AUMENTO DEL RENDIMIENTO EN PLANTAS CON SOBREEXPRESION DE LOS GENES ACCDP
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención se refiere en general a secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos asociados con desarrollo radicular, que contribuyen al crecimiento de las plantas y, en última instancia, afectan la producción de la planta (es decir, el rendimiento) en condiciones de estrés abiótico y sin estrés. En particular, la presente invención se refiere secuencias aisladas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que confieren a la planta aumento del crecimiento de la raiz, aumento del rendimiento y/o aumento de tolerancia a sequía, frío y/o salinidad, y el uso de dichos ácidos nucleicos aislados. Antecedentes en el arte El rendimiento de las plantas de cultivo es central para el bienestar de los humanos y se ve afectado directamente por el crecimiento de plantas en el ambiente físico. Los estreses abióticos ambientales, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor, y estrés por frío, son importantes factores limitantes del crecimiento y la productividad de las plantas. Las pérdidas de cultivos y las pérdidas en el rendimiento de los cultivos principales tales como poroto de soja, arroz, maíz, algodón y trigo causadas por estos estreses representan un importante factor económico y político y contribuyen a la escasez de alimentos de muchos países subdesarrollados. La biomasa de una planta es el rendimiento total de cultivos forrajeros tales como alfalfa, maíz de ensilado y heno. Se han usado muchos reemplazantes de rendimiento en los cultivos de grano. Entre ellos, los más importantes son las estimaciones de tamaño de la planta. El tamaño de la planta se puede medir de muchas maneras, según la especie y el estadio de desarrollo, pero incluye peso seco total de la planta, peso seco sobre el suelo, peso húmedo sobre el suelo, superficie de las hojas, volumen del tallo, altura de la planta, diámetro de la roseta, longitud de la hoja, longitud de la raíz, masa de la raíz, cantidad de retoños y cantidad de hojas. Muchas especies mantienen una relación conservadora entre el tamaño de las diferentes partes de la planta en determinado estadio de desarrollo. Estas relaciones alométricas se usan para extrapolar de una a otra de estas medidas tamaño. El tamaño de una planta en un estadio temprano de desarrollo
generalmente se correlaciona con el tamaño de la planta más tarde en el desarrollo. Una planta grande, con mayor superficie de hoja generalmente puede absorber más luz y dióxido de carbono que una planta pequeña y en consecuencia es probable que gane mayor cantidad de peso durante el mismo periodo. A esto se agrega la posible continuación de la ventaja microambíental o genética que tenia la planta para adquirir el mayor tamaño en principio. Hay un fuerte componente genético en el tamaño y la velocidad de crecimiento de una planta, y si lo mismo ocurre con un rango de diversos genotipos de tamaño vegetal en una condición ambiental es probable que se correlacionen con el tamaño en otra. De esta manera, se usa un ambiente estándar como representación de los diversos ambientes dinámicos que encuentran los cultivos en distintas ubicaciones y tiempos en el campo. El índice de cosecha, la relación entre rendimiento de semilla y peso seco sobre el suelo, es relativamente estable en muchas condiciones ambientales, por lo que a menudo se puede obtener una fuerte correlación entre tamaño de planta y rendimiento del grano. Estos procesos están ligados intrínsecamente, dado que la mayor parte de la biomasa del grano depende de la productividad fotosíntética actual o almacenada por las hojas y los tallos de la planta. En consecuencia, se ha usado la selección por tamaño de la planta, incluso en los estadios tempranos de desarrollo, como indicador de potenciales futuros. Cuando se analiza el impacto de las diferencias genéticas sobre la tolerancia al estrés, la capacidad para estandarizar las propiedades del suelo, la temperatura, la disponibilidad de agua y nutrientes, y la intensidad de luz, es una ventaja intrínseca de los invernaderos o los ambientes con cámaras de crecimiento de plantas, comparado con el campo. Sin embargo, las limitaciones artificiales sobre el rendimiento debido a una mala polinización por ausencia de viento o insectos, o el espacio insuficiente para la maduración de la raíz o el crecimiento de los brotes pueden restringir el uso de estos ambientes controlados al análisis de diferencias en el rendimiento. En consecuencia, La medición del tamaño de una planta en el desarrollo temprano, en condiciones estandarizadas en una cámara de crecimiento o invernadero, son prácticas estándar para proveer la indicación de posibles ventajas genéticas de rendimiento. Durante el ciclo vital, las plantas generalmente están expuestas a condiciones de reducido contenido de agua ambiental. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra estas condiciones de sequedad. Sin embargo, si la severidad y la duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos
sobre el desarrollo, el crecimiento, el tamaño de la planta y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cultivo son profundos. La exposición continua a condiciones de sequía causa alteraciones importantes en el metabolismo vegetal, que en última instancia conducen a la muerte celular, y las consecuentes pérdidas de rendimiento. El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es, en consecuencia, una estrategia que permite solucionar o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de cultivo de plantas tendientes a desarrollar nuevas líneas de plantas con resistencia y/o tolerancia a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren lineas resistentes específicas para el cruzamiento con la línea deseada. Los limitados recursos de germoplasma para tolerancia al estrés y la incompatibilidad en los cruzamientos entre especies vegetales con relaciones distantes representan significativos problemas que se encuentran en el cultivo convencional. Además, los procesos celulares que conducen a la tolerancia a sequía, frío, y salinidad en plantas modelo de tolerancia a sequía, frío y/o salinidad son de naturaleza compleja e incluyen múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas vias metabólicas. Esta naturaleza multicomponente de la tolerancia al estrés no solo ha tenido como consecuencia que el cultivo tendiente a lograr tolerancia sea en gran medida ineficaz, además ha limitado la capacidad para obtener plantas tolerantes al estrés mediante procesos de ingeniería genética mediante métodos biotecnológicos. En consecuencia, es necesaria la identificación de los genes y proteínas que intervienen en estos procesos multicomponentes que conducen al aumento del crecimiento y/o al incremento de la tolerancia al estrés. La dilucidación de la función de los genes expresados en las plantas tolerantes al estrés no solo adelantará nuestro conocimiento sobre la adaptación y la tolerancia de las plantas a los estreses ambientales, además puede proporcionar información importante para el diseño de nuevas estrategias de mejoramiento de los cultivos. Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Los sistemas radiculares de las plantas son fundamentales para el correcto crecimiento y desarrollo de todas las especies vegetales terrestres. Además de captar agua y nutrientes, y de proveer soporte físico, las raíces median un intercambio de comunicación complejo y poco conocido entre los microorganismos del suelo y otras plantas. En sistemas agronómicos, la producción recibe el impacto de la disponibilidad de agua y nutrientes en el suelo: el crecimiento de las raíces influye en forma directa o indirecta sobre el crecimiento y el
rendimiento de órganos aéreos, en particular en condiciones de limitación de nutrientes. Las raices también son importantes para la obtención de productos vegetales secundarios, tales como compuestos de defensa y hormonas vegetales. El establecimiento de una adecuada arquitectura radicular es un factor importante para el uso efectivo por la planta del agua y los nutrientes disponibles en el ambiente, y para maximízar el crecimiento y la producción de plantas. Además, en condiciones de sequía, las raíces se pueden adaptar para continuar con el crecimiento, al mismo tiempo que produce y envía señales de alarma tempranas a los brotes, que inhiben el crecimiento de la planta sobre el suelo. Además, el incremento del crecimiento de la raíz de las plantas de cultivo mejora la competitívidad con las malezas y mejora el crecimiento en zonas áridas, al incrementar el acceso y la captación de agua. El crecimiento mejorado de la raíz también es importante para los fines ecológicos, tales como la aplicación de remedios biológicos y la prevención/detención de la erosión del suelo. Las raíces más largas no solo alivian los efectos de la falta de agua en el suelo, además mejoran el anclaje y la postura de las plantas, lo cual facilita el asentamiento. Además, las raíces más largas permiten cubrir un mayor volumen de suelo y mejorar la captación de nutrientes. En consecuencia, la alteración de la biomasa radicular, y en particular el incremento de la longitud de la raíz, mejorará el crecimiento de la planta, además de aumentar el rendimiento del cultivo. Las raíces también son órganos de almacenamiento en varios cultivos comerciales importantes, por ejemplo, remolacha azucarera, papa, mandioca, ñame y batata. Las raíces también son un órgano importante para el consumo, en numerosos vegetales (p. ej., zanahorias, rabanito), hierbas (p. ej., jengibre, cúrcuma) y plantas medicinales (p. ej., ginseng). Además, algunos de los productos vegetales secundarios hallados en raíces tienen importancia económica en la industria química y farmacológica, por ejemplo, las moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroides se encuentran en el ñame, y las raíces de Lithospermum erythrorhizon producen shiconina, de amplio uso debido a sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y de cicatrización de heridas. La arquitectura de la raíz es un área que ha permanecido en gran medida inexplorada en el cultivo clásico, debido a las dificultades para evaluar este rasgo en el campo. En consecuencia, la biotecnología podría tener significativo impacto sobre el mejoramiento de este rasgo. La estructura de los sistemas de raíces resultan de una combinación de
predisposición genética y medio ambiente físico Adicionalmente, los microbios del suelo también tienen un efecto beneficioso sobre el crecimiento de las plantas, ya sea al reducir los efectos nocivos de otros microbios patógenos, al producir compuestos que promueven el crecimiento de las plantas o al incrementar la eficacia de la captación de nutrientes del medio ambiente Un microbio puede usar uno o todos estos mecanismos en diferentes etapas del ciclo de vida de la planta La hormona vegetal etileno fue implicada en un amplio espectro de procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas En las plantas, el 1-am?noc?clopropan-1-carboxilato (ACC) es un precursor biosintetico esencial de etileno Algunos estudios en los años setenta revelaron que las bacterias del suelo que expresan una ACC desaminasa pueden reducir los niveles de etileno en las plantas, llevando así a la elongación de la raíz (Brown, 1974, Ann Rev Phytopathol 12 181 -197, Honma and Shimomura, 1978, Agrie Biol Chem 42 1825-1831 ) Estos resultados fueron sustentados por experimentos en donde los genes que codificaban la ACC desammasa se movilizaron a bacterias no promotoras del crecimiento que, a su vez, conferían un efecto promotor del crecimiento (Shah et al , 1998, Can J Microbiol 44 833-843) Mas recientemente, los genes microbianos que codificaban la ACC desaminasa se expresaron directamente en plantas transgénicas y mostraron que promovían la elongación de las raices (Klee et al , 1991 , Plant Cell 3(1 1 ) 1187-93, Reed et al , 1996, J Ag Food Chem 44(1 ) 388-394) Aunque se han caracterizado algunos genes que intervienen en las respuestas a estrés en plantas, la caracterización y la clonación de genes vegetales que confieren tolerancia a estrés aun es en gran medida incompleta y fragmentada Por ejemplo, ciertos estudios indican que el estrés por sequía y salino en algunas plantas se puede deber a efectos genicos aditivos, en contraste con otras investigaciones, que indican la activación de la transcppción de genes específicos en el tejido s vegetativo de las plantas sometidas a condiciones de estrés osmótico Si bien generalmente se presupone que las proteínas inducidas por estrés tienen un papel importante en la tolerancia, aun se carece de evidencias directas, y se desconocen las funciones de muchos genes que responden al estrés En consecuencia, queda la necesidad de identificar otros genes expresados en plantas tolerantes a estrés con capacidad para conferir aumento del crecimiento de ña raíz y/o mayor rendimiento y/o tolerancia al estrés de la planta huésped y otras especies vegetales Las plantas tolerantes a estrés recién generadas tendrán muchas ventajas,
tales como aumento del rango de cultivo de las plantas de cultivo, por ejemplo, al reducir los requerimientos de agua de las especies vegetales SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a ácidos nucleicos aislados que codifican polipeptidos capaces de modular el crecimiento de la raíz, y/o el crecimiento y/o el rendimiento de la planta, y/o la tolerancia a estrés en condiciones normales o de estrés, comparadas con una variedad de tipo de la planta En particular, la invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos aislados que codifican polipéptidos relacionados con la proteína de estrés símil 1-am?noC?clopropan-1-Carbox?lato Desaminasa (ACCDP), de importancia en la modulación del crecimiento, el rendimiento, y/o la respuesta a un estrés ambiental de la raíz de una planta Más particularmente, la sobreexpresión de estos ACCDP que codifican ácidos nucleicos en una planta de cultivo da por resultado el aumento del crecimiento de la raíz y/o aumento del rendimiento en condiciones normales o de estrés, y/o aumento de tolerancia a un estrés ambiental En consecuencia, en una primera forma de realización, la invención se refiere a una planta de cultivo transgénica transformada por un acido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en a) un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N° 3 de la tabla 1 y de la tabla 2, b) un polinucleótido que codifica un polipeptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N° 4 de la tabla 1 y de la tabla 2, c) un polinucleótido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N° 3 de la tabla 1 y de la tabla 2, d) un polmucleótido que codifica un polipeptido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N° 4 de la tabla 1 y de la tabla 2, y e) un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquiera de los polinucleótidos a) a d) anteriores De preferencia, la planta de cultivo transgénica expresa dicho ácido nucleico aislado, para que de preferencia altere el fenotipo de las plantas en relación con las
plantas de tipo salvaje no transformadas. En particular, las plantas de cultivo transgénicas exhiben crecimiento modulado de la raíz (de preferencia, aumento del crecimiento de la raíz), y/o del crecimiento y/o rendimiento de la planta, y/o tolerancia a estrés en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. De preferencia, el ACCDP proviene de Arabidopsis thaliana, cañóla, soja, arroz, trigo, linaza, cebada, girasol o maíz. En otra forma de realización, la invención se refiere a plantas de cultivo transgénícas que sobreexpresan el ACCDP que codifica el ácido nucleico y demuestran un aumento del crecimiento de la raíz, y con mayor preferencia, demuestran un aumento de la longitud de la raíz en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. En una forma de realización, la sobreexpresión del ACCDP que codifica el ácido nucleico en la planta demuestra un aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una vapedad de tipo salvaje de la. En aun otra forma de realización, la sobreexpresión del ACCDP que codifica el ácido nucleico en la planta demuestra aumento del rendimiento, comparado con una vapedad de tipo salvaje de la planta. Se entiende que el estrés ambiental puede ser estrés por salinidad, sequía, temperatura, metal, agente químico, agente patógeno y agente oxidativo, o sus combinaciones. De preferencia, el estrés ambiental es estrés por sequía. En aun otra forma de realización, la invención se refiere a una semilla producida por una planta de cultivo transgénica transformada por un ACCDP que codifica un ácido nucleico, en donde la planta es un cultivo verdadero, para aumentar el crecimiento de la raíz, y/o aumentar el rendimiento, y/o aumentar la tolerancia a estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para crecer una planta de cultivo como en el sitio agrícola, en donde el método comprende obtener la antes mencionada planta de cultivo transgénica y hacer crecer la planta en un sitio agrícola. En aun otro aspecto, la invención se refiere a un producto obtenido a partir de las plantas transgénicas, partes de estas plantas, o sus semillas, tales como alimentos, nutrientes suplementos alimenticios, suplementos de nutrientes, cosméticos o compuestos farmacéuticos. En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para aumentar el crecimiento de la raíz y/o el rendimiento, y/o aumentar la tolerancia a estrés por un estrés
ambiental de una planta de cultivo en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta, en donde el método comprende obtener La antes mencionada planta de cultivo transgénica y cultivar la planta en la condición en que se exprese el ácido nucleico aislado En aun otra forma de realización, la invención se refiere a un método para producir la antes mencionada planta de cultivo transgénica, en donde el método comprende (a) la transformación de una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ACCDP que codifica el ácido nucleico, y (b) la generación, a partir de una célula vegetal, de la planta de cultivo transgénica que expresa el polipéptido codificado De preferencia, el polmucleótido está ligado operativamente a una o más secuencias reguladoras, y la expresión del polmucleótido en la planta da por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a estrés ambiental en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. De preferencia, la una o más secuencias reguladoras incluyen un promotor Con mayor preferencia, el promotor es un promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo. En otra forma de realización, la invención se refiere un nuevo ACCDP aislado que codifica un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende un polmucleótido seleccionado del grupo que consiste en a) un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 3 de la tabla 2, b) un polmucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 4 de la tabla 2, c) un polinucleótido con al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 3 de la tabla 2, d) un polinucleótido que codifica un pohpéptido con al menos 82% de identidad de secuencia con un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 4 de la tabla 2, e) un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquiera de los pohnucleótidos de a) a d) anteriores, y f) un pohnucleótido complementario con cualquiera de los polinucleótidos de a) a d) anterior
En otra forma de realización, la invención se refiere a una planta transgénica transformada por dichos ácidos nucleicos aislados, y una semilla producida por dicha planta transgénica. De preferencia, la planta transgénica expresa dichos ácidos nucleicos aislados, de preferencia para alterar el fenotipo de las plantas en relación con plantas no transformadas de tipo salvaje. En particular, la planta transgénica exhibe modificación (de preferencia, aumento) del crecimiento de la raíz, y/o crecimiento y/o rendimiento de la planta, y/o tolerancia a estrés en condiciones normales o de estrés comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. En aun otra forma de realización, la invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende un ACCDP aislado que codifica el ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótído seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 3 de la tabla y de la tabla 2; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 4 de la tabla y de la tabla 2; c) un polinucleótido con al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 3 de la tabla y de la tabla 2; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 82% de identidad de secuencia con un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 4 de la tabla y de la tabla 2; e) un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquierade los polinucleótidos de a) a d) anteriores; y f) un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos de a) a d) anterior. De preferencia, el polinucleótído está ligado operativamente a una o más secuencias reguladoras. Con mayor preferencia, las una o más secuencias reguladoras incluyen un promotor. Con mayor preferencia, el promotor es un promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo. En otra forma de realización, la invención se refiere a una planta transgénica que comprende dicho vector recombinante. De preferencia, la expresión del ACCDP que
codifica un ácido nucleico en la planta da por resultado un aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia al estrés ambiental, comparado con a la variedad de tipo salvaje de la planta En aun otra forma de realización, la invención se refiere a un método para identificar un nuevo ACCDP, que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpo contra un ACCDP, o su fragmento, tal como se describe más adelante, (b) analizar el posible material de ACCDP con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de un ACCDP potencial nuevo, y (c) identificar a partir del material fijado un nuevo ACCDP en comparación con el ACCDP conocido Alternativamente, la hibridación con sondas de acido nucleico tal como se describe más adelante se puede usar para identificar nuevos ácidos nucleicos de ACCDP
En otra forma de realización, la invención también se refiere a métodos para modificar el crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés de una planta que comprende modificar la expresión de un ACCDP que codifica el ácido nucleico en la planta De preferencia, dicha modificación da por resultado un aumento o disminución del crecimiento de la raíz, y/o del rendimiento, y/o de la tolerancia a estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta De preferencia, el crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés es aumento en una planta a través del incremento de la expresión de un ACCDP que codifica el acido nucleico | BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del gen AtACCD (SEQ ID NO 1; At1g48420) usada para la transformación de Arabidopsis, que tiene 1246 bp de longitud La región codificadora del gen tiene 1203 bp de longitud con el codon de inicio (es decir, ATG) y el codón de detención (es decir, TAG) subrayados La Figura 2 muestra la secuencia prevista de 401 aminoácidos del gen AtACCD (SEQ ID NO 2) usada para la transformación de Arabidopsis La Figura 3 muestra un esquema del T-ADN de vector binario usado para transformar el gen AtACCD (SEQ ID NO 1 ) LB borde izquierdo, pAHAS, promotor AHAS de Arabidopsis, 3'AHAS, señal de terminación AHAS, SP, superpromotor, AtACCD, cADN de AtACCD, 3'NOS, señal de terminación, RB, borde derecho Las Figuras 4A y 4B muestran un análisis de placa de las plantas transgenicas de Arabidopsis AtACCD (SEQ ID NO 1 ) 4A demuestra que todas las líneas muestran un
aumento fenotipo de longitud de raíz. Las líneas 2, 3, 5, 6 y 9 mostraron un aumento de longitud de raíz más significativo, comparado con los controles de tipo salvaje. 4B muestra el análisis a nivel génico de las plantas transgénicas AtACCD, lo cual confirma que las plantas AtACCD exhibían un fenotipo de aumento de longitud de raíz. En base a este análisis, las plantas transgénicas AtACCD exhibían un incremento del 13,8% en la longitud de raíz. En 4A y 4B, las tablas adjuntas muestran los valores medios reales usados para generar los gráficos de barras. La Figura 5 muestra el análisis en suelo de raices de las plantas AtACCD (SEQ ID
NO:1 ), en donde se midió la longitud de raíz de las líneas AtACCD de Arabidopsis. La Figura 6 muestra el nivel génico de análisis ANOVA de las plantas transgénicas
AtACCD (SEQ ID NO:1 ). Los datos del análisis de todas las líneas transgénicas se combinaron para determinar la actividad génica global. La Figura 7 muestra el nivel génico de análisis ANOVA de los pesos secos de las rosetas en las plantas transgénicas AtACCD (SEQ ID NO:1 ). La Figura 8 muestra los resultados del análisis tblastn de AtACCD (SEQ ID NO:2) respecto de las bases de datos de secuencias de cultivos patentadas. La tabla muestra el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos de AtACCD
(SEQ ID NO:2) y GmACCD-1 (SEQ ID NO:355), OsACCD (SEQ ID NO:353), ZmACCD-1
(SEQ ID NO:351 ) o TaACCD (SEQ ID NO:357). La Figura 9 muestra la alineación Blast entre las secuencias de aminoácidos de
AtACCD (SEQ ID NO:2, "Query") y GmACCD (SEQ ID NO:355, "Sbjct"). La Figura 10 muestra la alineación Blast entre las secuencias de aminoácidos de
AtACCD (SEQ ID NO:2, "Query") y OsACCD (SEQ ID NO:353, "Sbjct"). La Figura 11 muestra la alineación Blast entre las secuencias de aminoácidos de AtACCD (SEQ ID NO:2, "Query") y ZmACCD (SEQ ID NO:351 , "Sbjct"). La Figura 12 muestra la alineación Blast entre las secuencias de aminoácidos de
AtACCD (SEQ ID NO:2, "Query") y TaACCD (SEQ ID NO:357, "Sbjct").
