CN102177238A - 与硅转运相关的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

基于我们在已知有效吸收硅的植物(包括：小麦、木贼、燕麦、高粱、以及大麦)中对硅流入和流出转运蛋白基因的识别，本发明的特征在于对硅转运蛋白进行编码的多核苷酸；包括这类多核苷酸的载体、细胞、以及植物；以及用于制造这类植物的方法。本发明的特征还在于硅转运蛋白多肽以及它们的片段。表达异源的硅转运蛋白的植物可以显示增加的硅吸收以及对生物性和非生物性胁迫的增强的耐受性二者。具体而言，表达硅转运蛋白的植物例如大豆可以显示对病原体例如锈菌的增强的耐受性。

Description

与硅转运相关的组合物和方法

发明背景

本发明涉及可以用于在植物中(比如大豆)增加硅吸收并且增加对生物性以及非生物性胁迫的耐受性的组合物和方法。

对植物的生物性以及非生物性胁迫每年对作物引起价值数十亿美元的危害。例如，大豆锈病(由豆薯层锈菌真菌所引起的一种疾病)2003年在巴西导致价值大约十亿美元的损害。这种疾病现在已经开始传播进入美国(全世界大豆最大的生产者)。

虽然这种锈病可以使用化学杀菌剂来治疗，这么做是昂贵的、对环境有潜在的损害、并且可能仅仅是部分有效的。因此，对于用于保护植物免受生物性连同非生物性胁迫的额外的或改进的方法存在一种需求。大豆锈病的预防或控制是在这方面最重要的应用之一。

发明概述

我们已经发现在已知的有效吸收硅的植物中硅流入和流出转运蛋白的基因，这些植物包括：小麦、木贼、高粱、燕麦、以及大麦。这些编码的转运蛋白当在一种植物(如大豆)中表达时增加对生物性以及非生物性应激源的耐受性。因此，本发明的特征在于：对硅转运蛋白进行编码的多核苷酸；包括这类多核苷酸的载体、细胞、以及植物；以及用于制造这类植物的方法。该发明的特征还在于硅转运蛋白多肽以及它们的片段。具体地讲，有用的是用在此所说明的这些硅转运蛋白转化的大豆植物，其中该硅转运蛋白的表达导致对大豆锈病的耐受性增加。

相应地，在一个第一方面中，本发明的特征在于一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸包括与选自下组的一种序列基本上一致的一个核酸序列(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％一致性)，该组的组成为：SEQ ID NO：4、9、12、13、14、15、33、52、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014、或其一种片段。本发明的特征还在于包括一个核酸序列的一种多核苷酸，该核酸序列编码与选自下组的一种序列基本上一致的一种多肽，，该组的组成为：SEQ ID NOS：5、6、34-38、60、以及68、或其一种片段。在其他的实施方案中，将该核酸序列进行修饰以便包含一种或多种(例如至少2、3、4、5、8、10、15)突变、缺失、插入、或它们的一种组合。该修饰的核酸序列可以编码当它在一种细胞中表达时具有增加或者减少硅转运的一种多肽。该多肽在与小麦SIIT1序列(SEQ ID NO：37)的位置132对应的位置可以具有一种突变。在某些实施方案中，该突变是一种苏氨酸到丙氨酸的突变)。在某些实施方案中，该多核苷酸是与SEQ ID NO：50基本上一致的或该多核苷酸编码与SEQ ID NO：51基本上一致的一种多肽。在一些实施方案中，在一种细胞中由该第一方面的多核苷酸编码的多肽的表达增加或能够增加进入所述细胞的硅转运。

在另一方面，本发明的特征在于包括与选自下组的一种核苷酸序列基本上一致的(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％一致性)一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该组的组成为：SEQ ID NOS：29、71、以及73、或其一种片段。本发明的特征还在于包括一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该核酸序列编码与选自下组的一种氨基酸序列基本上一致的一种多肽，该组的组成为：SEQ ID NOS：31、72、以及74、或其一种片段。在一些实施方案中，在一种细胞中由该多核苷酸编码的多肽的表达增加或能够增加离开所述细胞的硅转运。

在另一方面，本发明的特征在于包括与选自下组的一种核苷酸序列基本上一致的(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％一致性)一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该组的组成为：SEQ ID NO：56、58、以及59、或其一种片段。本发明的特征还在于包括一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该核酸序列编码与选自下组的一种序列基本上一致的一种多肽，该组的组成为：SEQ ID NO：63、65、以及66、或其一种片段。在一些实施方案中，在一种细胞中由该多核苷酸编码的多肽的表达增加或能够增加进入所述细胞的硅转运。

在上述方面的任何一种中，该多核苷酸长度可能是小于1,000、500、100、50、30、20、15、10、8、6、5、4、3、或2kb。该多核苷酸可以被可操作地连接到一种启动子上，例如能够在一种植物细胞中表达的一种启动子。该启动子可以是时间依赖性的、细胞特异性的(例如根细胞)、或组织特异性的(例如在此所说明的任何一种组织中)。该启动子可以是组成型的或诱导型的，例如在类似任何一种非生物性或生物性胁迫的环境条件之下(例如在此所说明的那些)。本发明的特征还在于包括本发明的一种多核苷酸的一种载体。该载体可以进一步包括一种第二多核苷酸。在一个实施方案中，该第二多核苷酸编码一种硅流出转运蛋白或其一种片段(例如与选自下组的一种序列基本上一致的一种多核苷酸，该组的组成为：SEQ IDNO：28、29、71、以及73；对与选自下组的一种序列基本上一致的一种多肽进行编码的一种多核苷酸，该组的组成为：SEQ ID NO：30、31、72、以及74、或其一种片段)。在另一个实施方案中，该第二多核苷酸编码一种硅流入转运蛋白或其一种片段(例如与选自下组的一种序列基本上一致的一种多核苷酸，该组的组成为：SEQ ID NO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014；对与选自下组的一种氨基酸序列基本上一致的一种多肽进行编码的一种多核苷酸，该组的组成为：SEQ ID NO：5、6、34-38、51、54、60、61、62、63、64、65、66、以及68、或其一种片段)。本发明的特征还在于一种细胞，例如包括该载体的一种植物细胞(例如一种大豆细胞或来自在此所说明的任何一种植物的一种细胞)、一种细菌细胞、或在此所说明的任何一种细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是一种植物种子或来自一种植物(例如在此所说明的任何一种植物)的一种组织的一部分。

本发明的特征还在于由在此所说明的这些多核苷酸的任何一种进行编码的一种多肽、或其片段。该多肽可以是基本上纯的或可以在一种细胞中重组表达。

在另一方面，本发明的特征在于包括一个或多个异源多核苷酸的一种植物(例如大豆或在此所说明的任何一种植物)、植物组织、或种子，该异源多核苷酸包括与对一种硅流入转运蛋白或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一个核酸序列(例如，与选自下组的一种序列基本上一致的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014，或其一种片段)或对与SEQ ID NO：5、6、34-38、51、54、60、61、以及68、或其一种片段的一种氨基酸序列基本上一致的一种多肽进行编码的一个核酸序列。由该异源多核苷酸编码的多肽在表达时可以增加或能够增加进入该植物内至少一个组织或细胞(例如根细胞)的硅转运。该植物、植物组织、或种子可以进一步包括与对一种硅流出转运蛋白、一种硅流入转运蛋白、或其一种片段进行编码的一种多核苷酸基本上一致的一种第二异源多核苷酸。该第二异源多核苷酸可以是与以下序列基本上一致的：(a)选自下组的一个核酸序列，其组成为：SEQ ID NO：28、29、71、以及73，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：30、31、72、以及74，或(c)其一种片段。在其他的实施方案中，该第二异源多核苷酸是与以下序列基本上一致的：(a)SEQ ID NO：55、56、57、58、或59的核酸序列，(b)对SEQ ID NO：62、63、64、65、或66的氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，或(c)其一种片段。该植物可以显示对一种或多种生物性或非生物性胁迫(例如在此所说明的那些)增强的耐受性。在一个实施方案中，该植物是展示了对大豆锈病增强的耐受性的一种大豆植物、或来自这样一种植物的一种组织或种子。

在另一方面，本发明的特征在于一种植物(例如大豆或在此所说明的任何一种植物)、植物组织、或种子，它们包括一种或多种异源多核苷酸，这些异源多核苷酸包括与对一种硅流出转运蛋白或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一个核酸序列。该多核苷酸可以包括与以下序列基本上一致的一种序列：(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：28、29、71、以及73，或(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：30、31、72、以及74，或(c)其一种片段。该异源多核苷酸可以编码一种多肽，该多肽在表达时增加或能够增加离开该植物内至少一个组织或细胞(例如，根细胞)的硅转运。该植物、植物组织、或种子可以进一步包括与对一种硅流入转运蛋白、或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一种第二异源多核苷酸序列。该第二多核苷酸可以是与以下序列基本上一致的：(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：5、6、34-38、51、54、60、61、以及68，或(c)其一种片段。在其他的实施方案中，该第二异源多核苷酸是与以下序列基本上一致的：(a)选自下组的一个核酸序列，其组成为：SEQ ID NO：55、56、57、58、以及59，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ IDNO：62、63、64、65、以及66，或(c)其一种片段。该植物、植物组织、或种子可以显示对一种或多种生物性或非生物性胁迫(例如在此所说明的那些)增强的耐受性。在一个实施方案中，该植物是展示了对大豆锈病增强的耐受性的一种大豆植物、或来自这样一种植物的一种组织或种子。在又一方面，本发明的特征在于一种植物(例如大豆或在此所说明的任何一种植物)、植物组织、或种子，它们包括与对一种硅流入转运蛋白或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一种异源多核苷酸。该多核苷酸可以包括与以下序列基本上一致的(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％一致性)一个核酸序列：(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：55、56、57、58、以及59，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ IDNO：62、63、64、65、以及66，或(c)其一种片段。由该异源多核苷酸编码的多肽在表达时可以增加或能够增加进入该植物内至少一个组织或细胞(如根、茎、或叶细胞)的硅转运。该植物、植物组织、或种子可以进一步包括一种第二异源序列。该第二多核苷酸可以是硅流入转运蛋白(例如与以下序列基本上一致的一种多核苷酸：(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：5、6、34-38、51、54、60、61、以及68，或(c)其一种片段)。在某些实施方案中，用一种第三异源多核苷酸转化该植物，例如对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种多核苷酸。在其他的实施方案中，该第二异源多核苷酸编码硅流出转运蛋白。对一种硅流出转运蛋白进行编码的多核苷酸可以是与以下序列基本上一致的一种多核苷酸：(a)选自下组的一个核酸序列，其组成为：SEQ ID NO：28、29、71、以及73，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：30、31、72、以及74，或(c)其一种片段。

本发明的特征还在于用于生成如上说明的这些植物、植物组织、或种子的任何一种的方法。在一方面，该方法包括：(a)提供一种第一载体，该载体包括与一个核酸序列基本上一致的一种多核苷酸，该核酸序列对一种硅流入转运蛋白或其一种片段(例如如上说明的那些的任何一种)进行编码；(b)用该载体对一种植物细胞(例如一种大豆细胞或来自在此所说明的任何一种植物的一种细胞)进行转化；以及(c)从该细胞生长一种植物，其中该植物表达该多核苷酸，由此生成具有增加的硅吸收的一种植物。可以使用在本领域中已知的任何一种方法进行该转化(例如在此所说明的任何一种方法)。该载体可以包括一种第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括与一种硅流出转运蛋白(例如如上说明的那些的任何一种)或其一种片段基本上一致的一个核酸序列。

在另一方面，本发明的特征还在于生成具有增加的硅转运的一种植物、植物组织、或植物种子的一种方法。该方法包括：(a)提供一种第一载体，该第一载体包括与对一种硅转运蛋白或其一种片段(例如一种流入转运蛋白(例如一种SIIT1或SIIT2)或一种流出转运蛋白，例如以上所说明的那些的任何一种)进行编码的一个核酸序列基本上一致的一种多核苷酸；(b)用该载体对一种植物细胞(例如一种大豆细胞或来自在此所说明的任何一种植物的细胞)进行转化；以及(c)从该细胞生长一种植物，其中该植物表达该多核苷酸，由此生成具有增加的硅转运的一种植物。该载体可以进一步包括一种第二多核苷酸，该第二多核苷酸与对一种硅流入转运蛋白(例如以上所说明的那些的任何一个)或其一种片段进行编码的一个核酸基本上一致。

