CN102186980A - 植物中氮应答的改进 - Google Patents

Abstract

本发明提供了冠瘿碱合成和分解的调节，其利用冠瘿碱合成酶和氧化酶核酸和它们编码的蛋白，提供改进的氮应答。本发明提供了与改变植物中氮利用和/或摄入有关的方法和组合物。本发明进一步提供了重组表达盒、宿主细胞和转基因植物。

Description

植物中氮应答的改进

发明领域

本发明通常涉及分子生物学领域。

发明背景

在生长的谷物中，氮(N)肥料构成单独的最昂贵的投入。改进杂交种对N的应答不但将增加农民的利润率，而且帮助减轻流掉的或沥滤掉的硝酸盐对环境的不利影响。

玉米根以硝酸盐的形式从土壤中吸收大部分N，所述N除了在根中被较小程度地同化为氨基酸之外，其被运送至叶用于还原和同化(Crawford and Glass，(1998)Trends in Plant Science 3：389-395)。

根细胞中的硝酸盐流入伴随流出，这是有利的，因为细胞内部是带负电荷的，并且作为阴离子的硝酸盐被吸收是逆电化学梯度的。随着细胞内部硝酸盐浓度的增加，流出显著增高，占吸收的总硝酸盐高达30％(Volk，(1997)Plant Science 123：1-7)。这提示了硝酸盐从根的流失构成N利用的瓶颈。硝酸盐的摄入是主动(需要能量)过程：将每个硝酸盐离子吸收进细胞需要水解两个ATP分子。以过度流出的形式所浪费的能量反而可能用于提高生产率。为了从土壤中持续摄入硝酸盐，必需通过还原和同化为氨基酸然后是蛋白，耗尽细胞中的硝酸盐池，这大多数发生在叶中。

诸如玉米的作物植物中先存的新陈代谢体系可能不易于为改进的N利用的操纵做准备。例如，多胺，天然存在的富含N的化合物在植物细胞中无处不在，且已知在植物细胞暴露于胁迫后，马上就有它们的积累(Galston and Sawhney，(1990)Plant Physiology 94：406-410)。

还认为多胺在植物生理应答和形态发生中具有数种信号转导作用。诸如酰脲的富含N的嘌呤衍生物是从共生的豆科植物类的根瘤处N固定和运送的优选来源(Smith and Atkins(2002)Plant Physiology 128：793-802)。形成这些化合物的植物酶还参与无数核苷酸类型以及植物激素的合成。尽管有高的C∶N比，但是由于酰脲必须转换为用于再同化的铵和二氧化碳，所以酰脲构成移位的N的比较浪费的来源。

引入用于N利用的不同于先存新陈代谢体系的新机制提供了改进植物中N利用效率的吸引力的目标。表达了关于植物中冠瘿碱合成和分解的基因，并评价它们对N利用效率的影响。氨基酸-酮酸轭合物——冠瘿碱提供了移位N而不浪费任何能量的新方式，因为产生它们所使用的NADH由于它们的分解而再生。

本发明详细公开了工程化植物的方法，所述方法产生诸如改进N利用效率的冠瘿碱的小的富含氮的化合物，且随后利用所述化合物用于产量形成。冠瘿碱是由诸如农杆菌(agrobacterium)的一些肿瘤发生细菌类感染的植物细胞产生的独特的分子种类(Tempe and Goldmann，(1982)″Occurrence and biosynthesis of opines(冠瘿碱的发生和生物合成)″In Kahl G.and Schell J.，eds)Molecular Biology of Plant Tumors.(Academic Press)，New York，pp.427-449)。携带T-DNA的农杆菌将编码冠瘿碱合成酶的基因转移进植物基因组中，其中这些基因的表达导致冠瘿碱的合成。存在于非转移质粒(部分)上的分解冠瘿碱的酶在细菌细胞自身中表达，使这些细菌可以利用这些分子作为它们生长的C源和N源(Tempe and Petit，(1982)″Opine utilization by Agrobacterium(农杆菌的冠瘿碱利用)″；In Kahl G.and Schell J.，eds)Molecular Biology of Plant Tumors.(Academic Press)，New York，pp.451-459)。与一些其他富含N的化合物不同，冠瘿碱用于N从一个植物器官移位至其他植物器官中是理想的，因为它们保存了它们合成所消耗的所有能量并由于它们的分解而释放所述能量。

尽管已知天然存在各种各样的冠瘿碱分子，但是用于本方法中的最感兴趣的冠瘿碱是含有高浓度N的冠瘿碱。由于两种类型——章鱼碱和胭脂碱是由富含N的氨基酸制成，因此它们最适合用于我们所提出的工作中(Winans，1992)。

冠瘿碱形成基因的表达导致植物细胞中隔离附加的N，从而通过产生更有利于硝酸盐持续吸收的电化电势，降低从根回流至土壤的硝酸盐流出。由于一旦产生，植物细胞不能代谢这些化合物，通过表达冠瘿碱分解酶，可以在选择的组织或细胞中指定它们的利用。

表达了在植物细胞中合成和分解富含N的氨基酸的基因，并且可以通过本方法检测它们对N利用效率的影响。空间上和/或时间上调节农杆糖脂(两种糖的轭合物)合成和分解基因的表达，以改变不同器官中不同糖的含量和性质，例如，本方法还控制种子。

发明概述

本发明提供了将冠瘿碱合成和分解基因插入植物细胞的方法，以便这些基因各自的表达在空间上是分开的，允许在一个器官中合成而在其他的器官中利用。可选择地，本发明还提供了方法，其中这些基因的表达在时间上是分开的，在可得到过量的能量的白天发生合成而在晚上利用。植物中增加的N量和/或提高的生长率将表示引入的基因对N利用效率的正向效应。

本发明提供了诸如冠瘿碱的新的富含氮的化合物在高等植物中时间上和空间上分开的形成和分解，以提高氮利用效率。

本发明提供了冠瘿碱在根、叶和种子中形成和分解，导致增强的氮利用效率和种子组合物的方法。

本发明提供了增强植物中冠瘿碱合成和分解多肽的活性的方法。因此，一方面，本发明提供了冠瘿碱在根中形成以捕捉减少的N，并且在枝条中分解以释放减少的N用于生长。另一方面，本发明提供了冠瘿碱在枝条中合成，并且在种子中分解，用于增强种子生长和改良氨基酸成分。

在其他的方面中，本发明提供了冠瘿碱在根和枝条中形成，在种子中分解。

本发明提供了冠瘿碱在活性光合作用期间(光下)形成，并在黑暗条件下分解。

组合物进一步包括具有DNA构建体的植物和种子，所述DNA构建体包含可操作地连接于当前发明的启动子的目的核苷酸序列。在具体的实施方案中，DNA构建体稳定地整合进植物基因组。本方法包括将可操作地连接于本发明启动子的目的核苷酸序列引入植物。

发明的详细描述

除非另有定义，本文所用的所有技术和科技术语具有如本发明所属的本领域技术人员所通常理解的相同含义。除非另有所指，本文所用的和考虑的技术是本领域技术人员所公知的的标准方法。材料、方法和实施例仅为示例性的而非限制性的。下述内容以示例方式提出，且并非意图限制本发明的范围。

在后文中，将参照附图对本发明进行更全面的描述，其中，展示了本发明的一些而不是所有实施方案。实际上，这些发明可以以许多不同的形式体现，并且不应解释为局限于本文阐述的实施方案，更确切地是，提供这些实施方案，以便本公开满足合适的法律要求。全文相似标记指示相似的元件。

在获得前面描述和相关附图的教导后，本领域技术人员会想到本文展示的本发明的许多改变和其他实施方案。因此，应当理解，本发明并不限于所公开的具体实施方案，并且意图将改变和其他实施方案包括在附加的权利要求的范围内。尽管本文用到特定的术语，但是其仅以一般和说明性的含义而使用，并不是为了限制的目的。

除非另有所指，实施本发明将用到植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，其属于本领域技术范畴内。这些技术完全描述于文献中。参见，例如，Langenheim and Thimann，(1982)BOTANY：PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS(植物学：植物生物学和它与人类事件的关系)，John Wiley；CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS(植物细胞培养和体细胞遗传学)，volume 1，Vasil，ed.(1984)；Stanier，et al.，THE MICROBIAL WORLD(微生物世界)，5th ed.，Prentice-Hall(1986)；Dhringra and Sinclair，BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS(基础植物病理学方法)，CRC Press(1985)；Maniatis，et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(分子克隆：实验手册)(1982)；DNA CLONING(DNA克隆)，vols.I and II，Glover，ed.(1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(寡核苷酸合成)，Gait，ed.(1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(核酸杂交)，Hames and Higgins，eds.(1984)；和系列METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)，Colowick and Kaplan，eds，Academic Press，Inc.，San Diego，CA。

单位、前缀和符号可以表示为他们SI接受的形式。除非另有所指，分别地，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。数字范围包括定义该范围的数字。可以通过通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会所推荐的单字母符号来表示本文的氨基酸。同样，可以通过核苷酸通常接受的单字母密码来表示核苷酸。通过参照整个说明书更全面地定义下文定义的术语。

在描述本发明中，将用到下述术语，并且意图按下述指出的被定义。

“微生物(microbe)”表示任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，诸如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生生物以及其他单细胞结构。

“扩增”表示使用至少一种核酸序列作为模板，所述核酸序列的多拷贝或与所述核酸序列互补的多拷贝的构建。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见，例如，DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY：PRINCIPLES AND APPLICATIONS(分子微生物学诊断：原理和实践)，Persing，et al.，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC(1993)。将扩增产物称为扩增子。

术语“保守修饰变体”用于氨基酸和核酸序列。就具体的核酸序列而言，保守修饰变体是指编码相同的氨基酸序列或氨基酸序列的保守修饰变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任意给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个由密码子指定为丙氨酸的位置，可以将所述密码子改变为所述的任何相应的密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”并代表一种保守修饰变异。本文编码多肽的每个核酸序列还描述了每种可能的核酸沉默变异。本领域技术人员应当认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是蛋氨酸的唯一密码子；微球菌(Micrococcus rubens)是一个例外，其中GTG是蛋氨酸的密码子(Ishizuka，et al.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32))，从而产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变体都包含在每种描述的多肽序列中，并且通过引用并入本文。

就氨基酸序列而言，本领域技术人员应当认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小比例的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单独取代、缺失或添加，当所述改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸时，是“保守修饰变体”。因此，选自1-15的整数的任意数量的氨基酸残基可以这样改变。因此，例如，可以作出1、2、3、4、5、7或10个改变。保守修饰变体通常提供与它们来源的非修饰多肽序列相似的生物活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白与其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域内是公知的。

以下六组每组含有彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

还参见，Creighton，PROTEINS(蛋白)，W.H.Freeman and Co.(1984)。

如本文所用，“基本上由...组成”表示目标多核苷酸包括其他的序列，其中所述其他的序列在严紧杂交条件下不能与所述多核苷酸相同的cDNA选择性杂交，并且其中，杂交条件包括于65℃在0.1×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中的洗脱步骤。

对于指定核酸，“编码(enconding)”或“编码的(enconded)”表示包含翻译为指定的蛋白的信息。编码蛋白的核酸在所述核酸的翻译区内可以包含非翻译序列(例如，内含子)，或可以缺失这类插入非翻译序列(例如，如cDNA中)。编码蛋白的信息通过使用密码子被指定。通常，核酸使用“通用的”遗传密码编码氨基酸序列。然而，诸如存在于某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum)(Yamao，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9)或纤毛虫大核中的通用密码的变体，当用这些有机体表达核酸时，可以使用。

当以合成方法制备或改变核酸时，采用待表达核酸的预期宿主的已知偏爱密码子具有优势。例如，尽管可以在单子叶和双子叶植物物种中表达本发明的核酸序列，可以按照单子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏爱性和GC含量偏爱性修饰序列，由于已经显示这些偏爱性不同(Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98并通过引用并入本文)。因此，具体氨基酸的玉米偏爱密码子可以来自玉米的已知基因序列。来自玉米植物的28个基因的玉米密码子用法列于Murray，et al.，同上，的表4中。

如本文所使用的，对于核酸而言“异源的”是指来源于其他物种的核酸，或如果来源于同一物种，通过有意的人介入，从其天然形式在组成和/或基因组基因座中进行了实质上的修饰。例如，可操作地连接于异源结构基因的启动子，来源于与结构基因来源的物种不同的物种，或，如果来源于相同物种，则一个或两个都从其原始形式进行了实质上的修饰，异源蛋白可以来源于其他物种，或，如果来源于相同物种，则通过有意的人介入从其原始形式进行了实质上的修饰。

