MX2008013027A

MX2008013027A - Polipeptidos relacionados con estres y metodos de uso en plantas.

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Publication number: MX2008013027A
Application number: MX2008013027A
Authority: MX
Inventors: Damian Allen; Nocha Van Thielen; Ruoying Chen; Bryan Mckersie; Amber Shirley; Lori V Mills
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-03
Publication date: 2008-10-17
Also published as: CN101443355A; BRPI0710192A2; WO2007118790A2; EP2010560A2; AR060435A1; US20100175149A1; WO2007118790A3; US8637736B2; CN102766637A; CA2647944A1

Abstract

Una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica un polipéptido relacionado con el estrés (SRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. También se provee productos agrícolas, incluyendo semillas, producidos por las plantas transgénicas. También se provee SRPs aislados, SRPs que codifican ácido nucleico aislado, y vectores y células huésped que contiene los últimos.

Description

POLIPEPTIDOS RELACIONADOS CON ESTRÉS Y MÉTODOS DE USO EN PLANTAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere por lo general a secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que están asociados con crecimiento aumentado en plantas. En particular, esta invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que confieren sobre un crecimiento aumentado de planta bajo condiciones de estrés normal o abiótico y/o tolerancia aumentada bajo condiciones de estrés abiótico.

TÉCNICA DE ANTECEDENTES El estrés ambiental abiótico, tal como estrés por sequía, estrés por calor y estrés por frío, son factores limitantes principales de crecimiento y productividad de plantas. Las pérdidas de cosecha y pérdidas de producción de cosecha de cosechas principales, tales como soya, arroz, maíz (elote), algodón, y trigo causadas por este estrés representan un factor importante económico y político y contribuyen a escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Típicamente las plantas están expuestas durante su ciclo de vida a condiciones de contenido de agua ambiental reducido. La mayoría de las plantas han evolucionado estrategias para protegerse contra estas condiciones de desecación. Sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son tan grandes, los efectos en desarrollo, crecimiento y producción de la mayoría de las plantas son profundos. La exposición continua a condiciones de sequía causa alteraciones mayores en el metabolismo de planta, lo que finalmente conduce a muerte celular y por consiguiente pérdidas de producción. El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial para resolver o mediar por lo menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias de cultivo de planta tradicionales para desarrollar líneas nuevas de plantas que exhiben resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzar con la línea deseada. Los recursos de germoplasma limitados para tolerancia a estrés e incompatibilidad en cruces entre especies de planta distintamente relacionadas representan problemas significativos encontrados en cultivo convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia a sequía, frío y sal en plantas modelo tolerantes a sequía, frío y/o sal son complejos en naturaleza e involucran múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosos caminos metabólicos. Esta naturaleza multi-componente de tolerancia a estrés no sólo ha hecho del cultivo para tolerancia en gran parte no exitoso, sino también ha limitado la habilidad de genéticamente manipular plantas tolerantes a estrés usando métodos biotecnológicos. El estrés por sequía, estrés por calor, estrés por frío y estrés por sal tienen un tema importante común para crecimiento de plantas, y eso es disponibilidad de agua. Como se discutió antes, la mayoría de las plantas han evolucionado estrategias para protegerse contra estas condiciones de desecación, no obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son muy grandes, son profundos los efectos en el desarrollo, crecimiento y producción de plantas de la mayoría de plantas de cultivo. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles a concentraciones de sal más altas en la tierra. Ya que el contenido alto de sal en algunas tierras resulta en menos agua estando disponible para absorción celular, la alta concentración de sal tiene un efecto sobre plantas similar al efecto de sequía en plantas. Adicionalmente, bajo temperaturas de congelamiento, las células vegetales pierden agua como resultado de una formación de hielo que comienza en el apoplasto y saca agua desde el sincitio. Los mecanismos de respuesta molecular de una planta a cada una de estas condiciones de estrés son comunes, y los transportadores de iones juegan un papel esencial en estos mecanismos moleculares. El daño común de diferentes tipos de estrés tales como estrés por sequía, salinidad y frío, parece deberse en gran parte a deshidratación (Smirnoff, 1998, Curr. Opin. Biotech. 9:214-219). Las plantas tolerantes (estrés de agua) y sensibles a sequía se pueden distinguir con claridad por la acumulación dramática de iones y solutos en plantas tolerantes que conduce a ajustes osmóticos (Bohnert y Jensen, 1996, TIBTECH 14:89-97). Las condiciones de sequía y alta sal pueden ¡nteractuar con nutrición mineral en un número de maneras como una consecuencia de (1) transporte reducido de iones a través de la tierra a las raíces; y/o (2) absorción modificada de iones por las raíces. El potasio es un macronutriente principal de plantas, y el catión de potasio es el catión más abundante en plantas. El movimiento y transporte de potasio es importante para crecimiento, desarrollo, osmoregulación y homeostasis de plantas. Los transportadores de potasio en plantas han sido identificados como pertenecientes a varias familias, incluyendo la familia HAK. La familia HAK contiene miembros con homología a transportadores de potasio primero identificados en Escherichia coli y Schwannionyces occidentalis. Estos transportadores de potasio de HAK se encuentran como grandes familias de genes en Arabidopsis (Maeser y otros, 2001) y en arroz (Banuelos y otros, 2002). Los perfiles de hidrofobicidad de esta clase de HAK de transportadores de potasio sugieren que estas proteínas poseen 12 dominios de transmembrana y un lazo citosólico largo. Algunos miembros de esta familia se ha demostrado que funcionan como transportadores de catión de potasio de baja afinidad (Quintero y otros, 1997) mientras que en otros organismos el transportador de catión de potasio se ha demostrado que funciona como un transportador de alta afinidad (Rubio y otros, 2000). El potasio es particularmente importante en plantas no sólo como un nutriente, sino también como un osmoticum. El potasio puede hacer una contribución de 30-50% a potencial de agua, en particular en tejidos de hoja más viejos (Munns y otros, 1979, Aust. J. Plant Physiol. 6:379-389). Después de sequía prolongada en el campo, el potasio se acumula en hojas de ray-grass y cebada, y pudo tener un papel en ajuste osmótico. Además, el potasio juega un papel clave en la abertura de la estoma. Ya que el potasio se pierde de las células de protección (Ehret y Boyer, 1979, J. Exper. Bot. 30:225-234), un suministro reducido de potasio reduce conductancia de estoma a C02 mucho más de lo que reduce conductancia interna (Terry y Ulrich, 1973, Plant Physiol. 51:783-786). Las raíces de plantas pueden absorber potasio sobre más de un rango de concentración de 1000 veces, y la dependencia de concentración de absorción de potasio por raíces tiene cinética compleja, sugiriendo la presencia de múltiples sistemas de absorción de potasio. Se han identificado familias de genes codificando canales K+ rectificadores hacia adentro en varias especies de plantas. El gen de canal AKT1 K+ se expresa predominantemente en raíces y el análisis genético indica que el canal AKT1 media la absorción de K+ tanto en los rangos micromolares como milimolares (Hirsch y Sussman, 1999, TIBTECH 17:356-361). La biomasa de plantas se produce para cultivos de forraje como alfalfa, maíz ensilado y paja. Muchos poderes para producción se han usado en cultivos de grano. Los principales entre estos son estimados de tamaño de planta. El tamaño de planta se puede medir en muchas maneras dependiendo de las especies y etapa de desarrollo, pero incluyen peso seco de planta total, peso seco sobre tierra, peso fresco sobre tierra, área de hoja, volumen de tallo, altura de planta, diámetro de roseta, longitud de hoja, longitud de raíz, masa de raíz, número de caña y número de hojas. Muchas especies mantienen una relación conservadora entre el tamaño de partes diferentes de la planta en una etapa de desarrollo dada. Estas relaciones alométricas se usan para extrapolar de una de estas medidas de tamaño a otras (por ejemplo, Tittonell y otros 2005 Agrie Ecosys & Environ 105: 213). El tamaño de planta en cualquier etapa de desarrollo típicamente se correlacionará con tamaño de planta posterior en desarrollo. Una planta más grande con un área de hojas más grande típicamente absorberá más luz y dióxido de carbono que una planta más pequeña y por lo tanto probablemente ganará un mayor peso durante el mismo periodo (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50:39). Esto es además de la continuación potencial de la ventaja micro-ambiental o genética que la planta tuvo que lograr el tamaño más grande al inicio. Hay un fuerte componente genético a tamaño de planta y velocidad de crecimiento (por ejemplo, ter Steege y otros 2005 Plant Physiology 139:1078), y entonces para un rango de genotipos diversos, el tamaño de planta bajo una condición inflamatoria sistémica ambiental probablemente se correlacione con tamaño bajo otro (Hittalmani y otros 2003 Theoretical Applied Genetics 107:679). En esta manera, se usa un ambiente estándar como un poder para los ambientes diversos y dinámicos encontrados en diferentes ubicaciones y tiempos para cultivos en el campo. El índice de cosecha, la relación de producción de semilla a peso seco sobre tierra, es relativamente estable bajo muchas condiciones ambientales y así que una correlación robusta entre el tamaño de planta y la producción de grano a menudo se puede obtener (por ejemplo, Rebetzke y otros 2002 Crop Science 42:739). Estos procesos están intrínsecamente ligados porque la mayoría de biomasa de granos es dependiente de productividad fotosintética actual o almacenada por las hojas y tallo de la planta (Gardener y otros 1985 Physiology of Crop Plants. lowa State University Press, pp68-73). Por lo tanto, seleccionar el tamaño de planta, incluso en etapas tempranas de desarrollo, se ha usado como un indicador para producción potencial futura (por ejemplo, Tittonell y otros 2005 Agrie Ecosys & Environ 105:213). Cuando se prueba el impacto de diferencias genéticas en tolerancia a estrés, la habilidad de estandarizar propiedades de tierra, temperatura, agua y disponibilidad de nutriente e intensidad ligera es una ventaja intrínseca de invernadero o ambientes de cámara de crecimiento de plantas en comparación con el campo. Sin embargo, limitaciones artificiales en producción debido a polinización pobre debido a la ausencia de viento o insectos, o espacio insuficiente para raíz madura o crecimiento de cubierta forestal, pueden restringir el uso de estos ambientes controlados para probar las diferencias de producción. Por lo tanto, las medidas de tamaño de planta en desarrollo temprano, bajo condiciones estandarizadas en una cámara de crecimiento o invernadero, son prácticas estándar para proveer indicación de ventajas de producción genética potencial. Hay una compensación fisioquímicamente obligada fundamental, en todos los organismos terrestres, fotosintéticos, entre absorción de dióxido de carbono (C02) y pérdida de agua (Taiz y Zeiger, 1991, Plant Physiology, Benjamin/Cummings Publishing Co., p. 94). C02 necesita estar en solución acuosa para la acción de enzimas de fijación de C02 tales como Rubisco (Ribulosa 1,5-bifosfato Carboxilasa/Oxigenasa) y PEPC (Fosfoenolpiruvato carboxilasa). Ya que se requiere una superficie celular húmeda para difusión de C02, inevitablemente habrá evaporación cuando la humedad está debajo de 100% (Taiz y Zeiger, 1991, p. 257). Las plantas tienen numerosos mecanismos fisiológicos para reducir pérdida de agua (por ejemplo, cutículas de cera, cierre de estoma, pelos de hoja, hoyos de estoma hundidos). Ya que estas barreras no discriminan entre agua y flujo de C02, estas medidas de conversión de agua también actuarán para aumentar resistencia a absorción de C02 (Kramer, 1983, Water Relations of Plants, Acadamic Press p. 305). La absorción de C02 fotosintético es absolutamente requerida para crecimiento de planta y acumulación de biomasa en plantas fotoautotróf icas. La Eficiencia de Uso de Agua (WUE) es un parámetro frecuentemente usado para estimar la compensación entre consumo de agua y absorción/crecimiento de C02 (Kramer, 1983, Water Relations of Plants, Academic Press p. 405). WUE ha sido definida y medida en múltiples maneras. Una propuesta es calcular la relación de peso seco de planta entero, al peso de agua consumida por la planta a lo largo de su vida (Chu y otros, 1992, Oecologia 89:580). Otra variación es usar un intervalo de tiempo más corto cuando se miden acumulación de biomasa y uso de agua (Mian y otros, 1998, Crop Sci. 38:390). Otra propuesta es utilizar mediciones de partes restringidas de la planta, por ejemplo, midiendo solamente crecimiento aéreo y uso de agua (Nienhuis y otros 1994 Amer J Bot 81:943). WUE también se ha definido como la relación de absorción de C02 a pérdida de vapor de agua de una hoja o porción de una hoja, a menudo medida sobre un periodo de tiempo muy corto (por ejemplo, segundos/minutos) (Kramer, 1983, p. 406). La relación de 13C/12C fijo en tejido vegetal, y medida con un espectrómetro de masa de relación de isótopo, también se ha usado para estimar WUE en plantas usando fotosíntesis de C3 (Martin y otros, 1999, Crop Sci. 1775). Un aumento en WUE es informativo acerca de la eficiencia relativamente mejorada de crecimiento y consumo de agua, pero esta información tomada sola no indica si uno de estos dos procesos ha cambiado o ambos han cambiado. En seleccionar rasgos para mejorar cultivos, un aumento en WUE debido a una disminución en uso de agua, sin un cambio en crecimiento tendría mérito particular en un sistema agrícola irrigado en donde los costos de entrada de agua fueron altos. Un aumento en WUE llevado principalmente por un aumento en crecimiento sin un salto correspondiente en uso de agua tendría aplicabilidad a todos los sistemas agrícolas. En muchos sistemas agrícolas en donde el suministro de agua no es limitante, un aumento en crecimiento, incluso si viniese a costa de un uso de agua aumentado (es decir, sin cambio en WUE), podría aumentar también la producción. Por lo tanto, nuevos métodos para aumentar tanto WUE como acumulación de biomasa se requieren para mejorar la productividad agrícola. Ya que WUE integra muchos procesos fisiológicos con respecto al metabolismo primario y uso de agua, típicamente es un rasgo altamente poligénico con un genotipo grande por interacción ambiental (Richards y otros, 2002, Crop Sci. 42:111). Por estas y otras razones, pocos intentos por seleccionar cambios de WUE en programas de cultivo tradicional han sido exitosos. Aunque algunos genes que se involucran en respuestas de estrés y eficiencia de uso de agua en plantas se han caracterizado, la caracterización y clonación de genes vegetales que confieren tolerancia a estrés y eficiencia de uso de agua permanecen incompletos y fragmentos en gran parte. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que tensión por sequía y sal en algunas plantas se puede deber a efectos de genes aditivos, en contraste con otra investigación que indica genes específicos son transcripcionalmente activados en tejido vegetativo de plantas bajo condiciones de estrés osmótico. Aunque por lo general se asume que proteínas inducidas por estrés tienen un papel en tolerancia, todavía falta evidencia directa, y se desconocen las funciones de muchos genes responsivos a estrés. Por lo tanto, se necesita identificar genes adicionales expresados en plantas tolerantes a estrés y plantas que son eficientes en uso de agua que tienen la capacidad de conferir tolerancia a estrés y/o eficiencia de uso de agua aumentado a la planta huésped y a otras especies vegetales. Plantas tolerantes a estrés recientemente generadas y plantas con eficiencia de uso de agua aumentada tendrán muchas ventajas, tal como un rango aumentado en don de se pueden cultivar las plantas de cosecha, por ejemplo, al disminuir los requerimientos de agua de una especie vegetal. Otras ventajas deseables incluyen resistencia aumentada a hospedaje, la inclinación de brotes o tallos en respuesta a viento, lluvia, pestes o disminución.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención cumple, en parte, la necesidad de identificar nuevos genes únicos capaces de conferir tolerancia a estrés y/o crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de estrés a plantas al modificar la expresión de genes. La presente invención describe un género novedoso de polipéptidos relacionados con el estrés (SRPs) y ácidos nucleicos codificando SRP que son importantes para modular el crecimiento de una planta y la respuesta a un estrés ambiental. Más en particular, modificar la expresión de estos ácidos nucleicos codificando SRP en una planta resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales y de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental. Por lo tanto, la presente invención incluye una célula vegetal aislada que comprende un ácido nucleico codificando SRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula vegetal resulta en crecimiento aumentado bajo condiciones normales y de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula vegetal. Preferiblemente, el SRP es un Transportador de Canal de Potasio Activo (AKT). Más preferiblemente, el AKT es de Physcomitrella patens, Glycine max, o Triticum aestivum. A saber, en la presente se describen Transportadores de Canal de Potasio Activo de P. patens (PpAKT-3), Transportadores de Potasio Activo de Glycine max (GmAKT-2) y Transportador de Potasio Activo de Triticum aestivum (TaAKT-1). La invención provee en algunas modalidades que el SRP y ácido nucleico codificador son aquellos que se encuentran en miembros del género Physcomitrella, Glycine o Triticum. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico y polipéptido son de una planta de Physcomitrella patens, una planta de Glycine max, o una planta de Triticum aestivum . La invención provee que el estrés ambiental puede ser estrés por salinidad, sequía, nitrógeno, temperatura, metal, químico, patógeno y óxido, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, el estrés ambiental se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste de sequía, alta sal y baja temperatura. La invención provee además una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificando SRP, en donde la planta es de verdadera crianza para crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención provee además un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas descritas más adelante, partes de planta o semillas. La invención provee además un SRP aislado como se describe más adelante. La invención provee además un ácido nucleico codificando SRP aislado, en donde el ácido nucleico codificando SRP codifica un SRP como se describe más adelante. La invención provee además un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico que codifica SRP como se describe más adelante, en donde la expresión del vector en una célula huésped resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. La invención provee además una célula huésped que contiene el vector y una planta que contiene la célula huésped. La invención provee además un método de producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica SRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de !a planta que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica SRP, y (b) generar de la célula vegetal una planta transgénica con crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de agua limitada y/o una tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. En modalidades preferidas, el SRP y ácido nucleico codificando SRP son como se describe más adelante.

