CN102718845B - 一种基因在培育抗百草枯转基因植物中的应用 - Google Patents
一种基因在培育抗百草枯转基因植物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种增强植物百草枯抗性的方法，涉及一种具有百草枯抗性的转运体蛋白及其编码基因在转基因植物中的应用，其中编码百草枯抗性基因的蛋白序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，其基因核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有百草枯抗性的转运体蛋白及其编码基因在转基因植物中的应用。
背景技术
百草枯(paraquat，1,1'- 二甲基 -4,4'- 联吡啶二氯化物，methyl viologen)在农业中广泛应用已近50年，作为非选择性除草剂应用在世界范围内超过100个国家，受到广泛接受与欢迎。90年代以来，随着农业生产的需求，我国若干农药企业先后开始规模生产百草枯原药，并不断的改进生产工艺，产品在各地推广应用，在生产中发挥了一定的作用。
百草枯是继草甘磷之后的第二大除草剂，是一种速效触杀型除草剂，兼有一定内吸作用，主要用于果园、桑园、茶园、林带等作物的杂草，估计将来的应用呈上升、递增趋势。百草枯是典型的光合系统I抑制剂，其活性的发挥决定于光，植物对其吸收非常迅速，因而喷药后短期内降雨不影响药效的发挥；吸收的药剂通过木质部中的逆向流进行传导，在适宜条件下，大量药剂被叶片吸收并向其他部位传导，此种传导仅仅是非原质体(木质部)传导，因而叶面处理的百草枯通常停滞于被处理的叶片内。毒理学机理研究表明，百草枯的生物毒性与致突变性的原因是，双氧化合物存在时，百草枯被还原并重新被氧化，在此循环反应过程中产生负自由基O2-并在活细胞体内积累。Baldwin等人的研究结果表明，进入大肠杆菌中的百草枯，被胞质中的NADPH-依耐性硫辛酰胺脱氢酶还原成单价正自由基PQ+，随后与氧作用产生负自由基O2-（k2=7.7x108M-1s-1），Farrington 等人的研究结果也证实这条途径。Ju-Fang Ma等人从一株铜绿假单胞菌中克隆到6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，该基因对百草枯产生的负自由基O2 -具有有效的脱毒作用。Su Mei Kao等人通过对一株具百草枯抗性的大肠杆菌突变株的研究，初步探讨了该除草剂在微生物体内的转移、转化规律。
百草枯4,4' -位阳离子的存在使得它具有很强的还原性，是强氧化剂，强氧化剂的不稳定性又使它的研究受到了一定的限制，在原核生物中研究较多，但在真核生物尤其是植物中很少。随着该试剂的使用，具有抗性的植株出现。12-15年后发现了第一例抗性杂草(Powles and Cornic, 1987)。据多年数据显示，生物对抗百草枯可能与其体内的转运体有关。转运体蛋白广泛存在于原核生物和真核生物中，其中一些是有害物质的外排泵，在生物体排出环境中或自身代谢产生的有毒物质过程中起到重要作用。研究表明，原核生物的转运体蛋白PrqA、 PotE 、EmrE 能转运、隔离并除去PQ等毒性分子，以降低作用于靶标的药物浓度从而达到解毒的作用。
转运体蛋白在植物中的转化研究与应用情况的研究主要停留在实验室阶段， Jinki Jo等人将无色杆菌中的pqrA基因转进烟草中，并得到了很好的表达，对比于野生株转基因烟草具有对百草枯较高的抗性，而且烟叶中的残留量也相当少。
与抗草甘磷的转基因植物相比，至今抗百草枯转基因植物的商品化产品不多。前面提到的Jinki Jo等人研究的pqrA基因转烟草植株在和野生型烟草相比, 野生型生长在半固体培养基中当百草枯为1μM浓度时即出现枯萎，百草枯达20μM浓度时植株即死亡，而转基因烟草仍然是正常生长。在百草枯浓度20μM和50μM的情况下，在野生型烟草的叶片中叶绿素含量损失约80% ，而转基因烟草的叶片中叶绿素含量损失不超过15% 。
目前关于百草枯抗性基因在植物中的转化研究与应用情况的研究主要停留在实验室阶段，与抗草甘磷的转基因植物相比，抗百草枯转基因植物的商品还未出现。所以，进行百草枯抗性基因研究及其转化植物体系的建立是十分必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的使植物具有农药百草枯抗性的蛋白质。另外，本发明还提供了编码这些蛋白质的核酸以及基因工程中间体（如，表达盒、载体和细胞等），获得具有含百草枯成分农药抗性的植物和微生物的方法和应用，并且提供了判断植物和微生物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。
本发明所提供的对农药百草枯具有高抗性的转运蛋白，名称为PQR6（paraquat resistant 6）和PQR7（paraquat resistant 7） ，分别来源于人苍白杆菌（Ochrobactrum anthropi）KT-q077和人苍白杆菌（Ochrobacterium anthropi）B6-1，其中KT-q077于2008年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2787，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；另外一株B6-1于2011年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4941，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。PQR6是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1）序列表中的SEQ ID NO：1；