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se comprende más fácilmente en referencia a la siguiente descripción detallada de las formas de realización preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en la presente. Sin embargo, antes de divulgar y describir los presentes compuestos, composiciones y métodos, se debe entender que la presente
invención no se limita a ácidos nucleicos específicos, pohpeptidos específicos, tipos celulares específicos, células huésped especificas, condiciones especificas, o métodos específicos, etc , dado que estos obviamente pueden variar, y las numerosas modificaciones y variaciones en ellos serán aparentes a los expertos en el arte También se debe entender que la terminología usada en la presente solo tiene por finalidad describir específicas formas de realización y no pretende ser limitantes En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como pohpéptido "polipéptidos relacionados con estrés símil 1-Am?noC?clopropan-1-Carbox?lato Desaminasa" (ACCDP), de ninguna manera limita la funcionalidad de dichas secuencias La presente invención se refiere a ACCDP, y ACCDP que codifican ácidos nucleicos de importancia para aumentar el crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o para modular la respuesta de una planta a un estrés ambiental Más particularmente, la sobreexpresión de estos ACCDP que codifican ácidos nucleicos en una planta de cultivo da por resultado la modulación (aumento o disminución, de preferencia aumento) del crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de la tolerancia a un estrés ambiental Los miembros representativos del género ACCDP son AtACCD, ZmACCD, OsACCD, GmACCD y TaACCD En una forma de realización de preferencia, todos los miembros del género son enzimas biológicamente activas que pueden convertir ACC en a-cetobutirato y amoníaco En consecuencia, la presente invención abarca una planta de cultivo transgénica que comprende secuencias de polinucleótido y polipeptido de ACCDP, y un método para producir dicha planta transgénica de cultivo, en donde la expresión del polipéptido ACCDP en la planta da por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o del rendimiento, y/o de la tolerancia a un estrés ambiental En una forma de realización, las secuencias ACCDP provienen de una planta, de preferencia una planta de Arabidopsis, una planta de cañóla, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de cebada, una planta de girasol, una planta de linaza, una planta de trigo o una planta de maíz En otra forma de realización, las secuencias ACCDP son los genes resumidos en la Tabla 1 y en la Tabla 2 De preferencia, las secuencias ACCDP descritas tienen significativa identidad de secuencia con las enzimas ACCDP conocidas Tabla 1 Genes ACCDP, su origen, secuencia de nucleotidos y correspondiente secuencia de aminoácidos, y su porcentaje de identidad compartido con AtACCD (SEQ ID NO 2) en el nivel de los aminoácidos (algoritmo de Needleman-Wunsch para alineación
global de secuencias, J Mol Biol 48(3) 443-53, matriz Blosum 62, penalidad de apertura de brecha 10,0, penalidad de extensión de brecha 2,0)
Tabla 2 Nuevos genes ACCDP, su origen, secuencia de nucleotidos y correspondiente secuencia de aminoácidos, y su porcentaje de identidad compartido con AtACCD (SEQ ID NO 2) en el nivel de los aminoácidos (algoritmo de Needleman-Wunsch para alineación global de secuencias, J Mol Biol 48(3) 443-53, matriz Blosum 62, penalidad de apertura de brecha 10 0, penalidad de extensión de brecha 2 0)
La presente invención también comprende nuevos polmucleótidos ACCDP y secuencias de polipéptidos y su uso para aumentar el crecimiento de las raíces de las plantas y/o el rendimiento y/o la tolerancia a un estrés medioambiental En esta forma de realización, las secuencias ACCDP son de Arabidopsis, cañóla, soja, arroz, trigo o maíz o sus homólogos Con preferencia, en esta forma de realización, el polinucleótido ACCDP y las secuencias de polipéptidos son aquellas de Arabidopsis, cañóla, soja, arroz, trigo o maíz tal como se establecen en cualquiera de las SEQ ID NOS tal como se proveen en la Columna N° 3 y 4 de la tabla 2 La presente invención provee una planta transgenica transformada por un ACCDP que codifica un ácido nucleico, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico
en la planta da por resultado un aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta En particular, el aumento de crecimiento de la raíz es un incremento de la longitud de las raíces El término "planta", tal como se usa en la presente y según el contexto, se puede entender como referencia a plantas enteras, células vegetales, y partes de plantas, incluso semillas La palabra "planta" también se refiere a cualquier planta, particularmente a plantas con semillas, y puede incluir, sin limitaciones, plantas de cultivo Las partes de plantas incluyen, sin limitaciones, tallos, raíces, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones mepstemáticas, tejidos de callo, gametofitos, esporofitos, polen, microsporas, y similares En una forma de realización, la planta transgénica es masculina estéril. También se provee una semilla vegetal producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica ACCDP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico que codifica ACCDP, y en donde la planta es cultivo verdadero para el aumento de crecimiento de la raíz, y/o el aumento del rendimiento, y/o el aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta La invención también provee una semilla producida por una planta transgénica que expresa un ACCDP, en donde la semilla contiene el ACCDP, y en donde la planta es cultivo verdadero para el aumento de crecimiento de la raíz, y/o el aumento del rendimiento, y/o el aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta La invención también provee un producto producido por o a partir de las plantas transgénicas que expresan el ácido nucleico que codifica ACCDP, sus partes vegetales, o sus semillas El producto se puede obtener por diversos métodos bien conocidos en el arte. Tal como se usa en la presente, la palabra "producto" incluye, sin limitaciones, un alimento, nutriente, un suplemento alimenticio, un suplemento de nutriente, cosmético o compuesto farmacéutico Los alimentos se consideran composiciones usadas para la nutrición Estos también incluyen composiciones para suplementar la nutrición Los nutrientes animales y los suplementos de alimentos para animales, en particular, se consideran alimentos La invención también provee un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas, partes de plantas, y semillas de plantas. Productos agrícolas incluyen, sin limitaciones, extractos vegetales, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares. Tal como se usa en la presente, el término "variedad" se refiere a un grupo de
plantas en una especie que comparte caracteres constantes que las separa de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de dichas especies Mientras posee al menos un rasgo distintivo, una variedad también se caracteriza por cierta variación entre individuos dentro de la variedad, basada principalmente en la segregación mendehana de rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas Una variedad se considera "cultivo verdadero" para un rasgo particular si es genéticamente homocigoto para ese rasgo hasta el grado en que, cuando se autopoliniza la variedad de cultivo verdadero, no se observa significativa cantidad de segregación independiente del rasgo entre la progenie En la presente invención, el rasgo se origina en la expresión transgenica de una o más secuencias de ADN introducidas en una variedad vegetal Se entiende que la planta de cultivo de acuerdo con la invención incluye plantas de cultivo dicotiledóneas tales como, por ejemplo, las provenientes de las familias de Leguminosae tales como arveja, alfalfa y poroto de soja, la familia Umbelliferae, particularmente el género Daucus (muy particularmente las especies (zanahoria)) y Apium (muy particularmente la especie graveoiens var dulce (apio)) y muchas otras, la familia Solanaceae, particularmente el género Lycopersicon, muy particularmente la especie esculentum (tomate) y el género Solanum, muy particularmente la especie tuberosum (papa) y melongena (berenjena), tobáceo y muchas otras, y el genero Capsicum, muy particularmente la especie annum (pimiento) y muchas otras, la familia Leguminosae, particularmente el género Glycine, muy particularmente la especie max (poroto de soja) y muchas otras, y la familia Cruciferae, particularmente el genero Brassica, muy particularmente la especie napus (semilla oleaginosa de nabo), campestps (remolacha), olerácea cv Tastie (repollo), olerácea cv Snowball Y (coliflor) y olerácea cv Emperor (brocoli), y el género Arabidopsis, muy particularmente la especie thahana y muchas otras, la familia Compositae, particularmente el género Lactuca, muy particularmente la especie sativa (lechuga) y muchas otras, y la familia Malvaceae, particularmente el género Gossypium, muy particularmente la especie conocida como algodón, y la familia Fabaceae, particularmente el género Arachis, muy particularmente la especie hipogaea (mam) Las plantas de cultivo de acuerdo con la invención también incluyen plantas de cultivo monocotiledóneas tales como, por ejemplo, cereales tales como, cebada, sorgo y mijo, centeno, tpticale, maíz, arroz o avena, y caña de azúcar También se prefieren arboles tales como manzano, peral, membrillo, ciruelo, cerezo, duraznero, mandarino,
damasco, papaya, mango, y otras especies leñosas tales como coniferas y árboles de hojas deciduas tales como álamo, pino, sequoia, cedro, roble, etc. Especialmente se prefiere Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, semilla oleaginosa de nabo, poroto de soja, maíz, trigo, semilla de lino, papa y tagetes. La presente invención describe por ppmera vez que ACCDP es útil para aumentar el crecimiento de la raíz de una planta de cultivo, y/o su rendimiento, y/o su tolerancia a estrés ambiental. Tal como se usa en la presente, el término polipéptido se refiere a una cadena de al menos cuatro aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. La cadena puede ser lineal, ramificada, circular, o sus combinaciones. En consecuencia, la presente invención el uso en plantas de cultivo de ACCDP aislados seleccionados de cualquiera de los organismos provistos en la Columna N° 2 de la tabla 1 y de la tabla Table 2. En formas de realización de preferencia, el ACCDP se selecciona de: 1 ) cualquier polipéptido ACCDP de los que se proveen en la Columna N° 4 de la tabla 1 y de la tabla 2; y 2) sus homólogos y ortólogos. Los homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos son tal como se define a continuación. Los ACCDP de la presente invención de preferencia se producen mediante técnicas de ADN recombinantes. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido en un vector de expresión (como se describe más adelante), el vector de expresión se introduce en una célula huésped (como se descpbe más adelante) y el ACCDP se expresa en la célula huésped. Luego se puede aislar el ACCDP de las células mediante un adecuado esquema de purificación mediante técnicas estándar de purificación de polipéptidos. A los fines de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reorganizado, o modificado mediante ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, y los polinucleótidos ligados o unidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que son el resultado de eventos naturales, tales como mutaciones espontáneas. Como alternativa a la expresión recombinante, un ACCDP, o su péptido, puede ser sintetizado químicamente mediante técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, se puede aislar ACCDP nativo a partir de células (p. ej., células de Arabidopsis thaliana), por ejemplo mediante un anticuerpo anti-HSRP, que puede ser producido por técnicas estándar que utilizan un ACCDP o su fragmento. Tal como se usa en la presente, el término "estrés ambiental" se refiere a
condiciones subóptimas asociadas con estrés por salinidad, sequía, temperatura, metal, agente químico, agente patógeno y agente oxidativo, o sus combinaciones En formas de realización preferidas, el estrés ambiental puede ser seleccionado de uno o más del grupo que consiste en salinidad, sequía, o temperatura, o sus combinaciones, y en particular, puede ser seleccionado de uno o más del grupo que consiste en alta salinidad, bajo contenido de agua (sequía), o baja temperatura En una forma de realización de preferencia, el estrés ambiental es estrés por sequía Tal como también se usa en la presente, el término "eficiencia de uso de agua" se refiere a la cantidad de materia orgánica producida por una planta, dividido por la cantidad de agua usada por la planta para producirla, es decir el peso seco de una planta en relación con el uso de agua por la planta Tal como se usa en la presente, el término "peso seco" se refiere a todo lo contenido por la planta menos agua, e incluye, por ejemplo, hidratos de carbono, proteínas, aceites, y nutrientes minerales También se entiende que tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "una" puede significar uno o más, según el contexto en el cual se usa Asi, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar al menos una célula Tal como también se usa en la presente, el término "acido nucleico" y "polmucleótido" se refiere a ARN o ADN lineal o ramificado, monocatenapo o bicatenano, o uno de sus híbridos El término también abarca híbridos ARN/ADN Estos términos también abarcan secuencias no traducidas ubicadas en los extremos 3' y 5' de la región codificadora del gen al menos aproximadamente 1000 nucleotidos de secuencia corriente arriba desde el extremo 5' de la región codificadora y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de la secuencia corriente abajo desde el extremo 3' de la región codificadora del gen Bases menos comunes, tales como inosina, 5-met?lc?tos?na, 6-met?laden?na, hipoxantina, y otras también se pueden usar para apareamiento antisentido, dsARN, y de pbozíma Por ejemplo, se ha demostrado que los polmucleótidos que contienen análogos C-5 propino de updina y citidina fijan ARN con gran afinidad y son potentes inhibidores antisentido de la expresión génica También se pueden hacer otras modificaciones, tales como la modificación del esqueleto fosfodiéster, o el 2'-h?drox? en el grupo ribosa del ARN Los pohnucleótidos antisentido y las pbozímas pueden consistir totalmente por pbonucleótidos, o pueden contener mezclas de pbonucleotidos y desoxirpbonucleótidos Los polmucleótidos de la invención se pueden producir por cualquier medio, incluso preparaciones genómicas, preparaciones de cADN, síntesis m vitro, RT-PCR, y
transcripción m vitro o in vivo Una molécula "aislada" de ácido nucleico es la que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácidos nucleicos que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos) De preferencia, un ácido nucleico "aislado" está libre de algunas de las secuencias que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón natural Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado En diversas formas de realización, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica ACCDP puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de la secuencia de nucleótidos que naturalmente flanquea la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico (p ej , una célula de Arabidopsis thaliana). Un ácido nucleico también se considera aislado si ha sido alterado por intervención humana, o ubicada en un sitio o ubicación que no es su sitio natural, o si ha sido introducida en una célula por agroinfeccion Ademas, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de cADN, puede estar libre de parte del resto del material celular con el que se asocia naturalmente, o de medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros compuestos químicos cuando es sintetizado químicamente Se excluye específicamente de la definición de "ácidos nucleicos aislados": cromosomas naturales (tales como extendidos de cromosomas), bibliotecas de cromosomas artificiales, bibliotecas genómicas, y bibliotecas de cADN que existen como preparación m vitro de ácido nucleico o como preparación transfectada/transformada de células huésped, en donde las células huésped son una preparación heterogénea in vitro o plaqueadas como una población heterogénea de colonas únicas También se excluyen específicamente las bibliotecas anteriores, en donde un ácido nucleico especificado representa menos del 5% de la cantidad de inserciones de ácido nucleico en las moléculas vector También están específicamente excluidas las preparaciones de ADN genómico de célula entera o ARN de célula entera (incluso preparaciones de células enteras extendidas mecánicamente o enzimáticamente digeridas) Aun más específicamente se excluyen las preparaciones de células enteras que se encuentran en una preparación m vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis, en donde el ácido nucleico de la invención no ha sido también separado de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de electroforesis (p ej , también separa por excisión
una única banda de una población de bandas heterogéneas en gel de agarosa o blot de nailon) Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, p ej , una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleotidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de la Tabla 1 y de la Tabla 2, o una de sus porciones, se puede aislar mediante técnicas biológicas moleculares estándar y la información de secuencia provista en la presente Por ejemplo, se puede aislar un cADN de ACCDP de cualquier biblioteca de cultivos con todos o una porción de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 Ademas, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de la Tabla 1 y de la Tabla 2 mediante la reacción de cadena de polimerasa mediante cebadores de oligonucleótido diseñados en base a esta secuencia Por ejemplo, se puede aislar mARN de células vegetales (p ej , por el procedimiento de extracción de tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al , 1979, Biochemistry 18 5294-5299), y se puede preparar cADN mediante transcpptasa inversa (p ej , transcpptasa inversa Moloney MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o transcpptasa inversa AMV, disponible de Seikagaku America, Ine , St Petersburg, FL) Los cebadores sintéticos de ohgonucleótidos para amplificación por reacción en cadena de pohmerasa se pueden diseñar en base a la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las secuencias mostradas en la Columna N° 3 de la Tabla 1 y de la Tabla 2 Una molécula de acido nucleico de la invención se puede amplificar con cADN o, alternativamente, ADN genomico como molde y adecuados cebadores de oligonucleotido de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR La molécula de ácido nucleico asi amplificada se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar mediante análisis de secuencia de ADN Además, los oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleotidos ACCDP se pueden preparar por técnicas estándar de síntesis, p ej , mediante un sintetizador automático de ADN En una forma de realización de preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la invención comprende las secuencias de nucleotidos tal como se establece en cualquiera de las secuencias mostradas en la Columna N° 3 de la Tabla 1 y de la Tabla 2 Estos cADN pueden comprender las secuencias que codifican los ACCDP (es decir, la "región codificadora"), ademas de secuencias 5' no traducidas y secuencias 3'
no traducidas Alternativamente, las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender solo la región codificadora de cualquiera de las secuencias provistas en la Columna N° 3 de la Tabla 1 y de la Tabla 2, o pueden contener fragmentos genómicos aislados enteros del ADN genomico La presente invención también incluye ACCDP que codifica ácidos nucleicos codificadores de ACCDP tal como se describe en la presente Se prefiere un ácido nucleico que codifica ACCDP codificador de SHSPR tal como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOS provisto en la Columna N° 4 de la Tabla 1 y de la Tabla 2 Además, la molécula de acido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender una porción de la región codificadora de cualquiera de las secuencias provistas en la Columna N° 3 de la Tabla 1 y de la Tabla 2, por ejemplo, un fragmento que se puede usar como sonda o cebador, o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de un ACCDP Las secuencias de nucleotidos determinadas a partir de la clonación del gen ACCDP proveniente de cualquiera de los organismos provistos en la Tabla 1 y de la Tabla 2 permiten la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de homólogos de ACCDP en otros tipos celulares y organismos, además de homólogos de ACCDP provenientes de plantas de cultivo y especies relacionadas La porción de la región codificadora también puede codificar un fragmento biológicamente activo de un ACCDP Tal como se usa en la presente, el termino "porción biológicamente activa de" un
ACCDP pretende incluir una porción, p ej , un dominio/motivo, de un ACCDP que participa de la modulación del crecimiento de la raíz y/o rendimiento y/o la tolerancia a estrés en una planta, y con mayor preferencia, tolerancia a sequía A los fines de la presente invención, la modulación del crecimiento de la raíz y/o rendimiento y/o tolerancia a estrés se refiere al menos a un 10% de aumento o disminución del crecimiento de las raíces y/o rendimiento y/o la tolerancia a estrés de una planta transgenica que comprende un cásete de expresión de ACCDP (o vector de expresión), comparado con el crecimiento de la raíz y/o rendimiento y/o la tolerancia a estrés de una planta control no transgénica. Los métodos para cuantificar el crecimiento y/o rendimiento y/o la tolerancia a estrés se proveen al menos en los Ejemplos 5, 6, y 17-19 mas adelante En una forma de realización de preferencia, la porción biológicamente activa de un ACCDP aumenta el crecimiento de la raíz de una planta, de preferencia al incrementar la longitud de raíz Las porciones biológicamente activas de un ACCDP incluyen péptidos que
comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de un ACCDP, p ej , una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NOS provistos en la Columna N° 4 de la Tabla 1 y de la Tabla 2, o la secuencia de aminoácidos de un pohpéptido idéntico a un ACCDP, que incluye menos aminoácidos que un ACCDP de longitud total o el pohpéptido de longitud total que es idéntico a un ACCDP, y exhibe al menos una actividad de un ACCDP Generalmente, las porciones biológicamente activas (p ej , péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de un ACCDP Además, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas, en las cuales se eliminan otras regiones del pohpeptido, mediante técnicas recombinantes, y evaluar una o más de las actividades descritas en la presente De preferencia, la porción biológicamente activa de un ACCDP incluye uno o más dominios/motivos seleccionado o sus porciones que tienen la función de convertir ACC en s-cetobutirato y amoníaco La invención también provee polipéptidos ACCDP quiméricos o de fusión Tal como se usa en la presente, un "po péptido ACCDP quimérico" o "polipéptido ACCDP de fusión" comprende un ACCDP ligado operativamente a un no ACCDP Un ACCDP se refiere a un pohpéptido con una secuencia de aminoácidos correspondiente a un ACCDP, mientras que un no ACCDP se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente idéntico al ACCDP, p ej , un pohpeptido diferente de ACCDP y derivado de un organismo igual o diferente Respecto del polipéptido de fusión, el término "ligado operativamente" pretende indicar que el ACCDP y el no ACCDP se fusionan entre sí de manera tal que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia usada El no ACCDP se puede fusionar al N terminal o C terminal del ACCDP Por ejemplo, en una forma de realización, el pohpéptido de fusión es un pohpéptido de fusión GST-ACCDP en el cual las secuencias ACCDP se fusionan a C terminal de las secuencias GST Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de los ACCDP recombinantes En una forma de realización, el polipéptido de fusión es un ACCDP que contiene una secuencia señal heterologa en su N-terminal En ciertas células huésped (p ej , células huésped de mamíferos), la expresión y/o la secreción de un ACCDP pueden aumentar mediante el uso de una secuencia señal heteróloga De preferencia, un polipéptido ACCDP quimérico o de fusión de la invención se
produce mediante técnicas estándar de ADN recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las distintas secuencias de polipéptido están ligadas en el marco de acuerdo con las técnicas convencionales, por ejemplo al emplear terminales con extremos romos o escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proveer las terminales adecuadas, rellenar los extremos cohesivos según corresponda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseada y la ligadura enzimática. En otra forma de realización, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluso sintetizadores automáticos de ADN. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos génicos se puede llevar a cabo mediante el uso de cebadores de anclaje que dan origen a superposiciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que luego se pueden fusionar y reamplificar para generar una secuencia de gen quimérico (Ver, por ejemplo, Current Protocols ¡n Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión disponibles en el comercio ya codifican un residuo de fusión (p. ej., un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica ACCDP se puede clonar a dicho vector de expresión de manera tal que el residuo de fusión se liga dentro del marco con el ACCDP. Además de los fragmentos y polipéptidos de fusión de los ACCDP descritos en la presente, la presente invención incluye homólogos y análogos de ACCDP naturales y ACCDP que codifican ácidos nucleicos en una planta. Los "homólogos" se definen en la presente como dos ácidos nucleicos o polipéptidos con similares o "idénticos" nucleótido o secuencias de aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, paralogos, agonistas, y antagonistas de ACCDP tal como se definen más adelante. El término "homólogo" también abarca moléculas de ácidos nucleicos que difieren de la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 (y sus porciones) debido a la degeneración del código genético, y en consecuencia codifican el mismo ACCDP que el codificado por la correspondiente secuencia de nucleótidos establecida en tales SEQ ID NO según se provee en la Columna N° 3 de la Tabla 1 y de la Tabla 2. Tal como se usa en la presente, un ACCDP "natural" se refiere a una secuencia de aminoácidos ACCDP que aparece en la naturaleza. De preferencia, un ACCDP natural comprende una secuencia de aminoácidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de la Tabla 1 y de la Tabla 2.
Un agonista de ACCDP puede retener sustancialmente la misma, o un subtipo de las actividades biológicas de ACCDP Un antagonista de ACCDP puede inhibir una o más de las actividades de la forma natural del ACCDP Las moléculas de ácidos nucleicos correspondientes a vanantes alehcas naturales y análogos, ortólogos, y paralogos de un cADN ACCDP se pueden aislar sobre la base de su identidad con los ácidos nucleicos ACCDP descritos en la presente mediante cADN de ACCDP, o una de sus porciones, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación rigurosas En una forma de realización alternativa, los homólogos de ACCDP se pueden identificar mediante el análisis combinado de bibliotecas de mutantes, p ej , mutantes de truncación de ACCDP para la actividad de agonistas o antagonistas de ACCDP En una forma de realización, se genera una biblioteca vanada de vanantes de ACCDP por mutagenesis combinatoria a nivel del ácido nucleico y se codifica mediante una biblioteca vanada de gen Una biblioteca vanada de vanantes ACCDP se puede producir, por ejemplo, por ligadura enzimática que liga una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas tales que se expresa un conjunto degenerado de posibles secuencias ACCDP como polipeptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de pohpéptidos de función mas grandes (p ej , para la disposición del fago) que contiene el conjunto de secuencias ACCDP Existen diversos métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de posibles homólogos de ACCDP provenientes de una secuencia degenerada de oligonucleótidos La síntesis química de una secuencia genica degenerada se puede realizar en un sintetizador automático de ADN, y luego se liga el gen sintético en un adecuado vector de expresión El uso de un conjunto degenerado de genes permite proveer, en una mezcla, la totalidad de las secuencias que codifican el conjunto deseado de posibles secuencias ACCDP Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en el arte Además, se pueden usar las bibliotecas de fragmentos de regiones que codifican ACCDP para generar una vanada población de fragmentos ACCDP para la detección y la posterior selección de homólogos de un ACCDP En una forma de realización, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencias codificadoras al tratar un fragmento bicatenapo de PCR de una secuencia codificadora de ACCDP con una nucleasa en condiciones en las cuales se producen muescas solo aproximadamente una vez por molécula, se desnaturaliza el ADN bicatenapo, se renaturahza el ADN para formar ADN
bicatenario, que puede incluir pares de sentido/antisentido desde distintos productos con muescas, extraer porciones monocatenarías a partir de dobletes reformados por tratamiento con S1 nucleasa, y ligadura de la biblioteca de fragmentos obtenida en un vector de expresión. Por este método se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N terminal, C terminal, y fragmentos internos de diversos tamaños de ACCDP. Se conocen varias técnicas en el arte para detectar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas mediante mutaciones puntuales o truncaci?n, y para analizar bibliotecas de cADN para detectar productos génicos con una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptable al análisis rápido de las bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatoria de homólogos ACCDP. Las técnicas más ampliamente usadas, pasibles de análisis de alto resultado para detectar grandes bibliotecas génicas generalmente incluyen ia clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, para transformar adecuadas células con biblioteca de vectores resultante, y expresar los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad buscada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detecta. La mutagénesis de ensamblado recursivo (REM), una técnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de detección para identificar homólogos de ACCDP (Arkin y Yourvan, 1992, PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Polypeptide Engineering 6(3):327-331 ). En otra forma de realización, los ensayos basados en células pueden ser utilizados para analizar una variada biblioteca de ACCDP, mediante el uso de métodos bien conocidos en el arte. La presente invención también provee un método para identificar un nuevo ACCDP, que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpo contra un ACCDP, o uno de sus fragmentos, tal como se describe en la presente; (b) analizar el posible material ACCDP con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de un nuevo ACCDP posible; y (c) analizar el material fijado en comparación con el ACCDP conocido, a fin de determinar su novedad. Tal como se estableció con anterioridad, la presente invención se refiere a ACCDP y sus homólogos. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos (p. ej., la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, y una de sus formas mutantes), las
secuencias se alinean a fin de lograr la comparación óptima (p ej , se pueden introducir brechas en la secuencia de un polipéptido para el alineamiento óptimo con el otro pohpéptido o ácido nucleico) Luego se comparan los residuos de aminoácidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos Cuando una posición en una secuencia (p ej , la secuencia de cualquier SEQ ID NOS provisto en la Columna N° 4 de la Tabla 1 y de la Tabla 2) es ocupado por los mismos residuos de aminoácido que la correspondiente posición en la otra secuencia (p ej , la secuencia de una forma mutante del correspondiente SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2), entonces las moléculas son idénticas en dicha posición Se puede hacer el mismo tipo de comparación entre dos secuencias de ácidos nucleicos El porcentaje de identidad de secuencia entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencia = cantidad de posiciones idénticas/cantidad total de posiciones x 100) De preferencia, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención son al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad de toda una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2 En aun otra forma de realización, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención are al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o mas de identidad de toda una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 En otra forma de realización de preferencia, un homologo aislado de ácidos nucleicos de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 40-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con aun mayor preferencia al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad con una secuencia de nucleotidos mostrada en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2, o con una
porción que comprende al menos 60 de sus nucleotidos consecutivos La longitud de comparación de secuencia de preferencia para los ácidos nucleicos es al menos de 75 nucleotidos, con mayor preferencia al menos de 100 nucleotidos, y con mayor preferencia toda la longitud de la región codificadora Es aun mas preferible que los homólogos de ácido nucleico codifican proteínas con homología con cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2 También se prefiere que el homólogo aislado de ácido nucleico de la invención codifica un ACCDP, o una de sus porciones, que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, y que funciona como modulador de crecimiento de la raíz, y/o rendimiento, y/o una respuesta de estrés ambiental en una planta En una forma de realización de mayor preferencia, la sobreexpresion del homologo de ácido nucleico en una planta aumenta el crecimiento de la raíz de la planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia de la planta a un estrés ambiental En una forma de realización de mayor preferencia, el homólogo de ácido nucleico codifica un ACCDP que puede convertir ACC en s-cetobutirato y amoníaco A los fines de la invención, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos se determina mediante el paquete de software Vector NTI 9 0 (PC) (Invitrogen, 1600 Faraday Ave , Carlsbad, CA92008) Se usan una penalidad de apertura de brecha de 15 y una penalidad de extensión de brecha de 6,66 para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos Se usan una penalidad de apertura de brecha de 10 y una penalidad de extensión de brecha de 0,1 para determinar el porcentaje de identidad de dos polipeptidos Todos los demás parámetros se fijan como parámetros por defecto A los fines de una alineación múltiple (algoritmo Clustal W), la penalidad de apertura de brecha es 10, y la penalidad de extensión de brecha es 0,05 con matriz blosum62 Se debe entender que a los fines de determinar la identidad de secuencia al comparar una secuencia ADN con una secuencia ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo En otro aspecto, la invención se refiere a un acido nucleico aislado que comprende un polmucleótido que se híbrida al pohnucleótido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 en condiciones rigurosas Más particularmente, una molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la invención tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y se híbrida en condiciones rigurosas a la molécula
de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 En otras formas de realización, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250, o más nucleótidos de longitud De preferencia, un homólogo de ácido nucleico aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se híbrida en condiciones muy rigurosas a la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 y funciona como modulador del crecimiento de la raíz, y/o rendimiento, y/o tolerancia a estrés en una planta En tros forma de realización de preferencia, la sobreexpresión del homólogo aislado del ácido nucleico en una planta aumenta el crecimiento de la raíz de la planta, y/o rendimiento, y/o tolerancia a un estrés ambiental En una forma de realización de aun mayor preferencia, el homólogo aislado del ácido nucleico codifica un ACCDP que puede convertir ACC en s-cetobutirato y amoniaco Tal como se usa en la presente respecto de la hibridación de ADN a un ADN blot, el termino "condiciones rigurosas" se puede referir a hibridación durante la noche a 60°C en 10X de solución de Denhart, 6X de SSC, 0,5% de SDS, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado Los blot se lavan en secuencia a 62°C durante 30 minutos cada vez en 3X de SSC/0,1 % de SDS, seguido de 1X de SSC/0,1 % de SDS, y finalmente 0,1X de SSC/0,1 % de SDS En una forma de realización de preferencia, la frase "condiciones rigurosas" se refiere a la hibridación en una solución 6X de SSC a 65°C Tal como también se usa en la presente, "condiciones muy rigurosas" se refiere a una hibridación durante la noche a 65°C en 10X de solución de Denhart, 6X de SSC, 0,5% de SDS, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado Los blot se lavan en secuencia a 65°C durante 30 minutos cada vez en 3X de SSC/0,1 % de SDS, seguido de 1X de SSC/0,1% de SDS, y finalmente 0.1X de SSC/0,1 % de SDS Los métodos para la hibpdización de ácido nucleico se describen en Meinkoth y Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138 267-284, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al. Eds., Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York, 1995, y Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hibpdation with nucleic acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, Nueva York, 1993 De preferencia, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención que se híbrida en condiciones rigurosas o muy rigurosas a una secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 corresponde a una molécula natural de acido nucleico. Tal como
se usa en la presente, una molécula "natural" de ácido nucleico se refiere a una molécula de ARN o ADN con una secuencia de nucleótidos que aparece en la naturaleza (p. ej., codifica un polipéptido natural). En una forma de realización, el ácido nucleico codifica un ACCDP natural. Mediante los métodos antes descritos, y otros conocidos por los expertos en el arte, un experto en el arte puede aislar homólogos de los ACCDP que comprenden secuencias de aminoácidos mostrados en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2. Un subtipo de estos homólogos son las variantes alélicas. Tal como se usa en la presente, el término "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de un ACCDP y que existen dentro de una población natural (p. ej., una especie o variedad vegetal). Dichas variaciones alélicas naturales generalmente dan por resultado un 1-5% de varianza en un ácido nucleico ACCDP. Las variantes alélícas se pueden identificar al determinar la secuencia del ácido nucleico de interés en numerosas plantas diferentes, que se puede realizar con facilidad al usar sondas de hibridación para identificar el mismo sitio génico ACCDP en esas plantas. Todas y cada una de estas variaciones de ácidos nucleicos y los resultantes polimorfismos o variaciones de aminoácidos en un ACCDP, que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de un ACCDP, pretenden estar dentro del alcance de la invención. Además, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican ACCDP de la misma especie o de otras especies, tales como análogos, ortólogos, y paralogos, pretenden estar dentro del alcance de la presente invención. Tal como se usa en la presente, el término "análogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que tiene la misma función, o una similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. Tal como se usa en la presente, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de diferentes especies, pero que han evolucionado desde un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos con la misma función, o una similar. Tal como también se usa en la presente, el término "paralogos" se refiere a dos ácidos nucleicos relacionados por duplicación dentro de un genoma. Por lo general, los paralogos tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas (Tatusov, R.L. et al., 1997, Science 278(5338):631-637). Los análogos, ortólogos, y paralogos de un ACCDP natural pueden diferir del ACCDP natural por modificaciones
posteriores a la traducción, por diferencias en las secuencias de aminoácidos, o por ambos. Las modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivación química in vivo e in vitro de polipéptidos, p. ej., acetilaci?n, carboxilación, fosforilación, o glucosilación, y dichas modificaciones pueden ocurrir durante la sintesis o el procesamiento del polipéptido o después del tratamiento con enzimas aisladas modificadas. En particular, los ortólogos de la invención generalmente exhiben al menos 80-85%, con mayor preferencia, 85-90% o 90-95%, y con máxima preferencia 95%, 96%, 97%, 98%, o incluso 99% de identidad, o 100% de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de una secuencia de aminoácidos natural de ACCDP, y exhibirá una función similar a un ACCDP. De preferencia, un ortólogo de ACCDP de la presente invención funciona como modulador del crecimiento y/o una respuesta al estrés ambiental en una planta y/o convierte ACC en s-cetobutirato y amoníaco. Con mayor preferencia, un ortólogo de ACCDP aumenta el crecimiento y/o tolerancia a estrés de una planta. En una forma de realización, los ortólogos de ACCDP pueden convertir ACC en o-cetobutirato y amoníaco. Además de las variantes naturales de una secuencia de ACCDP que pueden existir en la población, el experto en el arte también apreciará que se pueden introducir cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, lo cual conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos del ACCDP codificado, sin alterar la actividad funcional del ACCDP. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótido que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos "no esenciales" de aminoácidos en una secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2. Un residuo "no esencial" de aminoácido es un residuo que se puede alterar respecto de la secuencia de tipo salvaje de uno de los ACCDP sin alterar la actividad de dicho ACCDP, mientras que se requiere un residuo "esencial" de aminoácido para la actividad de ACCDP. Otros residuos de aminoácido, sin embargo, (p. ej., los no conservados o solo semiconservados en el dominio con actividad ACCDP) pueden no ser esenciales para la actividad y en consecuencia es probable que se pueda alterar sin que se altere la actividad de ACCDP. En consecuencia, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican ACCDP que contiene cambios de los residuos de aminoácido que no son esenciales para la actividad ACCDP. Dichos ACCDP difieren en secuencia de aminoácidos respecto de una secuencia contenida en cualquier SEQ ID NOS tal como se
provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de ia Tabla 2, y retiene al menos una de las actividades ACCDP descritas en la presente En una forma de realización, la molécula aislada de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un poltpéptido, en donde el po péptido comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 50-60% de identidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, con mayor preferencia al menos aproximadamente 60-70% de identidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, con aun mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95% de identidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2 Los homólogos de ACCDP de preferencia de la presente invención de preferencia participan en el crecimiento de la raíz de una planta y/o rendimiento y/o en la respuesta de tolerancia a estrés en una planta, o más particularmente, pueden convertir ACC en s-cetobutirato y amoníaco Se puede crear una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un ACCDP con identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de cualquier SEQ ID NOS, tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, al introducir una o más sustituciones, adiciones, o deleciones de nucleótido en una secuencia de nucleótidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2, dichas una o más sustituciones, adiciones, o deleciones de aminoácidos se introducen en el pohpéptido codificado Las mutaciones se pueden introducir en la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 mediante técnicas estándar, tales como mutagenesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR De preferencia, se hacen sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido con cadena lateral similar Las familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares han sido definidas en el arte Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej , lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (p ej , acido aspártico, ácido
