葉をそれぞれ約100mgとってサンプルとし、QiagenのDNeasy Plant Maxi KitでそのゲノムDNAを抽出し、Taqmanプローブ蛍光定量PCR方法で、PAT遺伝子コピー数を検出して、24DT22遺伝子のコピー数を確定した。同時に、野生型大豆植物を対照物とし、上記方法で検出分析を行った。実験を3回繰り返し、その平均値をとった。
プライマー1:GAGGGTGTTGTGGCTGGTATTG、配列表でSEQ ID NO:11で示す;
プライマー2:TCTCAACTGTCCAATCGTAAGCG、配列表でSEQ ID NO:12で示す;
プローブ1:CTTACGCTGGGCCCTGGAAGGCTAG、配列表でSEQ ID NO:13で示す;
PCR反応体系は以下のとおりである:
10μL
50×プライマー/プローブ混合物 1μL
ゲノムDNA 3μL
水(ddH2O) 6μL
前記50×プライマー/プローブ混合物は、1mM濃度の各種プライマーを各45μL、100μM濃度のプローブ50μL、860μL 1×TE緩衝液を含み、4℃で、アンバー試験管に貯蔵されている。
21 95℃ 5分
22 95℃ 30秒
23 60℃ 1分
24 工程22に戻る、40回繰り返す
SDS2. 3ソフトウェア(Applied Biosystems)でデータを分析する。
24DT22ヌクレオチド配列に移入した大豆植物、対照配列に移入した大豆植物、野生型大豆植物(幼苗期)それぞれの2,4−Dジメチルアンモニウム塩とMCPAに対する除草剤耐性効果を検出した。
1、24DT22ヌクレオチド配列を含有するコーン組換え発現ベクターDBN100764の構築
制限エンドヌクレアーゼSpeIとKasIでそれぞれ、組換えクローンベクターDBN01−Tと発現ベクターDBNBC−02(ベクター骨格:pCAMBIA2301(CAMBIA機構が提供可能である))に酵素切断し、切断した24DT22ヌクレオチド配列断片を発現ベクターDBNBC−02のSpeIとKasI部位間に挿入し、通常の酵素切断方法でベクターを構築することは当業者にとって周知なものであって、発現ベクターDBNBC−02中のSpeIとKasIの酵素切断部位も、通常の酵素切断方法によるものであって、組換え発現ベクターDBN100764を構築し、その構築フローは図6に示す(Kan:カナマイシン遺伝子;RB:右境界;Ubi:コーンUbiquitin(ユビキチン)1遺伝子プロモーター(SEQ ID NO:9);24DT22:24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1);Nos:ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ(SEQ ID NO:4);PMI:リン酸マンノースメラーゼ遺伝子(SEQ ID NO:10); LB:左境界)。
本発明の第2実施例中の1に記載の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターDBN01−Tを構築する方法に従って、対照配列(SEQ ID NO:8)を利用して、対照配列を含有する組換えクローンベクターDBN02R−Tを構築した。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターDBN02R−Tに挿入された対照配列は配列表でSEQ ID NO:8で示されるヌクレオチド配列であって、即ち対照配列が正確に挿入された。
既に正確に構築された組換え発現ベクターDBN100764とDBN100764N(対照配列)を、液体窒素法でアグロバクテリウムLBA4404(Invitrgen、Chicago、USA、CAT:18313−015)に転化し、その転化条件は、100μLアグロバクテリウムLBA4404、3μLプラスミドDNA(組換え発現ベクター)である。液体窒素中に10分放置し、37℃温度で10分水浴した。転化後のアグロバクテリウムLBA4404をLB試験管に接種して温度28℃、回転速度200rpmの条件で2時間培養し、50mg/Lのリファンピシン(Rifampicin)と50mg/Lのカナマイシンを含有するLB板に陽性モノクローナルが成長するまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼSmaIとEcoRVでDBN100764に酵素切断を行った後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ StyIとBglIでDBN100764N(対照配列)に酵素切断を行った後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100764とDBN100764N(対照配列)の構造は完全に正確であった。
通常に利用されるアグロバクテリウム侵入法で、無菌培養したコーン種類中の綜31(Z31)の未熟胚を第7実施例中の3に記載のアグロバクテリウムと共同培養し、第7実施例中の1と2で構築した組換え発現ベクターDBN100764とDBN100764N(対照配列)中のT−DNA(コーンUbiquitin1遺伝子のプロモーター配列、24DT22ヌクレオチド配列、対照配列、PMI遺伝子、Nosターミネータ配列を含む)をコーン染色体組に移入して、24DT22ヌクレオチド配列を移入したコーン植物と対照配列に移入したコーン植物を取得した。同時に野生型コーン植物を対照物とした。
24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物と、対照配列に移入したコーン植物の葉をそれぞれ約100mgとってサンプルとし、QiagenのDNeasy Plant Maxi KitでそのゲノムDNAを抽出し、Taqmanプローブ蛍光定量PCR方法でPMI遺伝子コピー数を検出して、24DT22遺伝子のコピー数を確定した。同時に、野生型コーン植物を対照とし、上記方法で検出分析を行った。実験を3回繰り返し、その平均値をとった。
プライマー3:GCTGTAAGAGCTTACTGAAAAAATTAACA、配列表でSEQ ID NO:14で示す;
プライマー4:CGATCTGCAGGTCGACGG、配列表でSEQ ID NO:15で示す;
プローブ2:TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCC、配列表でSEQ ID NO:16で示す;
PCR反応体系は以下のとおりである:
10μL
50×プライマー/プローブ混合物 1μL
ゲノムDNA 3μL
水(ddH2O) 6μL
前記50×プライマー/プローブ混合物は、1mM濃度の各種プライマーを各45μL、100μM濃度のプローブ50μL、860μL 1×TE緩衝液を含み、4℃で、アンバー試験管に貯蔵されている。
41 95℃ 5分
42 95℃ 30秒
43 60℃ 1分
44 工程42に戻る、40回繰り返す
SDS2. 3ソフトウェア(Applied Biosystems)でデータを分析した。
24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、対照配列に移入したコーン植物、野生型コーン植物(V3−V4時期)それぞれの、2,4−Dジメチルアンモニウム塩とMCPAに対する除草剤耐性効果を検出した。