La presente invención provee además un método de identificar un SRP novedoso, que comprende (a) elevar una respuesta de anticuerpo especifica a un SRP, o fragmento del mismo, como se describe más adelante; (b) seleccionar material de SRP putativo con el anticuerpo, en donde la unión especifica del anticuerpo al material indica la presencia de un SRP potencialmente novedoso; y (c) identificar del material unido un SRP novedoso en comparación con un SRP conocido. Alternativamente, la hibridación con sondas de ácido nucleico como se describe más adelante se pueden usar para identificar ácidos nucleicos de SRP novedosos. La presente invención también provee métodos de modificar crecimiento de planta y/o tolerancia a estrés de una planta que comprende, modificar la expresión de un ácido nucleico de SRP en la planta, en donde el S P es como se describe más adelante. La invención provee que este método se puede realizar de modo que el crecimiento bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia a estrés se aumenta o disminuye. Preferiblemente, el crecimiento bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia a estrés se aumenta en una planta al aumentar la expresión de un ácido nucleico de SRP.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la correlación entre el nombre de gen y la SEC ID NO en el listado de secuencias. La figura 2 muestra la alineación detallada de las secuencias de aminoácidos de PpAKT-3 (SEC ID NO:2, EST472), GmAKT-2 (SEC ID NO:4, GM59666231) y TaAKT-1 (SEC ID NO:6, TA5924966) descritas. La alineación se generó usando Align X de Vector NTI. Los aminoácidos que son idénticos sobre todas las secuencias se indican con texto blanco y sombra negra, los aminoácidos que se conservan entre secuencias se indican con texto negro y sombra gris claro, y los aminoácidos que son similares sobre algunas o todas de las secuencias se indican con texto blanco y sombra gris obscuro. El dominio de Transportador de Potasio está presente en: EST 472 de aminoácido 78 a 772, TA59824966 de aminoácido 82 a 732, GM59666231 de aminoácido 43 a 768.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se puede entender más prontamente por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los ejemplos incluidos ahí. Sin embargo, antes de describir los presentes compuestos, composiciones y métodos, se debe entender que esta invención no se limita a ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos celulares específicos, células huésped específicas, condiciones específicas o métodos específicos, etc., como tales, desde luego, pueden variar, y las numerosas modificaciones y variaciones ahí serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. También se debe entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades específicas solamente y no debe ser limitante. En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como "Polipéptidos Relacionados con Estrés" (SRPs), en ninguna manera limita la funcionalidad de aquellas secuencias. La presente invención describe un género novedoso de SRPs y ácidos nucleicos codificando SRP que son importantes para modular el crecimiento de una planta bajo condiciones normales o de estrés y/o para modular la respuesta de una planta a un estrés ambiental. Más en particular, modificar la expresión de estos ácidos nucleicos codificando SRP en una planta resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental. Los miembros representativos del género de SRP incluyen, pero no se limitan a, PpAKT-3, GmAKT-2 y TaAKT-1. En una modalidad preferida, todos los miembros del género son transportadores de iones biológicamente activos. Por consiguiente, la presente invención abarca secuencias de polinucleótido y polipéptido relacionadas con estrés y su uso para aumentar el crecimiento de una planta bajo condiciones normales o de estrés y/o aumentar tolerancia de una planta a un estrés ambiental. En una modalidad, la secuencia de SRP es de una planta, preferiblemente una planta de Physcomitrella , una planta de Glycine, o una planta de Triticum, y más preferiblemente una planta de Physcomitrella patens, una planta de Glycine max o una planta de Triticum aestivum . En otra modalidad, las secuencias de SRP incluyen PpAKT-3 (SEC ID NOs: 1 y 2), GmAKT-2 (SEC ID NOs: 3 y 4), y TaAKT-1 (SEC ID NOs: 5 y 6). Las secuencias de aminoácidos descritas de un AKT de P. patens, un AKT de G. max, y un AKT de T. aestivum tienen identidad de porcentaje significativa a transportadores de canal de potasio activo se indican más adelante.