glutamico), cadenas laterales polares sin carga (p ej , glicina, asparagina, glutamina, sepna, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p ej , alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, tpptofano), cadenas laterales con ramificación beta (p ej , treonina, vahna, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (p ej , tirosina, fenilalanina, tpptófano, histidina) En consecuencia, de preferencia un residuo de aminoácido previsto no esencial en ACCDP se reemplaza por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral Alternativamente, en otra forma de realización, se pueden introducir mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia que codifica ACCDP, por ejemplo mutagenesis por saturación, y se analiza en los mutantes obtenidos la actividad ACCDP descrita en la presente, para detectar mutantes que retienen la actividad ACCDP Después de la mutagénesis de la secuencia de cualquiera SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2, el pohpéptido codificado se puede expresar en forma recombinante y determinar la actividad del polipéptido por análisis del crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés de una planta que expresa el pohpéptido tal como se describe al menos en los Ejemplos 5, 6, y 17-19 Además, se pueden crear ácidos nucleicos de ACCDP- optimizados De preferencia, un ácido nucleico de ACCDP optimizado codifica un ACCDP que modula el crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a un estrés ambiental, y con mayor preferencia aumenta el crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a un estrés ambiental tras su sobreexpresión en la planta. Tal como se usa en la presente, "optimizado" se refiere a un acido nucleico sometido a ingeniería genética para incrementar su expresión en determinada planta o animal Para proveer ácidos nucleicos de ACCDP optimizados vegetales, la secuencia de ADN del gen se puede modificar para 1 ) comprender codones preferidos por genes vegetales altamente expresados, 2) comprender un contenido de A+T en la composición de bases de nucleótidos tal como el sustancialmente hallado en las plantas, 3) formar una secuencia de iniciación, o 4) eliminar las secuencias que causan desestabi zación, pohadenilación inadecuada, degradación y terminación de ARN, o que forma horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN El aumento de expresión de los ácidos nucleicos ACCDP en plantas se puede lograr mediante la utilización de la frecuencia de distribución de uso de codones en plantas en general o en una planta particular Los métodos para optimizar la expresión de ácidos nucleicos en plantas se
pueden hallar en EPA 0359472, EPA 0385962, solicitud de PCT N° WO 91/16432, patente de los Estados Unidos N° 5 380 831 , patente de los Estados Unidos N° 5 436 391 , Perlack et al , 1991 , Proc Natl Acad Sci USA 88 3324-3328, y Murray et al , 1989, Nucleic Acid Res 17 477-498 Tal como se usa en la presente, "frecuencia de uso de codón de preferencia" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped especifica en el uso de codones de nucleótidos para especificar determinados aminoácidos A fin de determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, la cantidad de apariciones de dicho codon en el gen se divide por la cantidad total de apariciones de todos los codones que especifican el mismo aminoácido en el gen De modo similar, la frecuencia de uso de codones preferidos exhibida por una célula huésped se puede calcular por promedio de la frecuencia de uso de codón de preferencia en una gran cantidad de genes expresados por la célula huésped Se prefiere limitar este análisis a los genes altamente expresados por la célula huésped La desviación porcentual de la frecuencia de uso de codones preferidos para un gen sintético respecto del empleado por una célula huésped se calcula primero por determinación de la desviación porcentual de la frecuencia de uso de un codón único respecto del de la célula huésped, seguido de la obtención de la desviación promedio para todos los codones Tal como se define en la presente, este cálculo incluye codones únicos (es decir, ATG y TGG) En términos generales, la desviación promedio global del uso de codón en un gen optimizado respecto del de una célula huésped se calcula mediante la ecuación 1A = n = 1 Z X„ - Yn Xn por 100 Z, en donde Xn = frecuencia de uso de codón n en la célula huésped, Yn = frecuencia de uso de codón n en el gen sintético, n representa un codón individual que especifica un aminoácido, y la cantidad total de codones es Z La desviación global de la frecuencia de uso de codon A para todos los aminoácidos de preferencia debería ser de aproximadamente 25%, y con mayor preferencia menos de aproximadamente 10% En consecuencia, un ácido nucleico ACCDP se puede optimizar de manera tal que su frecuencia de distribución de uso de codón se desvíe, de preferencia, no más del 25% respecto de los genes vegetales altamente expresados y, con mayor preferencia, no más de aproximadamente 10% Además, se considera el porcentaje de contenido de G+C de la tercera base degenerada (las monocotiledóneas parecen preferir G+C en esta posición a diferencia de las dicotiledóneas) También se reconoce que el nucle?tido XCG (en donde X es A, T, C, o G) es el codón menos preferido en dicotiledóneas mientras que se
evita el codón XTA en monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos ACCDP optimizados de la presente invención de preferencia también tienen índices de evitación del doblete CG y TA muy aproximados de los de la planta huésped elegida (p. ej., Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, etc.). Con mayor preferencia, estos índices se desvían respecto de los del huésped en no más de aproximadamente 10-15%. Además de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los ACCDP antes descritos, otro aspecto de la invención se refiere a las moléculas aisladas de ácidos nucleicos que son antisentido respecto de ellas. Se cree que los polinucleótidos antisentido inhiben la expresión génica de un polinucleótido blanco al fijar específicamente el polinucleótido blanco e interferir en la transcripción, el empalme, el transporte, la traducción, y/o la estabilidad del polinucleótido blanco. Se describen métodos en el arte previo para dirigir el polinucleótído antisentido hacia el ADN cromosómico, a una transcripción de ARN primapo, o a un mARN procesado. De preferencia, estas regiones blanco incluyen sitios de empalme, codones de iniciación de la traducción, codones de terminación de la traducción, y otras secuencias dentro del marco de lectura abierto. El término "antisentido" a los fines de la invención, se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido suficientemente complementario a todos o una porción de un gen, transcripción primaria, o mARN procesado, a fin de interferir en la expresión del gen endógeno. Los polinucleótidos "complementarios" son los con capacidad de apareamiento de bases de acuerdo con las normas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Específicamente, las purinas aparean sus bases con pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con timina (A:T) en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleótidos se pueden hibridar entre sí aun si no son completamente complementarios entre sí, siempre que cada uno tenga al menos una región que es sustancialmente complementaria con el otro. El término "ácido nucleico antisentído" incluye ARN monocatenario además de casetes de expresión de ADN bícatenario que se pueden transcribir para obtener un ARN antisentído. Los ácidos nucleicos antisentido "activos" con moléculas de ARN antisentido capaces de hibridarse selectivamente con una transcripción primaria o mARN que codifica un polipéptido con al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a toda una cadena
codificadora de ACCDP, o solo a una de sus porciones. En una forma de realización, una molécula antisentido de ácido nucleico es antisentido a una "región codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica un ACCDP. El término "región codificadora" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones traducidos en residuos de aminoácido. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región no codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica un ACCDP. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora no traducida en aminoácidos (es decir, también referida como regiones 5' y 3' no traducidas). La molécula antisentido de ácido nucleico puede ser complementaria a toda la región codificadora de mARN de ACCDP, pero con mayor preferencia es un oligonucleótido antisentido solo a una porción de la región que codifica o que no codifica del mARN de ACCDP. Por ejemplo, el oligonucle?tido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de mARN de ACCDP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 nucleótidos de longitud. Generalmente, las moléculas antisentido de la presente invención comprenden un ARN con 60-100% de identidad de secuencia con al menos 14 nucleótidos consecutivos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 o un polinucleótido que codifica un polipéptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2. De preferencia, la identidad de secuencia será al menos del 70%, con mayor preferencia al menos del 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98%, y con máxima preferencia del 99%. Un ácido nucleico antisentido de la invención se puede construir por reacciones de síntesis química y ligadura enzimática, mediante procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (p. ej., un oligonucleótído antisentido) se puede sintetizar químicamente con nucleótidos naturales o diversos nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del doblete formado entre los ácidos nucleicos con sentido y antisentido, p. ej., se pueden usar nucleótidos sustituidos con derivados de fosforotioato y acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouraciloi, 5-clorouracilo, 5- yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcítosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiourídina, 5-carboxímetilaminometiluracilo, díhidrouracilo,
beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-?sopenten?laden?na, 1-met?lguan?na, 1-metilinosina, 2,2-d?met?lguan?na, 2-met?laden?na, 2-met?lguan?na, 3-met?lc?tos?na, 5-metilcitosina, N6-aden?na, 7-met?lguan?na, 5-met?lam?nomet?lurac?lo, 5-metox?am?nomet?l-2-t?ourac?lo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metox?carbox?met?lurac?lo, 5-metoxiuracilo, 2-met?lt?o-N6-?sopenten?laden?na, acido urac?l-5-ox?acét?co (v), wibutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-t?oc?tos?na, 5-met?l-2-t?ourac?lo, 2-t?ourac?lo, 4-tiouracilo, 5-met?lurac?lo, éster metílico de acido urac?l-5-ox?acet?co, ácido urac?l-5-oxiacetico (v), 5-met?l-2-t?ourac?lo, 3-(3-am?no-3-N-2-carbox?prop?l)urac?lo, (acp3)w, y 2,6-d?am?nopupna Alternativamente, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente mediante un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito desde el acido nucleico insertado tendrá orientación antisentido respecto de un acido nucleico blanco de interés, descrito también en la siguiente subsección) En aun otra forma de realización, la molécula antisentido de acido nucleico de la invención es una molécula de ácido nucleico a-anomepca Una molécula de ácido nucleico a-anomepca forma híbridos bicatenanos específicos con ARN complementario en el cual, en contrario d las unidades ß habituales, las cadenas son paralelas entre sí (Gaultier et al , 1987, Nucleic Acids Res 15 6625-6641 ) Las moléculas de ácidos nucleicos antisentido también pueden comprender un 2'-0-met?lr?bonucleót?do (Inoue et al , 1987, Nucleic Acids Res 15 6131-6148) o un análogo ARN-ADN (Inoue et al , 1987, FEBS Lett 215 327-330) Las moléculas de ácidos nucleicos antisentido de la invención generalmente se administran a una célula o se generan in situ de manera tal que se hibpdan o fijan un mARN celular y/o ADN genómico que codifica un ACCDP para asi inhibir la expresión del polipeptido, p ej , al inhibir la transcripción y/o la traducción La hibridación puede ser por complementapedad convencional de nucleotido para formar un doblete estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dobletes de ADN, mediante interacciones específicas en la cavidad mayor de la doble hélice La molécula antisentido se puede modificar de manera tal que se fija específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, p ej , por ligadura de la molécula de ácido nucleico antisentido con un peptido o un anticuerpo que se fija a una receptor de superficie celular o antígeno La molécula de acido nucleico antisentido también se puede proveer a células con los vectores descritos en la presente
A fin de lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vectores en las cuales la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte procaponte, viral, o eucaponte (incluso vegetal) Como alternativa a los po nucleótidos antisentido, se pueden usar pbozímas, pohnucleótidos con sentido, o ARN bicatenapo (dsARN) para reducir la expresión de un polipéptido ACCDP Tal como se usa en la presente, el termino "pbozíma" se refiere a una enzima catalítica basada en ARN con actividad de ribonucleasa, que es capaz de escindir un acido nucleico monocatenapos, por ejemplo mARN, con el cual tiene una región complementaria Las pbozímas (p ej , pbozímas de cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334 585-591 ) se pueden usar para escindir catalíticamente las transcripciones de mARN de ACCDP y asi inhibir la traducción de mARN de ACCDP Se puede diseñar una pbozíma con especificidad por un ácido nucleico codificador de ACCDP en base de la secuencia de nucleotidos de cADN de un ACCDP, tal como se describe en la presente (es decir, cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 ) o en base a una secuencia heterologa que se aisla de acuerdo con métodos enseñados en la presente invención Por ejemplo, se puede construir un derivado de ARN de Tetrahimena L-19 IVS en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementario de la secuencia de nucleótidos que se escinde en un mARN codificador de ACCDP Ver, p ej , de patente de los Estados Unidos N° 4 987 071 y 5 116 742 de Cech et al Alternativamente, se puede usar mARN de ACCDP para seleccionar un ARN catalítico con actividad especifica de ribonucleasa de un pool de moléculas ARN Ver, p ej , Bartel, D y Szostak, J W , 1993, Science 261 1411- 1418 En formas de realización de preferencia, la pbozíma contendrá una porción con al menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleotidos, y con mayor preferencia 7 u 8 nucleotidos, con 100% de complementapedad con una porción del ARN blanco Los métodos para preparar pbozímas son conocidos por los expertos en el arte Ver, p ej , patentes de los Estados Unidos N° 6 025 167, 5 773 260, y 5 496 698 El término "dsARN," tal como se usa en la presente, se refiere a híbridos de ARN que comprenden dos cadenas de ARN Los dsARNs pueden tener estructura lineal o circular En una forma de realización de preferencia, dsARN es específico de un po nucleotido que codifica el polipéptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2 o un pohpeptido con al menos 80% de
identidad de secuencia con un polipeptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2 Los ARN que se hibpdan pueden tener complementariedad sustancial o completa Por "complementapedad sustancial" se entiende que cuando los del ARN hibpdados se alinean en forma óptima mediante el programa BLAST antes descrito, las porciones hibpdazas tienen al menos 95% de complementapedad De preferencia, el dsARN tendrá al menos 100 pares de bases de longitud Generalmente, los ARN hibpdados RNAs tienen idéntica longitud, sin extremos 5' o 3' sobrantes y sin brechas Sin embargo, se pueden usar dsARNA con sobrantes 5' o 3' de hasta 100 nucleótidos en los métodos de la invención El dsARN puede comprender pbonucleótidos, análogos de pbonucleótidos tales como residuos 2'-0-met?lr?bos?lo, o sus combinaciones Ver, p ej , las patentes de los Estados Unidos N° 4 130 641 y 4 024 222 Se describe un dsARN de ácido polirpboinosínico ácido polirpbocitidihcoen la patente de los Estados Unidos N° 4 283 393 Los métodos para preparar y usar dsARN se conocen en el arte Un método comprende la transcripción simultánea de dos cadenas complementarias de ADN, m vivo, o en una única mezcla de reacción m vitro Ver, p ej , la patente de los Estados Unidos N° 5 795 715 En una forma de realización, se puede introducir dsARN en una planta o célula vegetal directamente mediante procedimientos de transformación estándar Alternativamente, se puede expresar dsARN en una célula vegetal al transcribir dos ARNs complementarios Otros métodos para la inhibición de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo la formación de una hélice triple (Moser et al , 1987, Science 238 645-650 y Cooney et al , 1988, Science 241 456-459) y cosupresion (Napoh et al , 1990, The Plant Cell 2 279- 289) son conocidos en el arte Se han usado cADN de longitud parcial y total para la cosupresión de genes endógenos vegetales Ver, p ej , las patentes de los Estados Unidos N° 4 801 340, 5 034 323, 5 231 020, y 5 283 184, Van der Kroll et al , 1990, The Plant Cell 2 291-299, Smith et al , 1990, Mol Gen Genetics 224 477-481 , y Napoli et al , 1990, The Plant Cell 2 279-289 Para la supresión con sentido se cree que la introducción de un polinucleótido con sentido bloquea la transcripción del correspondiente gen blanco El pohnucle?tido con sentido tendrá al menos 65% de identidad de secuencia con el gen vegetal blanco o ARN De preferencia, el porcentaje de identidad es al menos 80%, 90%, 95%, o más El pohnucleotido con sentido introducido no necesita tener la longitud total respecto del gen
blanco o transcripción De preferencia, el pohnucleótido con sentido tendrá al menos 65% de identidad de secuencia con al menos 100 nucleotidos consecutivos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 Las regiones de identidad pueden comprender intrones y/o exones y regiones no traducidas El polinucleotido con sentido introducido puede estar presente en la célula vegetal en forma transitoria, o se puede integrar en forma estable en un cromosoma vegetal o replicón extracromosómico Alternativamente, se puede inhibir la expresión genica de ACCDP al dirigir la secuencia de nucleótidos complementaria a la región reguladora de una secuencia de nucleotidos ACCDP (p ej , un promotor y/o mejorados de ACCDP) para formar estructuras de hélices triples que impiden la transcripción de un gen ACCDP en células blanco Ver en general, Helene, C , 1991 , Anticancer Drug Des 6(6) 569-84, Helene, C et al , 1992, Ann N Y Acad S 660 27-36, y Maher, L J , 1992, Bioassays 14(12) 807-15 Además de los ácidos nucleicos y pohpéptidos de ACCDP antes descritos, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y pohpeptidos adosados a un residuo Estos residuos incluyen, sin limitaciones, residuos de detección, residuos de hibridación, residuos de purificación, residuos de provisión, residuos de reacción, residuos de fijación, y similares Un grupo típico de ácidos nucleicos con residuos adosados son las sondas y los cebadores Las sondas y los cebadores generalmente comprenden un oligonucleótido sustancialmente aislado El o gonucleotido generalmente comprende una región de la secuencia de nucleótidos que se híbrida en condiciones rigurosas al menos a aproximadamente 12, de preferencia aproximadamente 25, con mayor preferencia aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos consecutivos de una cadena con sentido de la secuencia establecida en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2, una secuencia antisentido de la secuencia establecida en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2, o sus mutantes natural Los cebadores basados en una secuencia de nucleótidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 se pueden usar en reacciones PCR para clonar homólogos de ACCDP Las sondas en las secuencias de nucleótidos ACCDP se pueden usar para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifican el mismo polipeptido o unos sustancialmente idénticos En formas de realización de preferencia, la sonda también comprende un grupo
de rotulo adosado, p ej , el grupo de rótulo puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima Dichas sondas se pueden usar como parte de un kit de prueba para marcadores genomicos, para identificar células que expresan un ACCDP, por ejemplo por medición del nivel de un acido nucleico que codifica ACCDP, en una muestra de células, p ej , detectar los niveles de mARN de ACCDP o determinar si un gen genómico de ACCDP ha sido mutado o eliminado En particular, un método útil para asegurar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mARN disponible para la traducción al producto génico) consiste en realizar un Northern blot (para referencias, ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Nueva York) La información proveniente del Northern blot al menos demuestra en parte el grado de transcripción del gen transformado Se puede preparar el ARN celular total a partir de células, tejidos, u órganos por vanos métodos, todos bien conocidos en el arte, tales como el descrito en Bormann, E R et al , 1992, Mol Microbiol 6 317-326 Para evaluar la presencia o cantidad relativa de po péptido traducido a partir de dicho mARN, se pueden emplear técnicas estándar, tales como Western blot Estas técnicas son bien conocidas para los expertos en el arte (Ver, por ejemplo, Ausubel et al , 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Nueva York) La invención también provee un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de ACCDP, en donde la expresión del vector en una célula huésped da por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o rendimiento y/o tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la célula huésped Tal como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un rizo de ADN circular bicatenapo ADN en el que se pueden ligar segmentos ADN adicionales Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN al genoma viral Ciertos vectores tienen capacidad para la replicación autónoma en una célula huésped, en la que son introducidos (p ej , vectores bacterianos con un origen bacteriano de replicaaón y vectores episómicos de mamífero) Otros vectores (p ej , vectores no episódicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y luego se replican con el genoma del huésped Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que esta ligado operativamente