“宿主细胞”表示包含本发明异源核酸序列的细胞，其含有载体并支持表达载体的复制和/或表达。宿主细胞可以是诸如大肠杆菌(E.coli)的原核细胞或诸如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞的真核细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉、大麦、粟、柳枝稷、芒属植物、黑小麦和番茄。特别优选的单子叶植物宿主细胞是玉米宿主细胞。

术语“杂交复合物”是指包括由两条单链核酸序列彼此选择性杂交形成双链核酸结构。

在将核酸插入细胞情形下的术语“引入”表示“转染”或“转化”或“转导”，并且是指包括将核酸并入真核细胞或原核细胞，所述核酸可以在其中并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转变为自主复制子，或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

术语“分离的”是指诸如核酸或蛋白的材料，其实质上或基本上没有其天然存在的环境中所发现的通常伴随所述材料或与其相互作用的组分。所述分离的材料任选地包含在其天然环境中没有发现与其伴随的材料。如本文所定义的，“分离的”的核酸也被称为“异源的”核酸。除非另有所指，术语“冠瘿碱核酸”表示包含编码全长或部分长度的冠瘿碱多肽的多核苷酸(“冠瘿碱多核苷酸”)的核酸。

如本文所用，“核酸”是指包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非有其它限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物，其中，它们以与天然存在的核苷酸(例如，肽核酸)相似的方式与单链核酸杂交。

“核酸文库”表示分离的DNA或RNA分子的集合，其包含并实质上代表指定的有机体基因组的全部转录部分。诸如基因组和cDNA文库的示例性核酸文库的构建在标准分子生物学中有教导，参考例如Berger and Kimmel，GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES(分子克隆技术指导)，来自于METHOD IN ENZYMOLOGY s(酶学方法)系列，vol.152，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1987)；Sambrook，et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(分子克隆：实验手册)，2nd ed.，vols.1-3(1989)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(现代分子生物学操作)，Ausubel，et al.，eds，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.联合投资(1994年补编)。

如本文所用“可操作地连接”是指包括诸如启动子的第一序列和第二序列间的功能性连接，其中所述启动子序列起始并介导与所述第二序列对应的DNA的转录。通常，可操作地连接表示被连接的核酸序列是相邻的，并且当有必要将两段蛋白编码区连接时，是相邻的并在相同的阅读框中。

如本文所用，术语“植物”是指包括整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)，种子和植物细胞及其后代。如本文所用的植物细胞包括但不限于，种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用在本发明方法中的植物类别通常宽泛至可进行转化技术的高等植物类别，包括选自下述属的单子叶植物和双子叶植物：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、莲属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴豆属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、天竺葵属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、芥子属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、莨菪属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、矮牵牛属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、墨角属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、芦笋属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蝴蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽茄属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zea mays)。

如本文所用，“产量”可以包括涉及收获时每英亩谷物作物的蒲式耳量，其用谷物湿度调整(例如，玉米通常为15％)。收获时，测量谷物的谷物湿度。将调整后的谷物测试重量确定为收获时谷物湿度水平调整的每蒲式耳的磅重。

如本文所用，“多核苷酸”是指包括脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或具有天然核糖核苷酸基本特性的类似物，其中，它们在严紧杂交条件下杂交到与天然存在的核苷酸实质上相同的核苷酸序列和/或允许翻译成与天然存在的核苷酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然的或异源的结构基因或调节基因的全长或子序列。除非另有所指，所述术语是指包括指定序列及其互补序列。因此，用于稳定或用于其他原因的修饰主链的DNA或RNA是本文术语意指的“多核苷酸”。然而，包含诸如次黄嘌呤核苷的稀有碱基或诸如三苯甲基化碱基的修饰碱基的DNA或RNA(仅指出两个实例)是本文所用的术语多核苷酸。应当理解，对DNA和RNA进行的各种修饰满足本领域技术人员已知的诸多有用的用途。如本文所用的术语多核苷酸包括多核苷酸的这些化学上、酶上或代谢上修饰的形式，以及病毒和细胞(其中包括简单和复杂细胞)的DNA和RNA特征的化学形式。

本文可交换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及应用于天然存在的氨基酸聚合物。

如本文所用的“启动子”是指包括来自转录起始DNA上游的区，并且涉及RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合，从而起始转录。“植物启动子”是能在植物细胞中起始转录的启动子。示例性植物启动子包括但不限于，获自植物、植物病毒和细菌的那些启动子，所述植物病毒和细菌包含在植物细胞中表达的基因，例如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium)。实例是优选在诸如叶、根、种子、纤维质、木质部导管、管胞或厚壁组织的某些组织中起始转录的启动子。这类启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异的启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型中的表达，例如，根或叶中的维管细胞。“可诱导的”或“可调节的”启动子是环境控制下的启动子。可以通过可诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节的启动子，例如，花粉发育期间驱动表达的启动子。组织优选型启动子、细胞类型特异性启动子、发育调节型启动子和可诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。

术语“冠瘿碱合成酶多肽”是指一段或多段氨基酸序列。所述术语还包括其片段、变体、类似物、等位基因或前体(例如，前蛋白原或前蛋白)。“冠瘿碱合成酶蛋白”包括冠瘿碱多肽。除非另有所指，所述术语“冠瘿碱合成酶核酸”表示包含编码冠瘿碱合成酶多肽的多核苷酸的核酸(“冠瘿碱合成酶多核苷酸”)。

如本文所用的“重组体”是指包括细胞或载体，其已通过异源的核酸的引入而被修饰或者所述细胞来源于这种修饰细胞。因此，例如，由于有意的人类介入，重组细胞表达没有在细胞的天然(非重组)形式中发现相同形式的基因，或表达其他情况下异常表达、低表达或全然未表达的天然基因；或可以降低或消除天然基因的表达。如本文所用的所述术语“重组体”不包括由于天然存在的事件(例如，自发突变、天然转化/转导/转座)，例如没有有意的人类介入的存在的那些事件，细胞或载体的改变。

如本文所用，“重组表达盒”是重组或合成产生的具有一系列指定核酸元件的核酸构建体，其允许靶细胞中特定核酸的转录。可以将所述重组表达盒并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括其他序列、待转录的核酸和启动子。

本文可交换使用的术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”是指并入蛋白、多肽或肽(全体“蛋白”)中的氨基酸。所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非有其它限制，可以包括能如天然存在的氨基酸以相同方式发挥作用的天然氨基酸的已知类似物。

术语“选择性杂交”是指包括在严紧杂交条件下，核酸序列与指定核酸靶序列杂交的程度，可检测地大于其与非靶核酸序列和基本上排除非靶核酸杂交的程度(例如，至少为背景的两倍)。选择性杂交序列彼此通常具有至少约40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性和最优选100％序列同一性(即，互补)。

术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”是指包括，在该条件下，探针与其靶标序列杂交的程度，可检测地大于与其他序列杂交的程度(例如，至少为背景的两倍)。严紧条件是序列依赖性的，并且在不同的环境中是不同的。通过控制杂交和/或洗脱条件的严紧性，能鉴定与探针高达100％互补的靶标序列(同源探测)。可选择地，能调整严紧性条件，允许序列中的一些错配，以便检测较低程度的相似性(异源探测)。探针的长度最好是约500个核苷酸，但是长度可以有较大改变，从少于500个核苷酸至与靶序列的全长相等。

通常，严紧条件为这样的条件，在该条件中，盐浓度约少于1.5M Na离子，通常约0.01到1.0M Na离子浓度(或其他的盐)，pH为7.0到8.3并且对于短探针(例如，10到50个核苷酸)，温度至少约为30℃，且对于长探针(例如，长于50个核苷酸)，温度至少约为60℃。严紧条件也可以通过加入诸如甲酰胺或Denhardt’s的去稳定剂来实现。示例性的低严紧性条件包括在37℃用30％-35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液杂交，并且于50-55℃下在1×到2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中度严紧性条件包括于37℃在40-45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并且于55-60℃在0.5×到1×SSC中洗涤。示例性的高严紧性条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且于60-65℃在0.1×SSC中洗涤。特异性通常是杂交后洗涤的功能，决定性因素是离子强度和最后洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂合物，T_m能根据Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-84的方程式近似计算：T_m＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且L是碱基对中杂交体的长度。T_m是50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH值下)。每错配1％，T_m约降低1℃；因此，能调整T_m、杂交和/或洗涤条件以与期望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找有≥90％同一性的序列，能将T_m减小10℃。通常，选用的严紧条件比特异序列和其互补物在确定的离子强度和pH下的比热熔点(T_m)低约5℃。然而，严格的严紧条件能在比比热熔点(T_m)低1、2、3或4℃时使用杂交和/或洗涤；适度的严紧条件能在比比热熔点(T_m)低6、7、8、9或10℃时使用杂交和/或洗涤；低的严紧条件能在比比热熔点(T_m)低11、12、13、14、15或20℃时使用杂交和/或洗涤。利用上述方程、杂交和洗涤组合物以及期望的T_m，本领域技术人员应当理解，所述严紧性杂交和/或洗脱液的变化被内在地描述。如果期望的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最好增加SSC浓度以便能使用更高的温度。有关核酸杂交的广泛指导参见Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes(生化和分子生物学实验技术-核酸探针杂交)，Part I，Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays(杂交原理和核酸探针分析策略综述)，”Elsevier，New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学操作)Chapter 2 Ausubel，et al.，eds，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。除非另有所指，在本申请中，将高严紧性规定为：在65℃下在4×SSC、5×Denhardt’s(500ml水中有5g聚蔗糖(Ficoll)、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中杂交，并且于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。

如本文所用，“转基因植物”是指包括植物，在其基因组中包含异源多核苷酸。通常，所述异源多核苷酸稳定地整合进基因组中，以便将所述多核苷酸传递给连续的世代。可以将所述异源多核苷酸单独或作为重组表达盒的一部分整合进基因组。本文所用的“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，通过异源核酸的存在其基因型已被改变，所述异源核酸包括最初发生这种改变的那些转基因以及从最初转基因通过有性杂交或无性繁殖所产生的那些转基因。如本文所用的术语“转基因”不包括通过常规的植物育种方法或通过天然发生事件而改变的基因组(染色体或染色体外)，所述天然发生事件例如随机的异花授粉、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

如本文所用，“载体”是指包括用在宿主细胞转染中的核酸，并且其能被插入多核苷酸。载体通常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。

下述术语用来描述两条或多条核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗”(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分比”和(e)“基本同一性”。

如本文所用的，“参考序列”是用作序列比较基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完全的cDNA或基因序列。

如本文所用的，“比较窗”表示包括涉及多核苷酸序列的连续且指定的片段，其中，所述多核苷酸序列可以与参考序列比较，并且其中所述比较窗中的多核苷酸序列的部分与所述参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，间隙)，用于对这两条多核苷酸进行最佳比对。通常，所述比较窗的长度为至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30个、40个、50个、100个或更长。本领域技术人员应当理解，为了避免由于所述多核苷酸序列含有间隙而导致的与参照序列的高相似性，通常引入间隙罚分，并将其从匹配数中扣除。

用于比较的核苷酸和氨基酸序列比对方法在本领域内是公知的。Smith and Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482的局部同源算法(BESTFIT)，可以实施用于比较的序列的最佳比对；通过Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53的同源比对算法(GAP)；通过Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的搜索相似性方法(Tfasta和Fasta)；通过计算机执行的这些算法包括但不限于：通过Intelligenetics，Mountain View，California的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin genetics Software Package

，Version 8中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可从Genetics Computer Group(GCG

程序(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)获得)。CLUSTAL程序在Higgins and Sharp，(1988)Gene 73：237-44、Higgins and Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3、Corpet，et al.，(1988)Nucleics Res.16：10881-90、Huang，et al.，(1992)Computer Applications in the Biosciences(生物科学中的计算机应用)8：155-65以及Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31中有很好的描述。用于多重序列最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng and Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60，其与Higgins and Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53描述的方法类似，并且通过引用并入本文)。可以用于数据库相似性搜索的程序的BLAST家族包括：针对核苷酸数据库序列用于核苷酸查询序列的BLASTN、针对蛋白数据库序列用于核苷酸查询序列的BLASTX、针对蛋白数据库序列用于蛋白查询序列的BLASTP、针对核苷酸数据库序列用于蛋白查询序列的TBLASTN和针对核苷酸数据库序列用于核苷酸查询序列的TBLASTX。参见，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(现代分子生物学操作)，Chapter 19，Ausubel，et al.，eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。

GAP用Needleman and Wunsch，同上，的算法，来寻找两条全序列的比对，该比对使配对数最大化并使间隙数最小化。GAP考虑所有可能的比对和间隙位置并且用最大数量配对碱基和最少的间隙产生比对。其允许在配对碱基单元中提供间隙产生罚分和间隙延伸罚分。GAP必须利用其插入的每一个间隙的匹配的间隙产生罚分数量。如果选择的间隙延伸罚分大于0，那么对于插入的每个间隙，GAP必需另外地利用间隙长度乘以间隙延伸罚分。第10版的GCG