在这两种上述方法的任何一个中，该第二多核苷酸可以可替代地包含在一种第二载体中，将该第二载体转化为第一载体(例如同时地或顺序地)。在这上述的两种方法的任何一个中，该方法可以进一步包括步骤(d)从该植物生成种子或从该植物收获至少一个组织。在一个实施方案中，该第一多核苷酸是一种硅流出转运蛋白并且该第二多核苷酸是一种硅流入转运蛋白。

在针对植物、植物组织、以及种子或相关方法的方面中，该植物组织可以是、例如：根、果实、胚珠、雄性组织、种子、珠被、块茎、柄、果皮、叶、柱头、花粉、花药、花瓣、萼片、花梗、长角果、以及茎。种子组织包括胚、胚乳、以及种皮。

其中“基本上纯的多核苷酸”意思是指一个核酸(例如、一种DNA或一种RNA分子)，该核酸不含有在从中得到本发明的核酸分子的生物体的天然发生的基因组中位于该基因两侧的这些基因。因此，该术语包括，例如结合进入一种载体；进入一种自主复制质粒或者病毒；或进入一种原核生物或真核生物的基因组DNA的一种重组DNA；或作为一种独立于其他序列的单独的分子存在(例如一种cDNA或由PCR或限制性核酸内切酶消化生成的一种基因组或cDNA片段)的一种重组DNA。此外，该术语包括一种RNA分子，该RNA分子是从一种DNA分子转录的；连同一种重组DNA，该重组DNA是对额外的多肽序列进行编码的一种杂合基因的一部分。

其中“基本上纯的多肽”意思是指已经与自然伴随它的组分分离的一种多肽。典型地，当以重量计，该多肽至少是30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或甚至99％不含有这些蛋白以及与这些蛋白天然结合的天然发生的有机分子的时，该多肽基本上是纯的。一种基本上纯的多肽可以通过从一种天然来源提取，通过在正常不表达该蛋白的一种细胞中表达一种重组核酸，或通过化学合成而获得。

其中“转化的细胞”意思是指通过重组DNA技术已经将一种DNA分子(例如对一种硅流入或流出转运蛋白进行编码的一种DNA分子或在此所说明的这些核酸的任何一种)的引入其中(或引入其一种祖细胞中)的一种细胞。

其中一种多核苷酸或氨基酸序列的“片段”意思是指一种较长序列(例如在此所说明的一种序列)的任何一种的至少10、15、20、25、30、50、75、100、250、300、400、或500个连续核酸或氨基酸。

当用于氨基酸序列时，术语“基本上一致”表示多肽的一种特征，其中该肽包括与另一种序列(例如图1这些序列的任何一种或其一种片段)具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列一致性的一种序列。

当用于核酸序列时，术语“基本上一致”表示多核苷酸序列的一种特征，其中该多核苷酸包括与一个参照相比(例如在此所说明的这些序列的任何一种)具有至少50％，优选地50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％一致性的一种序列。

核苷酸序列基本上一致的另一个指标是是否两个分子在严格条件下彼此杂交。

严格条件是序列依赖性的并且在不同的情况下将是不同的。总体上，选择的严格条件是约5℃至约20℃，通常约10℃至约15℃，低于在一个定义的离子强度和pH下对于该特异的序列的热解链温度(T_m)。T_m是50％的目标序列杂交到一个匹配的探针上的温度(在定义的离子强度以及pH下)。典型地，严格条件将是那些，其中在pH7下该盐浓度是约0.02摩尔并且该温度是至少约60℃。例如在一种标准的DNA杂交步骤中，严格条件将包括在42℃下在6x SSC中的一次初始洗涤，随后在至少约55℃的温度下(典型地约60℃并且经常地约65℃)在0.2x SSC中的进行一次或多次额外的洗涤。

为了本发明的目的当所述核苷酸序列编码基本上一致的多肽和/或蛋白时，核苷酸序列也是基本上一致的。因此，当一个核酸序列编码与一种第二核酸序列基本上相同的多肽时，这两个核酸序列基本上是一致的即使由于遗传密码允许的简并性在严格条件下它们可能不会杂交(参见Darnell等人的Molecular Cell Biology，第二版Scientific American Books W.H.Freemanand Company New York，1990对于密码子简并性和遗传密码的一种解释)。蛋白质的纯度或者均一性可以通过本领域中众所周知的多种方式表示，例如一种蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后通过染色显像。为了某些目的，高分辨率可能是需要的并且可以使用HPLC或一种类似的方法用于纯化。

其中“增加(进入或离开一种细胞的)硅转运”的一种多肽意思是指一种多肽，在那种细胞中该多肽的表达导致与缺乏该多肽的一种细胞相比较，穿过该细胞膜(例如进入或离开该细胞)的硅或锗转运速率增加(例如至少5％、10％、25％、50％、100％、200％、300％、500％、1,000％、5,000％、或10,000％)，但基本上不破坏该细胞膜或以一种非特异性方式增加其他分子(例如甘油)的转运。一种“硅流入转运蛋白”或一种“硅流出转运蛋白”是对应地能够增加进入或离开一种细胞的硅转运一种多肽。

本发明的其他特征与优点从以下详细说明、附图以及权利要求中将会是清楚的。

附图简要说明

图1a-1vvv是在此所说明的序列(SEQ ID NO：1-74)的列表。

图2是预测的SIIT1与SIIT2的氨基酸序列的一个比对。一致的氨基酸被标记为黑色；相似的氨基酸被标记为灰色。

图3是预测的SIIT1的氨基酸序列的一个比对。一致的氨基酸被标记为黑色；相似的氨基酸被标记为灰色。

图4是一组图示，显示在一种无Si或具有1.7mM Si的溶液中孵育0、15、30、或60分钟后在卵母细胞中量化的硅浓度。用水注入对照卵母细胞。对于水稻和小麦SIIT1进行测试检测它们转运Si的能力。

图5是一组图示，显示在一种无Si或具有1.7mM Si的溶液中孵育0、15、30、或60分钟后在卵母细胞中量化的硅浓度。用水注入对照卵母细胞。“Lsi-”表示用突变的SIIT1cRNA注入的卵母细胞，并且“Lsi+”表示用野生型SIIT1cRNA注入的卵母细胞。

详细说明

木贼与禾本科植物比如小麦、燕麦、高粱、以及大麦已知是硅的高度积聚植物。具体地说已知木贼非常有效地积聚硅，并且硅化合物可以占木贼干重的15％。因此我们猜测这些植物，由于它们的高的硅含量，将可能有效地转运硅，例如能够使高浓度的硅在该植物中积聚，能够快速转运硅、或两者都能够。因此，这些转运蛋白可以用于在一种异源的细胞中(例如在正常时具有较低的硅吸收或转运的一种植物中)通过表达在此所说明的一种转运蛋白，增加硅吸收。因为在植物中增加的硅含量与对生物性以及非生物性胁迫二者的增强的耐受性相关联，在一种植物中这些转运蛋白的表达可以增强对胁迫的耐受性。当由豆薯层锈菌真菌所引起的大豆锈病对大豆作物引起显著损害时，这样一种方法在大豆中可能是特别有用的。因此，本发明的特征在于：具有与在此识别的这些硅转运蛋白序列一致的多核苷酸和多肽，包含这类多核苷酸的载体、细胞、以及植物(例如大豆)，以及用于制造这类植物的方法。表达硅转运蛋白的植物可以显示对真菌(例如锈菌)增强的耐受性。

植物中的硅

硅(Si)是以硅酸的形式通过根系吸收的，其中它可以以聚合硅的形式最终积聚在这些植物的嫩枝和叶中。然而，植物在它们吸收硅的能力上有很大的不同，由此引起它们从Si摄食受益的能力上的可变性。在接近500个植物物种的一项调查中，将这些植物按照它们的硅积聚情况分成三组：1)高的Si积聚植物，包括禾本科(草)；2)中等积聚植物，包括葫芦科；以及3)低积聚植物，包括大多数其他植物物种(对于一个汇总，参见Ma and Takahashi，Soil，Fertilizer，and Plant Silicon Research in Japan，Amsterdam rElsevier Science，2002)。例如，当在包含45ppm SiO₂(在pH 6.0下在溶液中)的土壤中生长时，禾本科植物例如燕麦、黑麦、以及黑麦草，包含2.04％、2.41％、以及2.34％的SiO₂。相比之下，绛三叶草、豌豆、以及芥菜，在相同的土壤中对应地包含0.12％、0.25％、以及0.15％的SiO₂(Jones et al，Advances inAgronomy，107-149，1967)。在硅积聚上的差异已经归结于根吸收Si的能力，由此植物将具有以下三种吸收方式的一种：主动的、被动的、或拒绝吸收。

硅是地球表面上最丰富的元素之一，但是其在植物生长中的本质还没有被清楚地证实(Epstein，Silicon in Agriculture.Datnoff et al.，eds.New York：Elsevier Science；2001：1-15；Epstein，Proc Natl Acad Sci USA 91：11-17，1994；Epstein，Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol50：641-664，1999)。虽然其在植物中营养作用似乎有限，有越来越多的证据表明硅吸收在保护使免受生物性以及非生物性胁迫中起一种重要的作用。许多报告已经隐含在营养缺乏或过剩的情况中硅改善植物生长。硅施肥也已经与植物对疾病的增强的耐受性相关联，这些疾病包括：发生在小麦、大麦、玫瑰、黄瓜、甜瓜、西葫芦、南瓜、葡萄、以及蒲公英上的白粉病病原体，以及其他疾病(例如发生在水稻上的稻瘟病(灰梨孢菌)和褐斑病(稻平脐蠕孢菌)，发生在黄瓜上的由终极腐霉菌和瓜果腐霉菌所引起的灰葡萄孢、蔓枯病(Didymella bryoniae)、镰孢菌枯萎病(Fusarium wilt)、以及根腐病)。

在水稻中已经识别了三种硅转运蛋白(Ma et al.，Nature 440：688-691，2006；Ma et al.，Nature 448：209-212，2007；Yamaji et al，The Plant Cell 20：1381-1389，2008)，包括两种硅流入转运蛋白(SIIT1、也称为Lsil，SEQ ID NO：3和5，以及SIIT2、也称为Lsi6；SEQ ID NO：55和62)和一种Si流出转运蛋白(SIET1、也称为Lsi2；SEQ ID NO：28和30)。预测该流入转运蛋白SIIT1和SIIT2是类似于水通道蛋白aquaporins的膜蛋白。这些蛋白属于NIP亚家族(Nod26-样主要内在蛋白)。该通道由六个跨膜区段(TM)、两个亲水性的环(在TM3与TM4之间的HL3；在TM4与TM5之间的HL4)、以及两个Asn-Pro-Ala(NPA)基序，在aquaporins中保守的一种安排组成。一种孔结构和可能决定选择性的水渗透性的收缩是用HL3与在细胞外侧的该第二NPA结构域(NPA2)以及用HL4与在该细胞质膜中该第一NPA结构域(NPA1)装配的。该NPA盒子对于aquaporins的三维结构的正确装配可能是重要的，因为在NPA盒子附近具有突变的这类蛋白可能被不适当地折叠。该SIIT1转运蛋白的表达似乎是位于具有通过硅水平调节的一种组成型表达的根中。该转运蛋白SIIT2似乎是在该根尖中以及在叶鞘和叶片的木质部薄壁组织细胞中表达的。

预测编码具有11个跨膜结构域的一种膜阴离子转运蛋白的水稻的硅流出基因与该硅流入转运蛋白SIIT1没有相似性。SIET1是一种有活性的流出转运蛋白。在根中SIET1的表达似乎遵循SIIT1的一样的模式，但是位于外胚层和内胚层细胞的近端侧，然而SIIT1是位于根细胞的远端侧。SIIT2也显示在木质部薄壁组织细胞中在面对该木质部维管侧的极性的定位。SIIT2被认为涉及Si从该木质部转运出Si并且转运进入这些叶子中。