La presente invención provee una célula vegetal transgénica transformada por un ácido nucleico codificando SRP, en donde modificar la expresión de la secuencia de aminoácidos en la célula vegetal resulta en crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula vegetal. La invención provee además partes de planta transgénica y plantas transgénicas que contienen las células vegetales descritas en la presente. Las partes de planta incluyen, pero no se limitan a, tallos, raíces, óvulos, estambre, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, polen, microsporas y similares. En una modalidad, la planta transgénica es macho estéril. También se provee una semilla de planta producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificando SRP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificando SRP, y en donde la planta es de crianza pura para crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención provee además una semilla producida por una planta transgénica expresando un SRP, en donde la semilla contiene el SRP, y en donde la planta es de crianza pura para crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención provee también un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas descritas más adelante, partes de planta y semillas de planta. Los productos agrícolas incluyen, pero no se limitan a, extractos de planta, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, grasas, aceites, polímeros, vitaminas y similares. Como se usa en la presente, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparte características constantes que las separan de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de esa especie. Aunque posee por lo menos un rasgo distintivo, una variedad también se caracteriza por alguna variación entre individuos dentro de la variedad, con base primariamente en la segregación mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones subsiguientes. Se considera una variedad de "crianza pura" para un rasgo particular si es genéticamente homocigótica para ese rasgo al grado que, cuando la variedad de crianza pura se auto-poliniza, una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie no se observa. En la presente invención, el rasgo surge de la expresión transgénica de una o más secuencias de ADN de SRP introducidas en una variedad de planta. También como se usa en la presente, el término "variedad de tipo silvestre" se refiere a un grupo de plantas que se analizan para propósitos comparativos como una planta de control, en donde la planta de variedad de tipo silvestre es idéntica a la planta de prueba (planta transformada con un SRP o planta en donde la expresión del ácido nucleico codificando SRP se ha modificado) con la excepción de que la planta de variedad de tipo silvestre no se ha transformado con un ácido nucleico codificando SRP y/o expresión del ácido nucleico codificando SRP en la planta de variedad de tipo silvestre no se ha modificado. La presente invención describe que los SRPs de P. patens (PpAKT-3), los SRPs de Glycine max (GmAKT-2) y el SRP de Triticum aestivum (TaAKT-1) son útiles para aumentar el crecimiento aumentado de una planta bajo condiciones normales o de estrés y/o aumentar la tolerancia de una planta a un estrés ambiental. Como se usa en la presente, el término polipéptido se refiere a una cadena de por lo menos cuatro aminoácidos unidos por enlaces de péptido. La cadena puede ser lineal, ramificada, circular o combinaciones de las mismas. Por consiguiente, la presente invención provee SRPs aislados seleccionados a partir del grupo que consiste de PpAKT-3, GmAKT-2, TaAKT-1 y homólogos de los mismos. En modalidades preferidas, el SRP se selecciona a partir de polipéptido de transportador-3 de canal de potasio activo de P. patens (PpAKT-3) como se define en SEC ID NO:2, polipéptido de transportador-2 de canal de potasio activo de Glycine max (GmAKT-2) como se define en SEC ID NO:4, polipéptido de transportador de canal de potasio activo de Triticum aestivum (TaAKT-1) como se define en SEC ID NO:6, y homólogos u ortólogos de los mismos. Los homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos se definen más adelante. Los SRPs de la presente invención se producen preferiblemente por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico codificando el polipéptido se clona en un vector de expresión (como se describe más adelante), el vector de expresión se introduce en una célula huésped (como se describe más adelante), y el SRP se expresa en la célula huésped. El SRP entonces se puede aislar de las células por un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de polipéptido estándar. Para los propósitos de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que se ha alterado, reacomodado o modificado mediante ingeniería genética. Ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, y polinucleótidos que se enlazan o juntan a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones a polinucleótidos que resultan de hechos que ocurren de manera natural, tales como mutaciones espontáneas. Alternativo a expresión recombinante, un SRP, o péptido del mismo, se puede sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de péptido estándar. Además, se pueden aislar SRPs nativos de células (por ejemplo, P. patens, Glycine max, Triticum aestivum o Brassica napus), por ejemplo, usando un anticuerpo anti-SRP, que se puede producir por técnicas estándar utilizando un SRP o fragmento del mismo. Como se usa en la presente, el término "estrés ambiental" o "estrés" se refiere a condiciones sub-óptimas asociadas con estrés por salinidad, sequía, nitrógeno, temperatura, metal, químico, patógeno y óxido, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, el estrés ambiental se puede seleccionar a partir de uno o más del grupo que consiste de salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de los mismos, y en particular, se puede seleccionar a partir de uno o más del grupo que consiste de alta salinidad, bajo contenido de agua o baja temperatura. También se debe entender que como se usa en la especificación y en las reivindicaciones, "un" o "uno/a" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en donde se usa. De esta manera, por ejemplo, referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar por lo menos una célula. Como también se usa en la presente, el término "eficiencia de uso de agua" se refiere a la cantidad de agua usada por la planta en producirla, es decir, el peso seco de una planta en relación al uso de agua de la planta. Como se usa en la presente, el término "peso seco" se refiere a todo en la planta que no sea agua, e incluye, por ejemplo, carbohidratos, proteínas, aceites y nutrientes minerales. Como también se usa en la presente, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a A N o ADN que es lineal o ramificado, de cadena individual o doble, o un híbrido del mismo. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Estos términos también abarcan secuencia no traducida ubicada en los extremos 3' y 5' de la región codificadora del gen: por lo menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia ascendente desde el extremo 5' de la región codificadora y por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos de secuencia descendente desde el extremo 3' de la región codificadora del gen. Las bases menos comunes, tales como inopina, 5-metílcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras también se pueden usar para apareamiento de antisentido, dsARN y ribozima. Por ejemplo, los polinucleótidos que contienen análogos de C-5 propina de uridina y citidina han sido mostrados por unir ARN con alta afinidad y ser inhibidores antisentido potentes de expresión de genes. Otras modificaciones, tal como la modificación a la estructura de fosfodiéster, o el 2'-hidroxi en el grupo de azúcar de ribosa del ARN también se pueden hacer. Los polinucleótidos y ribozimas antisentido pueden consistir enteramente de ribonucleótidos, o pueden contener ribonucleótidos y desoxiribonucleótidos mixtos. Los polinucleótidos de la invención se pueden producir por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de cADN, síntesis in vitro, RT-PCR y transcripción in vitro o in vivo. Una molécula de ácido nucleico "aislado" es una que sustancialmente se separa de otras moléculas de ácido nucleico, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de algunas de las secuencias, que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón que ocurre de manera natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado es considerado aislado. En varias modalidades, la molécula de ácido nucleico de SRP aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótido que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómica de la célula de la cual el ácido nucleico se deriva (por ejemplo, una célula de Physcomitrella patens, una célula de Glycine max, una célula de Triticum aestivum o una célula de Brassica napus). Un ácido nucleico también es considerado aislado si se ha alterado por intervención humana, o colocado en un lugar o ubicación que no sea su sitio natural, o si se introduce en una célula por agroinfección. Además, una molécula de ácido nucleico "aislado", tal como una molécula de cADN, puede estar libre de algunos de los materiales celulares con los cuales se asocia de manera natural, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Se excluye específicamente de la definición de "ácidos nucleicos aislados" los cromosomas que ocurren de manera natural (tales como expansiones de cromosoma), bibliotecas de cromosomas artificiales, bibliotecas genómicas, y bibliotecas de cADN que existen como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de célula huésped transfectada/transformada, en donde las células huésped son una preparación heterogénea in vitro o cubierta como una población heterogénea de colonias individuales. También se excluyen específicamente las bibliotecas anteriores en donde un ácido nucleico especificado conforma menos de 5% del número de insertos de ácido nucleico en las moléculas de vector. Se excluyen más específicamente preparaciones de ADN genómico celular entero o ARN celular entero (incluyendo aquellas preparaciones celulares enteras que son mecánicamente cortadas o enzimáticamente digeridas). Incluso además se excluyen específicamente las preparaciones celulares enteras encontradas ya sea como en preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis en donde el ácido nucleico de la invención no se ha separado más de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de electroforesis (por ejemplo, separando más al extirpar una banda individual de una población de banda heterogénea en un gel de agarosa o transferencia de nylon).

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de SEC ID NO:1, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, o una porción de la misma, se puede aislar usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia provista ahí. Por ejemplo, se puede aislar un cADN de SRP de P. patens de una biblioteca de P. patens usando toda o una porción de la secuencia descrita en la presente. Además, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de la secuencia de SEC ID NO:1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5 se puede aislar por la reacción en cadena de polimerasa usando cebadores de oligonucieótido diseñados con base en esta secuencia. Por ejemplo, mARN se puede aislar de células vegetales (por ejemplo, por el procedimiento de extracción de guanidinio-tiocianato de Chirgwin y otros 1979, Biochemistry 18:5294-5299), y cADN se puede preparar usando transcriptasa en reversa (por ejemplo, Moloney MLV transcriptasa en reversa, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o AMV transcriptasa en reversa, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los cebadores de oligonucieótido sintéticos para amplificación de reacción en cadena de polimerasa diseñados con base en la secuencia de oligonucieótido mostrada en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede amplificar usando cADN o, alternativamente, ADN genómico, como un molde y cebadores de oligonucieótido apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación de PCR estándar. La molécula de ácido nucleico así amplificada se puede clonar en un vector apropiado y caracterizado por análisis de secuencia de ADN. Además, oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótido de SRP se pueden preparar por técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.

En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención comprende la secuencia de nucleótido mostrada en SEC ID NO:1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. Estos cADNs pueden comprender secuencias que codifican el SRP (es decir, la "región codificadora"), así como secuencias no traducidas de 5' y secuencias no traducidas de 3'. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden comprender solamente la región codificadora de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5, o pueden contener fragmentos genómicos enteros aislados de ADN genómico. La presente invención también incluye ácidos nucleicos codificadores de SRP que codifican un SRP como se describe en la presente. Se prefiere un ácido nucleico codificando SRP que codifica un SRP seleccionado a partir del grupo que consiste de PpAKT-3 (SEC ID NO:2), GmAKT-2 (SEC ID NO:4), y TaAKT-1 (SEC ID NO:6). Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una porción de la región codificadora de la secuencia en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5, por ejemplo, un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de un SRP.

Las secuencias de nucleótido determinadas de la clonación de los genes de SRP de P. patens, Glycine max y T. aestivum permiten la generación de sondas y cebadores diseñados para usarse en identificar y/o clonar homólogos de SRP en otros tipos celulares y organismos, así como homólogos de SRP de otros musgos y especies relacionadas. La porción de la región codificadora también puede codificar un fragmento biológicamente activo de un SRP. Como se usa en la presente, el término "porción biológicamente activa de" un SRP debe incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, de un SRP que participa en la modulación de crecimiento bajo condiciones normales o de estrés y/o modulación de tolerancia a estrés en una planta, y más preferiblemente, tolerancia a sequía o tolerancia a sal. Para los propósitos de la presente invención, la modulación de crecimiento de planta bajo condiciones normales o de limitadas en agua y/o tolerancia a estrés se refiere a por lo menos un aumento o disminución de 10% en el crecimiento bajo condiciones normales o limitadas en agua y/o por lo menos un aumento o disminución de 10% en tolerancia a estrés de una planta transgénica que comprende un cásete de expresión de SRP (o vector de expresión) en comparación con el crecimiento bajo condiciones normales o limitadas en agua y/o tolerancia a estrés de una variedad de control de tipo silvestre de la planta. Métodos para cuantificar el crecimiento bajo condiciones normales o limitadas en agua y/o tolerancia a estrés se proveen por lo menos en los ejemplos 8, 13 y 14 más adelante. En una modalidad preferida, la porción biológicamente activa de un SRP aumenta el crecimiento de una planta bajo condiciones normales o limitadas en agua y/o la tolerancia de la planta a un estrés ambiental, en comparación con una variedad de control de tipo silvestre de la planta. Las porciones biológicamente activas de un SRP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de un SRP, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6, o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido idéntico a un SRP, que incluye menos aminoácidos que un SRP de longitud completa o el polipéptido de longitud completa que es idéntico a un SRP, y exhiben por lo menos una actividad de un SRP. Típicamente, las porciones biológicamente activas (por ejemplo, péptidos que son, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50 100 o más aminoácidos en longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de un SRP. Además, otras porciones biológicamente activas en donde otras regiones del polipéptido se omiten, se pueden preparar por técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades descritas en la presente. Como se muestra en la figura 2, el dominio transportador de potasio está presente en EST 472 del aminoácido 78 al aminoácido 772, TA59824966 del aminoácido 82 al aminoácido 732, GM59666231 del aminoácido 43 al aminoácido 768.