Wisconsin Genetics Software Package默认的间隙产生罚分值和间隙延伸罚分值，分别为8和2。间隙产生罚分和间隙延伸罚分可以表示为选自整数0-100的整数。因此，例如，间隙产生罚分和间隙延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或更大。

GAP表示最佳比对家族中的一个成员。该家族可以有很多成员，但没有其他成员具有较好的特点。GAP展示比对的四组品质数值：质量、比率、同一性和相似性。为了比对序列，所述质量最大化计量。比率是所述质量除以短片段中的碱基数。同一性百分比是实际上匹配符号的百分比。相似性百分比相似性符号的百分比。忽略跨越间隙的符号。当一对符号的评分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，进行相似性评分。用在Wisconsin Genetics Software Package

Version 10中的评分矩阵是BLOSUM62(参见，Henikoff and Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

除非另有说明，本文提供的序列同一性/相似性值是指用BLAST 2.0程序套装利用默认参数获得的(Altschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402)。

如本领域技术人员所理解的，BLAST搜索假设可以将蛋白模型化为随机序列。然而，多数真实的蛋白包含非随机序列区，其可以是同聚物区段、短周期重复或富含一个或多个氨基酸的区段。可以在不相关蛋白间比对这类低复杂区，尽管蛋白的其他区完全不相似。可以使用诸多低复杂性过滤程序以降低这类低复杂性比对。例如，可以单独使用或联合使用SEG(Wooten and Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂性过滤程序。

如本文所用，两条核酸或多肽序列情形下的“序列同一性”或“同一性”涉及所述两条序列中的残基，当在指定的比较窗内处于最大一致性比对时，所述残基是相同的。当使用的序列同一性百分比涉及蛋白时，应当认为，不相同的残基位置经常由于保守氨基酸取代而不同，其中，用具有相似化学特性的其他氨基酸残基取代(例如，电荷或疏水性)氨基酸残基，并且因此没有改变所述分子的功能特性。当序列因保守取代而不同时，可向上调整序列同一性百分比来纠正取代的保守性质。认为由于这种保守取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的方法是本领域技术人员公知的。通常这涉及将保守取代评分为部分错配而不是全部错配，由此增加序列同一性百分比。因此，例如，如果给予相同氨基酸的评分为1，给予非保守取代的评分为0，则给予保守取代的评分在0和1之间。例如，按照Meyers and Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17的算法，例如，按照PC/Gene程序(Intelligenetics，Mountain View，California)中所执行，计算保守取代评分。

如本文所用的，“序列同一性百分比”表示通过在比较窗内比较两个最佳比对序列所确定的值，其中，比较窗中的部分多核苷酸序列与参照序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，间隙)，用于对这两条序列进行最佳比对。通过确定两条序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量来产生配对位置数，以比较窗中的位置总数除配对位置数，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比，来计算百分比。

术语多核苷酸序列的“基本同一性”表示用描述的比对程序之一使用标准参数与参考序列比较，多核苷酸包含的序列具有50-100％的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，并且最优选至少95％。本领域技术人员应当认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等可以适当地调整这些数值，以便确定两段核苷酸序列所编码的蛋白的对应的同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本同一性通常表示55-100％的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％和最优选至少95％。

表明核苷酸序列基本上相同的另一个因素是严紧条件下两个分子是否彼此杂交。遗传密码的简并性允许多个氨基酸取代，其导致各种核苷酸序列编码相同的氨基酸，因此能编码相同的多肽但在严紧条件下不彼此杂交的DNA序列是可能的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码简并性产生核酸拷贝时，这可以发生。表明两段核苷酸序列基本上相同的一个因素是，第一核酸编码的多肽在免疫学上与第二核酸编码的多肽发生交叉反应。

术语肽情形下的“基本同一性”表明肽包含的序列与参考序列具有55-100％的序列同一性，针对指定的比较窗与参考序列优选至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选地，使用Needleman and Wunsch，同上，的同源比对算法进行最佳比对。表明两段肽序列基本相同的是一种肽与针对第二肽所产生的抗体发生免疫反应。因此，例如，当两段肽仅由于保守取代而不同时，肽与第二肽是基本相同的。此外，当通过非保守改变而不同时，如果抗体识别表位基本相同，则肽与第二肽可以是基本相同的。“基本相似的”肽共享上述序列，除了不相同的残基位置可以通过保守氨基酸改变而不同。

本发明公开了冠瘿碱合成酶多核苷酸和多肽。本发明新的核苷酸和蛋白的表达模式表明，它们调节氮含量，并因此在植物发育中发挥重要作用。所述多核苷酸在各种植物组织中表达。因此，多核苷酸和多肽提供操纵植物发育以改变种子和营养组织发育、发育时刻或成分的机遇。这可以用来产生具有改变的源汇(source and sink)N组合物的aa植物。

核酸

除此以外，本发明提供了RNA、DNA和其类似物的分离的核酸和/或其嵌合体，包括冠瘿碱合成酶多核苷酸。

本发明还包括在不同有机体中优化表达的多核苷酸。例如，为了在玉米植物中优化多核苷酸的表达，可以按照特异密码子偏爱性改变所述序列和按照Murray，et al，同上，改变GC含量。来自玉米植物的28个基因的玉米密码子使用列于Murray et al.，同上，的表4中。

本发明的冠瘿碱合成酶/氧化酶核酸包括分离的冠瘿碱合成酶/氧化酶多核苷酸，其包括：

(a)编码冠瘿碱合成酶/氧化酶多肽和其保守修饰与多态变体的多核苷酸；

(b)与(a)或(b)的多核苷酸至少具有70％序列同一性的多核苷酸；

(c)(a)或(b)多核苷酸的互补序列

核酸的构建

可以用(a)标准重组方法、(b)合成技术或其组合来制备本发明分离的核酸。在一些实施方案中，可以从真菌或细菌克隆、扩增或以其他方式构建本发明的多核苷酸。

所述核酸可以方便地包含本发明多核苷酸以外的序列。例如，可以向核酸插入包含一个或多个核酸内切酶限制性位点的多克隆位点，以帮助多核苷酸的分离。同样，可以插入可翻译的序列，以帮助本发明翻译的多核苷酸的分离。例如，六-组氨酸标记序列提供了纯化本发明蛋白的便利方法。任选地，本发明核酸除多核苷酸序列之外，可以是用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的载体、适配子或连接子。可以将其他序列添加至这类克隆和/或表达序列，用于优化它们在克隆和/或表达中的功能、帮助多核苷酸的分离或用于改进多核苷酸引入细胞。通常，本发明核酸的长度短于本发明它的多核苷酸长度，短于20kb碱基对，通常短于15kb，并且常常短于10kb。克隆载体、表达载体、适配子和连接子的使用在本领域内是公知的。示例性核酸包括下述这些载体：M13、λZAP Express、λZAP II、λgt 10、λgt 11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASHII、λEMBL3、λEMBL 4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORT I、pSPORT II、pOPRSVI CAT、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。用于本发明的任选载体包括但不限于λZAP II和pGEX。各种核酸的描述参见，例如，Stratagene Cloning Systems，Catalogs 1995，1996，1997(La Jolla，CA)和Amersham Life Sciences，Inc，Catalog’97(Arlington Heights，IL)。

构建核酸的合成方法

也可以通过直接化学合成法制备本发明分离的核酸，所述方法例如Narang，et al.，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9的磷酸三酯法；Brown，et al.，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51的磷酸二酯法；Beaucage，et al.，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62的二乙基亚磷酰胺法；Beaucage，et al.，同上，描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如，如Needham-VanDevanter，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-68中所描述的用自动合成仪，以及美国专利第4,458,066号的固相支持法。化学合成法通常产生单链寡核苷酸。这可以通过与互补序列的杂交或通过以单链为模板用DNA聚合酶聚合被转换成双链DNA。本领域技术人员应当认识到，尽管DNA的化学合成将序列限制为约100个碱基，但是可以通过较短序列的连接获得较长的序列。

UTR和密码子偏爱性

通常，已经发现RNA的5’非编码区或非翻译区(5’UTR)中的特定序列元件调节翻译效率。正向序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond，et al.，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。负向元件包括稳定的分子内5’UTR茎环结构(Muesing，et al.，(1987)Cell 48：691)和AUG序列或5’UTR中合适的AUG后的短可读框(Kozak，同上，Rao，et al.，(1988)Mol.andCell.Biol.8：284)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列翻译的5’UTR区和/或3’UTR区。

而且，可以修饰本发明多核苷酸的多肽编码片段，以改变密码子选择。可以利用改变的密码子选择，从而改变翻译效率和/或优化用于在所需的宿主中表达的编码序列或优化用于在玉米中表达的异源序列中的密码子选择。可以使用诸如从Wisconsin大学Genetics Computer Group获得的“密码偏爱性(Codon Preference)”的商购软件套装，统计分析本发明的多核苷酸编码区中的密码子选择。参见，Devereaux，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395；或MacVector 4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。因此，本发明提供了至少为本发明多核苷酸之一的编码区的密码子选择频率特征。可以用来确定密码子选择频率的多核苷酸数(每个氨基酸3个核苷酸)可以是从3至如本发明所提供的多核苷酸数的任意整数。任选地，所述多核苷酸是全长序列。用于统计分析的示例性序列数量可以至少为1、5、10、20、50或100。

序列改组

本发明提供了使用本发明的多核苷酸进行序列改组的方法和由此产生的组合物。序列改组描述于PCT公开第96/19256号。还参见，Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-9；和Zhao，et al.，(1998)Nature Biotech 16：258-61。通常，序列改组提供了用于产生具有所需特性，可以被选择或筛查的多核苷酸文库的方法。重组多核苷酸文库由相关的序列多核苷酸群体产生，所述相关的序列多核苷酸群体包含具有大量的序列同一性，且在体外或体内能被同源重组的序列区、。序列重组多核苷酸群体包括具有所需或有利特征的多核苷酸亚群体并且其可以通过适合的选择和筛查方法被选择。所述特征可以是能在筛查系统中被选择或检测的任何性质或特性，并且可以包括下述性质：编码的蛋白、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白结合元件等，诸如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施方案中，选择的特征是高于如本文所提供的野生型蛋白的改变的K_m和/或K_cat。在其他的实施方案中，由序列改组产生的蛋白或多核苷酸比非改组的野生型多核苷酸具有更大的配体结合亲和力。在其他的实施方案中，与非改组的野生型多核苷酸比较，由序列改组产生的蛋白或多核苷酸具有改变的最佳pH。这些性质的增加可以至少是野生型值的110％、120％、130％、140％或高于150％。

重组表达盒

本发明进一步提供了包含本发明核酸的重组表达盒。编码本发明所需多核苷酸的核酸序列，例如编码足够长的多肽以编码本发明的活性蛋白的cDNA或基因组序列，能用来构建重组表达盒，其可以被引入所需的宿主细胞中。重组表达盒通常包含可操作地连接于转录起始调节序列的本发明的多核苷酸，所述转录起始调节序列在诸如转化的植物的组织的预期宿主细胞中指导所述多核苷酸的转录。

例如，植物表达载体可以包括(1)在5’和3’调节序列转录控制下的克隆的植物基因和(2)显性的选择标记。如果需要，这类植物表达载体还可以含有启动子调节区(例如，赋予诱导型或组成型表达、环境调节或发育调节表达、细胞或组织特异性/选择性表达的区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

可以使用在再生植物的所有组织中指导本发明多核苷酸表达的植物启动子片段。这类启动子在本文中被称为“组成型”启动子，并且在多数环境条件和发育或细胞分化状态下具有活性。组成型启动子的实例包括的来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1’启动子或2’启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利第5,683,439号)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、如描述于Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-2中的来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；水稻激动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell 163-171)；泛素(Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89)；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8)；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-30)和玉米H3组蛋白(Lepetit，et al.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85和Atanassvoa，et al.，(1992)Plant Journal 2(3)：291-300)；如描述于PCT申请第WO 96/30530号中的ALS启动子和来自本领域技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区。对于本发明而言，泛素是用于在单子叶植物中表达的优选启动子。

可选择地，植物启动子可以在特定的组织中或在更精确的环境或发育控制下以其他方式指导本发明多核苷酸的表达。这类启动子在本文中被称为“诱导型”启动子。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件包括病原体攻击、厌氧条件或光的存在。诱导型启动子的实例是由缺氧或寒冷胁迫诱导的Adh1启动子、由热胁迫诱导的Hsp70启动子和由光诱导的PPDK启动子。