多核苷酸

我们已经从小麦、燕麦、大麦、高粱、以及木贼中识别并且克隆了硅转运蛋白。因此，本发明的特征在于具有与在此所说明的这些多核苷酸的任何一种基本上一致的多核苷酸、或这类多核苷酸的片段。在某些实施方案中，这些多核苷酸可以编码有功能的硅转运蛋白多肽(例如当在一种细胞中表达时能够增加硅流入或流出的多肽)。本发明的示例性的多核苷酸的识别在以下更详细地进行说明。

本发明的特征还在于在此所说明的这些多核苷酸的片段。这类片段也可以编码有功能的硅转运蛋白多肽。较短的片段可以被用作为引物、或可以编码抗原性的多肽序列。片段可以包括该转运蛋白的跨膜区段、或亲水性的环。

在植物中硅流入转运蛋白的识别

通过BLAST搜索，我们已经在小麦、燕麦、大麦、以及木贼中识别了硅转运蛋白序列。使用小麦EST数据库，我们在小麦中识别了一种转运蛋白序列并且称这种序列为SIIT1小麦Si-转运基因(SEQ ID NO：2)。将该小麦cDNA、编码序列(SEQ ID NO：4)、以及该296个氨基酸的小麦多肽序列(SEQ ID NO：6)与对应的水稻序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5)进行比较揭示对应地70％、84.2％、以及82％的一致性。

然后我们克隆了来自从水栽培养回收的小麦植物栽培品种HY644的一种SIIT1基因。将根冷冻在液氮中，使用一种研钵压碎并且使用来自QIAGen的一种RNA纯化试剂盒提取总RNA并且储存在-80℃。使用逆转录酶(Superscript III，Invitrogen)用oligodT引物制备总cDNA。

引物IF  (TCCCTCCTCACCTCCTCAAGAAG  (SEQ  ID  NO：7))以及2R(AGCTTGAAGGAGGAGAGCTTCTG(SEQ ID NO：8))用于在小麦cDNA制品中通过PCR证实该转运基因的存在。在94℃下进行PCR持续120秒；随后94℃的30个循环持续30秒；62℃持续30秒；以及72℃90秒；随后72℃10分钟。100ng的小麦cDNA与0.2μM的每种引物一起使用。这种PCR反应扩增一种700bp片段，然后将它测序(SEQ ID NO：9)并且与该数据库EST序列进行比较。使用ClustalW程序SEQ ID NO：9的序列分析表明在659bp重叠的序列上有98.9％的一致性。这些差异很可能通过用于获得在该数据库中SEQ ID NO：4的栽培品种与在我们的实验中使用的该栽培品种的种类来解释。

然后我们设计了两个额外的反向引物3R(CGAAGATGGACGTAATGCAAACC(SEQ IDNO：10))以及IR(CGCCCAGTAGAACGGAACCT(SEQ ID NO：11))以便识别在其他植物物种中的硅转运蛋白同系物。从包括Torka小麦栽培品种、ACCA大麦栽培品种、Rigodon燕麦栽培品种、以及木贼的植物中获得总cDNA。将植物生长在一个培养箱中在一个充满Promix PGX生长培养基(Premier Horticulture，Riviere-du-Loup，

，加拿大)6cm的塑料盆中。生长之后，将根回收、在蒸馏水中洗涤从而去除所有痕量的Promix底物，在液氮中冷冻、并且使用一种研钵压碎。使用来自QIAGen的一种RNA纯化试剂盒提取总RNA。使用来自Invitrogen的SuperscriptIII逆转录酶使用一种oligodT引物获得总cDNA。将所获得的cDNA保存在-20℃下。使用表1所示的这些引物对在Torka小麦栽培品种、ACCA大麦栽培品种、Rigodon燕麦栽培品种、以及木贼中检出一种硅-转运基因的存在。

表1：使用的引物

有机体	正向引物	反向引物	所获得的序列
				小麦栽培品种Torka	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：12

大麦栽培品种ACCA	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：13
				燕麦栽培品种Rigodon	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：10	SEQ ID NO：14
木贼属	SEQ ID NO：16	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：45

使用100ng的每一种cDNA制品用0.2μM的每一种引物进行PCR。在94℃下进行PCR反应持续120秒；随后94℃的30个循环持续30秒；62℃持续30秒；以及72℃持续60秒；随后72℃10分钟。然后将每一种扩增片段进行测序。将这些序列与这些水稻和小麦编码序列(SEQ ID NO：3和4)进行比较。每一种片段与该编码序列的这些对应的区域以及一致性百分率示于表2中。

表2：片段与水稻和小麦转运蛋白的比较。

由以上大麦和燕麦多核苷酸序列编码的该氨基酸序列对应地提供于SEQ ID NO：34和35中。部分大麦氨基酸序列(SEQ ID NO：34)与水稻和小麦氨基酸SIIT1序列(SEQ ID NO：5和6)的氨基酸57-260相对应。部分燕麦氨基酸序列(SEQ ID NO：35)与水稻和小麦氨基酸SIIT1氨基酸序列的氨基酸47-206相对应。

为了在小麦和木贼中获得SIIT1S1-转运基因的5′cDNA末端，采用一种RACE(cDNA末端的迅速扩增)的步骤。设计两个正向引物用于小麦和木贼属二者3RACE(ADApT：

GGAATCAGTCAGTAATTGGAGGTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：16)以及ADA：GGAATCAGTCAGTAATTGGAGG(SEQ ID NO：17))。设计植物特异性引物用于反向引物。对于小麦，使用BIeR(TCCTCGAAGCGGATGTAG(SEQ ID NO：18))和BleRNested(CCTGCGAAGATGGAGGTAA(SEQ ID NO：19))。对于木贼，使用PreleRNested(CGAGGGTGACGAACATCAT(SEQ ID NO：20))。

在小麦中进行一次3RACE。用从oligodT反转录(用0.2μM的ADApT和BIeR引物)获得的100ng的总小麦cDNA进行PCR。使用来自QIAgen的一种PCR纯化试剂盒将这种扩增的产物进行纯化然后稀释100倍。用0.2uM的ADA和BleRNested引物进行一种第二PCR。使每一个PCR如下进行：94℃持续120秒；随后94℃的40个循环持续60秒、52℃持续30秒、以及72℃持续60秒；随后72℃持续10分钟。然后将该扩增片段插入pGEM-T载体(Promega)中，并且用于转化一种大肠杆菌DH 5α菌株。用0.2μM的每一种M13正向(M13F)和反向(M13R)引物在以下条件下使用PCR筛选该适当的插入物的存在：94℃持续120秒；随后94℃的25个循环持续30秒、55℃持续30秒、以及72℃90秒；随后72℃持续5分钟。使用来自QIAgen的一种质粒提取试剂盒对阳性克隆进行一种质粒提取。用M13F和M13R引物将该插入物测序；该生成的序列示于SEQ ID NO：21中。与以前识别的小麦编码序列(SEQID NO：4)对应的一种ORF的5′区域被发现于SEQ ID NO：21从核苷酸124起始到末端(核苷酸919)。由这一序列编码的该第一246个氨基酸与在SEQID NO：6中识别的小麦的数据库序列一致。

使用以下数据库使用该小麦转运蛋白序列进行一次额外的BLAST搜索：GenBank(National Institutes of Health，Bethesda，Md.)、GrainGenes(U.S.Dept.of Agriculture，Washington，D.C.)、TIGR小麦基因组数据库(The Institute for Genomic Research，现在是theJ.Craig Venter Institute的一部分，Rockville，Md.)以及BarleyBase(Iowa State University，Ames，Iowa)。基于这种序列，在小麦中识别了另一个SIIT1全序列cDNA(SEQ ID NO：32)。存在从核苷酸124至1014的一种开放阅读框(ORF)。这个ORF具有与SEQ ID NO：4中识别的小麦序列98.7％一致性。由这个ORF编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：37中。

通过在GrainGenes数据库中施行对SEQ ID NO：13的一次BLAST搜索我们还在该数据库(SEQ ID NO：33)中识别了一种部分cDNA大麦SIIT1转运蛋白基因。这此搜索识别了该大麦SIIT1序列的部分cDNA。该大麦cDNA片段(SEQ ID NO：13)与该部分cDNA大麦SIIT1序列(SEQ ID NO：33)具有83％一致性。这种序列与水稻序列(SEQ ID NO：3)具有82％一致性，并且与该小麦序列(SEQ ID NO：4)具有97％一致性。由这个ORF编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：38中。

一种类似方法被用于克隆木贼的序列。遵循如上说明的相同的实验方案，从木贼获得总cDNA。使用100ng的总木贼cDNA，使用0.2μM的ADAPT和PreleRNested。将这种扩增产物稀释100倍并且用0.2μM的ADA和PreleRNested进行一种第二PCR。用来自QIAgen的PCR纯化试剂盒将该扩增片段(700bp)进行纯化，然后插入pGEM-T载体(Promega)中。这种载体用于转化一种大肠杆菌DH5α菌株。通过用0.2μM的每一种M13正向(M13F)和反向(M13R)引物在以下条件下使用PCR筛选该适当的插入物的存在：94℃持续120秒；随后94℃的25个循环持续30秒、55℃持续30秒、以及72℃90秒；随后72℃持续5分钟。使用来自QIAgen的质粒提取试剂盒对阳性克隆进行一种质粒提取。用M13F和M13R引物将质粒测序；该生成的序列示于SEQ ID NO：22中。然后将这种序列与该小麦SIIT1基因进行比较。使用ClustalW程序对728个重叠的核苷酸残基的序列分析揭示在小麦SIIT Si转运基因(SEQ ID NO：2)与木贼SILT-硅转运基因的片段(SEQ ID NO：22)之间有97.3％的同源性。我们还识别了与水稻和小麦编码序列(SEQ ID NO：3和4)的核苷酸1-549相对应的木贼序列的核苷酸146-694。该部分的木贼SIIT1氨基酸与小麦SIIT1序列的对应的氨基酸具有97％的一致性并且与水稻SIIT1序列的对应的氨基酸具有79％的一致性。表3和4对应地显示在已识别的不同的SIIT1序列之间核酸和氨基酸的一致性。

表3：在不同的植物物种之间SIIT1硅转运蛋白核酸序列的一致性百分比。

表4：在不同的植物物种之间SIIT1硅转运蛋白氨基酸序列的一致性百分比。

包括SIIT2序列的额外的硅流入转运蛋白的识别

我们也已经通过BLAST分析在小麦(SEQ ID NO：58)、高粱(SEQ ID NO：56)、以及大麦(SEQ ID NO：59)中识别了SIIT2基因。在马萨诸塞州波士顿的The Dana-Farber癌症研究所的the Gene Index数据库中识别了小麦和大麦SIIT2序列(在线可获得，在http://biocomp.dfci.harvard.edu/tgi/tgipage.html)。在the PlantGDB数据库中识别了高粱序列(在线可获得，在http://www.plantgdb.org/)。以上识别的大麦cDNA序列(SEQ ID NO：13)与在该数据库中发现的大麦SIIT2序列的一部分(SEQ ID NO：59)相一致。将这些序列与水稻(SEQID NO：55)以及玉蜀黍(SEQ ID NO：57)序列进行比较，如表5所示。该翻译的氨基酸序列示于表6中。