2）将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与百草枯抗性相关的蛋白质。
上述抗百草枯转运蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；
2）编码序列表中SEQ ID NO：1蛋白质序列的多核苷酸；
3）与序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65oC下杂交并洗膜。
PQR7是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1）序列表中的SEQ ID NO：2；
2）将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与百草枯抗性相关的蛋白质。
上述抗百草枯转运蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；
2）编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；
3）与序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65oC下杂交并洗膜。
PQR6和PQR7的蛋白序列一致性达99.6%,核苷酸序列一致性达98.99%，可以判定二者为同一基因。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
实验证明本发明的抗百草枯转运蛋白的编码基因转入大肠杆菌Ecoli BL21中可增强宿主菌对百草枯有效成分甲基紫精（methyl viololgen，MV）的耐受性。该基因转入植物拟南芥和水稻中，可增强拟南芥和水稻对MV的耐受性。
附图说明
表1为从无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）KT-q077扩增获得的百草枯抗性基因PRQ6基因的氨基酸序列。
表2为从无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）B6-1扩增获得的百草枯抗性基因PQR7基因的氨基酸序列。
表3为从无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）KT-q077扩增获得的百草枯抗性基因pqr6基因的核苷酸序列。
表4为从无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）B6-1扩增获得的百草枯抗性基因pqr7基因的核苷酸序列。
图1 A为将pqr6基因插入到原核表达载体pET30a（+）获得的pET30a- pqr6载体构建示意图；B为将pqr7基因插入到原核表达载体pET30a（+）获得的pET30a- pqr7载体构建示意图。
图2 A为将pqr6基因插入到植物表达载体pXQ35S获得的pXQ35S- pqr6载体构建示意图；B为将pqr7基因分别插入到植物表达载体pXQ35S获得的pXQ35S- pqr7载体构建示意图。
图3为在含有不同浓度MV的培养液中，分别带有pET30a空载体(A)、pET30a- pqr6（B）和pET30a- pqr7（C）质粒的Ecoli. BL21菌株，生长过夜的照片。
图4为分别带有pET30a空载体、pET30a- pqr6、pET30a- pqr7质粒的Ecoli. BL21菌株，在不同浓度MV的培养液中培养过夜后，OD600检测结果统计图表。
图5 为转基因拟南芥T1代喷洒百草枯实验：A为pqr6基因的转基因拟南芥，B为pqr7基因的转基因拟南芥。
图6为转基因拟南芥T2代喷洒百草枯实验：A为负对照，B为pqr6基因的转基因拟南芥，C为pqr7基因的转基因拟南芥。
图7为转基因拟南芥T3代喷洒百草枯实验：A为负对照，B为pqr6基因的转基因拟南芥，C为pqr7基因的转基因拟南芥。
图8 为PCR检测转基因拟南芥T1代电泳图，1-8是以转pqr6基因的拟南芥DNA为模板，9-16是以转pqr7基因的拟南芥DNA为模板，CK1是以携带pqr6基因的质粒为模板作为正对照，CK2是以携带pqr7基因的质粒为模板作为正对照，CK3是以水为模板的作为负对照，CK4是以非转基因拟南芥的DNA为模板作为负对照。
图9 为百草枯处理转基因水稻T0代叶片照片，CK-为负对照。
图10为百草枯处理转基因水稻T1代植株叶片照片，WT为非转基因水稻植株叶片照片。
图11为PCR检测转基因水稻T0代电泳图， -为负对照。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
一、 百草枯抗性相关转运蛋白编码基因的获得