发育控制下的启动子实例包括仅起始转录或优选在诸如在叶、根、果实、种子或花的某些组织中的启动子。启动子的操作还可以取决于其在基因组中的位置而改变。因此，在某些位置中，诱导型启动子可以变成完全或部分地组成型。

如果需要多肽表达，在多核苷酸编码区的3’端通常需要包括聚腺苷酸化区。所述聚腺苷酸化区可以来自各种植物基因，或来自T-DNA。例如，待添加的3’端序列可以来自胭脂碱合成酶或冠瘿碱合成酶基因，或可选择地，来自另一个植物基因或较低优选来自任何其他的真核生物基因。这类调节元件的实例包括但不限于，诸如根瘤农杆菌胭脂碱合成酶(nos)基因的那些3’终止子和/或聚腺苷酸化区(Bevan，et al.，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，et al.，(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-50和An，et al.，(1989)Plant Cell 1：115-22)和CaMV 19S基因(Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-72)。

可以将内含子序列添加至部分编码序列的5’非翻译区或编码序列，以增加在胞液中所积累的成熟信使的量。在植物和动物表达构建体的转录单元中包含可剪接的内含子已经被证实在mRNA和蛋白水平上增加基因表达高达1000倍(Buchman and Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis，et al.，(1987)Genes Dev.1：1183-200)。当置于转录单元5’端附近时，这类基因表达的内含子增强通常是最大的。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子在本领域内是已知的。通常参见，THE MAIZE HANDBOOK(玉米手册)，Chapter 116，Freeling and Walbot，eds.，Springer，New York(1994)。

植物信号序列包括但不限于，引导蛋白至植物细胞的细胞外基质的编码信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos，et al.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900)，诸如皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)扩张基因(DeLoose，et al.，(1991)Gene 99：95-100)；引导蛋白至液泡的信号肽，诸如甘薯储藏蛋白(sporamin)基因(Matsuka，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834)和大麦血凝素基因(Wilkins，et al.，(1990)Plant Cell，2：301-13)；引起蛋白分泌的信号肽，诸如PRIb中的信号肽(Lind，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53)或大麦α淀粉酶(BAA)中的信号肽(Rahmatullah，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：119，并通过引用并入本文)或引导蛋白至质体的信号肽，诸如油菜籽烯酰基ACP还原酶中的信号肽(Verwaert，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202)，其都用于本发明中。将所述的大麦α淀粉酶信号序列融合于冠瘿碱合成酶多核苷酸是用于在玉米中本发明表达的优选构建体。

包含来自本发明多核苷酸序列的载体通常包含标记基因，其赋予植物细胞选择表型。通常，选择标记基因用合适的基因编码抗生素抗性，包括编码抗生素壮观霉素抗性的基因(例如，aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码除草剂抗性以抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的功能而发挥作用的基因，尤其是磺酰脲类除草剂(例如，含有导致这类抗性突变，尤其是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对以抑制谷氨酰胺合酶的功能而发挥作用的除草剂抗性的基因，诸如膦丝菌素或basta(例如，bar基因)或本领域内已知的其他这类基因。所述bar基因编码除草剂basta抗性，并且所述ALS基因编码除草剂氯磺隆抗性。

用于在高等植物中基因表达的典型载体在本领域内是公知的，并且包括由Rogers，et al.，(1987)Meth.Enzymol.153：253-77描述的来自根瘤农杆菌瘤诱导(Ti)质粒的载体。这些载体是植物整合载体，其中转化时，所述载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。用于本文中的示例性根瘤农杆菌载体是Schardl，et al.，(1987)Gene 61：1-11和Berger，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6中的质粒pKYLX6和pKYLX7。本文的另一个有用的载体是可从CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)获得的质粒pBI101.2。

宿主细胞中蛋白的表达

使用本发明的核酸，我们可以在诸如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或优选植物细胞的重组工程细胞中表达本发明的蛋白。所述细胞在非天然条件下(例如，在数量、组合物、位置和/或时间上)产生蛋白，因为通过人为介入这样做所述细胞已经被遗传改变了。

预计本领域技术人员知晓可用于编码本发明蛋白的核酸的表达的多种表达系统。没有试图详细描述用于在原核生物和真核生物中表达蛋白的已知的各种方法。

简单总结，编码本发明蛋白的分离的核酸的表达通常可以通过例如，将DNA或cDNA可操作地连接于启动子(其为组成型或诱导型)，随后将其并入表达载体而实现。所述载体适于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体包含转录终止子和翻译终止子、起始序列和用于调节编码本发明蛋白的DNA表达的启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建最低限度包含指导转录的诸如泛素的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子的表达载体。将组成型启动子归为提供一系列组成型表达。因此，一些是弱组成型启动子，并且其他是强组成型启动子。通常，“弱启动子”意即驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”意即在约1/10,000转录本至约1/100,000转录本至约1/500,000转录本的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以“高水平”或约1/10转录本至约1/100转录本至约1/1,000转录本表达。

本领域技术人员应当认识到，可以在没有降低本发明蛋白的生物活性下，对其进行修饰。可以进行促进克隆、表达或将靶分子并入融合蛋白的一些修饰。这类修饰是本领域技术人员所公知的，并且包括例如，在氨基端添加蛋氨酸，从而提供起始位点或将其他氨基酸(例如，多聚His)置于任一端以产生便利定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。

原核生物中的表达

原核细胞可以用作表达宿主。原核生物最频繁地以各种大肠杆菌(E.coli)菌株为代表；然而，也可以使用其他微生物菌株。常用的原核控制序列，本文将其定义为包括用于转录起始的启动子，任选地带有操纵基因，以及核糖体结合序列，包括如下述一样常用的启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang，et al.，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，et al.，(1980)Nucleic Acids Res.8：5057)和源于λ的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，et al.，(1981)Nature 292：128)。将选择标记包括于在大肠杆菌中转染的DNA载体中，也是有用的。这种标记的实例包括指定抗氨苄青霉素、四环素或氯霉素抗性的基因。

选择载体以允许将目的基因引入合适的宿主细胞。细菌载体通常是质粒或噬菌体来源的。合适的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则用质粒载体DNA转染细菌细胞。用枝条孢杆菌种类(Bacillus sp.)和沙门氏菌(Salmonella)，可得到表达本发明蛋白的表达系统(Palva，et al.，(1983)Gene 22：229-35；Mosbach，et al.，(1983)Nature 302：543-5)。来自Pharmacia的pGEX-4T-1质粒载体是用于本发明的优选E.coli表达载体。

真核生物中的表达

多种真核表达系统，例如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞，对本领域技术人员而言是已知的。如下文简要解释的，本发明能在这些真核系统中表达。在一些实施方案中，如下文所讨论的，用转化的/转染的植物细胞作为产生本发明蛋白的表达系统。

在酵母中合成异源蛋白是公知的。Sherman，et al.，METHODS IN YEAST GENETICS(酵母遗传学方法)，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是得到很好验证的工作，描述了可用于在酵母中产生蛋白的各种方法。两种广泛应用的产生真核蛋白的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。在酿酒酵母和毕赤酵母中表达的载体、菌株和方案是本领域已知的，并且可从商业供应商(例如，Invitrogen)获得。适当的载体通常有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸盐激酶或醇氧化酶在内的，和复制起点、终止序列和及所需要的序列等。

一旦表达，就能通过裂解细胞和对该裂解产物和沉淀应用标准蛋白分离技术从酵母中分离本发明的蛋白。可以用免疫印迹技术或其他标准免疫测定技术的放射性免疫测定来完成纯化过程的监测。

编码本发明蛋白的序列也能连接到各种表达载体中，用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物。哺乳动物细胞系统通常为单层细胞形式，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮物。本领域内已开发了多种能表达完整蛋白的合适宿主细胞系，并且所述细胞系包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体包括表达控制序列，例如复制起点、启动子(例如，CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸盐激酶)启动子)、增强子(Queen，et al.，(1986)Immunol.Rev.89：59)、和必需的加工信息位点，例如，核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如，SV40巨大T Ag PolyA添加位点)和转录终止序列。用来产生本发明蛋白的其他动物细胞可以从例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤(American Type Culture Collection of Cell Lines and Hybridomas)(7th ed.，1992)获得。

用于在昆虫细胞中表达本发明蛋白的合适的载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、粘虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系例如，施耐德(Schneider)细胞系(参见，例如，Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65)。

同用酵母一样，当使用高等动物或植物宿主细胞时，通常将聚腺苷酸或转录终止序列并入载体中。终止序列的实例是源于牛生长激素基因的聚腺苷酸序列。还可以包括精确剪接转录物的序列。剪接序列的实例是来源于SV40的VP1内含子(Sprague，et al.，(1983)J.Virol.55：773-781)。此外，可以将控制宿主细胞中复制的基因序列并入载体中，例如，见于牛乳头状瘤病毒型载体中的那些序列(Saveria-Campo，“Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector(牛乳头状瘤病毒病毒DNA真核生物克隆载体)，”in DNA CLONING：A PRACTICAL APPROACH，vol.II，Glover，ed.，IRL Press，Arlington，VA，pp.213-38(1985))。

此外，可以用置于合适的植物表达载体中的冠瘿碱合成酶基因转化植物细胞。然后可以从植物愈伤组织分离多肽或转化的细胞可以用来再生转基因植物。可以收获这些转基因植物，并且可以对合适的组织(例如，种子或叶)进行大规模的蛋白提取和纯化操作。

植物转化方法

用于将外源基因引入植物中的多种方法是已知的，并且其可以用来将冠瘿碱合成酶多核苷酸插入植物宿主，包括生物的和物理的植物转化方案。参见，例如，Miki，et al.，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants(将外源DNA引入植物中的方法)，”METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY中，Glick and Thompson，eds.，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)。方法选择随着宿主植物而改变，并且包括诸如磷酸钙的化学转染方法、诸如农杆菌的微生物介导的基因转移(Horsch，et al.，(1985)Science 227：1229-31)、电穿孔、显微注射和弹道轰击。

用于植物细胞或组织转化和植物的再生的表达盒和载体及体外培养方法是已知的且可获得的。参见，例如，Gruber，et al.，“Vectors for Plant Transformation(植物转化载体)，”METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY中，同上，pp.89-119。

通过一种或多种通常用来直接递送进细胞中的技术可以将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。这类方案可以随着有机体类型、细胞类型、植物类型或植物细胞类型，即，基因修饰靶向的单子叶植物或双子叶植物而改变。转化植物细胞的合适的方法包括显微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：320-334和美国专利第6,300,543号)、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道粒子加速(参见，例如，Sanford，et al.，美国专利第4,945,050号；WO 91/10725和McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926)。还参见，Tomes，et al.，Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bormbardment(通过微粒轰击将DNA直接转移进完整的植物细胞中)，pp.197-213 Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methods中.eds.Gamborg and Phillips；Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995；美国专利第5,736,369号(分生组织)；Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；WO 91/10725(玉米)；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839和Gordon-Kamm，et al.，(1990)Plant Cell 2：603-618(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren and Hooykaas，(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet，et al.，(1985)In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman，et al.，pp.197-209 Longman，NY(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418；和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(触须介导的转化(whisker-mediated transformation))；美国专利第5,693,512号(超声处理)；D’Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou and Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotech.14：745-750；农杆菌介导的玉米转化(美国专利第5,981,840号)；碳化硅晶须方法(Frame，et al.，(1994)Plant J.6：941-948)；激光方法(Guo，et al.，(1995)Physiologia Plantarum 93：19-24)；超声处理方法(Bao，et al.，(1997)Ultrasound in Medicine & Biology 23：953-959；Finer and Finer，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah，et al.，(2001)J Exp Bot 52：1135-42)；聚乙二醇方法(Krens，et al.，(1982)Nature 296：72-77)；单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体可以用电穿孔(Fromm，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-5828)和显微注射(Crossway，et al.，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)转化，所有这些文献通过引用并入本文。

农杆菌介导的转化

用于将表达载体引入植物中的最广泛使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物致病土壤细菌，其在遗传学上转化植物细胞。分别为根瘤农杆菌和发根农杆菌的Ti质粒和Ri质粒携带负责植物遗传转化的基因。参见，例如，Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1。对农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移的方法的描述提供于Gruber，et al.，同上；Miki，et al.，同上和Moloney，et al.，(1989)Plant Cell Reports 8：238。