表5：在不同植物物种的SIIT2硅转运蛋白之间核酸序列的一致性百分比。

表6：在不同植物物种的SIIT2硅转运蛋白之间氨基酸序列的一致性百分比。

SIIT1与SIIT2序列的比较

我们已经在相同的物种内比较了以上识别的SIIT1和SIIT2核酸序列。这种比较示于表7中。

表7：在相同植物物种的SIIT1与SIIT2硅流入转运蛋白的核酸序列之间的一致性百分比。

在SIIT1与SIIT2序列的氨基酸序列之间进行一种类似的比较，如表8中所示。

表8：在相同植物物种的SIIT1与SIIT2硅流入转运蛋白的氨基酸序列之间的一致性百分比。

最后，我们已经在SIIT1与SIIT2序列之间生成一种序列对比，如图2所示。

在植物中硅流出转运蛋白(SIET1)的识别

通过BLAST搜索并且使用ClustalW程序分析我们也已经在小麦中识别了一种SIET1基因(SEQ ID NO：24)。然后我们设计新的引物(Lsi2F56(SEQ ID NO：25)以及Lsi2R100(SEQID NO：26))以便在我们的栽培变种中检验一种推测的SIET1小麦Si-转运基因的存在。因此如以前说明的用0.2μM的每一种Lsi2F56和Lsi2R100引物使用100ng的所获得的总小麦cDNA进行PCR。如下进行该PCR：94℃持续120秒；随后94℃的35个循环持续30秒、56℃持续30秒、以及72℃持续90秒；随后72℃持续5分钟。将扩增片段(850bp)进行纯化(来自QIAgen的PCR纯化试剂盒)，插入一种pGEM-T-T载体(Promega)中，将它用于转化一种大肠杆菌DH5α菌株。如上说明的通过PCR使用这些M13F和M13R引物确定了该适当的插入物的存在。在阳性克隆上进行一种质粒提取(来自QIAgen的质粒提取试剂盒)。然后使用该M13F和M13R引物将这些质粒测序；生成的序列示于SEQ ID NO：27中。

所克隆的小麦(SEQ ID NO：27)SIET1序列在重叠区的850bp之内与水稻序列(SEQ IDNO：23)具有83.5％的一致性。水稻SIET1(SEQ ID NO：23)与小麦SIET1数据库序列(SEQ IDNO：24)的比较表明在相同区域上具有76.5％的一致性。最后，小麦SIET1基因(SEQ ID NO：24)与在我们的研究中所获得的测序片段(SEQ ID NO：27)具有98.5％的一致性。这些差异可能是由于不同小麦栽培品种之间的天然的遗传变异。

水稻和小麦SIET1基因的推导出的开放读框(对应地SEQ ID NO：28和29、它们对应于SEQ ID NO：23的核苷酸152-1570和SEQ ID NO：24的核苷酸220-981)被示出，像编码的氨基酸序列(对应地为SEQ ID NO：30和31)一样。SEQ ID NO：28和29是57％一致的并且SEQID NO：30和31是38.9％一致的。在与其他的SIET1序列进行比较之后设计新的引物(SEQ IDNO：69；SEQ ID NO：70)以便扩增该完全的小麦SIET1ORF。这些生成的序列示于SEQ IDNO：71和SEQ ID NO：72中。在来自水稻、高粱(PlantGDB数据库)、以及小麦的SIET1序列之间的一种比较表示在表9(核酸序列)和10(氨基酸序列)中。SIET1氨基酸序列的一种比对示于图3中。

表9：在不同的植物物种的SIET1硅转运蛋白之间核酸序列的一致性百分比

表10：在不同的植物物种的SIET1硅转运蛋白之间氨基酸序列的一致性百分比

硅转运蛋白-卵母细胞测定方法的表征

为了评估和比较由在此所说明的这些多核苷酸编码的该硅-转运蛋白的效率，可以使用来自非洲爪蟾的转化的卵母细胞。可以使用本领域中已知的任何一种方法生成Si-转运蛋白cRNA，并且可以将其注入这些卵母细胞中，导致有功能的Si-转运蛋白的产生。使用这种系统，可以对于不同的转运蛋白的硅吸收或流出速率进行评价。这样的一种系统允许对一种或多种Si-转运蛋白进行表征并且选择具有令人希望的性状的转运蛋白，包括硅吸收的更快的速率或一种更高的总的硅吸收。可替代地，可以对于硅流出转运蛋白进行评价检测它们从卵母细胞去除硅的能力。

通过这些相应基因的瞬时过量表达，卵母细胞已经广泛地用于研究蛋白。具体地说，卵母细胞是非常适合用于受体、通道、以及离子泵的研究，因为这些蛋白在卵母细胞中经常显示正常的电生理学的特征。因此研究这类蛋白的装配、膜插入、以及功能是可能的。此外，因为卵母细胞是哺乳动物细胞，那些要求翻译后修饰的复合体蛋白可以生成并且保持它们的功能性。

如上指出，可以将cRNA注入这类卵母细胞以便生成所编码的蛋白的瞬时生产。可以将一种感兴趣的基因克隆进入能够产生包含该基因的cRNA的一种表达载体中。通过感兴趣的基因的DNA序列的体外转录可以获得一种有功能的cRNA的生产从而生成一种前体-cRNA。然后用7-甲基鸟苷使该前体-cRNA帽化，它摹拟在体内发现的大多数真核生物的mRNA。RNA的帽化提高了其稳定性并且因此提高了翻译的产率。然后可以将纯化的、帽化的cRNA微注射入制备的卵母细胞中。这样一个处理过程由Hildebrand等人说明(Nature 385：688-689，1997)以研究在硅藻中发现的一种硅转运蛋白。在卵母细胞转化之后，该硅流入或流出的速率可以使用本领域中已知的任何一种方法进行测量(例如在此所说明的那些)。示例性的方法还在Ma等人(Nature 440：688-691，2006)中说明。Ma等人使用锗68(⁶⁸Ge)作为一种对于硅的示踪物以测定进入非洲爪蟾卵母细胞的吸收。因为锗是有毒的，在测定中(其中细胞的活力是要求的)它以相对低浓度使用。通过在该卵母细胞中在一种推测的硅转运蛋白存在或不存在下测量低锗浓度的放射性，确定是否一种特殊蛋白的表达导致硅转运的增加是可能的。为确定是否在该蛋白表达时硅被特异性地转运，可以使用一种分子(例如甘油)的转运作为一种阴性对照。

一种类似测定可以用于测量从卵母细胞的硅流出。在这种方法中，将卵母细胞预先装入⁶⁸Ge，然后用对一种推测的硅流出转运蛋白进行编码的一种测试RNA注入。该RNA表达之后，测量细胞外的⁶⁸Ge。因此，在RNA注入时⁶⁸Ge的转运的一种增加指示硅流出的活性。

突变体硅转运蛋白的构建

为了评估由在此所说明的这些多核苷酸编码的Si-转运蛋白的特征，通过该核酸序列的修饰生成水稻和小麦SIIT1突变体。Ma等人(Plant Physiol.130：2111-2117，2002)鉴定了一种缺陷型水稻硅转运蛋白，其特征在于在该ORF核酸序列(SEQ ID NO：39)中在位置394处的一个单点突变，其中一个鸟嘌呤被替代为一个腺苷。这种突变通过在位置132处(SEQ IDNO：40)用一个苏氨酸替代丙氨酸改变了对应蛋白的氨基酸序列，它似乎是一个关键的残基，因为这种取代显著改变该蛋白的构象并且导致硅吸收的损失。

我们使用适当的一套引物在在水稻和小麦两者中复制了这种突变。对于水稻，在一个第一步中，我们对于5′端使用引物RizLsilF(GGAATTCATGGCCAGCAACAACTCGAGAACAAACTCC(SEQ ID NO：41))和RizLsilmutR(CGCTCCGGTGAACTGCGtCGCC(SEQ ID NO：44))，并且对于3′端使用引物RizLsilmutF(CAACCGTTCTACTGGGCGaCGC(SEQ  ID  NO：43))和RizLsil R(GTCTAGACCTATCACACTTGGATGTTCTCCATCTCGTCG(SEQ ID NO：42))，分别扩增该核酸序列(SEQ ID NO：3)的5′和3′端。称为“mut”的引物用于通过PCR生成该点突变。在94℃下进行一种第一PCR轮持续120秒；随后94℃的35个循环持续30秒；62℃持续30秒；以及72℃90秒；随后72℃10分钟。将100ng的水稻cDNA与0.2μM的每一种引物一起使用。对于SIIT1编码序列的5′的半条这种PCR反应扩增一种400bp片段并且对于其3′半条扩增一种500bp片段。通过一种来自QIAgen的PCR纯化试剂盒将两个半条都进行纯化，量化，并且用于一种第二轮的PCR。使用引物RizLsilF(SEQ ID NO：41)和RizLsilR(SEQ IDNO：42)来获得全长突变的编码序列。在94℃下进行该PCR持续120秒；随后94℃的35个循环持续30秒；62℃持续30秒；以及72℃90秒；随后72℃10分钟。将50ng的每一种半条水稻cDNA扩增子的一种混合物与0.2μM的每一种引物一起使用。两个半条编码序列二者的连接通过一种1.5％琼脂糖凝胶电泳检测一种大约900bp片段的存在得以证实，遵循制造商的说明书将该片段纯化并且插入pGEM-T载体(Promega)中。将这种质粒测序以证实该突变的存在(SEQ ID NO：39)。该翻译给出突变蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)。

因为在水稻和小麦二者中在该点突变周围核酸序列是非常相似的，我们决定对小麦SIIT1复制相同的蛋白以证实是否我们能在小麦中复制这些结果。采用一种与用于获得水稻突变体的类似的步骤，但是改为使用对小麦序列(SEQ ID NO：32)特异性的引物。对于第一轮PCR，所使用的这些引物是EcoRI LsilBle F(GGAATTCATGGCCACCAACTCGAGGTCGAACTCCAGG(SEQ ID NO：45))、LsilBle XbalR(GTCTAGACCTATCAGACGGGGATGTGGTCGAGCTCGTCG(SEQ ID NO：46))、BleLsi 1mutF(GTCCCGTTCTACTGGGCGaCGC(SEQ ID NO：47))、以及BleLsil mutR(CGCGCCCGTGAACTGCGtCGCC(SEQ ID NO：48))。对于第二轮PCR，所使用的这些引物是EcoRI LsilBle F(SEQ ID NO：45)以及LsilBle Xbal R(SEQ ID NO：46)。遵循制造商的说明将纯化的连接片段插入pGEM-T载体(Promega)中。将这种质粒测序以证实该突变的存在(SEQ ID NO：50)。该翻译给出突变蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)。

将这些构建体转化进入大肠杆菌DH5α菌株中并且在-80℃下冷冻保存。

在一种表达载体中硅转运蛋白的克隆

将一种表达载体、Poll(SEQ ID NO：49)用于SIIT1编码序列的体外转录。使用由用于PCR扩增的这些引物添加的限制性位点将这些序列插入该Poll载体中：使用本领域中已知的一种切除/连接步骤将含有该SIIT1的编码序列的一种EcoRI/Xbal片段从pGEMt插入至Poll载体。将这些新载体转化进入大肠杆菌DH 5α菌株中并且在-80℃下冷冻保存。

用于卵母细胞显微注射的cRNA的生产

使用来自QIAgen的一种小量制备质粒提取试剂盒从一种新鲜的细菌培养物回收质粒。用允许将该质粒线性化的Nhel限制性内切酶(Roche)消化这些质粒。使用一种PCR纯化试剂盒(QIAgen)将消化物纯化并且使用mMessage mMachine T7超极试剂盒(Ambion)将1μgfd DNA用于该体外转录。将cRNA回收、溶解在DEPC-处理的水中并且冷冻保藏在-80℃下直到使用为止。

启动子

在此所说明的任何一种多核苷酸可以可操作地连接到一种适当的启动子上以提供基因表达(例如、在一种细胞中或在一种体外系统中例如一种细胞提取物)。启动子可以按一种时间依赖性、细胞特异性(例如根细胞)、或组织特异性的方式调节表达。在本发明的这些表达盒中有用的启动子包括能够在一种植物细胞中起始转录的任何一种启动子。这类启动子包括可以从植物、植物病毒、以及细菌获得的那些，这些细菌包含在那些植物中表达的基因，例如土壤杆菌属和根瘤菌属。在一个实施方案中，该启动子在根细胞中是具有组成型活性的(例如AtI 7.1启动子)。在另一个实施方案中，该启动子是通过一种生物性或非生物性胁迫诱导的。

该启动子可以是组成型的、诱导型的、发育阶段优选的、细胞类型优选的、组织优选的、或器官优选的。在大多数情况下组成型启动子是有活性的。组成型启动子的实例包括：CaMV19S和35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812，1985)、sX CaMV 35S启动子(Kay等人，Science 236：1299-1302，1987)、Sepl启动子、水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，PlantCell 2：163-171，1990)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等人，Plant MoI.Biol.18：675-689，1989)、pEmu(Last等人，Theor. Appl.Genet.81：581-588，1991)、玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，EMBO J 3：2723-2730，1984)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)、来自土壤杆菌的T-DNA启动子、例如甘露碱合成酶、胭脂氨酸合酶、以及章鱼肉碱合酶、以及二磷酸核酮糖羧化酶的小亚基(ssuRUBISCO)启动子。