Dichos vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión " En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar en forma indistinta, dado que el plasmido es la forma mas comúnmente usada de vector Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vector de expresión, tales como vectores virales (p ej , retrovirus, adenovirus, y virus adenoasociados con defectos de la rep cación), que cumplen funciones equivalentes Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del acido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped usadas para la expresión, que están ligados operativamente a la secuencia de ácido nucleico expresada Tal como se usa en la presente con respecto a un vector de expresión recombinante, "ligado operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a la(s) secuenc?a(s) reguladoras de manera tal que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p ej , en un sistema m vitro de transcripción/traducción o en una célula huésped, cuando el vector se introduce en la célula huésped) El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, mejoradores, y otros elementos de control de expresión (p ej , señales de poliadenilación) Dichas secuencias reguladoras se describen por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds Ghck y Thompson, Capítulo 7, 89-108, CRC Press Boca Ratón, Florida, incluidas sus referencias Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y los que dirigen la expresión directa de la secuencia de nucleotidos solo en ciertas células huésped o en ciertas condiciones Los expertos en el arte apreciaran que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión del pohpeptido deseado, etc Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para así producir po péptidos o péptidos, incluso polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en la presente (p ej , ACCDP, formas mutantes de ACCDP, polipéptidos de fusión, etc )
Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de ACCDP en células procariontes y eucariontes. Por ejemplo, los genes de ACCDP se pueden expresar en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insectos (con vectores de expresión de baculovirus), levaduras y otras células fúngicas (ver Romanos, M.A. et al., 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, CA.M.J.J. et al., 1991 , Heterologous gene expresesion in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungí, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C. A.M. J.J. & Punt, P.J., 1991 , Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungí, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 ), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritríchia, Spírotrichia, Suctoria, Tetrahimena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stilonychia, especialmente del género Stilonychia lemnae con vectores que siguen un método de transformación como el descrito en la solicitud de PCT N° WO 98/01572, y células de plantas multicelulares (Ver Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium ftvmefac/ens-mediated transformation ot Arabidopsis thaliana leaf and cotiledón explants, Plant Cell Rep. 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, capítulos 6/7, S.71-1 19 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 , Annu. Rev. Plant Phisiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225 y sus referencias citadas allí), o células de mamífero. Las células huésped adecuadas se analizan también en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo medíante secuencias reguladoras de promotor T7 y T7 polimerasa. Con mayor frecuencia, la expresión de polipéptidos en procariontes se realiza con vectores que contienen promotores constitutivos o inducíbles que dirigen la expresión de los polipéptidos de fusión y no de fusión. Los vectores de fusión agregan cierta cantidad de aminoácidos a un polipéptido codificado allí, por lo general en el terminal amino del polipéptido recombinante, pero también en el C terminal, o se fusiona dentro de la región adecuado del polipéptido. Dichos vectores de fusión generalmente tienen tres objetivos: 1 )
aumentar la expresión de un polipéptido recombinante, 2) aumentar la solubilidad de un polipéptido recombinante, y 3) facilitar la purificación de un polipeptido recombinante al actuar como ligando en la purificación por afinidad A menudo, en los vectores de expresión de fusión se introduce un sitio de escisión proteolitico en la unión del residuo de fusión y el polipéptido recombmante para permitir la separación del polipéptido recombinante del residuo de fusión después de la purificación del po peptido de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias cognadas de reconocimiento incluyen Factor Xa, trombina, y enteroquinasa Los típicos vectores de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Ine, Smith, D B y Johnson, K S , 1988, Gene 67 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutation-S-transferasa (GST), polipéptido fijador de maltosa E, o polipeptido A, respectivamente, al polipéptido blanco recombinante En una forma de realización, la secuencia codificadora de ACCDP se clona en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica un polipéptido de fusión que comprende, desde el N terminal hasta el C terminal, un polipéptido X de sitio de escisión de trombina GST El polipéptido de fusión se puede purificar por cromatografía de afinidad con resina de glutatión-agarosa El ACCDP recombinante no fusionado a GST se puede recuperar por escisión del pohpeptido de fusión con trombina Los ejemplos de adecuados vectores de expresión inducibles no de fusión de E. coli incluyen pTrc (Amann et ai , 1988, Gene 69 301-315) y pET 1 1d (Studier et al , Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89) La expresión del gen blanco desde el vector pTrc depende de la transcripción de ARN pohmerasa del huésped a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac La expresión del gen blanco a partir del vector pET 1 1d depende de la transcripción desde un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una ARN-polimerasa del huésped (T7 gnl) Esta pohmerasa viral es provista por las cepas del huésped BL21 (DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago residente que contiene un gen T7 gnl bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5 Una estrategia para maximizar la expresión de polipeptido recombinante consiste en expresar el polipéptido en una bacteria huésped con deterioro de la capacidad para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S , Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 1 19-128) Otra estrategia consiste en alterar la secuencia del acido que se inserta en un
vector de expresión de manera tal que cada uno de los codones para cada aminoácido se utiliza de preferencia en la bacteria elegida para la expresión, tal como C glutamicum (Wada et al , 1992, Nucleic Acid Res 20 21 1 1-2118) Dicha alteración de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se puede llevar a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN En otra forma de realización, el vector de expresión ACCDP es un vector de expresión de levaduras Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSed (Baldan, et al , 1987, EMBO J 6 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30 933-943), pJRY88 (Schuitz et al , 1987, Gene 54 113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) Los vectores y métodos para la construcción de vectores adecuados para el uso en troos hongos, tales como hongos filamentosos, incluyen los detallados en van den Hondel, C A M J J & Punt, P J , 1991 , "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungí," en Applied Molecular Genetics of Fungí, J F Peberdy, et al , eds , p 1-28, Cambridge University Press Cambridge En una forma de realización de preferencia de la presente invención, los ACCDP se expresan en plantas y células vegetales tales como células vegetales unicelulares (p. ej , algas) (Ver Falciatore et al , 1999, Marine Biotechnology 1 (3) 239-251 y sus referencias) y células vegetales provenientes de plantas superiores (p ej , espermatofitos, tales como las plantas de cultivo) Un ACCDP puede ser "introducido" en una célula vegetal por cualquier medio, incluso transfeccion, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfeccion, y similares un método de transformación conocidos por los expertos en el arte consiste en sumergir una planta con flor en una solución de Agrobactena, en donde la Agrobactena contiene el ácido nucleico de ACCDP, seguido del cultivo de los gametos transformados Otros métodos adecuados para la transformación o transfección de células huésped que incluyen células vegetales se pueden hallar en Sambrook, et al (Molecular Cloning A Laboratory Manual latest ed , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol 44, Agrobacterium protocols, ed- Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey Dado que el aumento de crecimiento y el aumento de tolerancia biótico y abiotica a estrés son rasgos generales que se desea se transmitan por herencia en una amplia variedad de plantas tales como
maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, poroto de soja, mani, algodón, semilla de colza y cañóla, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como papa, tabaco, berenjena, y tomate, especie de Vicia, arveja, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de Salix, árboles (palmera aceitera, cocotera), pastos perennes, y cultivos forrajeros, estas plantas de cultivo también son plantas blanco preferidas para la ingeniería genética, como otra forma de realización de la presente invención. Los cultivos forrajeros incluyen, sin limitaciones, Wheatgrass, Canarygrass, Bromegrass, Wildrye Grass, Bluegrass, Orchardgrass, Alfalfa, Salfoin, Birdsfoot Trefoil, trébol Alsike, trébol rojo, y trébol dulce. En una forma de realización de la presente invención, la transfección de un
ACCDP en una planta se logra por transferencia géníca mediada por Agrobacteríum. La transformación génica mediada por Agrobacterium se puede realizar por ejemplo con cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación se puede realizar mediante técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere et al., 1994, Nucí. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2pd Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - en Sect., Ríngbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Ratón: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, las semillas de nabo se pueden transformar por transformación de cotiledón o hipocotilo (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8:238- 242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91 :694-701 ). El uso de antibióticos para Agrobacterium y la selección vegetal depende del vector binario y la cepa de Agrobacterium usada para la transformación. La selección de semilla de colza generalmente se realiza con canamicina como marcador vegetal seleccionable. La transferencia génica mediada por Agrobacterium a lino se puede realizar, por ejemplo, mediante una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Además, la transformación de poroto de soja se puede realizar, por ejemplo, mediante una técnica descrita en la patente europea N° 0424 047, la patente de los Estados Unidos N° 5.322.783, la patente europea N° 0397 687, la patente de los Estados Unidos N° 5.376.543, o la patente de los Estados Unidos N° 5.169.770. La transformación de maíz se puede lograr mediante bombardeo de partículas, captación de ADN mediada por polietilenglicol, o por la técnica de fibra de carburo de silicio (Ver, por ejemplo, Freeling y
Walbot "The maize handbook" Spnnger Verlag Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7) Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la patente de los Estados Unidos N° 5.990 387, y un ejemplo específico de transformación de trigo se puede encontrar en la solicitud de PCT N° WO 93/07256 De acuerdo con la presente invención, el ACCDP introducido se puede mantener en forma estable en la célula vegetal si se incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o integrado en el cromosoma vegetal Alternativamente, el ACCDP introducido puede estar presente en un vector no replicante extracromosómico y puede ser expresado en forma transitoria o tener actividad transitoria En una forma de realización, se puede crear un microorganismo homólogo recombinante en donde el ACCDP se integra al cromosoma, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de ACCDP en el cual se ha introducido una delecion, adición, o sustitución para así alterar, p ej , funcionalmente alterar el gen ACCDP De preferencia, el gen ACCDP es cualquiera de los genes ACCDP tal como se provee en Tabla 1 y de la Tabla 2, pero puede ser un homologo de una planta relacionada o levadura, o incluso de una fuente de mamífero o insecto En una forma de realización, el vector se diseña de manera tal que tras la recombinacion homologa, el gen endógeno ACCDP está funcionalmente alterado (es decir, ya no codifica un polipeptido funcional, también se denomina vector knock-out) Alternativamente, se puede diseñar el vector de manera tal que tras la recombinación homologa, el gen endógeno ACCDP está mutado o de otra manera alterado, pero aun codifica un polipeptido funcional (p ej , se puede alterar la región reguladora corriente arriba para asi alterar la expresión del ACCDP endógeno) Para crear una mutación puntual a través de la recombinacion homologa se pueden usar híbridos de ADN-ARN en una técnica denominada quimeroplastia (Cole- Strauss et al , 1999, Nucleic Acid Research 27(5) 1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene Therapy American Scientist 87(3) 240-247) Los procedimientos de recombinación homologa en Arabiodopsis thaliana, por ejemplo, son bien conocidos en el arte y se considera su uso en la presente En el vector de recombinacion homólogo, la porción alterada del gen ACCDP está flanqueado en sus extremos 5' y 3' por una molécula adicional de acido nucleico del gen ACCDP para permitir que ocurra la recombinaaón homologa entre el gen exógeno ACCDP transportado por el vector y un gen endógeno de ACCDP, en un microorganismo o planta La molécula adicional flanqueadora de acido nucleico de ACCDP tiene longitud
suficiente para que ocurra la recombinacion homologa con el gen endógeno Generalmente, se incluyen vanos cientos de pares de bases, hasta kilobases, de ADN flanqueador (en ambos extremos 5' y 3') en el vector (Ver p ej , Thomas, K R , y Capecchi, M R , 1987, Cell 51 503 para una descripción de vectores de recombinación homólogos) El vector se introduce en un microorganismo o célula vegetal (p ej , a través de ADN mediado por pohetilenghcol), y células en las cuales el gen ACCDP introducido recombinado en forma homologa con el gen endógeno ACCDP se ha seleccionado mediante técnicas conocidas en el arte En otra forma de realización, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido Por ejemplo, la inclusión de un gen ACCDP en un vector al colocarlo bajo el control del operón lac permite la expresión del gen ACCDP solo en presencia de IPTG Dichos sistemas reguladores son bien conocidos en el arte Cuando está presente en un vector no replicante extracromosómico vector o un vector integrado en un cromosoma, el polinucleótido de preferencia ACCDP reside en un cásete de expresión vegetal Un cásete de expresión de preferencia contiene secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión del gen en células vegetales ligado operativamente de manera tal que cada secuencia puede cumplir esta función, por ejemplo, la terminación de la transcripción de señales de pohadenilación Las señales de poliadenilación de preferencia son las originadas a partir de T-ADN Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como octopinasintetasa de Ti-plásmido pT?ACH5 (Gielen et al , 1984, EMBO J 3 835) o sus equivalentes funcionales, y también son adecuados todos los demás terminadores funcionalmente activos en plantas Dado que la expresión génica vegetal a menudo no se limita a los niveles de transcripción, un cásete de expresión vegetal de preferencia contiene otras secuencias ligadas operativamente como mejoradores de la traducción tales como la secuencia de sobredirección que contiene la secuencia guía no traducida 5' proveniente del virus de mosaico de tabaco que mejora la relación polipéptido por ARN (Galhe et al , 1987, Nucí. Acids Research 15 8693-8711 ) Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen los detallados en Becker, D , Kemper, E , Schell, J y Masterson, R , 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol 20 1195-1197, y Bevan, M W , 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucí Acid Res 12 8711-8721 , Vectors for Gene Transfer in Higher
Plants, en Transgenic plants, Vol 1 , Engineepng and Utilization, eds Kung y R Wu, Academic Press, 1993, S 15-38 La expresión genica vegetal debe estar ligada operativamente a un promotor adecuado que confiere la expresión genica en forma oportuna, especifica de célula o especifica de tejido Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal Dichos promotores incluyen, sin limitaciones, los que se pueden obtener de plantas, virus vegetales, y bacterias que contienen genes expresados en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium El promotor puede ser constitutivo, mducible, con preferencia por estadio de desarrollo, con preferencia por tipo celular, con preferencia por tejido, o con preferencia de órgano Los promotores constitutivos actúan en la mayoría de las condiciones Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen los promotores CaMV 19S y 35S (Odell et al , 1985, Nature 313 810-812), el promotor sX CaMV 35S (Kay et al , 1987, Science 236 1299-1302), el promotor Sep1 , el promotor de actina de arroz (McEIroy et al , 1990, Plant Cell 2 163-171), el promotor de actma de Arabidopsis, el promotor de ubicuitano (Chpstensen et al , 1989, Plant Molec Biol 18 675-689), pEmu (Last et al , 1991 , Theor Appl Genet 81 581-588), el promotor de virus de mosaico de escrofulapa 35S, el promotor Smas (Velten et al , 1984, EMBO J 3 2723-2730), el superpromotor (patente de los Estados Unidos N° 5 955 646), el promotor GRP1-8, el promotor cinnamilalcoholdeshidrogenasa (patente de los Estados Unidos N° 5 683 439), los promotores de T-ADN de Agrobacterium, tales como manopinasintetasa, nopalinasintetasa, y octopinasintetasa, el promotor de la subunidad menor de nbulosbifosfatocarboxilasa (ssuRUBISCO), y similares De preferencia los promotores inducibles son activos en ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque de agente patógeno, condiciones anaerobias, y similares Por ejemplo, el promotor hspdO de Brassica es inducido por shock de calor, el promotor PPDK es inducido por luz, los promotores PR-1 provenientes de tabaco, Arabidopsis, y maíz son inducibles por infección con un agente patógenon, y el promotor Adhl es inducido por hipoxia y estrés por frío La expresión génica vegetal también se ve facilitada por un promotor inducible (Para una revisión, ver Gatz, 1997, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 89-108) Los promotores químicamente inducibles son especialmente
adecuados si se desea que la expresión genica ocurra en forma especifica de tiempo Los ejemplos de dichos promotores son un promotor inducible por acido salicílico (solicitud de PCT N° WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclinas (Gatz et al , 1992, Plant J 2 397-404), y un promotor inducible por etanol (solicitud de PCT N° WO 93/21334) En una forma de realización de preferencia de la presente invención, el promotor mducible es un promotor inducible por estrés A los fines de la presente invención, los promotores inducibles por estrés de preferencia son activos en uno o más de los siguientes estreses condiciones subóptimas asociadas con estreses por salinidad, sequía, temperatura, metal, agente químico, agente patógeno, y agente oxidativo Los promotores inducibles por estrés incluyen, sin limitaciones, Cor78 (Chak et al , 2000, Planta 210 875-883, Hovath et al , 1993, Plant Phisiol 103 1047-1053), Cor15a (Artus et al , 1996, PNAS 93(23) 13404-09), Rc?2A (Medina et al , 2001 , Plant Phisiol 125 1655-66, Nilander et al , 2001 , Plant Mol Biol 45 341-52, Navarre y Goffeau, 2000, EMBO J 19 2515-24, Capel et al , 1997, Plant Phisiol 115 569-76), Rd22 (Xiong et al , 2001 , Plant Cell 13 2063-83, Abe et al , 1997, Plant Cell 9 1859-68, Iwasaki et al , 1995, Mol Gen Genet 247 391-8), cDet6 (Lang y Palve, 1992, Plant Mol Biol 20 951-62), ADH1 (Hoeren et al , 1998, Genetics 149 479-90), KAT1 (Nakamura et al , 1995, Plant Phisiol 109 371-4), KST1 (Muller-Rober et al , 1995, EMBO 14 2409-16), Rha1 (Terryn et al , 1993, Plant Cell 5 1761-9, Terryn et al , 1992, FEBS Lett 299(3) 287-90), ARSK1 (Atkinson et al , 1997, N° de acceso a GenBank L22302, y solicitud de PCT N° WO 97/20057), PtxA (Plesch et al , N° de acceso a GenBank X67427), SbHRGP3 (Ahn et al., 1996, Plant Cell 8 1477-90), GH3 (Liu et al , 1994, Plant Cell 6 645-57), el promotor de PRP1 inducible por agentes patógenos (Ward et al , 1993, Plant Mol Biol 22:361-366), el promotor inducible por calor hsp80 de tomate (patente de los Estados Unidos N° 5187267), el promotor inducible por alfa amilcasa de papa (solicitud de PCT N° WO
96/12814), o el promotor inducible por heridas pinll (patente europea N° 375091 ) Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío, y salinidad, tales como el promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozaleí et al , 1993, Mol Gen Genet 236-331-340.