La invención también provee polipéptidos quiméricos o de fusión de SRP. Como se usa en la presente, un "polipéptido quimérico" o "polipéptido de fusión" de SRP comprende un SRP ligado operativamente a un no SRP. Un SRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un SRP, mientras que un no SRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente idéntico al SRP, por ejemplo, un polipéptido que es diferente del SRP y se deriva del mismo o diferente organismo. Con respecto al polipéptido de fusión, el término "ligado operativamente" debe indicar que el SRP y el no SRP se fusionan entre sí de modo que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia usada. El no SRP se puede fusionar a la terminal N o terminal C del SRP. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión de GST-SRP en donde las secuencias de SRP se fusionan a la terminal C de las secuencias de GST. Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de SPRs recombinantes. En otra modalidad, el polipéptido de fusión es un SRP que contiene una secuencia de señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de un SRP puede aumentarse a través del uso de una secuencia de señal heteróloga. Preferiblemente, un polipéptido quimérico o de fusión de SRP de la invención se produce por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptido se ligan juntas en trama de conformidad con técnicas convencionales, por ejemplo, al emplear terminales en extremo romo o extremo escalonado para ligación, digestión de enzima de restricción para proveer terminales apropiadas, rellenando extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar junta y ligación enzimático no deseadas. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación de PCR de fragmentos de genes se puede llevar a cabo usando cebadores de ancla que dan aumento a sobresalientes complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que se pueden recocer posteriormente y re-amplificar para generar una secuencia de genes quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel y otros, 1992, John Wiley & Sons). Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles que ya codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico codificando SRP se puede clonar en dicho vector de expresión de modo que la porción de fusión se liga en trama al SRP. Además de fragmentos y polipéptidos de fusión de los SRPs descritos en la presente, la presente invención incluye homólogos y análogos de SRPs que ocurren de manera natural y ácidos nucleicos que codifican SRP en una planta. "Homólogos" se definen en la presente como dos ácidos nucleicos o polipéptidos que tienen secuencias de nucleótido o aminoácidos similares, o sustancialmente idénticas, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de SRPs como se define más adelante. El término "homólogo" además abarca moléculas de ácido nucleico que difieren de una de las secuencias de nucleótido mostradas en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5 (y porciones de las mismas) debido a degeneración del código genético y así codifican el mismo SRP como aquel codificado por las secuencias de nucleótido mostradas en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. Como se usa en la presente, un SRP "que ocurre de manera natural" se refiere a una secuencia de aminoácidos de SRP que ocurre en naturaleza. Preferiblemente, un SRP que ocurre de manera natural comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO: 2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. Un agonista del SRP puede retener sustancialmente las mismas, o una subserie, de las actividades biológicas del SRP. Un antagonista del SRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma que ocurre de manera natural del SRP. Por ejemplo, el antagonista de SRP puede unir competitivamente a un miembro descendente o ascendente de la cascada metabólica de componente de membrana celular que incluye el SRP, o unir a un SRP que media transporte de compuestos sobre dichas membranas, así previniendo que ocurra translocación. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un cADN de SRP se pueden aislar con base en su identidad a los ácidos nucleicos de SRP de P. patens, G. max o T. aestivum descritos en la presente usando cADNs de SRP, o una porción de los mismos, como una sonda de hibridación de conformidad con técnicas de hibridación estándar bajo condiciones de hibridación estrictas. En una modalidad alternativa, se pueden identificar homólogos del SRP al seleccionar bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, del SRP para actividad agonista o antagonista de SRP. En una modalidad, una biblioteca abigarrada de variantes de SRP se genera por mutagénesis combinatoria al nivel de ácido nucleico y se codifica por una biblioteca genética abigarrada. Una biblioteca abigarrada de variantes de SRP se puede producir, por ejemplo, al ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de modo que una serie degenerada de secuencias de SRP potenciales se puede expresar como polipéptidos individuos, o alternativamente, como una serie de polipéptidos de fusión más grandes (por ejemplo, para exhibición de fago) conteniendo la serie de secuencias de SRP ahí. Existe una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de homólogos de SRP potenciales de una secuencia de oligonucleótido degenerado. La síntesis química de una secuencia genética degenerada se puede realizar en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético después se liga en un vector de expresión apropiado. El uso de una serie degenerada de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican la serie deseada de secuencias de SRP potenciales. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura y otros, 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y otros, 1984, Science 198:1056; Ike y otros, 1983, Nucleic Acid Res. 11:477). Además, se pueden usar bibliotecas de fragmentos de las regiones que codifican SRP para generar una población abigarrada de fragmentos de SRP para clasificar y selección posterior de homólogos de un SRP. En una modalidad, una biblioteca de fragmentos de secuencia codificadora se puede generar al tratar un fragmento de PCR de cadena doble de una secuencia codificadora de SRP con un nucleasa bajo condiciones en donde ocurre festoneado sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de cadena doble, renaturalizando el ADN para formar ADN de doble cadena, que puede incluir pares de sentido/antisentido de diferentes productos festoneados, eliminando porciones de cadena sencilla de dúplex reformados por tratamiento con S1 nucleasa, y ligando la biblioteca de fragmento resultante en un vector de expresión. Por este método, una biblioteca de expresión se puede derivar que codifica fragmentos de terminal N, terminal C e internos de varios tamaños del SRP. Varias técnicas son conocidas en la técnica para clasificar productos de genes de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones o truncamiento de punto, y para clasificar bibliotecas de cADN para productos de genes que tienen una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para clasificación rápida de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de SRP. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles a análisis de alta producción, para clasificar bibliotecas de genes grandes típicamente incluyen clonar la biblioteca de genes en vectores de expresión que se pueden replicar, transformar células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en donde la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis de ensamble recursivo (REM), una técnica que realza la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con las pruebas de clasificación para identificar homólogos de SRP (Arkin y Yourvan, 1992, PNAS 89:7811-7815; Delgrave y otros, 1993, Polypeptide Engineering 6(3):327-331 ). En otra modalidad, se pueden explotar pruebas con base celular para analizar una biblioteca de SRP abigarrada, usando métodos bien conocidos en la técnica. La presente invención provee además un método de identificar un SRP novedoso, que comprende (a) elevar una respuesta a anticuerpo específica a un SRP, o un fragmento del mismo, como se describe en la presente; (b) clasificar material de SRP putativo con el anticuerpo, en donde la unión específica del anticuerpo al material indica la presencia de un SRP potencialmente novedoso; y (c) analizar el material unido en comparación con SRP conocido, para determinar su novedad. Como se mencionó antes, la presente invención incluye SRP y homólogos del mismo. Para determinar la identidad de secuencia de porcentaje de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una de las secuencias de SEC ID N0:2, SEC ID N0:4 o SEC ID NO:6 y una forma mutante de la misma), las secuencias se alinean para propósito de comparación óptima (por ejemplo, huecos se pueden introducir en la secuencia de un polipéptido para alineación óptima con el otro polipéptido o ácido nucleico). Los residuos de aminoácidos en posiciones de aminoácidos correspondientes entonces son comparados. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, una de las secuencias de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6) es ocupada por el mismo residuo de aminoácido como la posición correspondiente en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de la secuencia seleccionada de las secuencias de polipéptido de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6) entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El mismo tipo de comparación se puede hacer entre dos secuencias de ácido nucleico. La identidad de secuencia de porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad de secuencia de porcentaje = números de posiciones idénticas/números totales de posiciones x 100). Preferiblemente, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención son por lo menos aproximadamente 50-60%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60-70%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 95-90%) o 90-95%, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en SEC ID N0:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. Todavía en otra modalidad, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención son por lo menos aproximadamente 50-60%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60-70%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 85-90% o 90-95%, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a una secuencia de aminoácidos entera codificada por un secuencia de ácido nucleico mostrada en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. En otras modalidades, los homólogos de aminoácidos de SRP tienen identidad de secuencia sobre por lo menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, más preferiblemente por lo menos 25 residuos de aminoácidos contiguos y muy preferiblemente por lo menos 35 residuos de aminoácidos contiguos de SEC ID NO: 2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. En otra modalidad preferida, un homólogo de ácido nucleico aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótido que es por lo menos aproximadamente 40-60%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60-70%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 95-90% o 90-95%, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a una secuencia de nucleótido mostrada en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5, o a una porción que comprende por lo menos 60 nucleotidos consecutivos de la misma. La longitud preferible de comparación de secuencia para ácidos nucleicos es por lo menos 75 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos 100 nucleótidos, y muy preferiblemente la longitud entera de la región codificadora. Incluso es más preferible que los homólogos de ácido nucleico codifiquen proteínas teniendo homología con SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6 sobre los dominios funcionales mostrados más adelante. Además se prefiere que el homólogo de ácido nucleico aislado de la invención codifica un SRP, o porción del mismo, es decir al menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% idéntico a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6, y que funciona como un modulador de crecimiento de planta y/o una respuesta a estrés ambiental en una planta. En una modalidad más preferida, la sobreexpresión del homólogo de ácido nucleico en una planta aumenta el crecimiento de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o aumenta la tolerancia de la planta a un estrés ambiental. En otra modalidad preferida, el homólogo de ácido nucleico codifica un SRP que funciona como un transportador de iones, más preferiblemente, un transportador de canal de potasio activo. Para los propósitos de la invención, la identidad de secuencia de porcentaje entre dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido se determina usando el paquete de software vector NTI 9.0 (PC) (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA92008). Una penalidad de abertura de hueco de 15 y una penalidad de extensión de hueco de 6.66 se usan para determinar la identidad de porcentaje de dos ácidos nucleicos. Una penalidad de abertura de hueco de 10 y una penalidad de extensión de hueco de 0.1 se usan para determinar la identidad de porcentaje de dos polipéptidos. Todos los otros parámetros se establecen en los ajustes preestablecidos. Para propósitos de una múltiple alineación (algoritmo Clustal W), la penalidad de abertura de hueco es 10, y la penalidad de extensión de hueco es 0.05 con matriz biosum62. Se debe entender que para los propósitos de determinar identidad de secuencia al comparar una secuencia de ADN a una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo. En otro aspecto, la invención provee un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que híbrida al polinucleótido de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5 bajo condiciones estrictas. Más en particular, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención es al menos 15 nucleótidos en longitud e híbrida bajo condiciones estrictas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. En otras modalidades, el ácido nucleico es por lo menos 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos en longitud. Preferiblemente, un homólogo de ácido nucleico aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótido que híbrida bajo condiciones altamente estrictas a la secuencia de nucleótido mostrada en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5, y funciona como un modulador de crecimiento bajo condiciones normales o de estrés y/o un modulador para tolerancia a estrés en una planta. En otra modalidad preferida, la sobreexpresión del homólogo de ácido nucleico aislado en una planta aumenta el crecimiento de una planta bajo condiciones normales o de estrés y/o aumenta la tolerancia de una planta a un estrés ambiental. Incluso en otra modalidad preferida, el homólogo de ácido nucleico aislado codifica un SRP que funciona como un transportador de iones, más preferiblemente, un transportador de canal de potasio activo. Como se usa en la presente con respecto a hibridación para ADN a una transferencia de ADN, el término "condiciones estrictas" se refiere a hibridación durante la noche a 60°C en solución de 10X Denhart, 6X SSC, 0.5% SDS, y 100 pg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Se lavan transferencias en secuencia a 62°C durante 30 minutos cada vez en 3X SSC/0.1% SDS, seguido por 1X SSC/0.1% SDS, y finalmente 0.1X SSC/0.1% SDS. Como también se usa en la presente, en una modalidad preferida, la frase "condiciones estrictas" se refiere a hibridación en una solución de 6X SSC a 65°C. En otra modalidad, "condiciones altamente estrictas" se refiere a hibridación durante la noche a 65°C en solución de 10X Denhart, 6X SSC, 0.5% SDS y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Se lavan transferencias en secuencia a 65°C durante 30 minutos cada vez en 3X SSC/0.1% SDS, seguido por 1X SSC/0.1% SDS, y finalmente 0.1X SSC/0.1% SDS. Los métodos para hibridaciones de ácido nucleico se describen en Meinkoth y Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2, Ausubel y otros, eds., Greene Publishing y Wiley-I nterscience, Nueva York, 1995; y Tijssen, 1993, Laboratory Techniques ¡n Biochemistry and Molecular Biology: Hy bridization with Nucleic Acid Probes, parte 1, capítulo 2, Elsevier, Nueva York, 1993. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención que híbrida bajo condiciones estrictas o condiciones altamente estrictas a una secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5 corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre de manera natural. Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "que ocurre de manera natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN teniendo una secuencia de nucleótido que ocurre en naturaleza (por ejemplo, codifica un polipéptido natural). En una modalidad, el ácido nucleico codifica un SRP de P. patens, SRP de G. max o SRP de T. aestivum que ocurre de manera natural. Usando los métodos antes descritos, y otros conocidos a aquellos expertos en la técnica, uno de los expertos en la técnica puede aislar homólogos del SRP que comprende secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. Una subserie de estos homólogos son variantes alélicas. Como se usa en la presente, el término "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de un SRP y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de planta). Dichas variaciones alélicas naturales pueden resultar típicamente en 1-5% de variancia en un ácido nucleico de SRP. Las variantes alélicas se pueden identificar al secuenciar la secuencia de ácido nucleico de interés en un número de diferentes plantas, que se pueden llevar a cabo prontamente al usar sondas de hibridación para identificar el mismo lugar genético de SRP. Cualquiera y todas de dichas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes en un SRP que son el resultado de variación alélicas natural y no alteran la actividad funcional de un SRP, deben estar dentro del alcance de la invención. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican SRPs a partir de la misma u otra especie tales como análogos, ortólogos y parálogos de SRP, deben estar dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en la presente, el término "análogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. Como se usa en la presente, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de diferentes especies, pero que han evolucionado de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptido teniendo las mismas o similares funciones. Como también se usa en la presente, el término "parálogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen funciones diferentes, pero estas funciones se pueden relacionar (Tatusov y otros, 1997, Science 278(5338):631 -637). Los análogos, ortólogos y parálogos de un SRP que ocurre de manera natural pueden diferir del SRP que ocurre de manera natural por modificaciones de post-traducción, por diferencias de secuencia de aminoácidos, o por ambos. Las modificaciones de post-traducción incluyen derivación química in vivo e in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación o glicosilación, y dichas modificaciones pueden ocurrir durante síntesis de polipéptido o procesamiento o después de tratamiento con enzimas modificadoras aisladas. En particular, los ortólogos de la invención por lo general exhibirán por lo menos 80-85%, más preferiblemente 85-90% o 90-95%, y más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99%, o 100% de identidad de secuencia, con todo o parte de una secuencia de aminoácidos de SRP que ocurre de manera natural, y exhibirán una función similar a un SRP. Preferiblemente, un ortólogo de SRP de la presente invención funciona como un modulador de crecimiento de planta y/o una respuesta a estrés ambiental en una planta y/o funciona como un transportador de iones. Más preferiblemente, un ortólogo de SRP aumenta el crecimiento de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o aumenta la tolerancia a estrés de una planta. En una modalidad, los ortólogos de SRP mantienen la habilidad de participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en una planta, o en el transporte de moléculas sobre estas membranas. Además de variantes que ocurren de manera natural de una secuencia de SRP que puede existir en la población, el experto en la técnica apreciará que se pueden introducir cambios mediante mutación en una secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID N0:5, así conduciendo a cambios en la secuencia de aminoácidos del SRP codificado, sin alterar la actividad funcional del SRP. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótido conduciendo a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" se pueden hacer en una secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. Un residuo de aminoácidos "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo silvestre de uno de los SRPs sin alterar la actividad de dicho SRP, mientras que un residuo de aminoácidos "esencial" se requiere para actividad de SRP. Sin embargo, otros residuos de aminoácidos (por ejemplo, aquellos que no son conservados o solamente semi-conservados en el dominio teniendo actividad de SRP) quizá no sean esenciales para actividad y así probablemente sean susceptibles a alteración sin alterar la actividad de SRP. Por consiguiente, otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico que codifican SRPs que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para actividad de SRP. Dichos SRPs difieren en secuencia de aminoácidos de una secuencia contenida en SEC ID NO.2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6, aunque retienen por lo menos una de las actividades de SRP descritas en la presente. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID N0:6. Preferiblemente, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico es por lo menos aproximadamente 50-60% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 60-70% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6, incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% o 90-95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. Los homólogos de SRP preferidos de la presente invención participan de preferencia en el crecimiento de una planta y/o una respuesta de tolerancia a estrés, o más en particular, funcionan como un transportador de iones, preferiblemente, como un transportador de canal de potasio activo. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un SRP teniendo identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO.6 puede crearse al introducir una o más sustituciones, adiciones u omisiones de nucleótido en una secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5, respectivamente, de modo que una o más sustituciones, adiciones u omisiones de aminoácidos se introducen en el polipéptido codificado. Se pueden introducir mutaciones en la secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5 por técnicas estándar, tales como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en donde el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido teniendo una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos teniendo cadenas laterales similares se han identificado en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un SRP preferiblemente se reemplaza con otro residuo de aminoácido a partir de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria junto con toda o parte de una secuencia codificadora de SRP, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden clasificar para una actividad de SRP descrita en la presente para identificar mutantes que retienen actividad de SRP. Después de la mutagénesis de la secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID N0.5, el polipéptido codificado se puede expresar de forma recombinante y la actividad del polipéptido se puede determinar al analizar la tolerancia a estrés de la planta transgénica o crecimiento bajo condiciones normales o limitadas en agua, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 8. Adicionalmente, se pueden crear ácidos nucleicos de SRP optimizados. Preferiblemente, un ácido nucleico de SRP optimizado codifica un SRP que se une a un grupo fosfato y/o modula el crecimiento de una planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia a un estrés ambiental, y más preferiblemente aumenta el crecimiento de una planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia a un estrés ambiental sobre su sobreexpresión de la planta. Como se usa en la presente, "optimizado" se refiere a un ácido nucleico que se manipula genéticamente para aumentar su expresión en una planta o animal dado. Para proveer ácidos nucleicos optimizados de SRP, la secuencia de ADN del gen se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes vegetales altamente expresados; 2) comprender un contenido de A + T en composición de base de nucleótido a aquel encontrado sustancialmente en plantas; 3) formar una secuencia de iniciación de planta; o 4) eliminar secuencias que causen desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de A N. La expresión aumentada de ácidos nucleicos de SRP en plantas se puede lograr al utilizar la frecuencia de distribución de uso de codón en plantas en general o en una planta particular. Se pueden encontrar métodos para optimizar la expresión de ácido nucleico en plantas en EPA 0359472; EPA 0385962; Solicitud de PCT No. WO 91/16432; patente de E.U.A. No. 5,380,831; patente de E.U.A. No. 5,436,391; Perlack y otros, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:3324-3328; y Murray y otros, 1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498. Un ácido nucleico de SRP se puede optimizar de modo que su frecuencia de distribución de uso de codón desvía, preferiblemente, no más de 25% de aquel de genes vegetales altamente expresados y, más preferiblemente, no más de aproximadamente 10%. Además, se toma consideración al contenido de G + C de porcentaje de la tercera base degenerada (monocotiledones parecen favorecer G + C en esta posición, mientras que los dicotiledones no). También se reconoce que el nucleótido de XCG (en donde X es A, T, C o G) es el codón menos preferido en dicotes, mientras que el codón de XTA se evita tanto en monocotes como dicotes. Los ácidos nucleicos de SRP optimizados de esta invención también tienen de preferencia índices de evasión de doblete de CG y TA aproximándose cercanamente a aquellos de la planta huésped elegida (por ejemplo, P. patens, G. max o 7". aestivum) . Más preferiblemente, estos índices se derivan de aquel del huésped por no más de aproximadamente 10-15%. Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los S Ps descritos antes, otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico aislado que son antisentido a las mismas. Los polinucleótidos antisentido se cree que inhiben la expresión de genes de un polinucieótido objetivo al unir específicamente el polinucieótido objetivo e interferir con la transcripción, empalme, transporte, traducción y/o estabilidad del polinucieótido objetivo. Se describen métodos en la técnica anterior para reconocer el polinucieótido antisentido al ADN cromosómico, a un transcripto de ARN primario, o a un mARN procesado. Preferiblemente, las regiones objetivo incluyen sitios de empalme, codones de iniciación de traducción, codones de terminación de traducción y otras secuencias dentro del marco de lectura abierta. El término "antísentido" para los propósitos de la invención, se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucieótido que es suficientemente complementario a todo o una porción de un gen, transcripto primario o mARN procesado, para así interferir con la expresión del gen endógeno. Polinucleótidos "complementarios" son aquellos que son capaces de apareamiento de base de conformidad con las reglas de complementariedad estándar de Watson-Crick. Específicamente, purinas aparearán base con pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con timina (A:T) en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleótidos pueden hibridarse entre sí incluso si no son completamente complementarios entre sí, siempre y cuando tenga cada uno por lo menos una región que sea sustancialmente complementaria a la otra. El término "ácido nucleico antisentido" incluye ARN de cadena sencilla asi como casetes de expresión de ADN de cadena doble que se pueden transcribir para producir un ARN antisentido. Ácidos nucleicos antisentido "activos" son moléculas de ARN antisentido que son capaces de hibridar selectivamente con un transcripto primario o mARN que codifica un polipéptido teniendo por lo menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEC ID NO:2, SEC ID NO: 4 o SEC ID NO:6. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificadora de SRP entera, o solamente a una porción de la misma. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótido que codifica un SRP. El término "región codificadora" se refiere a la región de la secuencia de nucleótido que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región no codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótido que codifica un SRP. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias de 5' y 3' que flanquean la región codificadora que no se traducen en aminoácidos (es decir, también referidos como regiones no traducidas de 5' y 3'). La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificadora entera de mARN de SRP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido, que es antisentido a solamente una porción de la región codificadora o no codificadora de mARN de SRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de traducción del mARN de SRP. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, aproximadamente 5; 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos en longitud. Típicamente, las moléculas antisentido de la presente invención comprenden un ARN teniendo 60-100% identidad de secuencia con por lo menos 14 nucleótidos consecutivos de SEC ID NO:1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5, o un polinucleótido codificando un polipéptido de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. Preferiblemente, la identidad de secuencia será por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%, y muy preferiblemente 99%. Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención típicamente se administran a una célula o generadas in situ de modo que hibridan con o unen a mARN celular y/o ADN genómico codificando un SRP para así inhibir expresión del polipéptido, por ejemplo, al inhibir transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótido convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la ranura principal de la hélice doble. La molécula antisentido se puede modificar de modo que se une específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, al enlazar la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se une a un receptor o antígeno de superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido también se puede surtir a células usando los vectores descritos en la presente. Para lograr suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vector en donde la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor procariótico fuerte, viral o eucariótico (incluyendo planta). Como una alternativa a polinucleótidos antisentido, ribozimas, polinucleótidos de sentido, o ARN de cadena doble (dsARN) se pueden usar para reducir expresión de un polipéptido de SRP. Como se usa en la presente, el término "ribozima" se refiere a una enzima a base de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que es capaz de cortar un ácido nucleico de cadena sencilla, tal como un mARN, al cual tiene una región complementaria. Las ribozimas (por ejemplo, ribozimas de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334:585-591) se pueden usar para cortar catalíticamente transcriptos de mARN de SRP para así inhibir la traducción de mARN de SRP. Una ribozima teniendo especificidad para un ácido nucleico que codifica SRP se puede diseñar con base en la secuencia de nucleótido de un cADN de SRP, como se describen en la presente (es decir, SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5) o en la base de una secuencia heteróloga a aislarse de acuerdo con métodos enseñados en esta invención. Por ejemplo, un derivado de Tetrahymena L-19 IVS ARN se puede construir en donde la secuencia de nucleotido del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleotido a cortarse en un mARN que codifica SRP (ver, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,987,071 y 5,116,742 a Cech y otros). Alternativamente, se puede usar mARN de SRP para seleccionar un ARN catalítico teniendo una actividad de ribonucleasa específica de un acervo de moléculas de ARN (ver, por ejemplo, Bartel y Szostak, 1993, Science 261: 1411-1418). En modalidades preferidas, la ribozima contendrá una porción que tiene por lo menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleótidos, y más preferiblemente 7 u 8 nucleótidos, que tienen 100% de complementariedad a una porción del ARN objetivo. Aquellos expertos en la técnica conocen métodos para hacer ribozimas (ver, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 6,025,167; 5,773,260 y 5,496,698). El término "dsARN", como se usa en la presente, se refiere a híbridos de ARN que comprenden dos cadenas de ARN. Los dsARNs pueden ser lineales o circulares en estructura. En una modalidad preferida, dsARN es específico para un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6, o un polipéptido que tiene por lo menos 80% identidad de secuencia con un polipéptido de SEC ID NO.2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO.6. Los ARNs que hibridan pueden ser sustancial o completamente complementarios. Por "sustancialmente complementario", se quiere decir que cuando los dos ARNs que hibridan se alinean óptimamente usando el programa BLAST como se describió antes, las porciones que hibridan son al menos 95% complementarias. Preferiblemente, el dsARN será por lo menos 100 pares base en longitud. Típicamente, los ARNs que hibridan serán de longitud idéntica con no más extremos 5' o 3' sobresalientes y sin huecos. Sin embargo, los dsARNs que tienen sobresalientes de 5' y 3' de hasta 100 nucleótidos se pueden usar en los métodos de la invención. El dsARN puede comprender ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, tales como residuos de 2'-0-metilo ribosilo, o combinaciones de los mismos (ver, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,130,641 y 4,024,222). Un ácido poliriboinosínico:poliribocitidílico de dsARN se describe en la patente de E.U.A. No. 4,283,393. Se conocen en la técnica métodos para hacer y usar dsARN. Un método comprende la transcripción simultánea de dos cadenas de ADN complementarias, ya sea in vivo, o en una sola mezcla de reacción in vitro (ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,795,715). En una modalidad, dsARN se puede introducir en una planta o célula vegetal directamente por procedimientos de transformación estándar. Alternativamente, dsARN se puede expresar en una célula vegetal al transcribir dos ARNs complementarios. Otros métodos para la inhibición de expresión de gen endógena, tal como formación de hélice triple (Moser y otros, 1987, Science 238: 645-650 y Cooney y otros, 1988, Science 241: 456-459) y co-supresión (Napoli y otros, 1990, The Plant Cell 2: 279-289) se conocen en la técnica. Se han usado cADNs de longitud parcial y completa para la co-expresión de genes vegetales endógenos (ver, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,801,340, 5,034,323, 5,231,020 y 5,283,184; Van der Kroll y otros, 1990, The Plant Cell 2: 291-299; Smith y otros, 1990, Mol. Gen. Genetics 224: 477-481 y Napoli y otros, 1990, The Plant Cell, 2: 279-289). Para supresión de sentido, se cree que la introducción de un polinucleótido de sentido bloquea la transcripción del gen objetivo correspondiente. El polinucleótido de sentido tendrá por lo menos 65% identidad de secuencia con el gen vegetal objeto o ARN. Preferiblemente, el porcentaje de identidad es por lo menos 80%, 90%, 95% o más. El polinucleótido de sentido introducido no necesita ser de longitud completa relativo al gen objetivo o transcripto. Preferiblemente, el polinucleótido de sentido tendrá por lo menos 65% identidad de secuencia con al menos 100 nucleótidos consecutivos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. Las regiones de identidad pueden comprender intrones y/o exones y regiones no traducidas. El polinucleótido de sentido introducido puede estar presente en la célula vegetal de manera transitoria, o puede integrarse establemente en un cromosoma de planta o replicón extracromosómico. Alternativamente, la expresión de gen de SRP se puede inhibir al reconocer secuencias de nucleotido complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleotido de SRP (por ejemplo, un promotor de SRP y/o potenciador) para formar estructuras helicoidales triples que previenen transcripción de gen de SRP en células objetivo (ver, por lo general, Helene, 1991, Anticancer Drug Res. 6(6): 569-84; Helene y otros, 1992, Ann. N.Y. Acad. Sc¡. 660: 27-36; y Maher, 1992, Bioassays 14(12): 807-15). Además de los ácidos nucleicos de SRP y polipéptidos descritos antes, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y polipéptidos fijados a una porción. Estas porciones incluyen, pero no se limitan a, porciones de detección, porciones de hibridación, porciones de purificación, porciones de surtido, porciones de reacción, porciones de unión, y similares. Un grupo típico de ácidos nucleicos teniendo porciones fijas son sondas y cebadores. Las sondas y cebadores típicamente comprenden olígonucleótido aislado. El olígonucleótido típicamente comprende una región de secuencia de nucleótido que híbrida bajo condiciones estrictas a por lo menos aproximadamente 12, de preferencia aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena de sentido de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5; una secuencia antisentido de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5; o mutantes que ocurren de manera natural de los mismos. Los cebadores basados en una secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5 se pueden usar en reacciones de PCR para clonar homólogos de SRP. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótido de SRP se pueden usar para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican los mismos o polipéptidos sustancialmente idénticos. En modalidades preferidas, la sonda comprende además un grupo de etiqueta fijado a la misma, por ejemplo, el grupo de etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima. Dichas sondas se pueden usar como una parte de un equipo de prueba marcador genómico para identificar células que expresan un SRP, tal como al medir un nivel de un ácido nucleico codificando SRP, en una muestra de células, por ejemplo, detectando niveles de mARN de SRP o determinando si un gen de SRP genómico ha sido mutado u omitido. En particular, un método útil para establecer el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mARN disponible para la traducción del producto genético) es realizar una transferencia Northern (para referencia, ver, por ejemplo, Ausubel y otros, 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley; Nueva York). La información de una transferencia Northern al menos demuestra parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. Se puede preparar ARN celular total de células, tejidos u órganos por varios métodos, todos bien conocidos en la técnica, tal como se describe en Bormann y otros, 1992, Mol. Microbiol. 6: 317-326. Para evaluar la presencia o cantidad relativa de polipéptido traducido en este mARN, se pueden emplear técnicas estándar, tal como una transferencia Western. Estas técnicas son bien conocidas a aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel y otros, 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York). La invención provee además un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de SRP como se describió antes, en donde la expresión del vector en la célula huésped resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales o limitadas en agua y/o tolerancia aumentada a estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un lazo de ADN de cadena doble circular en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en donde se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped al introducir en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a la que se ligan operativamente. Dichos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención debe incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectivo de replicacion, adenovirus y virus adeno-asociados), que sirven funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped a usarse para expresión, que se liga operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresarse. Como se usa en la presente con respecto a un vector de expresión recombinante, "ligado operativamente" debe significar que la secuencia de nucleótido de interés se liga a la(s) secuencia(s) reguladora(s) en una manera que permite expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped en donde el vector se introduce en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" debe incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Methods in Planta Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Ratón, Florida, incluyendo las referencias ahí. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen expresión constitutiva de una secuencia de nucleotido en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen expresión de la secuencia de nucleotido solamente en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de dichos factores tal como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para asi producir polipéptidos o péptidos, incluyendo polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente (por ejemplo, SRPs, formas mutantes de SRPs, polipéptidos de fusión, etc.). Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para expresión de SRPs en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, genes de SRP se pueden expresar en células bacterianas tales como células de insecto de C. glutamicum (usando vectores de expresión de baculovirus), levadura y otras células fúngicas (ver Romanos y otros, 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423-488; van den Hondel y otros, 1991, Heterologous gene expression in filamentous fungí, in: More Gene Manipulations in Fungí, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondelm y Punt, 1991, Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy y otros, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), alga (Falciatore y otros, 1999, Marine Biotechnology 1(3): 239-251), ciliatos de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella y Stylonychia, en especial del genero Stylonichia lemnae con vectores que siguen un método de transformación como se describe en la solicitud de PCT No. WO 98/01572, y células vegetales multicelulares (ver Schmidt y Willmitzer, 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, capítulo 6/7, S.71-119, 1993; F.F. White, B. Jenes y otros, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Bio. 42: 205-225 y referencias citadas ahí), o células de mamífero. Se discuten células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Acadamic Press: San Diego, CA, 1990. Alternativamente, el vector de expression recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras promotoras T7 y polimerasa T7. La expresión de polipéptidos en procariotas a menudo se lleva a cabo con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos de fusión o no fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a un polipéptido codificado ahí, usualmente la terminal amino del polipéptido recombinante pero también a la terminal C o fusionado dentro de regiones adecuadas en los polipéptidos. Dichos vectores de fusión típicamente sirven tres propósitos: 1) aumentar la expresión de un polipéptido recombinante; 2) aumentar la solubilidad de un polipéptido recombinante; y 3) ayudar en la purificación de un polipéptido recombinante al actuar como un ligando en purificación de afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de corte proteolítico en la unión de la porción de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante de la porción de fusión posterior a purificación del polipéptido de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognado, incluyen Factor Xa, trombina y enterokinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech, Inc.; Smith y Johnson, 1988, Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan S-transferasa de glutationa (GST), polipéptido de unión de maltosa E, o polipéptido A, respectivamente, al polipéptido recombinante objetivo. En una modalidad, la secuencia codificadora del SRP se clona en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica un polipéptido de fusión que comprende, de la terminal N a la terminal C, polipéptido de sitio X de corte de GST-trombina. El polipéptido de fusión se puede purificar por cromatografía de afinidad usando resina de glutationa-agarosa. SRP recombinante no fusionado a GST se puede recuperar por corte del polipéptido de fusión con trombina. Ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann y otros, 1988, Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier y otros, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 60-89). La expresión de gen objetivo del vector pTrc recae en la transcripción de polimerasa ARN huésped de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión de gen objetivo del vector pET 11 d recae en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediado por una ARN polimerasa viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago ? residente albergando un gen T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5. Una estrategia para maximizar expresión de polipéptido recombinante es expresar el polipéptido en una bacteria huésped con una capacidad impedida para cortar proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Acadamic Press, San Diego, California, 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico a insertarse en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos utilizados de manera preferencial en la bacteria elegida para expresión, tal como C. glutamicum (Wada y otros, 1992, Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118).

Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención se puede llevar a cabo por técnicas de síntesis de ADN estándar. En otra modalidad, el vector de expresión de SRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSed (Baldari y otros, 1987, EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz y otros, 1987, Gene 54: 113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para usarse en otros hongos, tales como los hongos de filamento, incluyen aquellos detallados en: van den Hondel y Punt, 1991, "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungí, Peberdy, y otros, eds. P. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge. En una modalidad preferida de la presente invención, los SRPs se expresan en plantas y células vegetales tales como células vegetales unicelulares (por ejemplo, alga) (ver Falciatore y otros, 1999, Marine Biotechnology 1(3): 239-251 y referencias ahí) y células vegetales de plantas superiores (por ejemplo, los espermatof itos, tales como plantas de cultivo). Un SRP puede "introducirse" en una célula vegetal por cualquier medio, incluyendo transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partícula, agroinfección, y similares. Un método de transformación conocido a aquellos expertos en la técnica es la sumersión de una planta floreciente en una solución de agrobacteria, en donde la agrobacteria contiene el ácido nucleico de SRP, seguido por crianza de los gametos transformados. Otros métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped incluyendo células vegetales se pueden encontrar en Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Última ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Ya que la tolerancia a estrés biótico y abiótico es un rasgo general que se desea haber sido heredado en una amplia variedad de plantas como maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, colza, cañóla, manihot, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas como papa, tabaco, berenjena, y jitomate, especies Vicia, chícharo, alfalfa, plantas tupidas (café, cacao, té), especies Salix, árboles (palma, coco), pasto perene, y cultivos de forraje, estas plantas de cultivo también son plantas objetivo preferidas para una ingeniería genética como otra modalidad de la presente invención. Los cultivos de forraje incluyen, pero no se limitan a, Wheatgrass, Canarygrass, Bromegrass, WildryeGrass, Bluegrass, Orchardgrass, Alfalfa, Salfoin, Bridsfoot Trefoil, Alsike Clover, Red Clover y Sweet Clover. En una modalidad de la presente invención, la transfección de un SRP en una planta se logra por transferencia de gen mediada por agrobacteria. La transformación de planta mediada por agrobacteria se puede realizar usando, por ejemplo, el GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) o LBA4404 (Clontech) cepa Agrobacterium tumefaciens. La transformación se puede realizar mediante técnicas de transformación y regeneración estándar (Deblaere y otros, 1994, Nucí. Acids Res. 13: 4777-4788; Gelvin, Stanton, Schilperoort y Robert, Plant Molecular Biology Manual, 2a ed., Dordrecht: Kluwer Academic Publ. 1995, en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard, Thompson y John, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Ratón: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, se puede transformar colza vía transformación de cotiledón o hipocotilo (Moloney y otros, 1989, Plant Cell Report 8: 238-242; DeBlock y otros, 1989, Plant Physiol. 91: 694-701). Uso de antibióticos para selección de agrobacteria y planta depende del vector binario y la cepa de agrobacteria usada para la transformación. El uso de antibióticos para selección de agrobacteria y planta depende del vector binario y la cepa de agrobacteria usados para transformación. La selección de colza se realiza normalmente usando kanamicina como marcador de planta que se puede seleccionar. La transferencia de gen mediada por agrobacteria a lino se puede realizar usando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova y otros, 1994, Plant Cell Report 13: 282-285. Adicionalmente, se puede realizar transformación de soya usando, por ejemplo, una técnica descrita en la patente europea No. 0424 047, patente de E.U.A. No. 5,322,783, patente europea No. 0397 687, patente de E.U.A. No. 5,376,543, o patente de E.U.A. No. 5,189,770. La transformación de maíz se puede lograr por bombardeo de partícula, absorción de ADN mediada por polietileno glicol o vía la técnica de fibra de carburo de silicio. (Ver, por ejemplo, Freeling y Walbot "The Maize Handbook" Springer Verlag: Nueva York, 1993, ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación de maíz se puede encontrar en la solicitud de PCT No. WO 93/07256. De conformidad con la presente invención, el SRP introducido se puede mantener en la célula vegetal establemente si se incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o integrado en los cromosomas vegetales. Alternativamente, el SRP introducido puede estar presente en un vector de no replicante extra-cromosómico y se puede expresar de manera transitoria o activo de manera transitoria. En una modalidad, un microorganismo recombinante homólogo se puede crear en donde el SRP se integra en un cromosoma, un vector se prepara que contiene por lo menos una porción de un gen de SRP en donde se ha introducido una omisión, adición o sustitución para así alterar, por ejemplo, interrumpir f uncionalmente, el gen de SRP. Preferiblemente, el gen de SRP es un gen de SRP de P. patens, G. max, T. aestivum o B. napus, pero puede ser un homologo de una planta relacionada o incluso de una fuente de mamífero, levadura o insecto. En una modalidad, el vector se diseña de modo que, en recombinación homologa, el gen de SRP endógeno se interrumpe funcionalmente (es decir, ya no codifica un polipéptido funcional; también referido como un vector de supresión).