在另一些实施方式中，使用一种诱导型启动子。这类启动子在某些环境条件下是优选地有活性的，例如存在或缺少一种营养物或代谢物、热或冷、光、病原体袭击、厌氧条件、或在任何一种非生物性或生物性胁迫下(例如，在此所说明的那些)。例如，来自芸薹属的hsp80启动子是通过热休克诱导的；PPDK启动子是通过光诱导的；来自烟草、拟南芥、以及玉米的PR-1启动子可通过用一种病原体感染诱导；并且Adhl启动子是通过缺氧和寒冷胁迫诱导的。植物基因表达还可以通过一种诱导型启动子而协助(对于回顾，参见Gatz，Annu Rev.PlantPhysiol.PlantMoI.Biol.48：89-108，1997)。如果希望基因表达按一种时间特异性的方式发生，化学诱导型启动子是特别适当的。这类启动子的实例是一种水杨酸诱导型启动子(PCT公开号WO 95/19443)、一种四环素诱导型启动子(Gatz等人，Plant J.2：397-404，1992)、以及一种乙醇诱导型启动子(PCT公开号WO 93/21334)。一种诱导型启动子是一种胁迫-诱导型启动子。这类启动子可以基于亚最适度以下的条件(与盐度、干旱、温度、金属、化学、病原性的、以及氧化胁迫相关联)而被激活。胁迫诱导型启动子包括、但是不局限于：Cor78(Chaket al.，Planta 210：875-883，2000；Hovath et al.，Plant Physiol.103：1047-1053，1993)、Corl5a(Artuset al.，Proc Natl Acad Sci USA 93：13404-09，1996)、Rci2A(Medin et al.，Plant Physiol.125：1655-66，2001；Nylander et al.，Plant MoI.Biol.45：341-52，2001；Navarre et al.，EMBO J.19：2515-24，2000；Capel et al.，Plant Physiol.115：569-76，1997)、Rd22(Xiong et al.，Plant Cell13：2063-83，2001；Abe et al.，Plant Cell 9：1859-68，1997；Iwasaki et al，MoI.Gen.Genet.247：391-8，1995)、cDet6(Lang et al.，Plant MoI.Biol.20：951-62，1992)、ADH1(Hoeren et al.，Genetics 149：479-90，1998)、KAT1(Nakamura et al.Plant Physiol.109：371-4，1995)、KST1(Muller-Rober et al，EMBO 14：2409-16，1995)、Rhal(Terryn et al，Plant Cell 5：1761-9，1993；Terryn et al，FEBS Lett.299：287-90，1992)、ARSK 1(Atkinson et al，1997，GenBank Accession#L22302，以及PCT公开号WO 97/20057)、PtxA(Plesch et al，GenBank Accession#X67427)、SbHRGP3(Ahn et al.Plant Cell 8：1477-90，1996)、GH3(Liu et al.Plant Cell 6：645-57，1994)、病原体可诱导的PRP1-基因启动子(Ward et al.Plant.Mol.Biol.22：361-366，1993)、来自番茄的热可诱导的hsp80-启动子(美国专利号5,187,267)、来自马铃薯的冷可诱导的α-淀粉酶启动子(PCT公开号WO 96/12814)、或创伤可诱导的pinII-启动子(欧洲专利号375091)。其他的干旱、冷、以及盐诱导型启动子的实例(例如RD29A启动子)由Yamaguchi-Shinozalei等人说明(MoI.Gen.Genet.236：331-340，1993)。

发育阶段优选的启动子优选地在发育的某些阶段表达。组织和器官优选的启动子包括优选地在某些组织或器官、例如根、木质部、叶、或种子中表达的那些启动子。一种器官优选的以及胁迫上调的启动子的一种实例是AtI 7.1启动子，它在大豆植物的根和维管系统中驱动基因表达(Mazarei等人，MoI Plant Pathol 5：409-423，2004)。组织优选的以及器官优选的启动子的其他的实例包括：根优选的、果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、柄优选的、果皮优选的、以及叶优选的、柱头优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、花梗优选的、长角果优选的、以及茎优选的启动子。种子优选的启动子在种子发育和/或萌芽期间是优选表达的。例如，种子优选的启动子可以是胚优选的、胚乳优选的、以及种皮优选的(参见Thompson等人，BioEssays 10：108，1989)。种子优选的启动子的实例包括：纤维素合酶(celA)、Ciml、γ-玉米素、球蛋白-1、以及玉米19kD玉米素(cZ19B1)。

其他的适当的组织优选的或器官优选的启动子包括：来自油菜napin-基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆的USP-启动子(Baeumlein et al.，MoI.Gen.Genet.225：459-67，1991)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(PCT申请号WO 98/45461)、来自菜豆的菜豆球蛋白启动子(美国专利号5,504,200)、来自芸苔的Bce4启动子(PCT申请号WO 91/13980)、或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein et al.，Plant Journal，2：233-9，1992)、连同在单子叶植物(包括：玉米、大麦、小麦、黑麦、以及水稻)中提供种子特异性表达的启动子。适当的启动子是来自大麦的Ipt2或Ipt1-基因启动子(PCT公开号WO 95/15389和WO95/23230)或在PCT公开号WO 99/16890中所说明的那些启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、水稻的谷蛋白基因、水稻的水稻素(oryzin)基因、水稻的醇溶谷蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin-基因、以及黑麦的黑麦碱基因的启动子)。在本发明中有用的其他的启动子包括：主要的叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-伴大豆球蛋白(conglycin)启动子、napin启动子、大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米素启动子、22kD玉米素启动子、27kD玉米素启动子、γ-玉米素启动子、waxy、shrunken1、shrunken2、以及bronze启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)、以及SGB6启动子(美国专利号5,470,359)、连同合成的或其他的天然的启动子。

载体

对一种硅转运蛋白进行编码的一种多核苷酸(例如在此所说明的那些的任何一种，例如可操作地连接到一种启动子上的一种多核苷酸)可以是一种表达载体的一部分。可以使用本领域中已知的任何适当的载体。该载体可以是一种自主复制载体，即作为一种染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如一种质粒。可替代地，该载体可以是一种载体，当将它引入一种宿主细胞时该载体整合到该宿主细胞基因组中并且与它已经整合入其中的染色体同时复制。

植物表达载体可以包括：(1)在5′以及可任选地3明节序列(例如一种启动子，例如在此所说明的一种启动子)的转录控制之下的一种克隆的植物基因(例如如一种硅转运蛋白基因)。该载体还可以包括一种显性的可选择的标志物。如果希望，这类植物表达载体还可以包含：一种启动子调节区(例如、提供诱导型或组成型、病原体诱导的或创伤诱导的、环境调节的或发育调节的、或细胞特异性的或组织特异性的表达的一种启动子调节区)、一种转录起始起始位点、一种核糖体结合位点、一种RNA加工信号、一种转录终止位点、和/或一种多腺苷酸化信号。

植物表达载体还可以可任选地包括RNA加工信号，例如：内含子，它已经显示对于有效的RNA合成和积聚是重要的。该RNA剪接序列的位置可以显著地影响植物中转基因表达的水平。因此在该转基因中可以将一种内含子安置在一种硅转运蛋白编码序列的上游或下游以改变基因表达的水平。

除了上述的5明节控制序列之外，这些表达载体还可以包括调节控制区域，这些调节控制区域通常存在于植物基因的3′区域。例如，可以将3′终止子区域包括在该表达载体中以增加mRNA的稳定性。一种这类终止子区域可以从马铃薯的PI-II终止子区域得到。此外，其他通常使用的终止子得自章鱼碱或胭脂碱合酶信号。

该植物表达载体典型地还包含一种显性的可选择标志物基因，该基因用于识别已经被转化的那些细胞。对于植物体系有用的可选择的基因包括：转座子Tn5(Aph II)的氨基糖苷磷酸转移酶基因、对抗生素耐受性基因进行编码的基因，例如：对潮霉素、卡那霉素、博来霉素、新霉素、G418、链霉素、或大观霉素的耐受性进行编码的那些基因。对于光合作用所要求的基因还可以在光合不足的菌株中用作选择性标志物。最后，对除草剂耐受性进行编码的基因可以用作选择性标志物；有用的除草剂耐受性基因包括：对草丁膦转乙酰酶进行编码的、并且提供对广谱除草剂

(Bayer Cropscience Deutschland GmbH，Langenfeld，德国)耐受性的bar基因。其他的可选择的标志物包括：提供对其他的这类除草剂(例如草甘磷以及类似物、以及咪唑啉酮、磺酰脲、三唑并嘧啶除草剂，(例如氯磺隆(chlorosulfron)、溴苯腈、茅草枯)、以及类似物耐受性的那些基因。此外，对二氢叶酸还原酶进行编码的基因可以与多种分子比如氨甲蝶呤组合使用。

通过测定一种植物细胞对一种特别的可选择的试剂的敏感性的以及测定有效地杀死大多数(若不是全部)这些转化的细胞的这种试剂的浓度，有助于可选择标志物的有效使用。用于烟草转化的抗生素的一些有用的浓度包括：例如、20-100μg/ml(卡那霉素)、20-50μg/ml(潮霉素)、或5-10μg/ml(博来霉素)。例如由Vasil(Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants，VoI I，II，III Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press，New York，1984)说明了用于选择用于除草剂耐受的转化体的一种有用策略。

除一种可选择的标志物之外，使用一种报告基因可能是令人希望的。在一些情况中，可以使用一种报告基因不使用一种可选择的标志物。报告基因是这样的基因，它们典型地是不存在或表达于受体生物或组织中。报告基因典型地编码一种蛋白，该蛋白提供一些表型的变化或酶的性质。这类基因的实例提供于Weising等人(Ann.Rev.Genetics 22：421-478，1988)中，通过引用将它结合在此。优选的报告基因包括但不限于：葡萄糖醛酸酶(GUS)基因和GFP基因。

植物的转化

用于遗传转化的任何一种方法可以用于将对一种硅转运蛋白进行编码的一种多核苷酸插入进入一种植物中。在一些情况下，用一种硅流入转运蛋白、一种硅流出转运蛋白、或用二者(例如在此所说明的转运蛋白任何一种)转化一种植物可能是令人希望的。用于许多植物(包括大豆)的转化的方法对于那些本领域的普通技术人员是众所周知的。例如，可以用于大豆的遗传转化的技术包括：电穿孔法、微弹轰击、土壤杆菌介导的转化、以及通过原生质体直接吸收DNA。

为通过电穿孔法有效地转化，人们可以或者使用脆弱的组织，例如细胞、或胚胎发生的愈伤组织的一种悬浮培养物，或者可替代地人们可以直接地转化未成熟的胚或其他的有机体的组织。在这种技术中，人们可以通过使选中的细胞暴露于果胶降解酶类(果胶酶)或以一种控制的方式机械损伤组织从而部分地降解这些选中的细胞的细胞壁。

还可以采用原生质体用于植物的电穿孔法转化(Bates，MoI.Biotechnol.，2：135-145，1994；Lazzeri，Methods MoI.Biol.，49：95-106，1995)。例如，通过得自子叶原生质体的电穿孔法生成转基因大豆植物在PCT公开号WO 92/17598中进行说明，通过引用结合在此。用于向植物细胞递送转化DNA的区段的一种特别有效的方法是微弹轰击。这里，将颗粒用核酸包被并且通过一种推进力递送进入细胞。示例性的颗粒包括那些，其组成为：钨、铂、并且优选地是金。对于该轰击，将悬浮液中的细胞集中在滤纸或固体培养基上。可替代地，可以将未成熟的胚芽或其他的靶细胞安排在固体培养基上。将有待轰击的这些细胞安置在低于微弹挡板的一种适当的距离上。