Los promotores con preferencia por estadio de desarrollo se expresan de preferencia en ciertos estadios de desarrollo Los promotores con preferencia por tejido y órgano incluyen los que se expresan de preferencia en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas, o xilema Los ejemplos de promotores con preferencia de tejido y con preferencia por órgano incluyen, sin limitaciones preferencia por fruta,
preferencia por óvulo, preferencia por tejido masculino, preferencia por semilla, preferencia por tegumento, preferencia por tubérculo, preferencia por tallo, preferencia por pericarpio, y preferencia por hoja, preferencia por estigma, preferencia por polen, preferencia por anteras, preferencia por pétalo, preferencia por sépalo, preferencia por pedicelo, preferencia por silique, preferencia por peciolo, preferencia por raíz y similares Los promotores con preferencia por semilla de preferencia se expresan durante el desarrollo y/o la germinación de la semilla Por ejemplo, los promotores con preferencia por semilla pueden tener preferencia por embrión, preferencia por endosperma, y preferencia por cubierta de semilla Ver Thompson et al , 1989, BioEssays 10 108 Los ejemplos de promotores con preferencia por semilla incluyen, sin limitaciones, celulosa sintetasa (celA), C?m1 , gamma-zeína, globul?na-1 , zeina de maíz 19 kD (cZ19B1 ), y similares Otros promotores adecuados con preferencia por tejido o con preferencia por órgano incluyen el promotor de gen de napina proveniente de semilla de colza (patente de los Estados Unidos N° 5 608 152), el promotor USP proveniente de Vicia faba (Baeumlein et al , 1991 , Mol Gen Genet 225(3) 459-67), el promotor de oleosina proveniente de Arabidopsis (solicitud de PCT N° WO 98/45461 ), el promotor faseolina proveniente de Phaseolus vulgans (patente de los Estados Unidos N° 5 504 200), el promotor Bce4 proveniente de Brassica (solicitud de PCT N° WO 91/13980), o el promotor de legumina B4 (LeB4, Baeumlein et al , 1992, Plant Journal, 2(2) 233-9), ademas de promotores que confieren expresión específica de semilla a plantas monocotiledoneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc Cabe destacar promotores adecuados tales como los promotores de genes Ipt2 o Ipt1 provenientes de cebada (solicitud de PCT N° WO 95/15389 y solicitud de PCT N° WO 95/23230) o los descritos en la solicitud de PCT N° WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína provenientes de cebada, el gen glutelina de arroz, el gen origina de arroz, el gen prolamina de arroz, el gen gliadina de trigo, el gen glutelina de trigo, el gen glutelina de avena, el gen casipna de sorgo, y el gen secalina de centeno) Otros promotores de utilidad en los casetes de expresión de la invención incluyen, sin limitaciones, el promotor de proteina fijadora principal de clorofila a/b, promotores de histona, el promotor de Ap3, el promotor de ß-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lectina de poroto de soja, el promotor de zema de maíz 15kD, el promotor de zema 22kD, el promotor de zeina 27kD, el promotor de g-zeina, los promotores ceroso,
encogido 1 , encogido 2, y bronce, el promotor Zm13 (patente de los Estados Unidos N° 5 086 169), los promotores poligalacturonasa de maíz (PG) (patentes de los Estados Unidos N° 5 412 085 y 5 545 546), y el promotor SGB6 (patente de los Estados Unidos N° 5 470 359), además de promotores sintéticos u otros naturales Se puede obtener flexibilidad adicional en el control de la expresión de genes heterólogos en plantas al usar dominios fijadores de ADN y elementos de respuesta provenientes de fuentes heterólogas (es decir, dominios fijadores de ADN provenientes de fuentes no vegetales) Un ejemplo de dicho dominio fijador de ADN heterólogo es el dominio de fijación de ADN LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43 729-736) La invención también provee un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de ACCDP de la invención clonada en el vector de expresión en orientación antisentido Es decir, la molécula de ADN se liga operativamente a una secuencia reguladora de manera tal que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido respecto de un mARN de ACCDP De las secuencias reguladoras ligadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido se pueden elegir las que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en diversos tipos celulares Por ejemplo, se pueden elegir promotores y/o mejoradores virales, o secuencias reguladoras que dirijan la expresión constitutiva, específica de tejido, o especifica de tipo celular del ARN antisentido El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagémido, o virus atenuado en donde se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora con alta eficiencia La actividad de la región reguladora se puede determinar por el tipo celular en el que se introduce el vector Para el análisis de la regulación de la expresión génica mediante el uso de genes antisentido, ver Weintraub, H et al , 1986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol 1 (1 ), y Mol et al , 1990, FEBS Letters 268 427-430 Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan en forma intercambiable en la presente Se entiende que dicho término se refiere no solo a la célula objeto particular, sino también se aplica a la progenie o posible progenie de dicha célula Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas, debido a mutación o
la influencia ambiental, de hecho dicha progenie puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aun así se incluye en el alcance del término tal como se usa en la presente. Una célula huésped puede ser cualquier célula procarionte o eucarionte. Por ejemplo, un ACCDP se puede expresar en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas, o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células vegetales, hongos, o otros microorganismos tales como C. glutamicum. Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en el arte. Una célula huésped de la invención, por ejemplo una célula huésped procarionte o eucarionte en cultivo, se puede usar para producir (es decir, expresar) un ACCDP. En consecuencia, la invención también provee métodos para producir ACCDP mediante las células huésped de la invención. En una forma de realización, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un ACCDP, o en cuyo genoma se introdujo un gen que codifica un ACCDP de tipo salvaje o alterado) en un medio adecuado, hasta la producción de ACCDP. En otra forma de realización, el método también comprende el aislamiento de ACCDP del medio o la célula huésped. Otro aspecto de la invención se refiere a ACCDP aislados, y sus porciones biológicamente activas. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o su porción biológicamente activa está libre de parte del material celular cuando se produce medíante técnicas de
ADN recombinante, o de precursores químicos y otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. El término "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de ACCDP en las cuales el polipéptido se separa de parte de los componentes celulares de las células en las cuales se produce en forma natural o recombinante. En una forma de realización, el término "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un ACCDP con menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de material distinto de ACCDP (también denominado en la presente
"polipéptido contaminante"), con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de material distinto de ACCDP, con aun mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de material distinto de ACCDP, y con máxima preferencia menos de aproximadamente
5% de material distinto de ACCDP. Las moléculas de ácido nucleicos, polipéptidos, homólogos de polipéptido, polipéptidos de fusión, cebadores, vectores, y células huésped descritas en la presente se
pueden usar en uno o más de los siguientes métodos identificación de cualquiera de los organismos tal como se provee en la Columna N° 2 de Tabla 1 y de la Tabla 2 y organismos relacionados, mapeo de genomas de organismos relacionados con cualquiera de los organismos tal como se provee en la Columna N° 2 de Tabla 1 y de la Tabla 2, identificación y locahzación de las secuencias de ínteres de cualquiera de los organismos tal como se provee en la Columna N° 2 de Tabla 1 y de la Tabla 2, estudios evolutivos, determinación de regiones de ACCDP requeridas para la función, modulación de una actividad ACCDP, modulación del metabolismo de una o mas funciones celulares, modulación del transporte transmembrana de uno o mas compuestos, modulación de resistencia a estrés, y modulación de la expresión de ácidos nucleicos ACCDP En una forma de realización de estos métodos, el ACCDP pueden convertir ACC en a-cetobutirato y amoníaco La molécula de ácido nucleicos de ACCDP de acuerdo con la invención tiene diversos usos Más importante, el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de la presente invención se pueden usar parra transformar plantas, particularmente plantas de cultivo, por lo que se induce a estreses tales como sequía, alta salinidad, y frío La presente invención en consecuencia provee una planta transgenica transformada por un acido nucleico ACCDP, en donde la expresión de la secuencia de acido nucleico en la planta da por resultado un aumento de crecimiento de la raíz y/o tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea La invención también provee que la planta transgénica se seleccione de maíz, trigo, centeno, avena, tpticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, poroto de soja, maní, algodón, semilla de colza, cañóla, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, papa, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, arveja, alfalfa, café, cacao, te, especies de Salix, palmera aceitera, coco, pastos perennes, y cultivos de forraje, por ejemplo En particular, la presente invención describe el uso de la expresión del ácido nucleico que codifica ACCDP para someter a ingeniería plantas con aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o que son tolerantes a sequía, a salinidad, y/o a frío Esta estrategia se ha demostrado en la presente mediante AtACCD (SEQ ID NO 1 ) en Arabidopsis thaliana y maíz, pero su aplicación no está restringida a este gen o a estas plantas En consecuencia, la invención provee una planta de cultivo transgénica que contiene un ACCDP tal como se define en cualquier SEQ ID NOS tal
como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2, en donde la planta tiene aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequía, aumento de salinidad, o disminución o aumento de temperatura En unas formas de realización de preferencia, el estrés ambiental es sequía En otras formas de realización de preferencia, el aumento de crecimiento de la raíz es un aumento de la longitud de la raíz, de preferencia en condiciones de limitación de agua La invención también provee un método para producir una planta de cultivo transgénica que contiene un ácido nucleico que codifica ACCDP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da por resultado un aumento de crecimiento de la raíz y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta que comprende (a) introducir en la célula vegetal un vector de expresión que comprende un ácido nucleico ACCDP, y (b) la generación por o a partir de una célula vegetal de una planta transgénica con aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta La célula vegetal incluye, sin limitaciones, un protoplasto, una célula productora de gametos, y una célula que se regenera en una planta entera. Tal como se usa en la presente, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula vegetal, callo, tejido vegetal, o parte de planta que contiene la totalidad o parte de al menos un polinucleótido recombinante En muchos casos, la totalidad o parte del polinucleótido recombinante se integra en forma estable en un cromosoma o elemento extracromosómico estable, para que se pueda pasar a las generaciones sucesivas. En formas de realización de preferencia, el ácido nucleico de ACCDP codifica una proteína que comprende el pohpéptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2 La presente invención también provee un método para modular el crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a un estrés ambiental que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica ACCDP en la planta. El crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia al estrés ambiental pueden ser aumento o disminución, según se logre al aumentar o disminuir la expresión de un ACCDP, respectivamente. De preferencia, el crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia al estrés ambiental es aumento al incrementar la expresión de un ACCDP La expresión de un ACCDP se puede modificar
por cualquier método conocido por los expertos en el arte. Se pueden usar métodos para incrementar la expresión de ACCDP cuando la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta puede ser transformada por un vector que contiene cualquiera de los antes descritos ácidos nucleicos que codifican ACCDP, o la planta puede ser transformada por un promotor que dirige la expresión de ACCDP nativo en la planta, por ejemplo. La invención provee que dicho promotor sea con preferencia por tejido, regulado por el desarrollo, inducíble por estrés, o una de sus combinaciones. Alternativamente, las plantas no transgénicas pueden tener expresión de ACCDP nativo modificado por la inducción de un promotor nativo. La expresión de ACCDP tal como se define en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 4 de Tabla 1 y de la Tabla 2 en plantas blanco se puede lograr, sin limitaciones, mediante uno de los siguientes ejemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor inducido por agentes químicos, y (d) sobreexpresión por promotor sometido a ingeniería, por ejemplo, con factores de transcripción derivados de dedos de zinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275:657). En una forma de realización de preferencia, la transcripción del ACCDP es modulada mediante factores de transcppción derivados de dedos de zinc (ZFP) tal como se describe en Greisman y Pabo, 1997, Science 275:657 y se manufactura en Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFP comprenden un dominio de reconocimiento de ADN y un dominio funcional que genera la activación o represión de un ácido nucleico blanco tal como un ácido nucleico ACCDP. En consecuencia, los ZEP de activación y represión se pueden crear para reconocer específicamente los promotores ACCDP antes descritos y se usan para aumentar o disminuir la expresión de ACCDP en una planta, por lo que modulan el rendimiento y/o la tolerancia a estrés de la planta. La presente invención también incluye identificación de los homólogos de ácidos nucleicos que codifican ACCDP tal como se definen en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N° 3 de Tabla 1 y de la Tabla 2 en una planta blanco, además de un promotor del homólogo. La invención también provee un método para aumentar la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped, comparado con la variedad de tipo salvaje de la célula huésped, en donde el gene de interés se transcribe en respuesta a un ACCDP, que comprende: (a) transformar la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica ACCDP, y (b) expresar el ACCDP dentro de la célula huésped, por lo que se incrementa la expresión del transcripto en respuesta al ACCDP,
comparado con la variedad de tipo salvaje de la célula huésped Además, para introducir las secuencias de ácidos nucleicos ACCDP en las plantas transgénicas, estas secuencias también se pueden usar para identificar un organismo como parte de los organismos tal como se provee en la Columna N° 2 de Tabla 1 y de la Tabla 2, o uno muy relacionado Además, se pueden usar para identificar la presencia de cualquiera de los organismos tal como se provee en la Columna N° 2 de Tabla 1 y de la Tabla 2, o una relacionada en una población mixta de organismos La invención se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos de numerosos genes provenientes de cualquiera de los tal como se provee en la Columna N° 2 de Tabla 1 y de la Tabla 2, al sondar el ADN genómico extraído de un cultivo de una población singular o mixta de organismos en condiciones rigurosas con una sonda que abarca una región de un gen particular que es singular respecto del correspondiente organismo de acuerdo con la Tabla 1 y de la Tabla 2, se puede asegurar si dicho organismo está presente Además, las moléculas de ácido nucleico y polipéptido de acuerdo con la invención pueden actuar como marcadores para regiones específicas del genoma Esto es de utilidad no solo para mapear el genoma, también en estudios funcionales de los po péptidos codificados por dicho genoma Por ejemplo, para identificar la región del genoma al que se fija un pohpéptido de fijación a ADN particular de un organismo, se puede digerir el genoma del organismo, y los fragmentos se incuban con el polipéptido fijador de ADN Dichos fragmentos fijadores de polipéptido además se pueden sondar con la molécula de ácido nucleicos de la invención, de preferencia con rótulos fácilmente detectables La fijación de dicha molécula de ácido nucleico al fragmento del genoma permite la locahzación del fragmento en el mapa del genoma de dicho organismo, y cuando se realiza muchas veces con diferentes enzimas, facilita la rápida determinación de la secuencia de ácido nucleico a la que se fija el polipeptido Ademas, la molécula de ácido nucleicos de la invención puede tener suficiente identidad con las secuencias de las especies relacionadas para que estas moléculas de ácido nucleicos pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en plantas relacionadas. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención ACCDP también son útiles para los estudios evolutivos y estructurales de pohpeptido Los procesos de conversión de aminoácidos en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una amplia variedad de células procapontes y eucapontes, por comparación de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención con las que codifican
enzimas similares provenientes de otros organismos es posible evaluar la relación evolutiva entre los organismos De modo similar, dicha comparación permite evaluar cuáles de las regiones de la secuencia se conservan y cuáles no, cuáles pueden contribuir en la determinación de las regiones del pohpéptido que son esenciales para el funcionamiento de la enzima Este tipo de determinación es valioso para los estudios de ingeniería del po péptido y pueden dar una indicación de lo que puede tolerar el polipéptido en términos de mutagénesis, sin perder función La manipulación de las moléculas de ácidos nucleicos ACCDP de la invención puede dar por resultado la producción de ACCDP con diferencias funcionales con los ACCDP de tipo salvaje Estos polipéptidos se pueden mejorar en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayor número en la célula que lo usual, o pueden estar disminuidos en eficiencia o actividad Hay numerosos mecanismos por los cuales la alteración de un ACCDP de la invención puede afectar directamente el crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o una respuesta a estrés y/o tolerancia a estrés En el caso de las plantas que expresan ACCDP, la enzima puede actuar para estimular la elongación de la raíz al secuestrar e hidrolizar el ACC de las semillas en germinación, reduciendo asi el nivel de ACC y, por ende, reduciendo el nivel de etileno en las semillas Para muchas plantas, el etileno estimula la germinación. Se observó que, si la concentración de etileno permanece elevada después de la germinación, se inhibe la elongación de la raíz (Jackson (1991 ), p. 159-181 En A K Matoo and J C Suttle (ed ), The Plant Hormone Ethylene, CRC Press, Boca Ratón, FL) En consecuencia, la reducción de las concentraciones de etileno en las semillas después de la germinación, conduce a un incremento de la longitud de la raíz y mejore la eficiencia de uso de agua por la planta El efecto de la modificación genética en plantas, C glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre el crecimiento de la raíz y/o la tolerancia a estrés pueden ser evaluadas al dejar crecer el microorganismo modificado o planta en condiciones menos adecuadas y luego analizar las características de crecimiento y/o el metabolismo de la planta. Dichas técnicas de análisis son bien conocidas por los expertos en el arte, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de polipéptidos, síntesis de hidratos de carbono, síntesis de lípidos, tasas de evaporación/transpiración, rendimiento general de la planta y/o el cultivo, floración, reproducción, fijación de la semilla, crecimiento de la raíz, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc (Applications of HPLC in Biochemistry en Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol 17, Rehm et al , 1993 Biotechnology, vol 3, Chapter lll Product recovery and pupfication, pagina 469-714, VCH Weinheim, Belter, P A et al , 1988, Bioseparations downstream processing for biotechnology, John Wiley y Sons, Kennedy, J F y Cabral, J M S , 1992, Recovery processes for biological matepals, John Wiley y Sons, Shaeiwitz, J A y Henry, J D , 1988, Separaciones bioquímicas, en Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol B3, Capitulo 11 , página 1-27, VCH Weinheim, y Dechow, F J , 1989, Separation and pupfication techniques in biotechnology, Noyes Publications) Por ejemplo, los vectores de expresión de levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o sus fragmentos, se pueden construir y transformar en Saccharomyces cerevisiae mediante protocolos estándar Las células transgénicas obtenidas luego se pueden analizar para determinar fallas o alteraciones del aumento de crecimiento y/o la tolerancia estreses por sequía, salinidad, y temperatura De modo similar, los vectores de expresión vegetales que comprenden los ácidos nucleicos divulgados en la presente, o sus fragmentos, se pueden construir y transformar en una célula vegetal adecuada tal como Arabidopsis, soja, nabo, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc , mediante protocolos estándar Las células y/o plantas transgénicas obtenidas asi derivadas luego se pueden analizar para determinar fallas o alteraciones del aumento de crecimiento y/o la tolerancia estreses por sequía, salinidad, y temperatura Además, las secuencias divulgadas en la presente, o sus fragmentos, se pueden usar para generar mutaciones knockout en los genomas de diversos organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levaduras y células vegetales (Girke, T , 1998, The Plant Journal 15 39-48) Las células knockout obtenidas luego se pueden evaluar por su capacidad o habilidad para tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta a diversas condiciones de estrés y el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo de la mutación Para otros métodos de inactivación genica, ver la patente de los Estados Unidos N° 6 004 804 "Non-Chimepc Mutational Vectors" y Puttaraju et al , 1999, Sphceosome-mediated RNA fra/is-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17 246-252 Las estrategias de mutagénesis antes mencionadas para ACCDP que dan por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés no pretenden ser limitantes, las variaciones de estas estrategias serán rápidamente aparentes para los expertos en el arte Al usar dichas estrategias, e incorporar los