Claims (25)
- (a)SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むことを特徴とする除草剤耐性タンパク質。
- (a)請求項1に記載の除草剤耐性タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、
又は、
(b)SEQ ID NO:1で示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする除草剤耐性遺伝子。 - 調節配列と、請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子とを含むことを特徴とする発現カセット。
- 請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項3に記載の発現カセットを含むことを特徴とする組換えベクター。
- 請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項3に記載の発現カセットを含むトランスジェニック宿主生物の細胞を取得する工程と、
除草剤耐性タンパク質の発生を許容する条件で前記トランスジェニック宿主生物の細胞を培養する工程と、
前記除草剤耐性タンパク質を回収する工程と、を含むことを特徴とする除草剤耐性タンパク質を発生する方法。 - 前記トランスジェニック宿主生物が、植物、動物、細菌、酵母、バキュロウイルス、線虫又は藻類を含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート及びサトウキビからなる群から選択されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 請求項1に記載の除草剤耐性タンパク質又は請求項3に記載の発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質を、請求項1に記載の除草剤耐性タンパク質又は請求項3に記載の発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質と異なるタンパク質をコーディングする少なくとも1つの第2のヌクレオチド配列と一緒に植物中において発現することを含むことを特徴とする除草剤耐性範囲の拡大方法。
- 前記第2のヌクレオチド配列が、グリホサート耐性タンパク質、グルホシネート耐性タンパク質、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、チトクローム類タンパク質又はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコーディングすることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項3に記載の発現カセットで複数の植物細胞を形質転換し、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットの発現を許容する形質転換細胞で成長させ、そして、非形質転換細胞を殺傷する又は非形質転換細胞の成長を抑制する除草剤濃度で前記細胞を培養することを含み、前記除草剤はフェノキシオーキシンであることを特徴とする形質転換した植物細胞の選択方法。
- 請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項3に記載の発現カセット又は請求項4に記載の組換えベクターを含む作物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含み、
前記除草剤がフェノキシオーキシンであることを特徴とする雑草を制御する方法。 - 請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項3に記載の発現カセット又は請求項4に記載の組換えベクターを植物に導入し、導入後の植物に除草剤の障害から保護するのに充分な除草剤耐性タンパク質を発生させることを含み、
前記除草剤がフェノキシオーキシンであることを特徴とする、植物を除草剤による障害から保護する方法。 - 前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート及びサトウキビからなる群から選択されることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項3に記載の発現カセット又は請求項4に記載の組換えベクターを含むグリホサート耐性植物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含むことを特徴とするグリホサート耐性植物の田畑においてグリホサート耐性雑草を制御する方法。
- 前記除草剤が、フェノキシオーキシン及びグリホサートを少なくとも含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記グリホサート耐性植物が、単子葉植物又は双子葉植物であることを特徴とする請求項14又は15に記載の方法。
- 請求項2に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項3に記載の発現カセット又は請求項4に記載の組換えベクターを植物に導入することを含むことを特徴とする作物に2,4−D除草剤耐性を付与する方法。
- 前記作物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート及びサトウキビからなる群から選択されることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- フェノキシオーキシン類除草剤に耐えるための、除草剤耐性タンパク質の使用であって、
前記除草剤耐性タンパク質は、(a)SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むことを特徴とする、除草剤耐性タンパク質の使用。 - 除草剤耐性範囲の拡大、形質転換した植物細胞の選択、雑草を制御すること、植物をフェノキシオーキシン類除草剤による障害から保護すること、又は、植物にフェノキシオーキシン類除草剤耐性を付与することに使用することを特徴とする請求項19に記載の使用。
- 除草剤耐性範囲の拡大に使用することは、請求項8又は9に記載の方法を含むことを特徴とする請求項20に記載の使用。
- 形質転換した植物細胞の選択に使用することは、請求項10に記載の方法を含むことを特徴とする請求項20に記載の使用。
- 前記雑草を制御する使用が、請求項11、14〜16の何れかに記載の方法を含むことを特徴とする請求項20に記載の使用。
- 前記植物を除草剤による障害から保護する使用が、請求項12又は13に記載の方法を含むことを特徴とする請求項20に記載の使用。
- 前記植物に除草剤耐性を付与する使用が、請求項17又は18に記載の方法を含むことを特徴とする請求項20に記載の使用。
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