通过加速用于将DNA递送进入植物细胞的一种方法的一种说明性的实施方案是Biolistics粒子输送系统，它可以用于推进用DNA或细胞包被的颗粒穿过一种筛(例如一种不锈钢或Nytex筛)到达用目标大豆细胞覆盖的一个表面上。该筛将这些颗粒分散开从而使得它们不是以大聚集体递送至这些受体细胞。这些较小的聚集体据认为减少由较大的发射体对细胞造成的损害，因此导致较高的转化效率。微弹轰击技术是广泛适用的，并且可以用于转化几乎任何一种植物物种(如大豆或在此所说明的任何一种植物)。应用微弹轰击用于大豆的转化在例如在美国专利号5,322,783中进行说明，通过引用结合在此。

土壤杆菌介导的转移是另一个广泛使用的系统，用于将基因座引入进入植物细胞。该技术的一个优点是可以将DNA引入全部植物组织，由此绕过对从原生质体再生一个完整的植物体的的需要。现代的土壤杆菌转化载体能够在大肠杆菌连同土壤杆菌中进行复制，允许方便的操作(Klee et al.，Bio.Tech.，3：637-642，1985)。在用于土壤杆菌介导的基因转移的载体中最近的技术进步已经改进了在这些载体中基因和限制性酶切位点的安排从而有助于构建能够表达不同的编码多肽的基因的载体。所说明的这些载体具有方便的多连接区域(在一种启动子的侧面)以及一种聚腺苷酸化的位点(用于所插入的编码多肽的基因的直接表达)。额外地，包含带臂和不带臂Ti基因二者的土壤杆菌可以用于转化。土壤杆菌介导的转化在美国专利号6,384,301和6,037,522中说明，通过引用结合在此。

在这些植物株中，当土壤杆菌介导的转化是有效率的时，因为该基因座转移的温和性和定义的性质，它是选中的方法。使用土壤杆菌介导的植物整合型载体将DNA引入植物细胞在本领域中是众所周知的(Fraley等人Bio.Tech.，3：629-635，1985；美国专利号5,563,055)。在大豆转化背景下使用土壤杆菌已经被，例如、由Chee等人(Methods MoI.Biol.，44：101-119，1995)以及在美国专利号5,569,834中进行说明，通过引用将其每一个结合在此。

植物原生质体的转化还可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔法、以及这些处理的组合的方法而实现(参见例如：Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.，199：169-177，1985；Omirulleh et al.，Plant MoI.Biol.，21：415-428，1993；Fromm et al.，Nature，319(6056)：791-793.，1986；Uchimiya et al.，Mol.Gen.Genet.，204：204-207，1986；Marcotte et al.，Nature，335：454-457，1988)。已证明的从原生质体再生大豆植物的能力使得这些技术的每一个适用于大豆(Dhir etal.，Plant Cell Rep.，10：97-101，1991)。

植物

任何一种植物可以用于本发明中。在某些实施方案中，使用天然地不积聚高水平硅的一种植物。许多植物没有有效地积聚硅，包括大豆。在其他的情况下，在有效地积聚硅的一种植物中增加硅吸收(如水稻或一种禾本科植物，例如小麦、燕麦、高粱、或大麦)可能是令人希望的。可以用于本发明的那些植物包括：一种单子叶的农作物植物，比如大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、以及小麦；以及禾本科的禾本科家族的一员，比如梯牧草属、鸭茅属、黑麦草属、羊茅黑麦草属、羊茅属、早熟禾属、雀麦属、剪股颖属、燕麦草属、虉草属(Phalaris spp.)、以及三毛草属，例如：梯牧草、草坪型梯牧草、鸭茅、多年生黑麦草、多花黑麦草、一年生黑麦草(Lolium multiflorum westervoldicum)、羊茅黑麦草(Festuloliumbraunii)、欧黑麦草(Festulolium loliaceum)、疏花黑麦草(Festulolium holmbergii)、田野黑麦草(Festulolium pabulare)、草甸羊茅(Festuca pratensis)、紫羊茅、强壮匍匐紫羊茅(Festucarubra rubra)、邱氏羊茅、细弱匍匐紫羊茅、苇状羊茅(Festucaduriuscula)、羊茅、苇状羊茅、普通早熟禾(Poa trivialis)、草地早熟禾、泽地早熟禾(Poa palustris)、扁穗雀麦、阿拉斯加雀麦(Bromussitchensis)、无芒雀麦、发草、纤细剪股颖(Agrostis capilaris)、匍匐剪股颖、燕麦草、虉草、以及黄三毛草(Trisetum flavescens)；以及双子叶植物，例如苜蓿、胡萝卜、棉花、马铃薯、甘薯、油菜、萝卜、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、和芜菁；蔬菜例如芦笋、豆、胡萝卜、菊苣咖啡、芹菜、黄瓜、茄子、茴香、韭、莴苣、蒜、葱头、番木瓜、豌豆、胡椒/辣椒、菠菜、南瓜、西葫芦、以及番茄；芸薹属蔬菜，例如抱子甘蓝(brussel sprouts)、青花椰菜、甘蓝、以及花椰菜；果实，比如鳄梨、香蕉、黑莓、黑果越桔、葡萄、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番木瓜、菠萝、悬钩子、草莓；蔷薇科的果实，例如苹果、杏、桃子、梨、樱桃、李子、以及榅桲；草本植物，例如比如茴香、罗勒、月桂、刺山柑、藏茴香、辣椒、芹菜、细叶芹、细香葱、芫荽、时萝、辣根、蜜蜂花、甘草、墨角兰、薄荷、牛至、荷兰芹、迷迭香、芝麻、龙蒿、以及百里香；木本的物种，例如桉树、橡树、松树、以及白杨。

转化的植物的筛选

一旦用一种硅转运基因转化一种植物，以使用在本领域中已知的任何方法进行筛选。在一些情况下，使用如下所述的硅检测技术进行筛选。其他的筛选技术可以包括对于⁶⁸Ge的吸收、转运、或流出进行筛选。如上所说明的，⁶⁸Ge已经用于在非洲爪蟾的卵母细胞中评价硅吸收。这样一种方法还可以用于高等植物中评价硅吸收，因为已经观测到在不同的植物组织中吸收后⁶⁸Ge与硅之间的摩尔比率保持恒定(Nikolic等人Plant Physiol 143：495-503，2007)。

在其他的实施方案中，可以筛选这些植物检测对一种或多种生物学胁迫、一种或多种非生物学胁迫、或它们的任何组合的耐受性。在一个实例中，对用一种硅流入转运蛋白、一种硅流出转运蛋白、或二者的转化的大豆植物进行筛选检测其对大豆锈病(豆薯层锈菌)的耐受性。通常地，将未转化的植物和已转化的植物在一种胁迫存在下生长(如在此所说明的任何一种胁迫)，并且通过测量对该胁迫的一种表型的应答(例如：生长、存活、重量、产率)而确定硅转运蛋白表达对胁迫耐受性的影响，其中与这些未转化的植物相比较，在这些已转化的植物中该表型应答的增强(例如，增加的生长，存活率更高)表明使用该硅转运蛋白的这种转化是有益的。

任何适当的非生物性胁迫可以用于评价用一种硅转运蛋白转化一种细胞或植物效果。示例性的非生物性胁迫包括：盐度、温度(例如热或冷)、氧化应激、水分不足或过量(涝或旱)、矿物质不足或过量(例如矿物质毒性)、物理性胁迫(例如风)。记录健康或生长参数，例如：高度、重量、产率、或存活并且与受到相同胁迫的未转化的对照植物进行比较。

可替代地，可以使植物经受生物性胁迫例如：细菌、真菌、或一种昆虫。本领域中已知的任何生物性胁迫可以用于筛选植物。影响大豆的其他病原体包括：大雄疫霉大豆专化型(Phytophthora megasperma fsp.glycinea)、菜豆壳球孢菌、立枯丝核菌、核盘菌、尖孢镰刀菌、菜豆间座壳大豆变种(大豆拟茎点霉)、大豆北方茎溃疡病菌、齐整小核菌、大豆紫斑病菌、大豆灰斑病菌、霜霉菌、黑线炭疽菌(大豆炭疽病菌)、多主棒孢菌、大豆壳针孢菌、大豆生叶点霉(Phyllosticta sojicola)、互隔交链孢菌、丁香假单胞菌大豆致病变种、野油菜黄单胞菌菜豆疫病致病变种、扩散叉丝壳菌、半裸镰孢菌、大豆茎褐腐病菌、大豆花叶病毒、大豆小丛壳菌、烟草环斑病毒、烟草线条病毒、瓜果腐霉菌、终极腐霉菌、德巴利腐霉菌、番茄斑萎病毒、大豆胞囊线虫、以及镰刀菌。

通常地、示例性的真菌类包括：链格孢霉属(芸薹生链格孢；茄链格孢)、壳二孢属(豌豆壳二孢)；葡萄孢属(灰葡萄孢)；尾孢属(大豆紫斑病菌；玉米灰斑病菌(Diplodiazeae-maydis))；炭疽菌属(菜豆炭疽病菌)；色二孢属(玉米色二孢(Diplodia maydis))；白粉菌属(禾谷类白粉病菌小麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.Graminis)；禾谷类白粉菌大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.Hordei))；镰孢菌属(雪腐镰孢菌；尖孢镰刀菌；禾谷镰孢菌；黄色镰孢菌；镰刀菌；串珠镰孢菌；粉红镰孢菌)；顶囊壳属(禾顶囊壳小麦专化型)；长蠕孢菌属(玉米大斑凸脐蠕孢菌；炭色长蠕孢菌；玉蜀黍平脐蠕孢菌)；壳球孢属(菜豆壳球孢菌)；大角间座壳属(灰色大角间座壳菌)；丛赤壳属(红球丛赤壳)；霜霉属(霜霉菌；烟草霜霉)；茎点霉属(甜菜茎点霉)；瘤梗孢属(多主瘤梗孢菌)；疫霉属(樟疫霉；恶疫霉；菜豆疫霉；寄生疫霉；柑桔褐腐疫霉；大雄疫霉大豆专化型(Phytophthora megasperma f.sp.Sojae)；致病疫霉)；单轴霉属(葡萄霜霉菌)；叉丝单囊壳属(白叉丝单囊壳)；柄锈菌属(高粱柄锈菌；小麦条锈菌；禾柄锈菌小麦专化型；天门冬柄锈菌；叶锈菌；落花生柄锈菌)；核腔菌属(燕麦草核腔菌)；梨孢属(稻梨孢菌)；腐霉属(瓜果腐霉菌；终极腐霉菌)；丝核菌属(立枯丝核菌；禾谷丝核菌)；小核菌属(齐整小核菌)；核盘菌属(核盘菌)；壳针孢属(番茄壳针孢菌；大豆壳针孢菌；颖枯壳针孢菌；小麦壳针孢菌)；根串珠霉属(根串珠霉菌)；钩丝壳属(葡萄钩丝壳)；黑星菌属(苹果黑星病菌)；以及轮枝孢属(大丽花轮枝孢菌；黑白轮枝孢菌)。

锈病的实例包括由下列所引起的锈病：锈菌目的担子菌类；柄锈菌属(禾柄锈菌、小麦条锈菌、叶锈菌、大麦柄锈菌、冠柄锈菌、高粱柄锈菌、多堆柄锈病菌、高粱柄锈病菌、甘蔗柄锈菌(Puccinia sacchari)、屈恩柄锈菌、柄锈菌、天门冬柄锈菌、菊柄锈菌、锦葵柄锈菌、以及金鱼草柄锈菌(Puccinia antirrhini))；胶锈菌属(美洲苹果锈病菌，美洲山楂锈病菌)；驼孢锈菌属(咖啡驼孢锈菌)；多胞锈菌属；单孢锈菌属(石竹单孢锈菌)；柱锈菌属(松疱锈病菌、栎柱锈菌梭型专化型、栎柱锈菌(C.quercuum f.sp.virginianae)、甜厥疱锈菌(Cronartium comptoniae)、北美松疱锈菌(Cronartium comandrae)、球穗草柱锈菌(Cronartiumstrobilinum))；栅锈菌属(亚麻栅锈菌)；鞘锈菌属(紫菀鞘锈菌)；裸双胞锈菌属；层锈菌属(豆薯层锈菌)以及疣双胞锈菌属。

在一个实例中，在一种营养溶液中水栽生长已转化的植物与未转化的对照，该溶液包含1.7mMSi(硅在溶液中最大的溶解度)。收获植物根部以及地上部分，并且通过如下所说明的技术测量它们的Si含量。