实施例1、百草枯抗性相关转运蛋白编码基因的获得
1、研究表明，转运体蛋白能够将百草枯转运至其作用位点以外是生物具有百草枯抗性的机制。经鉴定，我们实验室分离到的几株具有抗性的菌株（KT-q077、B6-1）为无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）。通过检索NCBI中Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 基因组，选择10个转运蛋白基因作为目标基因。
2、其中根据locus_tag：Oant_1883，（GenBank: CP000758.1）设计引物：DRT2-F：5`-CCAATGTTGCCGAAAAATC-3`和DRT2-R：TTATGCGGCAATAGTCTTACG。分别以菌株KT-q077和B6-1为模板，用PCR方法（Transgen公司）分别扩增出pqr6和pqr7的DNA基因片段；其中，扩增体系为: 10× pfu buffer(含有 Mg2+) 5 ul, 10mM dNTPs 1ul, 10uM 引物 DRT2-F 1ul, 10uM 引物 DRT2-R 1ul, 菌株KT-q077 和B6-1基因组DNA 1ul,pfu DNA 聚合酶 1ul,加水至 50ul。 扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒，35个循环；72℃延伸 7分钟。扩增均得到1488bp片段，将其连接到pEasy-T1载体（Transgen公司）得到重组载体，经测序表明该扩增片段具有序列表中序列2和4的核苷酸序列，与Ochrobactrum anthropi ATCC 49188的Oant_1883，氨基酸序列一致性达99%。该扩增片段即为PQR6和PQR7的DNA基因。将该重组载体分别命名为pPQR6-T1和 pPQR7-T1。
实施例2、原核表达载体的构建
具体实施步骤如下：pET30a- pqr6构建策略
以pPQR6-T1为模板，利用引物DRT2-pet-F：5`-GAGACCATGGCTATGTTGCCGAAAAAT
CGC-3` RDT2-pet-R：5`-GCGCCTCGAGTGCGGCAATAGTCTTACG-3`（引物设计时引入NcoI 、 XhoⅠ酶切位点）进行PCR扩增 ，扩增体系为: 10× pfu buffer(含有 Mg2+) 5 ul, 10mM dNTPs 1ul, 10uM 引物 DRT2-F 1ul, 10uM 引物 DRT2-R 1ul, 菌株KT-q077 基因组DNA 1ul,pfu DNA 聚合酶 1ul,加水至 50ul。 扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒，35个循环；72℃延伸 7分钟。扩增得到的片段和载体质粒pET30a（+）经NcoI 、 XhoⅠ酶切后，连接，得到原核表达载体pET30a- pqr6，如图1A所示。
pET30a- pqr7构建策略
以pPQR7-T1为模板，利用引物DRT2-pet-F：5`-GAGACCATGGCTATGTTGCCGAAAAAT
CGC-3` RDT2-pet-R：5`-GCGCCTCGAGTGCGGCAATAGTCTTACG-3`（引物设计时引入NcoI 、 XhoⅠ酶切位点）进行PCR扩增 ，扩增体系为: 10× pfu buffer(含有 Mg2+) 5 ul, 10mM dNTPs 1ul, 10uM 引物 DRT2-F 1ul, 10uM 引物 DRT2-R 1ul, 菌株KT-q077 基因组DNA 1ul,pfu DNA 聚合酶 1ul,加水至 50ul。 扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒，35个循环；72℃延伸 7分钟。扩增得到的片段和载体质粒pET30a（+）经NcoI 、 XhoⅠ酶切后，连接，得到原核表达载体pET30a- pqr7，如图1B所示。
实施例3、植物表达载体的构建
具体实施步骤如下：pXQ35S- PRQ6构建策略
BlpI、BamHI酶切原核表达载体pET30a- pqr6，得到1271bp含his tag 标签的融合表达基因片段，与经Sma I、BamHI酶切的pXQ35S载体连接，得到植物过量表达载体pXQ35S- PRQ6，如图2-A所示。
pXQ35S- PRQ7构建策略
BlpI、BamHI酶切原核表达载体pET30a- pqr6，得到1271bp含his tag 标签的融合表达基因片段，与经Sma I、BamHI酶切的pXQ35S载体连接，得到植物过量表达载体pXQ35S- PRQ6，如图2-B所示。
二、PQR6 、PQR7基因功能验证
实施例4、原核表达及功能验证
表达目的基因菌株的获得：
大肠杆菌转化：将构建好的原核表达载体转化大肠杆菌Ecoli. BL21, 将空载体质粒pET30a（+）转化大肠杆菌Ecoli. BL21作为负对照。
目的基因在大肠杆菌中的功能验证：