类似地，可以将基因插入到分别来自根瘤农杆菌或发根农杆菌的Ti质粒或Ri质粒的T-DNA区。因此，可以按上述用这些质粒构建表达盒。已知多个控制序列当其与异源编码序列连接且被转化进入宿主有机体时，在基因表达中表现出关于原始编码序列的组织/器官特异性的忠实性。参见，例如，Benfey and Chua，(1989)Science 244：174-81。尤其适用于这些质粒中的控制序列是用于各种靶植物中基因的组成型叶特异性表达的启动子。其他有用的控制序列包括来自胭脂碱合成酶基因(NOS)的启动子和终止子。存在于质粒pARC2中的NOS启动子和终止子可从美国典型培养物保藏中心且保藏号为ATCC 67238处获得。如果使用这类系统，还必须存在来自Ti质粒或Ri质粒的毒性(vir)基因，其或者伴随T-DNA部分存在，或者通过其中vir基因存在于单独的载体的二元系统存在。本文中使用的这类系统、载体和转化植物细胞的方法描述于美国专利第4,658,082号；美国专利申请系列第913,914号，提交于1986年10月1日，其在公布于1993年11月16日的美国专利第5,262,306号中引用和Simpson，et al.，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(也被‘306专利引用)中，所有的文献以其整体通过引用并入本文。

一旦构建完，可以将这些质粒置于发根农杆菌或根瘤农杆菌中，并且这些载体用来转化通常易受镰刀霉(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染的细胞或植物种。本发明还可以考虑数种其他转基因植物包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、苜蓿、甘蓝、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜、柳枝稷、芒属植物、黑小麦和甜椒。根瘤农杆菌或发根农杆菌的选择取决于因而被转化的植物。通常根瘤农杆菌用于转化的优选有机体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如，百合目(Liliales)和天南星目(Arales)中的某些成员)易受根瘤农杆菌感染。发根农杆菌也具有广泛的宿主范围，包括多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。目前单子叶植物转化也获得一些成功。EP专利申请系列第604 662 A1号公开了用农杆菌使用未成熟胚盾片转化单子叶植物的方法。Ishida，et al.讨论了通过将未成熟胚暴露于根瘤农杆菌转化玉米的方法(Nature Biotechnology 14：745-50(1996))。

一旦转化完，这些细胞可以用来再生转基因植物。例如，可以通过使植物受伤，然后将载体引入受伤位点使用这些载体感染整个植物。可以使植物的任何部分受伤，包括叶、茎和根。可选择地，可以用这些载体接种诸如子叶组织或叶盘的外植体形式的植物组织，并在促进植物再生的条件下培养。通过用含有编码伏马菌素降解酶的基因的发根农杆菌或根瘤农杆菌接种植物组织而转化的根或枝条，通过体细胞胚发生或器官发生，可以用作再生为伏马菌素抗性转基因植物的植物组织源。这些再生植物组织方法的实例公开于Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40；美国专利第4,658,082号；Simpson，et al.，同上；和美国专利申请系列第913,913和913,914号，两者都提交于1986年10月1日，被1993年11月16日的美国专利第5,262,306号引用。所有公开通过引用并入本文。

直接基因转移

尽管事实是农杆菌介导转化的宿主范围是广泛的，但是一些主要的谷类作物物种和裸子植物通常不服从该基因转移模式，尽管最近在水稻中已经获得了一些成功(Hiei，et al.，(1994)The Plant Journal 6：271-82)。已经开发出共同被称为直接基因转移的数种植物转化方法，作为农杆菌介导的转化的备选方案。

植物转化的通常适用方法是微弹介导的转化，其中DNA被测量约为1-4μm的微弹表面携带。用将所述微弹加速至300-600m/s足以穿过植物细胞壁和膜的速度的弹道设备将表达载体引入植物组织(Sanford，et al.，(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299；Sanford，(1990)Physiol.Plant 79：206 and Klein，et al.，(1992)Biotechnology 10：268)。

用于将DNA物理递送进植物中的另一个方法是靶细胞的超声处理，如Zang，et al.，(1991)BioTechnology 9：996中所描述的。可选择地，脂质体或球状质体(spheroplast fusions)已经用于将表达载体引入植物。参见，例如，Deshayes，et al.，(1985)EMBO J.4：2731和Christou，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3962。用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚L鸟氨酸将DNA直接摄入原生质体，也已有报道。参见，例如，Hain，et al.，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161和Draper，et al.，(1982)Plant Cell Physiol.23：451。

还描述了原生质体和整个细胞和组织的电穿孔。参见，例如，Donn，et al.，(1990)in Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53；D’Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-505和Spencer，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61。

调节转基因植物中冠瘿碱的合成和分解

提供了产生和降解诸如本发明的冠瘿碱的富含N的化合物的方法。通过向植物提供冠瘿碱合成酶多肽可以实现本发明的冠瘿碱水平的提高。通过将编码冠瘿碱合成酶多肽的氨基酸序列引入植物、通过将编码冠瘿碱合成酶多肽的的核苷酸序列引入植物，可以提供冠瘿碱合成酶多肽。

如本文其他地方所讨论的，用于将多肽提供给植物的本领域已知的诸多方法包括但不限于，将多肽直接引入植物、将编码具有冠瘿碱合成酶或氧化酶活性的多肽的多核苷酸构建体直接引入植物(瞬时地或稳定地)。还应当认识到，本发明方法可以使用在转化的植物中不能指导蛋白或RNA表达的多核苷酸。因此，通过改变编码冠瘿碱合成酶多肽的基因或它的启动子可以增加冠瘿碱多肽的水平和/或活性。参见，例如，Kmiec，美国专利第5,565,350号；Zarling，et al.，PCT/US93/03868。

植物中增强的氮应答

作为阴离子的硝酸盐是对抗不利的电化电势被吸收的。在美国的中西部经常发生的，在灌溉和施肥良好的土壤中，不是从土壤中硝酸盐的吸收而是它的同化作用可以受限(Robinson，et al.，(1991)Plant Cell and Environment 14：77-86)。当土壤中可得到过剩的N时，可以利用少于4％的根系统以满足植物所有的N需求。当N在土壤中受限时，该部分根系统增加至稍高于10％(Robinson，et al.，1991)。当植物的N需求超过土壤中它的可利用量，摄入量等于可利用量，而当可利用量超过需求时，摄入量等于需求量(Jeuffroy，et al.，(2002)Journal of Experimental Botany 53：809-823)。

根细胞中的硝酸盐流入伴随流出，这是有利的，因为细胞内部是带负电荷的，并且作为阴离子的硝酸盐是逆电化学梯度被吸收的。随着根表面周围硝酸盐浓度的增加，流出显著增高，占有吸收的总硝酸盐高达30％(Volk，(1997)Plant Science(Shannon)123：1-7)。这提示了硝酸盐从根的流失构成N利用的瓶颈。为了持续从土壤中摄入硝酸盐，必须通过还原和同化为氨基酸然后是蛋白，耗尽细胞中硝酸盐池，这大多数发生在叶中。

不易控制诸如玉米的作物植物中先存的新陈代谢体系，从而为改进的N利用操纵做准备。引入不同于N利用的先存机制的新机制提供了改进植物中N利用效率的有吸引力靶标。表达了用于植物中冠瘿碱合成和分解的基因，并评价它们对N利用效率的影响，氨基酸-酮酸轭合物，冠瘿碱提供了改变N位置而不消耗任何能量的新方式，因为产生它们所使用的NADH在它们的分解上恢复。最感兴趣的冠瘿碱是含有高浓度N的冠瘿碱。章鱼碱和胭脂碱两种类型，由于它们由富含N的氨基酸组成，因此最适于本发明(Winans，1992)。冠瘿碱形成基因的表达为在植物细胞中隔离附加的N提供了有利途径，其通过产生更有利于硝酸盐持续吸收的电化电势，可以帮助降低硝酸盐从根回流至土壤。由于一旦产生，植物细胞不能代谢这些化合物，通过表达分解它们的细菌酶，可以在选择的指定组织或细胞中利用它们。

1.基于多核苷酸的方法：

在本发明的一些实施方案中，用能表达编码本发明冠瘿碱合成酶/氧化酶多肽的多核苷酸的表达盒转化植物。如本文所用的，术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。来自DNA分子的蛋白或多肽的“表达”或“产生”是指编码序列的转录和翻译，以产生蛋白或多肽，而来自RNA分子的蛋白或多肽的“表达”或“产生”是指RNA编码序列的翻译，以产生蛋白或多肽。

下文给出正调节冠瘿碱合成酶和冠瘿碱氧化酶多肽表达的多核苷酸的实例。

iv.调节根发育

提供了调节植物中根发育的方法。“调节根发育”意指，与对照植物比较时，植物根发育中的任何改变。根发育的这些改变包括但不限于，初生根生长速率的改变、新鲜根重量的改变、侧根和不定根形成程度的改变、脉管系统的改变、分生组织发育改变或径向膨胀的改变。

提供了调节植物中根发育的方法。所述方法包括调节植物中冠瘿碱的水平。在一个方法中，给植物提供了本发明的冠瘿碱合成酶和氧化酶序列。在另一个方法中，通过向植物中引入包含本发明的冠瘿碱合成酶和氧化酶序列的多核苷酸、调节冠瘿碱水平并据此修饰根发育，来提供冠瘿碱新陈代谢核苷酸序列。在其他的方法中，引入植物中的冠瘿碱新陈代谢核苷酸构建体稳定地并入植物基因组。

如本文所用的，“根生长”包括，在单子叶植物和双子叶植物中，在根发育的不同阶段，组成根系统的不同部分的所有生长方面。应当理解，根生长的增强起因于一种或多种其部分生长的增强，所述部分包括初生根、侧根、不定根等。

检测根系统中这类发育改变的方法在本领域内是已知的。参见，例如，美国专利申请公开第2003/0074698号和Werner，et al.，(2001)PNAS 18：10487-10492，通过引用将两者并入本文。

如上述所讨论，本领域技术人员可以识别用于调节植物根发育的合适启动子。本实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根优选的启动子。在本文的其他地方已经公开了示例性根优选的启动子。

v.调节枝条和叶发育

还提供了调节植物枝条和叶发育的方法。“调节枝条和/或叶发育”意指植物枝条和/或叶发育中的任何改变。在枝条和/或叶发育中的这种改变包括但不限于，枝条分生组织发育中的改变、叶数量的改变、叶大小的改变、叶和茎维管组织的改变、节间长度的改变和叶衰老的改变。如本文所用的，“叶发育”和“枝条发育”包括在单子叶植物和双子叶植物中在叶和枝条的不同发育阶段，分别组成叶系统和枝条系统的不同部分的所有生长方面。检测枝条和叶系统中这种发育改变的方法在本领域内是已知的。参见，例如，Werner，et al.，(2001)PNAS 98：10487-10492和美国专利申请公开第2003/0074698号，通过引用将上述每一篇并入本文。

调节植物枝条和/或叶发育的方法包括，调节本发明的冠瘿碱合成酶和氧化酶多肽。在一个实施方案中，提供了本发明的冠瘿碱合成酶和氧化酶序列。在其他实施方案中，通过向植物中引入包含本发明冠瘿碱合成酶和氧化酶核苷酸序列的多核苷酸，表达该冠瘿碱新陈代谢序列并且据此修饰枝条和/或叶发育，来提供冠瘿碱合成酶和氧化酶核苷酸序列。在其他实施方案中，引入植物中的冠瘿碱合成酶核苷酸构建体稳定地并入该植物的基因组。

在具体的实施方案中，通过增加植物中冠瘿碱合成酶多肽的水平和/或活性，调节枝条或叶发育。冠瘿碱活性的增加能导致枝条和/或叶发育中的至少一种或多种下述改变，包括但不限于，当与对照植物比较时，减少的叶数量、减少的叶面积、减少的维管、更短的节间部和妨碍生长和迟缓的叶衰老。

如上文讨论，本领域技术人员可以识别用于调节植物枝条和叶发育的合适启动子。本实施方案中示例性的启动子包括组成型启动子、枝条优选启动子、枝条分生组织优选启动子和叶优选启动子。本文其他地方公开了示例性的启动子。

增加植物冠瘿碱活性和/或水平导致更短的节间部和妨碍生长。因此，发现本发明方法在产生矮小植物中的用途。此外，如上述，植物中冠瘿碱活性的调节调节根和枝条生长。因此，本发明进一步提供了提供了改变根/枝条比率的方法。通过降低植物中冠瘿碱合成酶或冠瘿碱氧化酶多肽的水平和/或活性，可以进一步调节枝条或叶发育。

因此，本发明还提供了当与对照植物相比时枝条和/或叶发育受到调节的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有水平/活性增加的本发明的冠瘿碱合成酶多肽。在其他的实施方案中，本发明的植物具有水平/活性降低的本发明的冠瘿碱合成酶和冠瘿碱氧化酶多肽。

vi调节生殖组织发育

提供了调节生殖组织发育的方法。在一个实施方案中，提供了调节植物花发育的方法。“调节花发育”意指当与冠瘿碱合成酶多肽的活性或水平不受调节的对照植物比较时植物生殖组织结构的任何改变。“调节花发育”进一步包括当与冠瘿碱合成酶多肽的活性或水平不受调节的对照植物比较时植物生殖组织发育发生时刻的任何改变(即，推迟的或加速的花发育发生时刻)。宏观的改变可以包括大小的改变、形状的改变、生殖器官的数量或位置改变、这些结构形成的发育时间周期的改变或在环境胁迫时期维持或继续通过开花过程能力的改变。微观的改变可以包括组成生殖器官的细胞类型或形状的改变。