mecanismos descritos en la presente, las moléculas de ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención se pueden utilizar para generar algas, ciliados, plantas, hongos, u otros microorganismos tales como C glutamicum, que expresan moléculas mutadas de ácido nucleico y pohpéptido de ACCDP que mejoran el crecimiento de la raíz y/o la tolerancia a estrés La presente invención también provee anticuerpos que se fijan específicamente a un ACCDP, o una de sus porciones, como se codifica con un ácido nucleico descrito en la presente Los anticuerpos se pueden preparar mediante muchos métodos bien conocidos (ver, p ej , Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)) Brevemente, se puede inyectar antigeno purificado en un animal en una cantidad y por intervalos suficientes para desencadenar una respuesta inmune Los anticuerpos se pueden purificar directamente, o las células del bazo se pueden obtener del animal Las células luego se pueden fusionar con una línea de células inmortales y analizar para la secreción de anticuerpo Los anticuerpos se pueden usar para analizar bibliotecas de clones de ácido nucleico para células que secretan el antígeno En estos clones positivos luego se puede determinar la secuencia (Ver, por ejemplo, Kelly et al , 1992, Bio/Technology 10 163-167, Bebbington et al , 1992, Bio/Technology 10 169-175) Las frases "fijación selectiva" y "fijación especifica" con el polipeptido se refieren a una reacción de fijación que determina la presencia del polipeptido en una población heterogénea de polipéptidos y otros agentes biológicos En consecuencia, en condiciones diseñadas de inmunoensayos, los anticuerpos especificados unidos a un pohpéptido particular no se unen en cantidad significativa a otros pohpeptidos presentes en la muestra La fijación selectiva de un anticuerpo en dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para un polipeptido particular Se pueden usar diversos formatos de inmunoensayos para seleccionar anticuerpos que se fijan selectivamente con un polipéptido particular Por ejemplo, de rutina se usan inmunoensayos de ELISA de fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con un pohpéptido Ver Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Pubhcations, Nueva York, (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se podrían usar para determinar la fijación selectiva En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales provenientes
de varios huéspedes. Se puede hallar una descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales en Stites et al., eds., "Basic and Clinícal Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., cuarta edición) y sus referencias citadas, y en Harlow y Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988. En toda la presente memoria descriptiva se hace referencia a diversas publicaciones. Las divulgaciones de todas estas publicaciones y sus referencias citadas dentro de dichas publicaciones en su totalidad por la presente se incorporan como referencia en la presente solicitud, a fin de describir mejor el estado del arte al cual pertenece la presente invención. También se debe entender que lo anterior se refiere a formas de realización de preferencia de la presente invención y que se pueden hacer numerosos cambios sin apartarse del alcance de la invención. La invención también se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que de ninguna manera se deben interpretar como limitaciones impuestas sobre su alcance. Por el contrario, se debe entender con claridad que se puede recurrir a diversas otras formas de realización, modificaciones, y sus equivalentes, que después de leer la descripción de la presente, pueden sugerirse a los expertos en el arte, sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones adjuntas. EJEMPLOS Ejemplo 1 Aislamiento de ADN total a partir del material vegetal Los detalles sobre el aislamiento de ADN total se refiere a la elaboración a partir de un gramo de peso fresco de material vegetal. Los materiales usados incluyen los siguientes buffers: CTAB buffer: 2% (p/v) de bromuro de N-cetil-N,N,N-trímetilamonio (CTAB); 100 mM de Tris HCl pH 8,0; 1 ,4 M de NaCI; 20 mM de EDTA; buffer de N- laurilsarcosina: 10% (p/v) de N-laurilsarcosína; 100 mM de Tris HCl pH 8,0; y 20 mM de EDTA. El material vegetal se trituró bajo nitrógeno líquido en un mortero y se transfirió a tubos de Eppendorf de 2 ml. El material vegetal congelado luego se cubrió con una capa de 1 ml de buffer de descomposición (1 ml de buffer CTAB, 100 µl de buffer de N- laurilsarcosína, 20 µl de Xmercaptoetanol, y 10 l de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60 °C durante hora con agitación continua. El homogenado obtenido se
distribuyó en dos tubos de Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por agitación con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24 1 ) Para al separación de fases se centrifugó a 8000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos eb cada caso El ADN luego se precipitó a -70 °C durante 30 minutos con isopropanol helado El ADN precipitado se sedimentó a 4 °C y 10 000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 µl de buffer TE (Sambrook et al , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN 0-87969-309-6) Para la ulterior purificación se trato el ADN con NaCI (1 ,2 M de concentración final) y se volvió a precipitar a -70 °C durante 30 minutos con el doble de volumen de etanol absoluto Después del paso de lavado con 70% de etanol, se secó el ADN y luego se recuperó en 50 µl de H2O + ARNsa (50 mg/ml de concentración final) El
ADN se disolvió durante la noche a 4 °C, y luego se realizo la digestión con ARNasa a 37 °C durante 1 hora El ADN se almacenó a 4 °C Ejemplo 2 Preparación de ARN total y cADN de material vegetal de Arabidopsis Se aisló AtACCD al preparar ARN de hojas de Arabidopsis con un equipo de miniaislamiento de ARN (Qiagen kit) según las recomendaciones del fabricante Más adelante se describen reacciones de transcripción inversa y amplificación del cADN
1 El uso de 2 µl de una preparación de ARN (0,5 - 2,0 µg ) en una mezcla de reacción con 10 µl de ADNasa, se mueve el tubo a 37 °C durante 15 minutos, se agrega 1 µl de 25 mM de EDTA, y luego se hizo reaccionar al calor hasta 65 °C durante 15 minutos a Buffer (10X- 200 mM de Tris, 500 mM de KCl, 20 mM de MgCI2) - 1 µl b ARN - 2 µl c ADNasa (10 U/µl)- 1 µl d H2O - 6 µl 2 Se usó 1 µl de la mezcla de reacción en una reacción a temperatura ambiente, y se calentó a 65 °C durante 5 minutos a ARN sometido a acción de ADNasa (0,025-0,1 µg según la cantidad de inicio)- 1 µl b 10 mM de dNTP - 1 µl c Cebador (10 µM)- 1 µl d H2O - hasta 10 µl 3 Se preparó una mezcla de reacción con estos reactivos en otro tubo
a Buffer SuperScppt II RT (10X)- 2 µl b 25 mM de MgCI2 - 4 µl c DTT (0,1 M) - 2 µl d Inhibidor de ARNasa para eliminar ARNasa (40 U/µl)- 1 µl 4 Se agregó 9 µl de la mezcla de reacción a la solución de ARN desnaturalizada, y se mantuvo a 42 °C durante 2 minutos 5 Se agregó 1 µl de SuperScpptlI RT (50 U/µl), y se incubo a 42 °C durante 50 minutos 6 Se terminó la reacción a 70 °C durante 15 minutos 7 Opcional agregar 1 µl de ARNsaH a la mezcla de reacción para extraer ARN
8 Se realizó PCR como se haría con 1-2 µl del nuevo cADN Se cosechó el tendo. se aisló ARN, y se construyó la biblioteca cADN Las plantas de cultivos se cultivaron en diversas condiciones y tratamientos, y se cosecharon diferentes tejidos en distintos estadios de desarrollo El crecimiento de la planta y la cosecha se realizaron en forma estratégica a fin de maximizar la probabilidad de cosechar todos los genes expresables en al menos uno o mas de las bibliotecas obtenidas El mARN se aisló tal como se describió con anterioridad a partir de cada una de las muestras cosechadas, y se construyeron bibliotecas de cADN No se usaron etapas de amplificación en el proceso de producción de la biblioteca, a fin de minimizar la redundancia de genes en la muestra y retener la información de la expresión Todas las bibliotecas eran generadas de 3' a partir de mARN purificado en columnas de oligodT Las colonias obtenidas de la transformación de la biblioteca de cADN en E coli se juntaron al azar y se colocaron en placas de microtitulación Amplificación por PCR de inserciones de cADN y manchas Las inserciones de cADN provenientes de cada clon de las placas de microtitulación se amplificaron por PCR El ADN plasmido se aislo de colonias de E coli y luego se mancharon sobre membranas No fue necesario el paso de purificación antes de ubicar las manchas sobre membranas de nailon Ejemplo 3 Clonación de AtACCD Se usó el cADN aislado tal como se describe en Ejemplo 2 para clonar el gen AtACCD por RT-PCR Se usaron los siguientes cebadores El cebador hacia adelante era 5'-GGGGTCGACGAAGCAATGAGAGGACGAAGCT-3' (SEQ ID NO 358) El cebador de
reversa era 5'-GGGTTAATTAACAGATTTTGTTGTGCT?G?AC-3' (SEQ ID NO:359). Las reacciones por PCR para la amplificación incluyeron: 1 x de buffer PCR, 0,2 mM de dNTP, 100 ng de ADN de Arabidopsis thaliana, 25 pmol de cebador de reversa, 2,5 u de Pfu o ADN Herculasa polímerasa. Se realizó PCR de acuerdo con condiciones estándar y los protocolos del fabricante (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2o Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Biometra T3 Thermocycler). Los parámetros para la reacción eran: 1 ciclo durante 3 minutos a 94 °C; seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, y 1 ,5 minutos a 72 °C. Los fragmentos amplificados luego se extrajeron con gel de agarosa con un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen) y se ligó al vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se transformaron en células Topl O (Invitrogen) en condiciones estándar (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2° Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 µg/ml de carbenicilina, 0,8 mg X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-(XD-galact?sido) y 0,8 mg IPTG (isopropiltio-ß-D-galactósido) cultivado durante la noche a 37 °C. Se seleccionaron las colonias blancas y ser usaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 µg/ml de ampícilina y se cultivó durante la noche a 37 °C El ADN plásmido se extrajo con QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se realizó el análisis de los clones posteriores y el mapeo de restricción de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2° Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). En los clones se determinó la secuencia, que confirmó que la identidad del gen clonado era idéntico a la secuencia depositada en la base de datos de Arabidopsis thaliana. (SEQ ID NO:1 ). La secuencia de aminoácidos deducida de AtACCD se muestra en SEQ ID NO:2. Luego se clonó el gen AtACCD en un vector binario y se expresó con el Superpromotor (Figura 3). El Superpromotor es constitutivo, pero con preferencia por la raíz (patente de los Estados Unidos N° 5.428.147 y 5.217.903).
Ejemplo 4 Transformación de planta de Arabidopsis Se generaron plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana (Col) por el método de infiltración por inmersión (Bechtold et al , 1993, "In plant Agrobactepum-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants," C R Acad Sci París, Life Sci 316 1 194-1199) Los vectores binarios se transformaron en una cepa de Agrobactena C58C1 o pMP90 mediante electroporacion Se dejo crecer el cultivo de la Agrobactena transformada y se resuspendieron las bacterias en medio de infiltración por inmersión (1/2 MS, 5% de sacarosa, 0,5 mg/ml de MES, pH 5,7 y con agregado de 200 ppm Silwet L-77 (Lehle Seeds) ) Cada cultivo se uso para transformar 3 potes de plantas ColO de Arabidopsis de aproximadamente 5 semanas de edad, 5 minutos cada uno en cultivos resuspendidos de Agrobacterium Las plantas luego se cultivaron hasta obtener semilla en condiciones estándar para Arabidopsis (23 °C d?a/20 °C noche, 18 horas día y 65% humedad) Las semillas T1 se analizaron en placas MS con 100 nM de Pursuit (BASF) Análisis de Plantas Transformadas Las semillas T1 se esterilizaron de acuerdo con protocolos estándar (Xiong et al , 1999, Plant Molecular Biology Repórter 17 159-170) Las semillas se seleccionaron en medio V2 Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich), 0,6% de agar y suplementado con 1% de sacarosa, y 2 µg/ml de benomilo (Sigma-Aldrich) Las semillas de las placas se vernalizaron durante cuatro días a 4°C Las semillas se germinaron en una cámara climatizada con temperatura del aire de 22 °C e intensidad de luz de 40 micromoles-1 m2 (luz blanca, tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo de longitud de día de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad Las semillas germinadas transformadas se seleccionaron después de 14 días y se transfirieron a ! MS suplementado con 0,6% de agar, 1% de sacarosa, y se dejó recuperar durante cinco a siete días Las semillas de la generación T2 se usaron para el análisis de raíz de planta en suelo e m vitro Ejemplo 5 Análisis de raíz in vitro de plantas transformadas de Arabidopsis Para el análisis m vitro de la raíz de plantas transformadas se usaron placas cuadradas que medían 12 cm x 12 cm Para cada placa se uso 52 ml de medio MS (0,5X de sales MS, 0,5% de sacarosa, 0,5 g/L de buffer MES, 1 % Phytagar) sin selección Las placas se dejaron secar en la campana estéril durante una hora, as fin de reducir la futura
condensación Se esterilizaron alícuotas en viales de vidrio con etanol durante 5 minutos, se extrajo etanol, y las semillas se dejaron secar en la campana estéril durante una hora Las semillas se colocaron en las placas con el Vacuseed Deviee (Lehle) En el diseño experimental, cada placa contenía el tipo salvaje y AtACCD de plantas transgénicas En consecuencia, cada línea se comparó siempre a los controles cultivados en la misma placa para justificar la variación del microambiente Después de colocar las semillas en las placas, las placas se envolvieron en Ventwrap y se colocaron verticales en hileras en la oscuridad a 4 °C durante cuatro días para estratificar las semillas durante cuatro días para estratificar las semillas Las placas se transfirieron a una Cámara de Crecimiento C5 Percival y se colocaron verticales durante catorce días Las condiciones de la cámara de crecimiento eran 23 °C día/21 °C noche y 16 horas de d?a/8 horas de noche Para la reunión de datos se usó un escaneo de lecho plano de alta resolución El análisis de las raíces se hizo con el paquete de software WinRhizo El resultado de estos experimentos también se analizo a nivel genico Para ello, se promediaron las longitudes de raíz de todas las plantas para todas las lineas transgénicas y se compararon contra el promedio de las plantas de tipo salvaje La presencia del transgen y el número de copias de los eventos se determino al dirigir el terminador NOS con PCR de tiempo real Los cebadores NOS usados en el análisis fueron cebador hacia adelante - 5 -TCCCCGATCGTTCAAACATT-3' (SEQ ID NO 360) y cebador de reversa - 5 -CCATCTCATAAATAACGTCATGCAT-3' (SEQ ID NO 361 ) Las reacciones se corrieron en una placa óptica de 96 cavidades (Applied Biosystems, 4314320), y se corrieron simultáneamente las mezclas de reacción del control endógeno y el gen de interés en la misma placa Se preparo una mezcla maestra para ambos conjuntos de cebadores Las mezclas maestro y la placa de ensayo de 96 cavidades se deben mantener sobre hielo Se incluyeron los cálculos para 52 reacciones, lo cual es adecuado APRA la mitad de la placa con el uso de un pipeteador de canales múltiples Se usó el kit Eurogentec, (cat#RTSNRT032X-1 ), y se prepararon mezclas de reacción según las recomendaciones del fabricante Se uso un GeneAmp 5700 para correr las reacciones y juntar los datos Resultado Los resultados demuestran que las plantas transgenicas AtACCD evaluadas en las placas tienen un fenotipo de raíz más larga La Figura 4A muestra el resultado de las
plantas cultivadas en placas verticales en base a las lineas La mayoría de las líneas transgénicas AtACCD analizadas exhibieron un fenotipo de raíz más larga, comparado con raices de plantas control de tipo salvaje El fenotipo se observo más claramente en las lineas 2, 3, 5, 6 y 9 El análisis del nivel génico de las plantas transgenicas AtACCD, tal como se ven en la Figura 4B, confirmó que las plantas AtACCD exhibieron un fenotipo de aumento de longitud de raíz En base a este análisis, las plantas transgenicas de Arabidopsis ACCDP exhibieron un aumento del 13,8% de la longitud de raíz Ejemplo 6 Análisis de raíz en suelo de plantas transformadas de Arabidopsis Para el análisis de raíz en suelo, las semillas se sumergieron a 4°C durante 2 días en agua y se plantaron directamente en suelo sin selección Se usaron macetas (Hummert D40) con un sedimento saturado de piedras (Jiffy 727) en la base y llenas con Metromix saturado con agua Después de la siembra se cubrieron las macetas con plástico para impedir el secado Las plantas se cultivaron solo con el agua presente en el medio de preparación, dado que el agua en el suelo de estas grandes macetas es suficiente para 3 semanas de crecimiento, y estimula el rápido crecimiento de la raíz La envoltura plástica de las macetas se retiró después de 12 días y se documentaron los datos morfológicos El día 17 se cosecharon las partes aereas de la planta, se secaron a 65°C durante 2 días y se midió el peso seco Para examinar las raíces se empujó el sedimento de piedras hacia la parte superior de la maceta para retirar la tierra y las raíces como una unidad Luego se separó la tierra de las raices en una bandeja y se midió la longitud máxima de la raíz Para determinar el impacto del fenotipo de la raíz en los tejidos sobre el suelo de las plantas transgénicas, se midió el peso seco de la roseta y se comparó contra la de las plantas de tipo salvaje Resultado También se evaluaron las raíces de las líneas AtACCD en tierra, tal como se describió antes El resultado indicó que las plantas transgenicas exhibieron un fenotipo de raíz más larga cuando las plantas se cultivan en tierra (Figuras 5 y 6) En general, todas las lineas AtACCD analizaron exhibieron aumento de crecimiento en el ensayo basado en tierra Las líneas 2, 4, 7, 10 y 11 mostraron el mayor incremento de la longitud de raíz (Figura 5) La Figura 6 muestra el ANOVA del rendimiento global del gen AtACCD, lo cual
demuestra que las plantas transgénicas AtACCD se desempeñaron significativamente mejor que los controles de tipo salvaje. Se midió el peso seco de la roseta, y el resultado del análisis ANOVA se muestra en la Figura 7. No se observaron diferencias significativas entre las plantas transgénícas y los controles de tipo salvaje. En consecuencia, la biomasa de la roseta no parece verse afectado por la sobreexpresión del gen AtACCD. Ejemplo 7 Identificación de homólogos de AtACCD Los algoritmos usados en la presente invención incluyen: FASTA (base de datos de secuencia muy sensible que estima la significancia estadística; Pearson, 1990, comparación de secuencia rápida y sensible con FASTP y FASTA, Methods Enzymol.
183:63-98); BLAST (base de datos de secuencia muy sensible que estima la significancia estadística; Altschul et al., Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology
215:403-10); PREDATOR (predicción de estructura secundaria de alta precisión de secuencia única y múltiple; Frishman y Argos, 1997, 75% de precisión en la predicción de la estructura secundaria proteica. Proteins 27:329-335); CLUSTALW (alineación de secuencias múltiple; Thompson et al., 1994, CLUSTAL W (mejora de la sensibilidad de la alineación de secuencias múltiples a través de los valores relativos de las secuencias, penalidades de brecha específicas de la posición y selección de la matriz de peso), Nucleic Acid Research 22:4673-4680); TMAP (predicción de la región transmembrana a partir de secuencias varias veces alineadas; Persson y Argos, 1994, Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing múltiple sequence alignments, J. Mol. Biol.
237:182-192); ALOM2 (predicción de la región transmembrana a partir de secuencias individuales; Klein et al., Prediction of proteín function from sequence properties: A discrimínate analysis of a datábase. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Versión
2 de Dr. K. Nakai); PROSEARCH (detección de patrones de secuencias proteicas
PROSITE; Kolakowski et al., 1992, ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Bíotechniques 13,
919-921 ); BLIMPS (búsquedas de similitud según la base de datos de bloques sin brecha, Wallace y Henikoff, 1992); PATMAT (un programa de búsqueda y extracción para cuestiones de secuencias, patrones y bloques y bases de datos, CABIOS 8:249-254.