硅的检测、定位、以及定量

一旦已经将一种细胞或一种植物(例如一种非洲爪蟾卵母细胞或在此所说明的一种植物)转化为表达一种硅转运蛋白时，在这种细胞或植物中测量硅的量值可能是令人希望的。存在几种方法以在不同的底物中测定一种Si的含量。典型地，当在生物样品中测量硅时，通过一种光谱分析进行硅的定量，在一些情况下这种光谱分析可能导致样品的破坏。

一种不破坏的分析方法是X-射线荧光光谱法。这种技术允许在生物材料中对硅进行检测和定量，例如、通过测量并且分析从一种底物发射的二次辐射，该底物用一种X-射线源激发的。在显像之前，将样品冷冻到-80℃下并且然后冻干。一旦完全干燥后，将它们附于碳扫描电镜的轴端并且用金包被。然后将样品提交给X-射线并且记录和量化该二次辐射。

对已处理的样品进行其他的光谱分析，其中通常将Si溶解在一种酸性溶液中。可以通过高压釜诱导消化、酸消化、微波辅助加酸消化、或NaOH溶化来制备样品。然后可以使用一种比色法(或者黄色硅钼酸或蓝色硅亚钼酸的方法)、原子吸收光谱法、或电感耦合等离子体(ICP)对生成的溶液进行分析。

据报道ICP具有最低的检测限(3ppb)以及最大精确度。因此，在处理Si的定量问题时它可能是选中的方法，其中溶解是可能的。一旦制备一种样品用于一种ICP分析，用一种喷雾器将它转变为气溶胶。发生一种去溶剂化/挥发阶段，其中将水去除同时将固体和液体馏分转变为气体。然后进行一种雾化阶段，其中气相键被打开。这一步产生一种等离子体，它要求一种高温(5000至8000℃)来保持并且通常由氩提供一种惰性的化学环境。然后通过X-射线将该等离子体激发并且以一种元素特异性波长释放电磁辐射(hv)。例如，硅在251,611nm处发射。然后一种检测器测量所发射的光并且对它定量。因此ICP可以用于在卵母细胞转化之后评估Si-转运效率，并且还用于测量植物中Si的吸收(例如已转化的或未转化的)。

间接地，可以使用用一种锗示踪器测量硅吸收的分析方法。以上使用卵母细胞说明了这种方法，但是这种方法还可以用于高等植物。使用少量的放射性锗(⁶⁸Ge)作为一种示踪物可以用作用于测量硅吸收的一种方法(参见，例如Nikolic et al.，Plant Physiol 143：495-503，2007)。

最后，在卵母细胞转化、并且在一种包含硅的溶液中孵育之后可以通过另一个方法测量硅流入或流出：将卵母细胞洗涤、溶解在HNO₃中，并且通过原子能的吸收(AA)光谱直接定量该硅含量。原子吸收光谱使用光的吸收来测量气相原子的浓度。因为样品通常是液体或固体的，这些被分析物的原子或离子必须在一种燃烧或石墨熔炉中汽化。这些原子吸收紫外线或可见光并且使得跃迁至更高的电子能级。从吸收的量确定该被分析物的浓度。在用已知浓度的标准品校正仪器后，从一个工作曲线确定硅浓度的测量。

硅转运蛋白多肽的合成

可以将编码硅转运蛋白多肽或其片段的那些核酸引入各种细胞类型或非细胞体系中用于表达，由此允许纯化这些多肽用于生物化学的表征、大规模的生产、抗体产生、以及患者治疗。

可以生成真核的以及原核的硅转运蛋白表达系统，其中将一种硅转运蛋白基因序列引入一种质粒或其他的载体、然后将它用于转化活细胞。可以将构建物(其中该硅转运蛋白cDNA包含以正确的方向插入到一种表达质粒中的全部开放阅读框)用于蛋白表达。可替代地，可以插入部分的这些硅转运蛋白基因序列，包括野生型或突变型硅转运蛋白序列。若希望，原核的(如大肠杆菌)以及真核的表达系统允许回收这些硅转运蛋白的各种重要的功能域，如果想要，作为融合蛋白，并且然后用于结合、结构、以及功能研究，并且也用于生成适当的抗体。

典型的表达载体包含多个启动子，这些启动子在带有该质粒的细胞中指导与该插入的硅转运蛋白核酸对应的大量mRNA的合成。它们还可以包括复制序列的一个真核的或原核的起点(该起点允许它们在该宿主有机体内自主复制)、编码遗传性状的序列(这些序列允许在另外的毒性药品存在下选出包含载体的细胞)、以及增加效率的序列(用它们翻译合成的mRNA)。通过使用例如病毒(例如来自Epstein Barr病毒基因组的这些OriP序列)这样的调控元件将稳定的长期载体可以作为自由复制的实体而被保持。还可以产生细胞系，这些细胞系已经将该载体整合进入其基因组DNA，并且用这样的方式连续地产生该基因产物。

在细菌中(比如大肠杆菌)外来序列的表达要求将该硅转运蛋白核酸序列插入到一种细菌性的表达载体中。这类质粒载体包含要求用于在细菌中繁殖该质粒并且用于表达插入到该质粒中的DNA的几个元件。通过将可选择标志物-编码序列引入该质粒实现仅带质粒的细菌的繁殖，该可选择标志物-编码序列允许带质粒的细菌在另外的毒性药品的存在下生长。该质粒还包含能够从该克隆的基因产生大量mRNA的一种转录启动子。这类启动子可以是(但不是必需的)诱导型启动子，该诱导型启动子在诱导时启动转录。该质粒还优选地包含一种多聚接头从而在该载体中在正确的方向上简化基因的插入。

一旦构建了包含一种硅转运蛋白基因、片段、融合物、或突变体的这些适当的表达载体，通过转化技术将它们引入一种适当的宿主细胞，例如、但不局限于：磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔法、显微注射、原生质体融合、或脂质体介导的转染。用本发明的这些载体转染的这些宿主细胞可以包括(但是不限于)：大肠杆菌或其他的细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞(例如在SF9昆虫细胞中使用杆状病毒载体用于表达)、或从小鼠、人类、或其他动物得到的细胞。还可以使用体外表达硅转运蛋白、融合物、多肽片段、或由克隆的DNA编码的突变体。在分子生物学领域中的普通技术人员将会理解多种多样的表达系统和纯化系统可以用于产生重组硅转运蛋白以及其片段。

一旦一种重组蛋白被表达，可以使用蛋白纯化技术(例如亲和层析法)将它从细胞裂解液中分离出来。一旦分离，如果希望，可以将该重组蛋白进一步纯化，例如通过高效液相色谱法(HPLC；例如参见Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology，Work and Burdon，Eds.，Elsevier，1980)。

本发明的多肽，特别是短的硅转运蛋白片段还可以通过化学合成生成(例如通过在SolidPhase Peptide Synthesis，2nd ed.，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL中所说明的这些方法)。

以下实例旨在展示而不是限制本发明。

实例1

从小麦根制备总cDNA提取物

将小麦植物栽培品种HY644培养在水栽系统中，设置为每30分钟将根浸入一种营养液中15分钟。每一个系统包含12个盆，每一个盆包含2-3粒种在蛭石上种子。将这些系统保持在温室中(在22℃下光照16小时，并且在18℃下黑暗8小时，80％湿度)。在蒸馏水中使种子萌芽，在2-3叶期将蒸馏水替换为Hoagland营养溶液。每隔一周替换这种溶液。一旦成熟，将小麦根小心地回收并且立即冷冻在液氮中。将冰冻的根在一个清洁的经高压灭菌的研钵中压碎。然后使用一种RNA提取试剂盒(QIAgen)将总mRNA从这些根粉末中提取出来；将该RNA储存在-80℃下直到使用。将5μl的一种300ng/μl的总mRNA添加到一种混合物中，该混合物包含：2μl oligodT18(5μM)、1μl的dNTP(10mM)、以及4.5μl的无RNAse的水，然后在65℃下孵育5分钟，随后在冰上2分钟。将4μl的TP 5X、1μl的DTT、1μl的RNase OUT RNase抑制剂(Invitrogen)、以及1μl的SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen)添加到该RNA溶液中并且在55℃下孵育50分钟以允许oligodT引物延伸。然后将这些混合物在70℃下孵育15分钟以使这些逆转录酶失活。将2μl的一种1U/μl核糖核酸酶H(Roche)添加到该cDNA制品中并且在37℃下孵育20分钟以使RNA水解。然后用一种PCR纯化试剂盒(QIAgen)纯化该cDNA样品，从而去除所有痕量的dNTP、oligodT、以及RNA片段。

实例2

在小麦中一种硅转运蛋白片段的扩增和克隆

将如在实例1中所说明获得的100ng的小麦cDNA添加到一种混合物中，该混合物包含：1μl的dNTP(10mM)、2.5μl pf TP 10X、1.5μl的25mM MgCl₂、12.75μl的ddH₂O、0.25μl的HotStart Taq DNA聚合酶(Eppendorf)、1μl的5μM引物IF(SEQ ID NO：7)、以及1μl的5μM引物2R(SEQ ID NO：8)。使用以下条件实施PCR。在94℃下持续2分钟实现初始的变性、随后40个循环的变性作用(94℃，30秒)、退火(62℃，30秒)、以及引物延伸(72℃，1分钟)、以及一个最终延伸(72℃，10分钟)。

该PCR产物的琼脂糖凝胶电泳证明了该预期大小的一种独特条带。将3μl的该纯化的PCR产物添加到5μl的TP 2X快速连接缓冲液、1μl的50ng/μl pGEM-TT质粒(Promega)、以及1μl的T4DNA连接酶(Promega)，并且在4℃下孵育过夜。将5μl的该连接反应物置于一种尼龙膜上并且用30％甘油脱盐30分钟。在置入一个电穿孔器中的一个无菌的电穿孔杯(Biorad)中，将该脱盐连接物添加到50μl的DH5α大肠杆菌感受态细胞。电穿孔法的条件是：(200Ω，2，5KV)。在将不同量的转化物铺于LB+100μg/ml氨苄青霉素培养皿上之前，将950μl的预冷却LB培养基添加到电穿孔的细胞，并且将该溶液在37℃下孵育30分钟。将10μl的IPTG以及40μl的X-GaI添加入各培养皿中以允许使用白/蓝测试选择阳性转化体。将培养皿在37℃下孵育过夜。将白色菌落回收并且进行PCR分析以证实该正确插入物的存在。

将24个推测的转化体回收并且放置入一种PCR混合物中，该PCR混合物包含：0.8μldNTP(10mM)、2μl TP 10X、1.2μl MgCl₂、15.4μl ddH₂O、0.2μl Taq DNA聚合酶、0.2μl M13F引物(50μM)、以及0.2μl M13R引物(50μM)。使用以下条件实施PCR。在94℃下持续2分钟实现初始的变性、随后24个循环的变性(94℃，30秒)、退火(55℃，30秒)、以及引物延伸(68℃，2分钟)、以及一个最终延伸(62℃，10分钟)。

该PCR产物的琼脂糖凝胶电泳证明了具有预期大小的一种插入物的几个克隆的存在。将这些好的转化体在37℃下在5ml的液体LB+100μg/ml氨苄青霉素中培养过夜。在4℃下将该培养物离心10分钟，并且将该细胞小球进行一种质粒纯化试剂盒(QIAgen)的处理。将回收的质粒在“Service de 

de l′Universitó Laval”下测序。

实例3

在小麦中的3′RACE(cDNA末端的迅速扩增)

将如在实例1中所说明获得的100ng的小麦cDNA添加到一种混合物中，该混合物包含：1μl的dNTP(10mM)、2.5μl pf TP 10X、1.5μl的25mM MgCl₂、12.75μl的ddH₂O、0.25μl的HotStart Taq DNA聚合酶(Eppendorf)、1μl的5μMADAPT引物(SEQ ID NO：16)、以及1μl的5μM BIeR引物(SEQ ID NO：18)。使用以下条件实施PCR。在94℃下持续2分钟实现初始的变性、随后40个循环的变性(94℃，1分钟)、退火(52℃，30秒)、以及引物延伸(72℃，1分钟)、以及一个最终延伸(72℃，10分钟)。将该PCR产物稀释100倍并且用相同条件(但是使用1μl的5μM的ADA引物(SEQ ID NO：17)以及1μl的5μM的BleRNested(5μM，5′-CCTGCGAAGATGGAGGTAA-3′))进行另一次扩增。