分别挑取带有pET30a、pET30a-pqr6和pET30a-pqr7质粒的Ecoli.Bl21菌株的单克隆，用LB培养液在37℃ 200rpm震荡培养16小时。取1ml培养物，以200倍体积扩大培养，LB培养液中加0.1mM IPTG，用来诱导pqr6和pqr7基因表达。37℃ 200rpm震荡培养4小时后（菌株培养OD600达到0.6时），向含不同浓度methyl violengen 等体积的LB培养液中投加等量的菌液，37℃ 200rpm震荡培养16小时后，观察菌液浓度（图3）并测定统计OD值（图4）。如图3所示，分别带有pET30a-pqr6（图3-B）和pET30a-pqr7（图3-C）质粒的Ecoli.Bl21菌株最高能耐受25mM MV。其中在5mM浓度下，菌液的浓度分别是对照的16倍和17倍。
实施例5、植物转化、苗期筛选
植物转化：将构建好的植物表达载体转化农杆菌AgL0，用于转化植（作）物：拟南芥和水稻。拟南芥是通过农杆菌液浸花法转化；水稻是通过农杆菌侵染愈伤后分化再生获得转基因苗。
重组载体转化拟南芥各阶段筛选如下：
T1代转基因植株的筛选：将收获的转基因拟南芥T1代种子播种在营养钵中，长至4-5叶时，用百草枯（25μm MV，0.025% Tween）溶液喷洒叶片，筛选高抗植株，如图5所示。
以单株形式收集具有百草枯特性植株的种子T2代，干燥后直播于营养钵中。当植株生长至4片叶时，用百草枯（25μm MV，0.025% Tween）溶液喷洒叶片，筛选高抗植株，如图6所示。
以单株形式收集具有百草枯特性植株的种子T3代，干燥后直播于营养钵中。当植株生长至4-5片叶时，用百草枯（25μm MV，0.025% Tween）溶液喷洒叶片，筛选高抗植株，如图7所示。
转基因拟南芥的分子检测：取筛选得到的转基因植株T1代叶片，提取基因组DNA，以pqr6和pqr7 基因自身引物PCR检测，植物表达载体质粒作阳性对照，空白作阴性对照。图8为PCR检测电泳图。
重组载体转化水稻各阶段筛选如下：
组培苗的筛选：用G418（100mg/L）抗性筛选T0代转基因水稻苗。
转基因植株T0代叶片耐受实验：在转基因植株T0代叶片长至4-5叶期，每个单株取新叶中段2cm长左右，浸泡于1ml（5μm百草枯，0.025% Tween）百草枯溶液72小时观察叶片，如图9所示。
转基因植株T1代筛选：将T1代种子按每个株系50－100粒分别播种，待植株长到2叶期时，将植株叶片浸泡于100ml（5μm百草枯，0.025% Tween）百草枯溶液5分钟，4天后观察植株，如图10所示。
转基因水稻的分子检测：取组培筛选得到的转基因植株T0代叶片，提取基因组DNA，以PQR6 和PQR7基因自身引物PCR检测，植物表达载体质粒作阳性对照，空白作阴性对照，如图11所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京未名凯拓农业生物技术有限公司
<120> 一种基因在培育抗百草枯转基因植物中的应用
<130>
<150> 201110131887.4
<151> 2011-05-20
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 495
<212> PRT
<213> 无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）
<400> 1
Met Leu Pro Lys Asn Arg Trp Leu Val Leu Thr Ile Val Ser Ser Ala
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ile Val Val Asp Met Thr Val Leu Tyr Thr Ala Leu Pro
20 25 30
Arg Leu Thr His Asp Leu Ala Ala Ser Ala Ser Glu Lys Leu Trp Ile
35 40 45
Met Asn Ile Tyr Pro Leu Val Val Ala Gly Phe Leu Pro Gly Leu Gly
50 55 60
Thr Leu Gly Asp Lys Val Gly His Lys Arg Met Phe Met Ser Gly Leu
65 70 75 80
Ala Val Phe Gly Leu Ala Ser Phe Cys Ala Ala Tyr Ser Pro Asn Pro
85 90 95
Glu Phe Leu Ile Ala Ala Arg Ala Phe Leu Ala Cys Gly Ala Ala Met
100 105 110
Met Met Pro Ala Thr Leu Ser Ile Ile Arg Leu Thr Phe Thr Asp Asp
115 120 125
Lys Glu Arg Ser Leu Ala Ile Gly Ile Trp Ala Ala Ile Ala Ser Gly
130 135 140
Gly Ala Ala Ile Gly Pro Val Ala Gly Gly Val Leu Leu Glu Tyr Phe
145 150 155 160
Trp Trp Gly Ser Val Phe Leu Ile Asn Val Pro Val Val Leu Val Ala
165 170 175
Leu Ser Leu Ser Val Phe Thr Leu Glu Asn Arg Pro Leu Gly Ser Lys
180 185 190