Escrito por Bill Alford). Los homólogos del gen AtACCD se hallaron en las bases de datos públicos y de
propiedad Estos homólogos se evaluaron para determinar el nivel de relación con AtACCD El programa tblastn de la familia BLAST de algoritmos se uso para comparar la secuencia de proteínas AtACCD contra las bases de datos de propiedad de cultivos traducidas en los seis marcos de lectura Las secuencias con homología significativa se hallaron en cada biblioteca de cultivo El porcentaje de identidad de secuencia al nivel de aminoácidos de cada secuencia en comparación con AtACCD se muestra en la Columna N° 5 de la Tabla 1 y de la Tabla 2 Las alineaciones BLAST en el nivel de los aminoácidos entre AtACCD (SEQ ID NO 2) y ACCDP de cultivos tales como soja, arroz, maíz y trigo se muestran en las Figuras 9-12 El ACCDP de soja, arroz, maíz y trigo tal como se indican en las Figuras 9-12 son consideradas de longitud total Las secuencias de longitud total para las restantes secuencias parciales se pueden obtener por medio de secuencias de cebadores basadas en las secuencias de cADN parciales descritas usando técnicas estándar de biología molecular (ver Sambrook et al , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY) Ejemplo 8 Ingeniería de plantas de poroto de soja con sobreexpresion del gen ACCDP Las semillas de poroto de soja se esterilizan en superficie con etanol al 70% durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido de 20% (v/v) de Clorox suplementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos con agitación continua Luego se enjuagaron las semillas 4 veces con agua destilada y se colocaron sobre papel de filtro estéril húmedo en una placa de Petp a temperatura ambiente durante 6 a 39 horas Las cascaras de semilla se pelaron, y los cotiledones se separaron del eje del embrión El eje del embrión se analiza parea tener la certeza de que la región mepstemática no está dañada Los ejes del embrión extraído se juntan en una placa de Petp estéril semiabierta y se secaron al aire hasta tener un contenido de humedad inferior a 20% (peso fresco) en una placa de Petp sellada hasta el uso posterior Se prepara el cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una única colonia de medio sólido LB más los adecuados agentes de selección, seguido de crecimiento de la única colonia en medio líquido LB hasta tener una densidad óptica a 600 nm de 0,8 Luego se sedimento el cultivo bacteriano a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS suplementado con 100 µM de acetosipngona Los cultivos bacterianos se incubaron en este medio preinduccion durante 2 horas a
temperatura ambiente antes del uso El eje de embriones de semillas cigoticas de poroto de soja con un contenido de humedad de aproximadamente 15% se sumergieron durante 2 horas a temperatura ambiente con el cultivo en suspensión de Agrobacterium preinducido Los embriones se retiran del cultivo de imbibición y se transfieren a placas de Petp que contienen medio MS sólido suplementado con 2% de sacarosa y se incubaron durante 2 días en la oscuridad a temperatura ambiente Alternativamente, los embriones se colocaron sobre papel de filtros estéril humedecido (medio liquido MS) en una placa de Petp y se incubaron en las mismas condiciones antes descritas Después de este periodo, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o liquido suplementado con 500 mg/L de carbenicihna o 300 mg/L de cefotaxima para matar la Agrobactena El medio líquido se utilizo para humedecer el papel de filtro estéril Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25°C, con una intensidad de luz de 150 µmol rrf2sec~1 y un fotoperíodo de 12 horas Una vez que las semillas germinadas produjeron raices, se transfirieron a tierra metromix estéril El medio de las plantas in vitro se quita por lavado antes de transferir las plantas al suelo Las plantas se mantienen bajo una cubierta plástica durante 1 semana para favorecer el proceso de aclimatación Cuando las plantas se transfirieron a una habitación de crecimiento donde se incubaron a 25°C, con 150 µmol m"2sec~1 de intensidad de luz y 12 horas de fotopepodo durante aproximadamente 80 días Las plantas transgénicas se analizan por su mejor crecimiento de la raíz y/o tolerancia a estrés, lo cual demuestra que la expresión de transgen confiere aumento del crecimiento de la raíz, tolerancia a estrés y/o aumento de eficiencia de uso de agua Ejemplo 9 Plantas de ingeniería de colza /cañóla con sobreexpresion del gen ACCDP El método de transformación vegetal descrito en la presente es aplicable a Brassica y otros cultivos Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie con etanol al 70% durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido de 20% (v/v) de clorox suplementado con 0,05 % (v/v) de Tween durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua Luego se enjuagaron las semillas 4 veces con agua destilada y se colocaron sobre papel de filtro estéril humedecido en una placa de Petp a temperatura ambiente durante 18 horas Luego se retiraron las cubiertas de la semilla, y las semillas se secaron al aire durante la noche en una placa de Petp estéril semiabierta durante este periodo, las semillas pierden aproximadamente el 85% de su contenido de agua Las semillas luego se almacenaron a temperatura ambiente en una
placa de Petp sellada hasta su uso ulterior Las construcciones de ADN y la imbibición del embrión fueron como se describió en el Ejemplo 10 Las muestras de las plantas transgenicas primarias (TO) se analizaron por PCR para confirmar la presencia de T-ADN Estos resultados se confirmaron por hibridación Southern, donde el ADN se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se transfirió a una membrana de nailon con carga positiva (Roche Diagnostics) Se uso el PCR DIG Probé Synthesis Kit (Roche Diagnostics) para preparar una sonda con rótulo de digoxigenina por PCR, y se usó según las recomendaciones del fabricante Las plantas transgénicas se analizaron para determinar su mejor crecimiento de la raíz y/o tolerancia a estrés, lo cual demuestra que la expresión del transgen confiere aumento de crecimiento de la raíz, tolerancia a estrés, y/o aumento de eficiencia del uso de agua Ejemplo 10 Ingeniería de plantas de maíz con sobreexpresion del gen ACCDP La transformación de maiz (Zea Mays L ) con el gen de ínteres se realizó con el método descrito por Ishida et al , 1996, Nature Biotech 14745-50 Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens portador de vectores "superbinapos", y las plantas transgénicas se recuperaron mediante organogénesis Este procedimiento provee una eficiencia de transformación de entre 2,5% y 20% En las plantas transgénicas se analizan el mejor crecimiento de la raíz y/o la tolerancia a estrés, lo cual demuestra que la expresión del transgén confiere aumento de crecimiento de la raíz, tolerancia al estrés y/o aumento de la eficiencia de uso de agua Ejemplo 11 Ingeniería de plantas de arroz con sobreexpresion del gen ACCDP La transformación de arroz con el gen de ínteres se puede realizar mediante técnicas de transferencia directa de genes que utilizan protoplastos o bombardeo de partículas La transformación mediada por protoplastos fue descrita para los tipos Japónica e Indica (Zhang et al , Plant Cell Rep 7 379-384, 1988, Shimamoto et al Nature 338 274-277, 1989, Datta et al Biotechnology 8 736-740, 1990) Ambos tipos también son transformables en forma rutinaria mediante bombardeo de partículas (Chnstou et al Biotechnology 9 957-962, 1991 ) Las plantas transgenicas se analizan para determinar su mejor crecimiento y/o tolerancia a estrés, lo cual demuestra que la expresión transgenica confiere aumento de crecimiento de la raíz, tolerancia al estrés y/o aumento
de la eficiencia de uso de agua Ejemplo 12 Identificación de genes homólogos y heterólogos Las secuencias génicas se pueden usar para identificar genes homólogos o heterólogos de las bibliotecas de cADN o genómicas Los genes homólogos (p ej. clones de cADN de longitud total) se pueden aislar mediante hibridación de ácidos nucleicos al usar por ejemplo bibliotecas de cADN Según la abundancia del gen de interés, de 100 000 a 1 000 000 bacteriófagos de interés se siembran en placas y se transfieren a membranas de nailon Tras la desnaturalización con álcali, el ADN se inmovilizó sobre la membrana, p ej , por formación de enlaces cruzados por UV La hibridación se realizó en condiciones de alta rigurosidad En solución acuosa se realizó la hibridación y el lavado con una fuerza iónica de 1 M de NaCI y una temperatura de 68 °C Las sondas de hibridación se generaron, p ej , por rotulado de transcripción radioactivo (32P) puntual (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania) Las señales se detectan por autorradiografía. Los genes parcialmente homólogos o heterologos relacionados pero no idénticos se pueden identificar de manera análoga al procedimiento antes descrito, mediante condiciones de hibridación y lavado de baja rigurosidad Para la hibridación acuosa, la fuerza iónica normalmente se mantiene a 1 M de NaCI mientras que la temperatura se reduce progresivamente de 68 a 42 °C El aislamiento de las secuencias génicas con homologías (o de identidad/similitud de secuencia) solo en dominios diferenciados (por ejemplo 10-20 aminoácidos) se puede realizar mediante sondas de ohgonucleotido sintético con marca radiactiva Los oligonucleótidos con marca radiactiva se preparan por fosforilación del extremo 5' de dos oligonucleótidos complementarios con T4-pol?nucleot?doqu?nasa Los oligonucleótidos complementarios se fusionan y se ligan para formar concatomeros Los concatómeros bicatenapos luego se adosan a marca radiactiva, por ejemplo, por transcripción del nick. La hibridación normalmente se realiza en condiciones de baja rigurosidad con altas concentraciones de oligonucleótido Solución de hibridación de ohgonucleótido 6 x SSC 0,01 M de fosfato de sodio 1 mM de EDTA (pH 8) 0,5 % de SDS
100 µg/ml de ADN d esperma de salmón desnaturalizado 0,1 % de leche descremanda en polvo Durante la hibridación, la temperatura se redujo gradualmente a 5-10 °C por debajo de la Tm estimada del oligonucleótido, o menor que la temperatura ambiente, seguido de pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realizó con baja rigurosidad, al igual que los 3 pasos de lavado con 4 x SSC. Otros detalles se describe en Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons. Ejemplo 13 Identificación de genes homólogos al analizar las bibliotecas de expresión con anticuerpos
Los clones de c-DNA se pueden usar para obtener proteínas recombinantes, por ejemplo en E. coli (p. ej., el sistema Qiagen QIAexpress pQE). Las proteínas recombinantes luego se purificaron por afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes luego se usaron para producir anticuerpos específicos, por ejemplo al usar técnicas estándar para la inmunización de conejos. Los anticuerpos se purificaron por afinidad con una columna estándar de Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante tal como se describe en Gu et al., 1994, BioTechniques 17:257-262. El anticuerpo se puede usar para analizar las bibliotecas de expresión de cADN a fin de identificar los genes homólogos o heterólogos mediante análisis inmunológíco (Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons). Ejemplo 14 Mutagénesis in vivo La mutagénesis in vivo de microorganismos se puede realizar por pasaje de ADN plásmido (u otro vector) por E. coli u otros microorganismos (p. ej., Bacillus spp. o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que tienen deteriorada la capacidad para mantener la integridad de su información genética. Las típicas cepas mutadoras tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de ADN (p. ej., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, ver Rupp, W.D., 1996, ADN repair mechanísms, en: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington.) Dichas cepas son bien conocidas por los expertos en el arte. El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo,
en Greener, A. y Callahan, M., 1994, Strategies 7:32-34. La transferencia de moléculas de ADN mutadas en plantas de preferencia se realiza tras la selección y el análisis en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de acuerdo con diversos ejemplos dentro de la ejemplificación del presente documento. Ejemplo 15 Análisis in vitro de la función de los genes de Arabidopsis en organismos transgénicos La determinación de las actividades y los parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en el arte. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada deben ser ajustados según la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo cual es parte de la capacidad de los expertos en el arte. Se pueden hallar generalidades sobre las enzimas en general, además de detalles específicos referidos a estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones, y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas, por ejemplo, en las siguientes referencias: Dixon, M., y Webb, E.C., 1979, Enzymes. Longmans: London; Fersht, 1985, Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L., 1982, Fundamentáis of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed., 1983, The Enzymes, 3° ed. Academic Press:
Nueva York; Bisswanger, H., 1994, Enzymkinetik, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M., eds., 1983-1986, Methods of Enzymatic Analysis, 3° ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheím; y Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1987, vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352- 363. La actividad de las proteínas que se fijan a ADN se puede medir mediante varios métodos bien establecidos, tales como los ensayos de modificación de banda de ADN (también denominados ensayos de retardación en gel). El efecto de dichas proteínas sobre la expresión de otras moléculas se puede medir mediante ensayos de genes informadores (tales como el descrito en Kolmar, H. et al., 1995, EMBO J. 14: 3895-3904 y sus referencias). Los sistemas de pruebas de gen informador son bien conocidos y establecidos para aplicaciones en células procariontes y eucariontes, con enzimas tales como Xgalactosidasa, proteína fluorescente verde, y varios otros. La determinación de la actividad de las proteínas de transporte de membrana se puede realizar de acuerdo con técnicas tales como las descritas en Gennis, R.B., 1989, Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Funtion,
pp 85-137, 199-234 y 270-322, Sppnger Heidelberg Ejemplo 16 Purificación del producto deseado a partir de organismos transformados La recuperación del producto deseado a partir de material vegetal, hongos, algas, ciliados, células de C glutamicum, u otras células bacterianas transformadas por las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente, o el sobrenadante de los cultivos antes descrito se puede realizar por diversos métodos bien conocidos en el arte Si el producto deseado no se secreta por las células, se pueden cosechar las células del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y se pueden lisar por técnicas estándar tales como fuerza mecánica o sonicacion Los órganos de las plantas se pueden separar por medios mecánicos de otros tejidos y órganos Tras la homogenizacion se retiran los restos celulares por centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se mantiene para la ulterior purificación del compuesto deseado Si el producto es secretado de las células deseadas, entonces las células se extraen del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la fracción sobrenadante se retiene para la ulterior purificación La fracción sobrenadante de cualquier método de purificación se sometió a cromatografía con una resina adecuada, en donde la molécula deseada es retenida en una resina de cromatografía, mientras que muchas de las impurezas de la muestra no lo son, o cuando las impurezas son retenidas, pero la muestra no lo es Dichos pasos de cromatografía se pueden repetir según necesidad, mediante las mismas resinas de cromatografía u otras diferentes Un experto en el arte esta versado en la selección de adecuadas resinas de cromatografía y en su aplicación mas eficaz para purificar una molécula particular El producto purificado se puede concentrar por filtración o ultrafiltración, y almacenar a una temperatura en la cual se maximiza la estabilidad del producto Existe una amplia variedad de métodos de purificación conocidos en el arte y el método precedente de purificación no pretende ser limitante Dichas téncias de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J E & Ollis, 1986, D F Biochemical Engineepng Fundamentáis, McGraw-Hill New York Ademas, se pueden evaluar la identidad y la pureza de los compuestos aislados por técnicas estándar en el arte Estas incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía en capa fina, NIRS, ensayo enzimático, o
microbiologicamente Dichos métodos de análisis se revisan en Patek et al , 1994, Appl. Environ Microbiol 60 133-140, Malakhova et al , 1996, Biotekhnologiya 11 27-32, y Schmidt et al , 1998, Bioprocess Engineer 19 67-70, Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1996, vol A27, VCH Weinheim, p 89-90, p 521-540, p 540-547, p 559-566, 575-581 , y p 581-587, Michal, G , 1999, Btochemical Pathways An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley y Sons, Fallón, A et al , 1987, Applications of HPLC in Biochemistry en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol 17 Ejemplo 17 Análisis de tolerancia salina Pruebas salinas en placa de MS Las semillas germinadas se transfieren a papel de filtro empapado en 1 MS y se colocan en ?? MS 0,6% de agar suplementado con 2 ug/ml de benomilo la noche antes del análisis de estrés Para el análisis de estrés se desplaza el papel de filtro con las semillas germinadas a pilas de papel de filtro estéril, empapado en 50 mM de NaCI, en una placa de Petp Después de dos horas, el papel de filtro con las semillas germinadas se mueven a pilas de papel de filtro, empapadas en 200 mM de NaCI, en una placa de Petp Tras dos horas, el papel de filtro con las semillas germinadas se mueve a pilas de papel de filtro estéril empapadas en 600 mM de NaCI, en una placa de Petp Después de 10 horas, se mueve la semilla germinada a placas de Petp que contienen Vi MS 0,6% de agar suplementado con 2 ug/ml de benomilo Las semillas germinadas se califican después de 5 días, lo cual demuestra que la expresión transgenica confiere tolerancia salina Prueba en tierra de tolerancia salina Las semillas de las plantas a analizar se esterilizaron (100% de blanqueador, 0,1 % de TptonX durante cinco minutos dos veces y se enjuagaron cinco veces con ddH20) Las semillas se sembraron en placa en medio no selectivo (1/2 MS, 0,6% de Phyagar, 0,5 g/L de MES, 1% de sacarosa, 2 µg/ml de benamilo) Las semillas se dejaron germinar durante aproximadamente diez días En el estadio de 4-5 hojas, las plantas transgénicas se sembraron en macetas de 5,5 cm de diámetro llenos de tierra suelta (Metromix 360, Scotts) humedecida con 1 g/L 20-20-20 de fertilizante (Peters Professional, Scotts) Se dejaron crecer las plantas (22°C, luz continua) durante aproximadamente siete días, con riego según necesidad Cuando las plantas estaban por brotar se retiró el agua
de la bandeja y se inició el ensayo Para comenzar con el ensayo se agregaron tres litros de 100 mM de NaCI y 1/8 MS a la bandeja debajo de las macetas En la bandeja que contenía las plantas control se agregaron tres litros de 1/8 MS Después de 10 días, las plantas tratadas con NaCI y las plantas control recibieron agua Luego de diez días se fotografiaron las plantas Ejemplo 18 Análisis de la tolerancia a sequía Semillas germinadas T1 y T2 se transfirieron a papel de filtro seco estéril en una placa de Petn y se dejaron secar durante dos horas a 80% RH (humedad relativa) en un gabinete de crecimiento Sanyo MLR-350H, micromols-1 m2 (luz blanca, tubo fluorescente Philips TL 65W/25) Luego se redujo RH al 60% y las semillas se secaron durante otras ocho horas, las semillas luego se retiraron y se colocaron en placas de agar Vz MS 0,6% suplementadas con 2 µg/ml de benomilo se calificaron después de cinco días Las plantas transgénicas se analizaron por su mejor tolerancia a la sequía, lo cual demuestra que la expresión transgénica confiere tolerancia a sequía Ejemplo 19 Análisis de la tolerancia a la congelación Las semillas germinadas se llevan a placas de Petp que contienen Vz MS de 0,6% de agar suplementado con 2% de sacarosa y 2 ug/ml de benomilo Después de cuatro días, las semillas se incubaron a +4°C durante 1 hora y luego se cubrieron con hielo picado Las semillas germinadas luego se colocaron en la cámara ambiental Specialist ES2000 y se incubaron durante 3,5 horas comenzando con-1 ,0°C y con descensos de- 1°C hora Las semillas germinadas luego se incubaron a -5,0°C durante 24 horas y luego se descongelaron a +5°C durante 12 horas El agua se vuelca y las semillas germinadas se calificaron tras 5 días Las plantas transgénicas se analizan para determinar su mayor tolerancia al frío, lo cual demuestra que la expresión del transgén confiere tolerancia al frío.