Alternativamente, el vector se puede diseñar de modo que, en recombinación homologa, el gen de SRP endógeno se muta o de lo contrario altera pero todavía codifica un polipéptido funcional (por ejemplo, la región reguladora ascendente se puede alterar para así alterar la expresión del SRP endógeno). Para crear una mutación de punto vía recombinación homologa, se pueden usar híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss y otros, 1999, Nucleic Acids Research 27(5): 1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene Therapy American Scientist, 87(3): 240-247). Procedimientos de recombinación homologa en P. patens, G. max, T. aestivum o 8. napus también son bien conocidos en la técnica y se contemplan para usarse en la presente. Mientras que en el vector de recombinación homologa, la porción alterada del gen de SRP se flanquea en sus extremos 5' y 3' por una molécula de ácido nucleico adicional del gen de SRP para permitir que ocurra recombinación homologa entre el gen de SRP exógeno portado por el vector y un gen de SRP endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de SRP que flanquea adicional es de suficiente longitud para recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios cientos de pares base hasta kilobases de ADN de flanqueo (tanto en el extremo 5' como 3') se incluyen en el vector (ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51: 503 para una descripción de vectores de recombinación homologas o Strepp y otros, 1998, PNAS, 95 (8): 4368-4373 para recombinación a base de cADN en P. patens).