调节植物花发育的方法包括调节植物中冠瘿碱合成酶和氧化酶活性。在一种方法中，提供了本发明的冠瘿碱合成酶和氧化酶序列。通过向植物中引入包含本发明冠瘿碱合成酶和氧化酶核苷酸序列的多核苷酸，表达该冠瘿碱合成酶和氧化酶序列并且据此修饰花发育，来提供冠瘿碱合成酶和氧化酶核苷酸序列。在其他实施方案中，引入植物中的冠瘿碱合成酶和氧化酶核苷酸构建体稳定地并入该植物的基因组。

在具体的方法中，通过增加植物中冠瘿碱合成酶多肽的水平或活性，调节花发育。冠瘿碱活性的增加能导致花发育中的至少一种或多种下述改变，包括但不限于，当与对照植物比较时，延迟的花期、减少的花数量、部分雄性不育和降低的结籽率。诱导延迟的花期或抑制花期可以用来增加诸如苜蓿的饲料作物的产量。检测花发育这类发育改变的方法在本领域内是已知的。参见，例如，Mouradov，et al.，(2002)The Plant Cell S111-S130，通过引用并入本文。

如上文讨论，本领域技术人员可以识别用于调节植物花发育的合适启动子。该实施方案中示例性的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、枝条优选启动子和花序优选启动子。

还提供了使用本发明的冠瘿碱合成酶和氧化酶序列，以增加氮利用效率的方法。所述方法包括在植物或诸如根、枝条、表皮细胞等植物部分中增加冠瘿碱合成酶和氧化酶序列的活性。

如上文讨论，本领域技术人员可以识别用于操纵冠瘿碱表达的合适启动子。该实施方案中示例性的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子和根或枝条或叶优选启动子。

目的基因反应商业市场和作物发育中涉及的那些兴趣。目的作物和市场改变了，并且随着发展中国家打开国际市场，也出现了新的作物和技术。此外，随着我们对诸如产量和杂种优势增加的农艺学性状和特征的了解，用于转化的基因选择相应地发生变化。通常的目的基因分类包括，例如，诸如锌指的涉及信息的那些基因、诸如激酶的涉及通讯的那些基因和诸如热激蛋白的涉及看家的那些基因。转基因更具体的分类例如包括，编码重要农艺学性状的基因、编码昆虫抗性的基因、编码疾病抗性的基因、编码除草剂抗性的基因、编码不育性的基因、编码谷物特征的基因和编码商业产物的基因。目的基因通常包括，涉及油、淀粉、碳水化合物或营养新陈代谢的那些基因以及影响核大小、蔗糖负载等的那些基因。

在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以用来与多种目的多核苷酸序列的组合(叠加)，以产生具有所需表型的植物。产生的组合可以包括多拷贝的任何一种或多种目的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以和任何基因或基因组合叠加，从而产生具有各种所需性状组合的植物，包括但不限于，动物饲养所需的性状，诸如高油基因(例如，美国专利第6,232,529号)；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美国专利第5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409号)；大麦高赖氨酸(Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO 98/20122)和高蛋氨酸蛋白(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359和Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增强的消化性(例如，修饰的储存蛋白(美国专利申请系列第10/053,410号，提交于2001年11月7日)和硫氧还蛋白(美国专利申请系列第10/005,429号，提交于2001年12月3日))，通过引用将上述公开并入本文。也可以将本发明的多核苷酸与昆虫抗性、疾病抗性或除草剂抗性所需的性状叠加(例如，苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(美国专利第5,366,892、5,747,450、5,737,514、5723,756、5,593,881号，Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109)；血凝素(Van Damme，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马菌素解毒基因(美国专利第5,792,931号)；无毒性和疾病抗性基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089)；引起除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，诸如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂诸如膦丝菌素或basta(例如，bar基因)和草甘膦抗性(EPSPS基因))和加工或工艺产品所需的性状，诸如高油(例如，美国专利第6,232,529号)；修饰的油(例如，脂肪酸去饱和基因(美国专利第5,952,544号、WO 94/11516))；修饰的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利第5.602,321号；β酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酸辅酶A还原酶(Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基脂肪酸酯(PHAs)的表达)，通过引用将上述公开的内容并入本文。还能将本发明的多核苷酸与影响农艺学性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状例如，雄性不育(例如，参见，美国专利第5,583,210号)、茎强度、花期或转化技术性状，例如，细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619、WO 00/17364、WO 99/25821)。通过引用将上述公开的内容并入本文。

在一个实施方案中，目的序列提高植物生长和/或作物产量。例如，目的序列包含产生改良的初生根系统或侧根系统的农艺学上重要的基因。这类基因包括但不限于，营养/水运输体和生长诱导体。这类基因的实例包括但不限于玉米质膜H+-ATPase(MHA2)(Frias，et al.，(1996)Plant Cell 8：1533-44)；AKT1，拟南芥(Arabidopsis)中钾摄入机构的组分(Spalding，et al.，(1999)J Gen Physiol 113：909-18)；在根顶端细胞中激活细胞分裂周期的RML基因(Cheng，et al.，(1995)Plant Physiol 108：881)；玉米谷氨酰胺合酶基因(Sukanya，et al.，(1994)Plant Mol Biol 26：1935-46)和血红素(Duff，et al.，(1997)J.Biol.Chem 27：16749-16752，Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol 114：493-500及其中设置的参考文献)。目的序列也可以用于表达基因的反义核苷酸序列，其负向影响根发育。

此外，除了使用传统的育种方法，诸如油、淀粉和蛋白含量的农艺学上重要的性状可以被遗传改变。修饰包括增加油酸、饱和油和不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸、还有修饰淀粉。Hordothionin蛋白修饰描述于美国专利第5,703,049、5,885,801、5,885,802、和5,990,389号中，通过引用并入本文。另一个实例是美国专利第5,850,016号所描述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，和Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106所描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，其公开通过引用并入本文。

可以由定点诱变产生编码序列的衍生物以在所编码的多肽中提高预先选择的氨基酸的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因来自大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，于1996年11月1日提交的美国专利申请系列第08/740,682号和WO 98/20133，其公开通过引用并入本文。其他的蛋白包括富含蛋氨酸的植物蛋白，例如来自向日葵种子(Lilley，et al.，(1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstu

昆虫抗性基因可以编码对具有巨大产量制约的害虫的抗性，诸如食虫、切根虫、欧洲玉米螟(European Corn Borer)等。这类基因包括例如，苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利第5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881号和Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109)等。

编码疾病抗性性状的基因包括解毒基因，例如抗伏马毒素(美国专利第5,792,931号)的基因；无毒性(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432和Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089)等。

除草剂抗性性状可以包括编码对以抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的功能而发挥作用的除草剂，尤其是磺脲类型除草剂抗性的基因(例如，含有引起这类抗性突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突变)、编码对以抑制基因谷氨酰胺合酶的功能而发挥作用的除草剂，诸如膦丝菌素或basta抗性的基因(例如，bar基因)或本领域内已知的其他这类基因。所述bar基因编码对除草剂basta的抗性、nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性和ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。

还能在表达盒中编码不育基因，并提供物理去雄的备选方案。用在这些方法中的基因的实例包括美国专利第5,583,210号中描述的雄性组织优选基因和诸如QM的雄性不育表型基因。其他的基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些基因。

谷物质量反映在诸如油水平和类型、饱和和不饱和、必需氨基酸的质量和数量和纤维素水平的性状上。在玉米中，修饰的hordothionin蛋白描述于美国专利第5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389号中。

也可以在一个或多个基因上编码商业性状，例如，所述一个或多个基因增加产乙醇的淀粉或提供蛋白表达。转化的植物的另一个重要的商业用途是产生诸如描述于美国专利第5,602,321号中的聚合物和生物塑料。诸如β酮硫解酶基因、PHBase基因(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酸辅酶A还原酶基因(参见，Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基脂肪酸酯(PHA)的表达。

外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物的其他来源的那些产物。这些产物包括酶、辅因子、激素等。可以提高植物蛋白的水平，尤其是具有改进的氨基酸分布的修饰蛋白的水平以增加植物的营养价值。这通过具有增强的氨基酸含量的这些蛋白的表达来实现。

通过参考下述非限制性实施例可以更好的理解本发明。本领域技术人员应当理解，在没有偏离本文所公开的和要求的本发明的实质和范围内，可以实施本发明的其它实施方案。

实施例

实施例1：用于转化进高等植物中的根瘤农杆菌基因的克隆

章鱼碱和胭脂碱合成(基本氨基酸和酮酸间的还原缩合，参见下述)以及分解(氧化释放相同的两个分子)的基因可从公共数据库获得或通过PCR克隆。只用一种酶(SEQ ID NO：2)，脱氢酶能够产生所有四种类型的章鱼碱，如同单一酶能再生相应的底物。对于将章鱼碱氧化为它的底物而言，需要由两个亚基组成的酶(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6)。相似的情况发生于胭脂碱合成酶(SEQ ID NO：8)和分解(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12)中。这构成全部六种基因，每种大小≤1.5kb，编码OCS、OOXA、OOXB、NOS、NOXA和NOXB(分别为SEQ ID NOS：1、3、5、7、9和11)。通过PCR从不同野生型农杆菌菌株克隆所述基因。

实施例2：在转基因植物中时间和/或空间调节冠瘿碱合成酶(SEQ ID NOS：2和8)和冠瘿碱氧化酶(SEQ ID NOS：4、6、10、12)的表达，从而提高NUE和/或产量

将六种基因各自克隆进用于在高等植物中表达的中间载体中。将这些基因和启动子的不同组合用于转基因植物，以优化冠瘿碱合成以及利用的表达(参见，表1)。产生数种单叠加、双叠加或三叠加的载体，并获得转基因事件。从相同T-DNA可以表达多个基因，由此每个基因可以由不同的启动子驱动(Gupta，et al.，(2002)″Functional relationship of cytochrome c6 and plastocyanin in Arabidopsis(拟南芥中细胞色素c6和质体蓝素的功能关系)″；Nature(London)417：567-571)。这是有优势的，因为所有的转基因都将隔离为单基因座，通过杂交促进多于三种基因的组合(例如，章鱼碱和胭脂碱、形成和分解)。叶特异性和光特异性表达启动子包括ZM-PEPC1 PRO(Schaffner and Sheen，(1992)plant J 2：221-232)。AT-ASN1启动子用来驱动黑暗中分解基因的表达(Lam，et al.，(1998)plant Journal 16：345-353)。对于转基因的种子特异性表达，可以使用来自大豆的种子特异性启动子GM-KTI PRO(Jofuku，et al.，(1989)Plant Cell 1：1079-1093)。转基因植物特征在于在分子水平上分别通过基因组PCR和RT-PCR分析在基因组和mRNA表达中存在转基因。在基因阳性植物中，用比色法或基于HPLC/MASS的方法(Yang，et al.，(1987)″Detection of opines by colorimetric assay(通过比色分析检测冠瘿碱)″；Anal.Biochem.160：342-245)检测冠瘿碱。可以用形态学性状和其他性状中的差异来检验表达冠瘿碱合成酶和氧化酶的植物。除了总生物量之外，可以在不同的发育阶段检测枝条中的N浓度，从而确定引入的基因是否赋予某些优势。所选的事件组中，表现出合成酶和氧化酶活性高表达的一部分可以在不同的N水平下生长，然后检验不同性状，以确定外源N在影响植物N利用效率中是否与冠瘿碱合成和分解相互作用。营养组织中更大量的N积累和/或增加的生长率是改进N利用效率的指示。

表1：在转基因植物中调节章鱼碱和胭脂碱形成和降解的构建体(启动子)