在琼脂糖凝胶电泳上分析的该PCR产物证明了这种预期大小的独特的条带。如在实例2中所说明的，将该PCR产物进行克隆用于测序。

实例4

在非洲爪蟾卵母细胞中cRNA的表达以及Si含量的定量

从雌性非洲爪蟾取出卵母细胞。在解剖以后，将一组卵母细胞转移至具有抗生素的一种生理培养基。将它们保存在18℃直到使用持续达72小时。将cRNA溶解在无Rnase的水中。使用一种显微操作器将20至50nl的注入流体(200ng/μl cRNA)注入进入每一个已制备的卵母细胞中。然后将这些卵母细胞在18℃下孵育约48小时以允许蛋白合成以及膜整合。然后进行Si吸收测量。将Si添加入该生理培养基中以达到1.7mM的浓度。在0、15、30、或60分钟以后，冲洗卵母细胞以除去外面的硅。然后，如上说明的通过原子吸收光谱法测量在卵母细胞中的Si含量。

然而在注入水的卵母细胞中，在实验期间该浓度保持恒定，在用小麦或水稻SIIT1二者转化的卵母细胞中，随着时间推移检出了更高浓度的硅(图4)。这些结果表明：在小麦中识别的SIIT1的序列是水稻SIIT1的同系物并且可以作为一种硅转运蛋白起作用。

还在水稻和小麦二者中还进行了野生型与突变型SIIT1之间的一种比较。水稻SIIT1突变型显示出一种缺陷型硅转运蛋白的特征，与野生型蛋白相比，它具有较低的转运活性的(图5)。

出乎意料的是：在孵育30分钟以后，用该小麦突变型SIIT1注入的卵母细胞显示出了比野生型蛋白更高的活性。这将表明：在该蛋白序列中的那些突变(改变)可能导致或者较低或者较高的硅转运活性。

实例5

用硅-转运基因转化大豆植物

在一个单一转化事件期间可以将几个基因引入一种植物。对于本发明，一种DNA构建体的一个实例由一种土壤杆菌p-CAMBIA质粒组成，该质粒包含可以使用卡那霉素耐受性作为一种选择标记而被引入该植物基因组的以下序列：CaMV 35S启动子-卡那霉素耐受性基因-终止子-CaMV 35S启动子-SIIT1基因-终止子-CaMV 35S启动子-SIIT2基因-终止子-CaMV 35S启动子-SIET1基因-终止子。(对于用两个昆虫耐受性基因进行大豆转化的一个实例，例如参见Dans and Wei Plant Science 173：381-389，2007)。将该DNA构建物引进土壤杆菌属土壤杆菌细菌。

将大豆愈伤组织与该土壤杆菌共培养。然后将这些植物细胞转移至一种培养基中，该培养基包含选择标志物，在这个实例中为卡那霉素。仅那些已经整合了该DNA构建物并且表达了卡那霉素-耐受性基因的植物细胞将会生长。

可以使用PCR进行额外的控制。为证实该SIIT1、SIIT2、以及SIET1基因整合到该植物基因组中，提取总植物DNA，并且使用对于SIIT1、SIIT2、或SIET1基因任意一个特异性的引物进行PCR。为证实SIIT1、SIIT2、以及SIET1基因在该植物中的表达，提取根RNA并且在互补脱氧核糖核酸(cDNA，如在实例1中所说明的)中反向转录。然后使用标准方法使用对于这些SIIT1、SIIT2、以及SLET1基因特异性的引物对该cDNA进行PCR。

这些植物一旦长大，可以进行测试检测对不同生物性以及非生物性胁迫(包括大豆锈病)的增强的耐受性。令人希望的是：这类转化的植物将对这类胁迫具有增加的耐受性，包括对大豆锈病的增强的耐受性。

其他实施方案

所有的专利、专利申请(包括2008年3月24日提交的美国临时申请号61/070,528)、以及在本说明书中提到的公开文件通过引用结合在此，其程度就像各独立的专利、专利申请、或公开文件被专门地并且单独地表明通过引用被结合一样。

Claims (69)

1.一种基本上纯的多核苷酸，包括与选自下组的一种核苷酸序列具有至少85％一致性的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：15、4、9、12、13、14、33、50、52、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

2.一种基本上纯的多核苷酸，包括与SEQ ID NO：56的核苷酸序列具有至少95％的一致性、或与SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59的核苷酸序列具有至少90％一致性的一个核酸序列。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中在一种细胞中由所述多核苷酸编码的该多肽的表达能够增加进入所述细胞的硅转运。

4.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少95％。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少99％。

6.如权利要求5所述的多核苷酸，包括选自下组的一种核苷酸序列，该组的组成为：SEQID NO：4、9、12、13、14、15、33、50、52、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

7.如权利要求5所述的多核苷酸，包括选自下组的一种核苷酸序列，该组的组成为：SEQID NO：56、58、以及59。

8.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在长度上小于20kB。

9.如权利要求1或2所述的多核苷酸，该多核苷酸被可操作地连接至一种启动子上。

10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述启动子能够在一种植物细胞中表达。

11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述植物细胞是一种根细胞。

12.一种载体，包括如权利要求9所述的多核苷酸。

13.如权利要求12所述的载体，进一步包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种第二多核苷酸。

14.如权利要求13所述的载体，其中所述第二多核苷酸与选自下组的一个核酸序列具有至少80％的一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：28、29、71、以及73。

15.一种细胞，包括如权利要求12所述的载体。

16.如权利要求15所述的细胞，其中所述细胞是一种植物细胞。

17.如权利要求16所述的细胞，其中所述植物细胞是一种大豆植物细胞。

18.一种种子，包括如权利要求15所述的细胞。

19.一种基本上纯的多肽，该多肽由如权利要求1或2所述的多核苷酸编码。

20.一种基本上纯的多核苷酸，包括与选自下组的一种核苷酸序列具有至少80％一致性的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：29、71、以及73。

21.如权利要求20所述的多核苷酸，其中在一种细胞中由所述多核苷酸编码的该多肽的表达能够增加离开所述细胞的硅转运。

22.如权利要求20所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少95％。

23.如权利要求22所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少99％。

24.如权利要求23所述的多核苷酸，包括选自下组的一种核苷酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：29、71、以及73。

25.如权利要求20所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在长度上小于20kB。

26.如权利要求20所述的多核苷酸，该多核苷酸被可操作地连接至一种启动子上。

27.如权利要求26所述的多核苷酸，其中所述启动子能够在一种植物细胞中表达。

28.如权利要求27所述的多核苷酸，其中所述植物细胞是一种根细胞。

29.一种载体，包括如权利要求26所述的多核苷酸。

30.如权利要求29所述的载体，进一步包括一种第二多核苷酸，该第二多核苷酸与选自下组的一个核酸序列具有至少80％一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

31.一种细胞，包括如权利要求29所述的载体。

32.如权利要求31所述的细胞，其中所述细胞是一种植物细胞。

33.如权利要求32所述的细胞，其中所述植物细胞是一种大豆细胞。

34.一种种子，该种子包括如权利要求31所述的细胞。

35.一种基本上纯的多肽，该多肽由如权利要求20所述的多核苷酸编码。

36.一种植物，包括一种异源的多核苷酸，该多核苷酸包括与选自下组的一个核酸序列具有至少85％一致性的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：4、9、12、13、14、15、33、50、52、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

37.如权利要求36所述的植物，其中所述一致性是至少95％。

38.如权利要求37所述的植物，其中所述一致性是至少99％。

39.如权利要求38所述的植物，其中所述多核苷酸包括选自下组的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：4、9、12、13、14、15、33、50、52、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

40.如权利要求36所述的植物，其中由所述异源的多核苷酸编码的多肽在表达时增加了进入所述植物内至少一种组织之中的硅转运。

41.如权利要求36所述的植物，进一步包括一种第二异源序列，该第二异源序列与对一种硅流出转运蛋白或一种第二硅流入转运蛋白进行编码的一种多核苷酸具有至少80％的一致性。

42.如权利要求41所述的植物，其中所述第二序列与选自下组的至少一种序列具有至少80％的一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：28、29、71、73、55、56、57、58、以及59。

43.如权利要求36所述的植物，其中所述植物是一种大豆植物。

44.一种植物，包括一种异源的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与选自下组的一个核酸序列具有至少80％一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：29、71、以及73。

45.如权利要求44所述的植物，其中所述一致性是至少95％。

46.如权利要求45所述的植物，其中所述一致性是至少99％。

47.如权利要求46所述的植物，其中所述多核苷酸包括选自下组的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：29、71、以及73。

48.如权利要求44所述的植物，其中由所述异源的多核苷酸编码的多肽在表达时增加了离开所述植物内至少一种组织的硅转运。

49.如权利要求44所述的植物，进一步包括一种第二异源序列，该第二异源序列与对一种硅流入转运蛋白进行编码的一个核酸序列具有至少80％一致性。

50.如权利要求49所述的植物，其中所述第二异源的序列与选自下组的至少一种序列具有至少80％的一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

51.如权利要求43所述的植物，其中所述植物是一种大豆植物。

52.一种植物，包括一种异源的多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：56、58、或59的一个核酸序列具有至少90％一致性。

53.如权利要求52所述的植物，其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO：56、58、或59的序列。

54.如权利要求52所述的植物，其中所述植物包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种第二异源的多核苷酸。

55.如权利要求54所述的植物，其中所述第二异源的多核苷酸与选自下组的一种序列具有至少80％的序列一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：28、29、71、以及73。

56.如权利要求52所述的植物，其中所述植物包括对一种硅流入转运蛋白进行编码的一种第二异源的多核苷酸。

57.如权利要求56所述的植物，其中所述第二异源的多核苷酸与选自下组的至少一种序列具有至少80％的序列一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

58.如权利要求56所述的植物，其中所述植物包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种第三异源的多核苷酸。

59.如权利要求58所述的植物，其中所述第三异源的多核苷酸与选自下组的一种序列具有至少80％的一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：28、29、71、以及73。

60.一种生成具有增加的硅吸收的植物的方法，所述方法包括：

(a)提供一种包括以下多核苷酸的第一载体，该多核苷酸包括与选自下组的一种序列具有至少85％一致性的一个核酸序列，该组的组成为：SEQ ID NO：4、9、12、13、14、15、33、50、52、56、58、59、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014；

(b)用所述载体转化一种植物细胞；并且

(c)从所述细胞生长一种植物，其中所述植物表达所述多核苷酸，由此生成一种具有增加的硅吸收的植物。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述载体进一步包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一个第二序列。

62.如权利要求60所述的方法，其中用一种第二载体与所述第一载体同时地或顺序地将所述细胞进一步转化，该第二载体包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一个第二序列。

63.如权利要求61或62所述的方法，其中所述第二序列与选自下组的一种序列具有至少80％的一致性，该组的组成为：SEQ ID NO：28、29、71、以及73。

64.如权利要求60所述的方法，其中所述植物细胞是一种大豆细胞。

65.一种生成具有增加的硅转运的植物的方法，所述方法包括：

(a)提供包括以下多核苷酸的一种第一载体，该多核苷酸包括与SEQ ID NO：29、71、以及73的一种核苷酸序列具有至少80％一致性的一个核酸序列；

(b)用所述载体转化一种植物细胞；并且

(c)从所述细胞生长一种植物，其中所述植物表达所述多核苷酸，由此生成一种具有增加的硅转运的植物。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述载体进一步包括对一种硅流入转运蛋白进行编码的一个第二序列。

67.如权利要求65所述的方法，其中将所述植物细胞用一种第二载体与所述第一载体同时地或顺序地进一步转化，该第二载体包括与一种硅流入转运蛋白具有至少80％一致性的一个第二序列。

68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述第二序列选自下组，其组成为：SEQ IDNO：3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO：21的核苷酸124-919、SEQ ID NO：22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO：32的核苷酸124-1014。

69.如权利要求65所述的方法，其中所述植物细胞是一种大豆细胞。

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