Arg Lys Trp Asp Leu Ile Gly Ser Ile Gln Ile Met Val Gly Leu Ile
195 200 205
Ala Leu Thr Tyr Ala Val Lys Glu Leu Ala Lys Arg Asp Ala Ser Met
210 215 220
Thr Val Phe Thr Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Val Ala Ser Phe Ile
225 230 235 240
Phe Val Arg Arg Gln Leu Ala Ser Glu Ala Pro Leu Ile Asp Phe Ser
245 250 255
Leu Phe Asn Asn Lys Leu Phe Ser Met Gly Val Phe Ala Ala Leu Val
260 265 270
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275 280 285
Gln Leu Ile Glu Gly Met Thr Pro Leu His Ala Gly Leu Ser Ile Leu
290 295 300
Pro Ile Pro Leu Ala Ala Phe Val Ala Gly Pro Leu Ala Gly Ile Met
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Leu Pro Arg Leu Gly Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ser Ser Leu Gly Ile
325 330 335
Thr Ala Leu Gly Val Ile Val Tyr Ile Leu Thr Tyr Lys Thr Ser Ala
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Asn Ala Leu Gly Val Thr Val Phe Gly Ser Ile Leu Ser Val Phe Tyr
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Arg Asp Ser Leu Asp Glu Ala Leu Leu Ala Ala Gln Ser Leu Pro Pro
435 440 445
Ala Asp Ala Gln Thr Leu Thr Ala Leu Ala Ser Ala Ala Phe Glu Ser
450 455 460
Ala Tyr Val Ala Val Ile Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Ser Ile Ala
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<213> 无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）
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<213> 无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）
<400> 3
atgttgccga aaaatcgctg gctggttctg accattgttt ccagcgcatt gtttctgatc 60
gtcgtggaca tgacggtgct ttatacggcg ctaccccgcc tcacccacga tctcgcggcc 120
agcgcttccg aaaagctctg gatcatgaac atctatccgc tcgtcgttgc agggttcctg 180
cccggcctcg gcacgcttgg cgacaaggtc ggccacaagc gcatgttcat gtctggactc 240
gcagtcttcg ggcttgcctc attctgcgcg gcctactcgc caaacccgga gttccttatt 300
gccgctcgcg catttctcgc ttgcggcgca gccatgatga tgcccgcaac gctctccatc 360
attcggttga cgttcaccga tgacaaggaa cgctcgcttg caatcggcat ctgggcggct 420
attgcatcag gcggtgccgc catcggtcct gtggcaggcg gcgttctgct ggaatatttc 480
tggtggggat cggtcttcct tatcaacgta cctgtcgtac tggttgcgct gtcactctcc 540
gtcttcacac ttgaaaaccg cccgctcggc tccaagcgca aatgggattt gatcggttcg 600
atccagatta tggttggatt gattgcactc acctatgccg tgaaggaact cgcaaagcgc 660
gatgcgtcca tgactgtatt tacagccgcg cttgcagtcg ggttggtcgc atcattcatc 720