实施例3：农杆菌介导的转化

对于用本发明的冠瘿碱合成酶序列的反义序列进行的农杆菌介导的玉米转化，优选使用Zhao的方法(美国专利第5,981,840号和PCT专利公开WO 98/32326；通过引用将其内容并入本文)。简单而言，从玉米分离未成熟的胚并将该胚与农杆菌悬液接触，其中该细菌能将反义冠瘿碱合成酶序列转移至至少一个未成熟胚的至少一个细胞中(第1步：感染步骤)。在该步中，优选将未成熟胚浸入农杆菌悬液中以起始接种。将该胚与该农杆菌共培养一段时间(第2步：共培养步骤)。感染步骤以后，优选将该未成熟胚培养于固体培养基。该共培养时期后，考虑任选的“休眠(resting)”步骤。在该休眠步骤中，在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在而没有添加植物转化体的选择剂的情况下，孵育该胚(第3步：休眠步骤)。为了去除农杆菌和为了感染细胞的休眠期，优选将该未成熟的胚培养于有抗生素但没有选择剂的固体培养基上。然后，将接种过的胚培养于含有选择剂的培养基中，并且恢复生长中的转化的愈伤组织(第4步：选择步骤)。优选地，将未成熟胚培养于含有选择剂的固体培养基上，该选择剂导致转化的细胞的选择生长。随后将愈伤组织再生为植物(第5步：再生步骤)，并优选将生长于选择培养基上的愈伤组织培养在固体培养基上，以再生为植物。对植物的组织发育调节进行监测并评分。

实施例4：转基因植物的转化和再生

用含有冠瘿碱合成酶序列和选择标记基因PAT的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚，所述冠瘿碱合成酶序列可操作地连接于干旱诱导型启动子RAB17启动子(Vilardell，et al.，(1990)Plant Mol Biol 14：423-432)，所述PAT赋予对除草剂双丙氨膦(Bialaphos)的抗性。可选择地，将该选择标记基因提供在单独的质粒上。按下述实施转化。培养基配方如下。

准备靶组织：

将穗去壳并在30％的Clorox漂白剂外加0.5％的Micro洗涤剂(Micro detergent)中表面灭菌20分钟，并用无菌水漂洗两次。切下未成熟的胚，并将胚轴朝下(盾片朝上)，每个平板有25个胚，置于560Y培养基中5小时，然后排列于2.5cm靶区域内准备轰击。

准备DNA：

制备包含冠瘿碱合成酶序列的质粒载体，所述冠瘿碱合成酶序列可操作地连接于泛素启动子。用如下CaCl₂沉淀法将该质粒DNA和含有PAT选择标记的质粒DNA沉淀于1.1μm(平均直径)的钨球上：

100μl制备的钨颗粒水悬液

10μl(1μg)DNA的Tris EDTA缓冲液(1μg总DNA)

100μl 2.5M的CaCl₂

10μl 0.1M的亚精胺

向钨颗粒悬液依次加入每种试剂，同时保持于多管振荡器上。将最终的混合液短暂超声处理并于持续涡旋中孵育10分钟。沉淀期以后，将管短暂离心，去除液体，用500ml 100％的乙醇洗涤并离心30秒。再次去除液体并向最终的钨颗粒沉淀中添加105μl 100％的乙醇。为了粒子枪轰击，将钨/DNA颗粒短暂超声处理，并取10μl点于每个大载体(macrocarrier)的中心，并允许在轰击前干燥约2分钟。

粒子枪处理：

用#HE34-1或#HE34-2粒子枪在水平#4轰击样品平板。所有的样品以650PSI接受单次射击，总共10等份等分试样取自每管制备的颗粒/DNA。

随后的处理：

轰击后，将胚于560Y培养基中保存2天，然后转移至含有3mg/L双丙烯膦的560R选择培养基中，并每两周传代培养。在选择约10周后，将选择抗性愈伤组织克隆转移至288J培养基中，起始植物再生。体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育良好的体细胞胚转移至发芽培养基中，并转移至光照培养室中。约7-10天后，将发育中的小植物(plantlet)转移至管中不含激素的272V培养基中7-10天，直至小植物充分建立(well-established)。随后将植物转移到含有盆栽土的浅箱的衬垫(inserts in flats)(相当于2.5″的盆)中，并于生长室中生长1周，随后于温室中再生长1-2周，随后转移至标准的盆600中(1.6加仑)并生长至成熟。对植物的增强的干旱耐受性进行监测并评分。检测改进干旱耐受性的分析在本领域内是常规的，并包括例如，干旱条件下，当与在相同的环境条件下的对照玉米植物比较时，增加的仁-穗生产能力产量。可选择地，对转化的植物的分生组织发育调节进行监测(即，穗上的小穗形成减少)。参见，例如，Bruce，et al.，(2002)Journal of Experimental Botany 53：1-13。

轰击和培养基：

轰击培养基(560Y)含有4.0g/l的N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l的Eriksson维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH将pH调节至5.8，随后用D-I水定容)；2.0g/l Gelrite

(在用D-I水定容后添加)；和8.5mg/l硝酸银(将培养基灭菌并冷却至室温后添加)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l 2，5-D(用KOH将pH调节至5.8后，用D-I水定容)；3.0g/l Gelrite

(在用D-I水定容后添加)和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙烯膦(两者都在培养基灭菌并冷却至室温后添加)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/lMS维生素储备液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-I水定容)(Murashige and Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在将pH值调至5.6后，用精制的的D-I水定容)；3.0g/l Gelrite

(在用D-I水定容后添加)和1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙烯膦(将培养基灭菌并冷却至60℃后添加)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储备液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-I水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在将pH值调到5.6以后，用精制的D-I水定容)和6g/l Bacto^TM-琼脂(在用精制的D-I水定容后添加)，灭菌并冷却至60℃。

实施例5：大豆胚转化

如下述，用含有反义冠瘿碱合成酶序列的质粒轰击大豆胚，所述反义冠瘿碱合成酶序列可操作地连接于泛素启动子。为了诱导体细胞胚，将从表面灭菌的大豆品种A2872的未成熟种子切下长度为3-5mm的子叶，在光下或黑暗中于26℃下于琼脂培养基中培养6-10周。随后切下产生次级胚的体细胞胚，并置于合适的液体培养基中。在反复选择繁殖为早期球形期胚的体细胞胚簇后，按下文所述，维持悬液。

将大豆胚发生悬浮培养物维持于26℃下，维持在150rpm旋转振荡器上的35ml液体培养基中，同时按日/夜为16∶8小时安排荧光照射。每两周，通过将约35mg的组织接种至35ml液体培养基中，对培养物进行传代培养。

然后用粒子枪轰击方法转化大豆胚胎发生悬浮培养物(Klein，et al.，(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利第4,945,050号)。DuPont Biolistic PDS1000/HE仪器(改装氦)可用于这些转化。

用来促进大豆转化的选择标记基因是转基因，该转基因由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自E.coli；Gritz，et al.，(1983)Gene 25：179-188)和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA中的胭脂碱合成酶基因的3′端组成。包含反义冠瘿碱合成酶序列的表达盒可分离为限制性片段，所述反义冠瘿碱合成酶序列可操作地连接于泛素启动子。随后而异将该片段插入携带标记基因的载体的独特限制性位点。

向50μl的60mg/ml的1μm金粒悬液中加入(依次)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl₂(2.5M)。该颗粒制剂随后搅动3分钟，微量离心机中离心10秒，并去除上清。该DNA包被的微粒随后在400μl 70％乙醇中洗涤一次，并重悬于40μl无水乙醇中。将该DNA/微粒悬液超声处理3次，每次1秒。随后，将5μl DNA包被的金粒加载于每个大载体盘(macro carrier disk)上。

将约300-400mg两周龄的悬浮培养物放置于空的60×15mm的皮氏培养皿中，并用吸管从组织中去除残余的液体。对于每次转化实验，通常轰击约5-10个平板组织。膜破裂压设置在1100psi，并将所述室抽真空至28英寸汞。距保留屏(retaining screen)约3.5英寸，放置组织，并轰击3次。轰击后，将组织分成两半，并放回至液体中，并按上述描述培养。

轰击后5-7天，用新鲜的培养基更换液体培养基，并且轰击后11-12天，用含50mg/ml潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换该选择培养基。轰击后7-8周，可以观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚簇中长出。去除分离的绿色组织并接种至个体烧瓶中，以产生新的无性繁殖的、转化的胚胎发生悬浮培养物。可以将每个新品系作为独立的转化事件处理。这些悬液可随后进行传代培养，并作为未成熟胚簇维持，或通过个体体细胞胚的成熟和发芽再生为完整植物。

实施例6：向日葵分生组织转化

如下述，用含有反义冠瘿碱合成酶/氧化酶序列的表达盒转化向日葵分生组织，所述反义冠瘿碱合成酶/氧化酶序列可操作地连接于泛素启动子(还参见，欧洲专利申请号第EP 0 486233号，通过引用并入本文，和Malone-Schoneberg，et al.，(1994)Plant Science 103：199-207)。用单小麦穗脱粒机(single-wheat head thresher)将成熟的向日葵种子(Helianthus annuus L.)去壳。将种子在每50ml溶液加两滴Tween20

的20％Clorox漂白剂溶液进行表面灭菌30分钟。将种子用无菌蒸馏水漂洗两次。

劈开胚轴的外植体通过改良的Schrammeijer等(Schrammeijer，et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：55-60)所述的方法制备。表面灭菌过程后，将种子在蒸馏水中浸没60分钟。随后折断每粒种子的子叶，从而在胚轴平面处产生干净的断面。切除根尖以后，在初叶间纵向对切外植体。将两等份切面朝上放置于GBA培养基中，所述GBA培养基由Murashige和Skoog矿物元素(Murashige，et al.，(1962)Physiol.Plant.，15：473-497)、Shepard维生素添加物(Shepard，(1980)in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops(University of Minnesota Press，St.Paul，Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-苄基氨基喋呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA₃)以及8g/l植物琼脂组成，pH 5.6。

在农杆菌处理之前，外植体进行微弹轰击(Bidney，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。将30-40株外植体放置于60×20mm平板中心围成圆圈进行该处理。将约4.7mg 1.8mm的钨微弹重悬浮于25ml无菌TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，并且每次轰击用1.5ml等分试样。在PDS 1000

粒子加速装置中，通过置于样品上方2cm处的150mm nytex屏幕，将每一平板轰击两次。

在所有的转化实验中，使用无害的根瘤农杆菌菌株EHA105。包含表达盒的二元质粒载体，如Holsters，et al.，(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187所述，通过冻融引入农杆菌菌株EHA105，所述表达盒含有可操作地连接于泛素启动子的冠瘿碱基因。该质粒还包含卡那霉素选择标记基因(即nptII)。将用于植物转化实验的细菌在液体YEP培养基(10gm/l酵母提取物，10gm/l Bacto

蛋白胨和5gm/l NaCl，pH 7.0)中生长过夜(于28℃和100RPM连续搅拌)，所述液体YEP培养基中有细菌菌株和二元质粒维持所需的合适的抗生素。当悬液的OD₆₀₀达到约0.4-0.8时，可以使用该悬液。沉淀农杆菌细胞，并以0.5的最终OD₆₀₀重悬浮于由12.5mM MES pH 5.7、1gm/l NH₅Cl和0.3gm/l MgSO₅组成的接种培养基中。

将新近轰击的外植体置于农杆菌悬液中，混合，并静置30分钟。随后将该外植体转移至GBA培养基中，于26℃和日18小时下共培养，切割面向下。共培养3天后，将该外植体转移至补充有250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(不含生长调节剂和蔗糖水平减少至1％的GBA培养基)中。根据选择，将该外植体培养2-5周，随后转移至不含卡那霉素的新374B培养基中继续发育1-2周。将具有未形成适于切割枝条的分化的抗生素抗性生长区域的外植体转移至含有250mg/l头孢噻肟的GBA培养基中，进行第二次3天的植物激素处理。通过ELISA检测来自绿色卡那霉素抗性枝条的叶样品中NPTII的存在，并通过检测分生组织发育调节(即，枝条和花分生组织的大小和外型的改变)，检测转基因表达的存在。

将NPTII阳性枝条嫁接至体外生长的PIONEER

杂种6550向日葵幼苗根茎。表面灭菌的种子在48-0培养基中萌发(半强度Murashige和Skoog盐、0.5％蔗糖、0.3％Gelrite

pH 5.6)，并生长于外植体培养所述的条件下。除去幼苗的上部分，于下胚轴中制成1cm的垂直切片，并将转化的枝条插入该切口。用parafilm

包裹整个区域以固定枝条。在体外培养一周后，将嫁接的植物转移至土壤中。土壤中的嫁接物维持在高湿度条件下，缓慢适应温室环境。通过叶提取物的NPTII ELISA鉴定和/或通过冠瘿碱活性分析，鉴定温室中成熟的T₀植物(亲本)的转化部分，而通过干种子子叶小部分的冠瘿碱活性活性分析来鉴定从NPTII阳性T₀植物收获的转基因种子。

可选择的向日葵转化方案允许转基因后代的恢复而不使用化学选择压力。将种子去壳并在每100ml溶液加2-3滴Tween20的20％Clorox

漂白剂溶液中表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水漂洗三次。将灭过菌的种子置于浸水的滤纸上，在黑暗中于26℃吸水20小时。去除子叶和根部，并将分生组织外植体在黑暗中于374E(GBA培养基由MS盐、Shepard维生素、40mg/l硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.5mg/l 6-BAP、0.25mg/l IAA、0.1mg/l GA和0.8％植物琼脂组成，pH 5.6)中培养24小时。将初生叶去除以暴露顶端分生组织，将约40个外植体以顶朝上于374M(含有1.2％植物琼脂的GBA培养基)中心围成2cm圆圈。然后于培养基上在黑暗中培养24小时。

将约18.8mg的1.8μm钨颗粒重悬于150μl无水乙醇中。超声处理后，将8μl滴在大载体表面的中心。在氦枪真空为26mm Hg，以第一架上破裂片为650psi下对每个平板轰击两次。

如上述，通过冻融将目的质粒引入根瘤农杆菌菌株EHA105。将存在50μg/l卡那霉素的液体YEP培养基(10g/l酵母提取物、10g/l Bacto蛋白胨和5g/l NaCl，pH 7.0)中在28℃过夜生长的细菌团重悬于接种培养基(12.5mM的2-mM 2-(N-吗啉)乙磺酸、MES、1g/l NH₄Cl和0.3g/lMgSO₄，pH 5.7)中达到OD₆₀₀为4.0的终浓度。将颗粒轰击的外植体转移至GBA培养基(374E)，并且将小滴细菌悬液直接置于分生组织顶端。将外植体于培养基上共培养4天，之后将该外植体转移至374C培养基(含有1％蔗糖、无BAP、IAA、GA3，且补加250μg/ml头孢噻肟的GBA)。在16小时日照和26℃的孵育条件下，将小植物于培养基上培养约2周。

筛查调节分生组织发育(即，枝条和花分生组织大小和外型发生改变)的于374C培养基中培养两周的外植体(约2cm长)。鉴定出阳性(即，冠瘿碱表达降低)外植体后，弃去没有表现出冠瘿碱活性降低的那些枝条，并且将每株阳性外植体细分为结外植体。一株结外植体含有至少一个潜在的结节。将所述结片段于GBA培养基上培养3-4天，以促进每个结节的腋芽形成。然后将它们转移至374C培养基并允许再发育4周。将发育的芽分离，并在374C培养基上再培养4周。通过合适的蛋白活性分析对来自每株新恢复枝条的混合叶样本进行再筛查。此时，从单结节恢复的阳性枝条通常已经富集在结培养前在最初的分析中所检测的转基因部分。

将对降低的冠瘿碱表达阳性的恢复枝条嫁接至体外生长的PIONEER杂种6440向日葵幼苗根茎。以下述方式制备所述根茎。将种子去壳并在每100ml溶液加2-3滴Tween

20的20％Clorox漂白剂溶液中表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水漂洗三次。使灭过菌的种子在浸水的滤纸上萌发三天，然后将它们转移至48培养基(半强度MS盐、0.5％蔗糖、0.3％ gelrite

，pH 5.0)，并于黑暗中26℃下生长三天，然后将其在16小时日照的培养条件下孵育。除去所选幼苗的上部分，在每个下胚轴中制成垂直切片，并将转化的枝条插入V口。用parafilm

包裹该切口区域。于培养基上培养一周后，将嫁接的植物转移至土壤中。在前两周，将它们维持在高湿度条件下，以适应温室环境。

实施例7：不同N条件下的幼苗生长分析

为了测试转基因表达对植物性能的影响，所述植物性能即生长率的改变、植物中的N浓度和积累的总N量，使植物生长在与Tollenaar and Migus(Tollenaar and Migus，(1984)Can J.Plant Sci.64：465-485)所述的系统相似的半水培系统中。用种子标记将来自表1描述的构建体的转基因玉米种子与野生型分开，并将两种种子的每种种植于装满Turface MVP的4英寸方形塑料盆中，并在出土后缩减至每盆1株植物。每天用400ml营养液(6mM KNO₃或1mM KNO₃、2mM MgSO₄、1mM CaCl₂、0.5mM KH₂PO₄、3mM KCl、83ppm Sprint330、3μM H₃BO₄、1μM MnCl₂、1μM ZnSO₄、0.1μM CuSO₄、0.1μM NaMoO₄和足够的H₂SO₄以达到pH 5.5)对这些植物供水4次。种植19天后将幼苗从盆中移除，从根处洗掉生根物质，将根和枝条分离，并将植物部分于70℃干燥70小时。测定根、枝条和全部干重量，将所述干植物研磨成细粉末，并通过micro-Kjeldahl(Yasuhura and Nokihara，(2001)J Agric Food Chem 49：4581-4583)将约35mg组织用来评估降低的总N量。按(Loussaert，(1992)Agron J.84：256-259)所述的分析数据，并将转基因的平均参数与相应的无效平均参数进行比较。

实施例8：正常和低N条件下的产量试验

为了进一步说明转基因玉米中这些基因的操纵的影响，进行了大规模的田地测试。将表1描述的每个构建体的多个转基因事件的后代种子种植于田地中，用于评估在正常和降低土壤N下，当与非转基因对照植物比较时，转基因增强产量/NUE的能力。在多个位置，用具有各种环境胁迫的多次重复实施这些实验。收集的数据由产量、植物特征和NUE的多次测量组成。所述特征可以包括但不限于下述：增强的营养生长、生物量积累、加速的生长率、站立总数、茎和/或根倒伏、谷物产量、平均仁重量、总种子数量/植物、总种子重量/植物、收获指数、N收获指数、饱满种子的数量/植物、初生与次生穗质量和谷物产量增加。实验数据揭示，对于检测的具体性状，转基因的玉米植物比非转基因的对照植物表现更好。

实施例9：冠瘿碱合成酶和氧化酶序列变体

A.不改变编码的氨基酸序列的冠瘿碱合成酶和氧化酶的变异的核苷酸序列

用冠瘿碱合成酶和氧化酶核苷酸序列来产生变异的核苷酸序列，该变异的核苷酸序列具有与相应SEQ ID NO的初始未改变的ORF核苷酸序列比较，具有70％、75％、80％、85％、90％和95％的核苷酸序列同一性的开放阅读框的核苷酸序列。用标准密码子表产生这些功能变体。尽管变体的核苷酸序列发生了改变，但开放阅读框编码的氨基酸序列并未发生改变。

B.冠瘿碱合成酶和氧化酶多肽的变异的氨基酸序列

产生冠瘿碱多肽的变异的氨基酸序列。在本实施例中，改变一个氨基酸。特别是，可以检查开放阅读框，以确定适当的氨基酸改变。通过参考蛋白比对(与来自各物种的其他直系同源物和其他基因家族成员)，作出待改变的氨基酸选择。选择认为并未处于高选择压(不是高度保守的)下并且其相当容易地被有相似化学特征(即，相似的功能侧链)的氨基酸取代的氨基酸。一旦鉴定出靶向的氨基酸，则进行下述部分C概括的程序。用该方法产生具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。

C.冠瘿碱合成酶和氧化酶多肽的其他变异的氨基酸序列

在本实施例中，产生相对于参照蛋白序列具有80％、85％、90％和95％的同一性的人工蛋白序列。该较后的努力需要鉴定保守区和可变区，然后明智地运用氨基酸取代表。这些部分将在下文进行更详细的论述。

在很大程度上，确定改变哪个氨基酸序列是基于冠瘿碱合成酶/氧化酶蛋白或其他冠瘿碱合成酶/氧化酶多肽中的保守区做出的。基于序列比对，可能被改变的冠瘿碱合成酶/氧化酶多肽的各个区用小写字母表示，而保守区用大写字母表示。应当认识到，能在保守区域内进行保守取代而不改变功能。此外，本领域技术人员应当理解，本发明冠瘿碱合成酶/氧化酶序列的功能变体可以在保守结构域内有较小的非保守氨基酸改变。

随后产生人工蛋白序列，其在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性的间隔内，不同于原始序列。这些间隔的中点，例如以加或减1％的自由范围(literal latitude)靶向。氨基酸取代会被常规Perl script影响。下文的表2提供了该取代表。

表2.取代表

氨基酸	高度相似的和最佳的取代	改变的顺序等级	备注
				I	L，V	1	50∶50取代
L	I，V	2	50∶50取代
				V	I，L	3	50∶50取代
A	G	5
				G	A	5
D	E	6
				E	D	7
W	Y	8
				Y	W	9
S	T	10
				T	S	11
K	R	12
				R	K	13
N	Q	15
				Q	N	15
F	Y	16
				M	L	17	第一个蛋氨酸不能改变
H		Na	没有好的取代
				C		Na	没有好的取代
P		Na	没有好的取代

首先，鉴定蛋白中不应当被改变的任何保守氨基酸，并且“标出”以与取代隔离。当然，起始蛋氨酸将自动地添加至该表。下一步，进行所述改变。

H、C和P在任何条件下不改变。首先，改变将从异亮氨酸开始，从N末端扫到C末端。随后是亮氨酸等，沿列表向下至达到所需的靶标。可以进行中间数量的取代，以不引起改变的逆转。列表按1-17排列，以便在亮氨酸等向下至蛋氨酸前以进行所需数量异亮氨酸改变开始。很显然，按这种方式，很多氨基酸不需要改变。L、I和V将涉及两种交替的最佳取代的50∶50的取代。

变异的氨基酸序列作为输出写出。Perl script用来计算同一性百分比。使用该程序，产生与SEQ ID NO：1、3、5、7、9和11的起始未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％的氨基酸同一性的冠瘿碱多肽变体。

本说明书中的所有出版物和专利申请表示本发明所属技术领域技术人员的水平。通过引用将所有出版物和专利申请并入本文，其引用程度如同特别和单独指出通过引用并入的每一个单个出版物或专利申请。

已经参照各种具体的和优选的实施方案和技术对本发明进行了描述。然而，应当理解，只要仍在本发明的实质和范围内，可以进行多种变化和改变。

Claims (34)

1.选自以下的分离的多核苷酸的用途：

a.由默认参数下的GAP算法所确定的，与选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9和11的多核苷酸全长序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码作为氮利用效率调节器而发挥功能的多肽；

b.编码选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的多肽的多核苷酸；

c.选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9和11的多核苷酸；和

d.与(a)、(b)或(c)的多核苷酸互补，以修饰植物中冠瘿碱表达的多核苷酸。

2.重组表达盒的用途，所述重组表达盒包含权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义方向可操作地连接于启动子。

3.宿主细胞，其包含权利要求2所述的表达盒。

4.转基因植物，其包含权利要求2所述的重组表达盒。

5.如权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。

6.如权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。

7.如权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、花生、甘蔗和可可。

8.来自权利要求4所述的转基因植物的转基因种子。

9.调节植物中氮利用效率的方法，其包括：

a.将包含可操作地连接于启动子的权利要求1所述的多核苷酸的重组表达盒引入植物细胞；和

b.在植物细胞生长条件下培养所述植物，其中所述植物细胞中氮利用受到调节。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自选自以下的植物：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、花生、甘蔗和可可。

11.调节植物中氮利用效率的方法，包括：

a.将包含可操作地连接于启动子的权利要求1所述的多核苷酸的重组表达盒引入植物细胞；

b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；和

c.从所述植物细胞再生植物，其中所述植物中氮利用效率受到调节。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、花生、甘蔗和可可。

13.增加植物细胞中冠瘿碱新陈代谢多肽活性的方法，包括：

a.提供包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的互补序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；

b.提供包含mRNA的植物细胞，其中所述mRNA具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示的序列；和

c.将步骤(a)的核苷酸序列引入步骤(b)的植物细胞，其中所述核苷酸序列增加所述植物细胞中所述mRNA的表达。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、水稻、大麦、高粱、甘蔗或黑麦。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

17.如权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物中氮利用效率活性增加。

18.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的植物生长。

19.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的枝条生长。

20.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的根生长。

21.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增大的种子大小。

22.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的种子重量。

23.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物的种子具有增大的胚大小。

24.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增大的叶大小。

25.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的幼苗活力。

26.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的抽丝期。

27.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的穗大小。

28.如权利要求2所述的表达盒的用途，其中所述启动子是根特异性启动子。

29.如权利要求2所述的表达盒的用途，其中所述启动子是叶特异性启动子。

30.如权利要求29所述的表达盒的用途，其中所述启动子是光特异性叶启动子。

31.如权利要求29所述的表达盒的用途，其中所述启动子是黑暗特异性叶启动子。

32.如权利要求2所述的表达盒的用途，其中所述启动子是种子特异性启动子。

33.如权利要求32所述的表达盒的用途，其中所述种子特异性启动子是胚特异性启动子。

34.如权利要求32所述的表达盒的用途，其中所述种子特异性启动子是胚乳特异性启动子。