ttcgtgcgca ggcagctcgc aagcgaagca ccgctgatcg acttctctct gttcaacaac 780
aagctgtttt cgatgggtgt tttcgcagct ctggtagcgt ccggttcaat gacgggaatg 840
gagctcgtct tcagccagcg catgcagctg atcgaaggca tgacaccctt gcatgccgga 900
ttatcaatct tgcctattcc tctggccgct ttcgttgcag ggccgctcgc tggcatcatg 960
ctgccgcgcc ttggtaccgg caagcttctg tggtcgtcgc tggggatcac agcactcggc 1020
gttattgtct acattctgac ttacaagact tcggcatcgt tctatctggt cgggcttgcg 1080
attctcggct tcggcgtggg agctgccatg acaggtgcat cgtcggcgat catgaccaat 1140
gcaccggttg aaaaggcagg catggcagct tccgttgaag aagtttcctt tgaactcggc 1200
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gtgatccctg aaggcgcagg tatccccgca atcgtgcgcg atagtctgga cgaagcgctt 1320
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gcttttgaga gtgcttatgt tgccgtcatc acagcgaccg caaccctgct ttcgatcgct 1440
acgctcgtgg cctacattat tcagcgacgt aagactattg ccgcataa 1488
<210> 4
<211> 1488
<212> DNA
<213> 无色杆菌（Ochrobactrum anthropi）
<400> 4
atgttgccga aaaatcgctg gctggttctg accattgttt ccagcgcatt gtttctgatc 60
gtcgtggaca tgacggtgct ttatacggcg ctaccccgcc tcacccacga tctcgcggcc 120
agcgcttccg aaaagctctg gatcatgaac atctatccgc tcgtcgttgc agggctcctg 180
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gcagtcttcg ggcttgcctc attctgcgcg gcctactcgc caaacccaga attccttatt 300
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acgctcgtgg cctacattat tcagcgacgt aagactattg ccgcataa 1488
Claims (8)
1.一种赋予转基因植物百草枯抗性的方法，其特征是将百草枯抗性相关转运蛋白编码基因插入表达载体，获得含有百草枯抗性基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述百草枯抗性基因的植株或所述百草枯抗性增加的植株中筛选得到百草枯抗性增强的植株；其中，所述百草枯抗性相关转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述百草枯抗性相关转运蛋白的编码基因，是下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，或；
2）序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述百草枯抗性基因导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到百草枯抗性提高的转基因植物。
4.权利要求1所述的方法，其中所述表达载体的特征是：用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或用于植物微弹轰击的载体，或者是在原核生物中复制的载体。
5.权利要求3所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶或双子叶植物。
6.权利要求5所述的方法，其中所述单子叶植物来自水稻，双子叶植物来自拟南芥。
7.权利要求2中所述的百草枯抗性相关转运蛋白的编码基因在植物转基因抗性筛选中的应用，其特征在于将所述编码基因的核苷酸序列导入植物表达载体，同时还插入其它可赋予植物对除草剂、盐、低温、干旱、氧化胁迫、抗生素、病原体或昆虫的抗性，或是调控植物的生长发育的表达盒。
8.权利要求7所述的应用，为在烟草、苜蓿、玉米、水稻、棉花、油菜或大豆中的应用。
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