El vector se introduce en un microorganismo o célula vegetal (por ejemplo, vía ADN mediado por polietileno glicol), y células en donde el gen de SRP introducido ha recombinado homologamente con el gen de SRP endógeno se seleccionan usando técnicas conocidas en la técnica. En otra modalidad, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen de SRP en un vector colocándolo bajo control del operón lac permite expresión del gen de SRP solamente en presencia de IPTG. Dichos sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica. Ya sea que esta presente en un vector de no replicación extra-cromosómico o un vector que se integra en un cromosoma, el polinucleótido de SRP reside preferiblemente en un cásete de expresión de planta. Un cásete de expresión de planta contiene de preferencia secuencias reguladoras capaces de impulsar expresión de gen en células vegetales que se ligan operativamente de modo que cada secuencia puede cumplir su función, por ejemplo, terminación de transcripción por señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan de t-ADN de Agrobacterium tumefaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintasa del Ti-plásmido pTiACH5 (Gielen y otros, 1984, EMBO J. 3: 835) o equivalentes funcionales del mismo, pero también son adecuados otros terminadores funcionalmente activos en plantas. Como expresión de gen vegetal muy a menudo no está limitado en niveles de transcripción, un cásete de expresión de planta contiene de preferencia otras secuencias ligadas operativamente como potenciadores de traducción tal como la secuencia sobremultiplicadora que contiene la secuencia líder no traducida de 5' de virus de mosaico de tabaco potenciando el polipéptido por relación de ARN (Gallie y otros, 1987, Nucí. Acids Research 15: 8693-8711). Ejemplos de vectores de expresión de planta incluyen aquellos detallados en: Becker, Kemper, Schell y Masterson, 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the Leith border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformaron, Nucí. Acid. Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung y Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. La expresión de gen de planta se debe ligar operativamente a un promotor apropiado confiriendo expresión de gen en una manera específica celular a tiempo o específica de tejido. Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor que sea capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se pueden obtener de plantas, virus de planta, y bacteria que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium. El promotor puede ser constitutivo, inducible, de desarrollo de etapa preferida, preferido de tipo celular, preferido de tejido, o preferido de órgano. Los promotores constitutivos son activos bajo la mayoría de las condiciones. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen los promotores CaMV 19S y 35 S (Odell y otros, 1985, Nature 313: 810-812), el promotor sX CaMV 35S (Kay y otros, 1987, Science 236: 1299-1302), el promotor Sep1, el promotor de actina de arroz (McEIroy y otros, 1990, Plant Cell 2: 163-171), el promotor de Arabidopsis actina, el promotor de ubiquitan (Christensen y otros, 1989, Plant Molec. Biol. 18: 675-689), pEmu (Last y otros, 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), el promotor de virus 35S mosaico de "figwort", el promotor Smas (Veiten y otros, 1984, EMBO J 3: 2723-2730), el promotor GRP1-8, el súper promotor (patente de E.U.A. No. 5,955,646), el promotor de cinamilo alcohol deshidrogenase (patente de E.U.A. No. 5,683,439), promotores del T-ADN de agrobacteria, tal como manopina sintasa, nopalina sintasa y octopina sintasa, la subunidad pequeña del promotor de ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRUBISCO), y similares. Los promotores inducibles son de manera preferencial activos bajo ciertas condiciones ambientales, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque patógeno, condiciones anaeróbicas, y similares. Por ejemplo, el promotor hsp80 de Brassica se induce por choque de calor; el promotor PPDK se induce por luz; el promotor PR-1 de tabaco, Arabidopsis, y maíz son inducibles por infección con un patógeno; y el promotor Adh 1 se induce por hipoxia y estrés por frío. También se puede facilitar la expresión de gen de planta vía un promotor ¡nducible (para una revisión, ver Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Promotores químicamente inducibies son especialmente adecuados si se quiere que ocurra expresión de gen en una manera específica de tiempo. Ejemplos de dichos promotores son un promotor inducible con ácido salicílico (solicitud de PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible con tetraciclina (Gatz y otros, 1992, Plant J. 2: 397-404), y un promotor inducible con etanol (solicitud de PCT No. WO 93/21334). En una modalidad preferida de la presente invención, el promotor inducible es un promotor inducible con estrés. Para los propósitos de la invención, los promotores inducibies de estrés son activos de manera preferencial bajo uno o más de los siguientes estreses: condiciones sub-óptimas asociadas con salinidad, sequía, temperatura, mental, químico, patogénico y oxidante. Los promotores inducibies de estrés incluyen, pero no se limitan a, Cor78 (Chak y otros, 2000, Planta 210: 875-883; Hovath y otros, 1993, Plant Physiol. 103: 1047-1053), Cor15a (Artus y otros, 1996, PNAS 93(23): 13404-09), Rc¡2A (Medina y otros, 2001, Plant Physiol. 125: 1655-66; Nylander y otros, 2001, Plant Mol. Biol. 45: 341-52; Navarre y Goffeau, 2000, EMBO J. 19. 2515-24; Capel y otros, 1997, Plant Physiol. 115: 569-76), Rd22 (Xiong y otros, Plant Cell 13: 2063-83; Abe y otros, 1997, Plant Cell 9: 1859-68; Iwasaki y otros, 1995, Mol. Gen. Genet. 247: 391-8), cDet6 (Lang y Palve, 1992, Plant Mol. Biol. 20: 951-62), ADH1 (Hoeren y otros, 1998, Genetics 149: 479-90), KAT1 (Nakamura y otros, 1995, Plant Physiol. 109: 371-4), KST1 (Müller-Róber y otros, 1995, EMBO 14: 2409-16), Rha1 (Terryn y otros, 1993, Plant Cell 5: 1761-9; Terryn y otros, 1992, FEBS Lett. 299(3). 287-90), ARSK1 (Atkinson y otros, 1997, GenBank Acceso # L22302, y solicitud de PCT No. WO 97/20057), PtxA (Plesch y otros, GenBank Acceso # X67427), SbHRGP3 (Ahn y otros, 1996, Plant Cell 8: 1477-90), GH3 (Liu y otros, 1994, Plant Cell 6: 645-57), el promotor de gen PRP1 inducible con patógeno (Ward y otros, 1993, Plant. Mol. Biol. 22: 361-366), el promotor hsp80 inducible con calor de jitomate (patente de E.U.A. No. 5187267), promotor alfa-amilasa inducible con frío de papa (solicitud de patente No. WO 96/12814), o el promotor pinlll inducible con viento (patente europea No. 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles con sequía, frío y sal, tal como el promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozalei y otros, 1993, Mol. Gen. Genet. 236: 331-340. Los promotores preferidos de etapa en desarrollo se expresan de manera preferencial en ciertas etapas de desarrollo. Los promotores preferidos de tejido y órgano incluyen aquellos que se expresan de manera preferencial en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas o xilema. Ejemplos de promotores preferidos de tejido y preferidos de órgano incluyen, pero no se limitan a, promotores preferidos de fruta, preferidos de óvulo, preferidos de tejido masculino, preferidos de semilla, preferidos de integumento, preferidos de tubérculo, preferidos de tallo, preferidos de pericarpio, preferidos de hoja, preferidos de estigma, preferidos de polen, preferidos de antera, preferidos de un pétalo, preferidos de sépalo, preferidos de pedicelo, preferidos de silique, preferidos de tallo, preferidos de raíz y similares. Los promotores preferidos de semilla se expresan de manera preferencial durante el desarrollo y/o germinación de la semilla. Por ejemplo, los promotores preferidos de semilla pueden ser preferidos de embrión, preferidos de endoesperma y preferidos de cubierta de semilla (ver Thompson y otros, 1989, BioEssays 10:108). Ejemplos de promotores preferidos de semilla incluyen, pero no se limitan a, celulosa sintasa (celA), Cim1, gamma-zeína, globulina-1, maíz 19 kD zeína (cZ19B1), y similares. Otros promotores adecuados preferidos de tejido o preferidos de órgano incluyen el promotor de napín-gen de colza (patente de E.U.A. No. 5,608,152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein y otros, 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3): 459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (solicitud de PCT No. WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente de E.U.A. No. 5,504,200), el promotor Bce-4 de Brassica (solicitud de PCT No. WO 91/13980), o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein y otros, 1992, Plant Journal, 2(2): 233-9), así como promotores que confieren expresión específica de semilla en plantas de monocot como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Promotores adecuados a señalar son el promotor de gen Ipt2 o Ipt1 de cebada (solicitud de PCT No. WO 95/15389 y solicitud de PCT No. WO 95/23230) o aquellos descritos en la solicitud de PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen de cebada hordeína, gen de arroz glutelina, gen de arroz origina, gen de arroz prolamina, gen de trigo gliadina, gen de trigo glutelina, gen de avena glutelina, gen de sorgo kasirina, y gen de centeno secalina). Otros promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor de proteína de unión a/b de clorofila principal, promotores de histona, el promotor Ap3, el promotor de ß-conglicina, el promotor de napín, el promotor de soya lectinas, el promotor de maíz 15kD zeína, el promotor de 22kD zeína, el promotor de 27kD zeína, el promotor de ?-zeína, los promotores de cera encogidos 1, encogidos 2 y bronce, el promotor de Zm13 (patente de E.U.A. No. 5,086,169), los promotores de maíz poligalacturonasa (PG) (patentes de E.U.A. Nos. 5,412,085 y 5,545,546), y el promotor SGB6 (patente de E.U.A. No. 5,470,359), así como promotores sintéticos y otros naturales. Se puede obtener flexibilidad adicional en controlar expresión de gen heterologo al usar dominios de unión de ADN y elementos de respuesta de fuentes heterologas (es decir, dominios de unión de ADN de fuentes de no planta). Un ejemplo de dicho dominio de unión de ADN heterologo es el dominio de unión de ADN LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43: 729-736). La invención provee además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de SRP de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN se liga operativamente a una secuencia reguladora en una manera que permite expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que sea antisentido a un mARN de SRP. Las secuencias reguladoras ligadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido se pueden elegir que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos celulares. Por ejemplo, se pueden elegir promotores virales y/o potenciadores, o secuencias reguladoras que dirigen expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo celular de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagómido o virus atenuado en donde ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región reguladora se puede determinar por el tipo celular en donde el vector se introduce. Para una discusión de la regulación de expresión de gen usando genes antisentido, ver Weintraub, H. y otros, 1986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews -Trends in Genetics, vol. 1(1), y Mol y otros, 1990, FEBS Letters 268: 427-430. Otro aspecto de la invención pertenece a células huésped en donde un vector de expresión recombinante de la invención se ha introducido. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan de manera intercambiable en la presente. Se entiende que dichos términos se refieren no sólo a la célula sujeto particular sino también aplican a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Ya que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsiguientes debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula origen, pero todavía se incluyen dentro del alcance del término como se usa en la presente. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un SRP se puede expresar en células bacterianas tal como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), alga, ciliatos, células vegetales, hongos, u otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células huésped adecuadas son conocidas a aquellos expertos en la técnica. Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo, se puede usar para producir (es decir, expresar) un SRP. Por consiguiente, la invención provee además métodos para producir un SRP usando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en donde un vector de expresión recombinante que codifica un SRP se ha introducido, o en donde genoma se ha introducido un gen que codifica un SRP de tipo silvestre o alterado) en un medio adecuado hasta producir el SRP. En otra modalidad, el método comprende además aislar un SRP del medio o la célula huésped. Otro aspecto de la invención pertenece a un SRP aislado, y porciones biológicamente activas del mismo. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o porción biológicamente activa del mismo está libre de parte del material celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinantes, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un SRP en donde el polipéptido se separa de parte de los componentes celulares de las células en donde se produce de manera natural o recombinante. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un SRP que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de material no de SRP (también referido en la presente como un "polipéptido contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de material de no SRP, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de material de no SRP, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 5% de material de no SRP. Cuando el SRP o porción biológicamente activa del mismo se produce de manera recombinante, también está de preferencia sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y muy preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de polipéptido. El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de SRP en donde el polipéptido se separa de precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis del polipéptido. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de un SRP teniendo menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o químicos de no SRP, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o químicos de no SRP, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o químicos de no SRP, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o químicos de no SRP. En modalidades preferidas, polipéptidos aislados, o porciones biológicamente activas de los mismos, carecen de polipéptidos contaminantes del mismo organismo del cual se deriva el SRP. Típicamente, dichos polipéptidos se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, un SRP de P. patens, G. max o T. aestivum en plantas diferentes de P. patens, G. max o T. aestivum o microorganismos tales como C. glutamicum , ciliatos, alga u hongos. Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, homólogos de polipéptido, polipéptidos de fusión, cebadores, vectores y células huésped descritas en la presente se pueden usar en uno o más de los siguientes métodos: identificación de P. patens, G. max o T. aestivum y organismos relacionados; mapeo de genomas de organismos relacionados a P. patens, G. max o T. aestivum; identificación y localización de secuencias de interés de P. patens, G. max o T. aestivum ; estudios evolutivos; determinación de regiones de SRP requeridos para función; modulación de una actividad de SRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte de transmembrana de uno o más compuestos; modulación de crecimiento bajo condiciones limitadas en agua; modulación de resistencia a estrés; y modulación de expresión de ácidos nucleicos de SRP. El P. patens de musgo se relaciona a otros musgos tal como Ceratodon purpureus que son capaces de crecimiento en ausencia de luz. Los musgos como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de identidad de secuencia en la secuencia de ADN y nivel de polipéptido permitiendo el uso de clasificación heteróloga de moléculas de ADN con sondas que evoluciona de otros musgos u organismos, así permitiendo la derivación de una secuencia de consenso adecuada para clasificación heteróloga o anotación funcional y predicción de funciones de genes en terceras especies. La habilidad de identificar dichas funciones por tanto puede tener relevancia significativa, por ejemplo, predicción de especificidad de sustrato de enzimas. Además, estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como puntos de referencia para el mapeo de genomas de musgo, o de genomas de organismos relacionados. Las moléculas de ácido nucleico de SRP de la invención tienen una variedad de usos. Más importante, el ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de la presente invención se pueden usar para transformar plantas, así aumentando el crecimiento de planta y/o induciendo la tolerancia a estreses tales como sequía, alta salinidad y frío. Por lo tanto, la presente invención provee una planta transgénica transformada por un ácido nucleico de SRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. La planta transgénica puede ser un monocote o un dicote. La invención provee además que la planta transgénica se puede seleccionar de maíz, trigo, centeno, avena, triticalo, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, colza, cañóla, manihot, pimiento, girasol, tapetes, plantas solanáceas, papa, tabaco, berenjena, jitomate, especie Vicia, chícharo, alfalfa, café, cacao, té, especie Salix, palma, coco, pasto perene y cultivo de forraje, por ejemplo. En particular, la presente invención describe usando la expresión de PpAKT-3 de P. patens; GmAKT-2 de G. max y TaAKT-1 de T aestivum para manipular plantas tolerantes a sequía, tolerantes a sal y/o tolerantes a frío, y/o plantas con crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de estrés. Esta estrategia ha sido demostrada en la presente para A. thaliana, pero su aplicación no se restringe a esta planta. Por consiguiente, la invención provee una planta transgénica que contiene un SRP tal como el PpAKT-3 como se define en SEC ID NO:2, GmAKT-2 como se define en SEC ID NO:4 o TaAKT-1 como se define en SEC ID NO:6, en donde la planta ha aumentado crecimiento bajo condiciones normales o de estrés y/o una tolerancia aumentada a un estrés ambiental seleccionado a partir de uno o más del grupo que consiste de sequía, sal aumentada, o temperatura disminuida o aumentada. En modalidades preferidas, el estrés ambiental es sequía o temperatura disminuida. Por consiguiente, la invención provee un método de producir una planta transgénica con un ácido nucleico codificando SRP, en donde la expresión del ácido(s) nucleico en la planta resulta en el crecimiento aumentado de la planta bajo condiciones normales o limitadas en agua y/o tolerancia aumentada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta que comprende: (a) introducir en una célula vegetal un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de SRP, y (b) generar de la célula vegetal una planta transgénica con crecimiento aumentado bajo condiciones normales o limitadas en agua y/o tolerancia aumentada a estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. La célula vegetal incluye, pero no se limitan a, un protoplasto, gameto que produce célula, y una célula que regenera en una planta entera. Como se usa en la presente, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula vegetal, tejido vegetal o parte de planta, que contiene todo o parte de por lo menos un polinucleótido de SRP recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante se integra establemente en un cromosoma o elemento extra-cromosómico estable, de modo que pasa en generaciones siguientes. En modalidades preferidas, el ácido nucleico de SRP codifica el polipéptido de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. La presente invención también provee un método de modular el crecimiento de una planta bajo condiciones normales o de estrés y/o modular la tolerancia de una planta a un estrés ambiental que comprende, modificar la expresión de un ácido nucleico codificando SRP en la planta. El crecimiento de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia al estrés ambiental se puede aumentar o disminuir como se logra al aumentar o disminuir la expresión de un SRP, respectivamente. Preferiblemente, el crecimiento de la planta bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia al estrés ambiental se aumenta al aumentar expresión de un SRP. La expresión de un SRP se puede modificar por cualquier método conocido a aquellos expertos en la técnica. Los métodos de aumentar expresión de SRPs se pueden usar en donde la planta es transgénica o no transgénica. En casos en donde la planta es transgénica, la planta se puede transformar con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican SRP descritos antes, o la planta se puede transformar con un promotor que dirige expresión de un SRP nativo en la planta, por ejemplo. La invención provee que dicho promotor puede ser preferido de tejido, regulado de manera en desarrollo, inducible por estrés, o una combinación de los mismos. Alternativamente, las plantas no transgénicas pueden tener expresión de SRP nativa modificada al inducir un promotor nativo. La expresión de PpAKT-3 como se define en SEC ID NO:1, GmAKT-2 como se define en SEC ID NO:3 o TaAKT- 1 como se define en SEC ID NO:5 en plantas objetivo se puede lograr, pero no se limita a, por uno de los siguientes ejemplos: (a) promotor consecutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor inducido por químico, y (d) sobreexpresión promotora manipulada con, por ejemplo, factores de transcripción de dedo de zinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657). En una modalidad preferida, la transcripción del SRP se modula usando factores de transcripción derivados de dedo de zinc (ZFPs) como se describe en Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657 y fabricados por Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFPs comprenden tanto un dominio de reconocimiento de ADN como un dominio funcional que causa activación o represión de un ácido nucleico objetivo tal como un ácido nucleico de SRP. Por lo tanto, ZFPs activadores y represores se pueden crear que reconocen específicamente los promotores de SRP descritos antes y usados para aumentar o disminuir expresión de SRP en una planta, así modulando el crecimiento y/o tolerancia a estrés de la planta. La presente invención también incluye identificación de los homólogos de PpAKT-3 como se define en SEC ID NO:1, GmAKT-2 como se define en SEC ID NO:3 o TaAKT-1 como se define en SEC ID NO:5 en una planta objetivo, así como el promotor del homólogo. La invención también provee un método de aumentar expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a un SRP, que comprende: (a) transformar la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificando SRP, y (b) expresar el SRP dentro de la célula huésped, así aumentando la expresión del gen transcrito en respuesta al SRP, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. Además de introducir la secuencia de ácido nucleico de SRP en plantas transgénicas, esta secuencia también se puede usar para identificar un organismo como siendo P. patens, G. max o T. aestivum, o un pariente cercano del mismo. También, se pueden usar para identificar la presencia de P. patens, G. max o T. aestivum, o un pariente del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención provee la secuencia de ácido nucleico de P. patens, G. max o T. aestivum; al sondar el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mixta de microorganismos bajo condiciones estrictas con una sonda girando una región de gen de P. patens, G. max o T. aestivum que es único a este organismo, uno puede asegurar si este organismo está presente. Además, el ácido nucleico y moléculas de polipéptido de la invención pueden servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no solamente en el mapeo del genoma, sino también en estudios funcionales de polipéptidos de P. patens, G. max o T. aestivum. Por ejemplo, para identificar la región del genoma al que se une un polipéptido de unión a ADN de P. patens particular, el genoma de P. patens se puede digerir, y los fragmentos incubar con el polipéptido de unión a ADN. Aquellos fragmentos que unen el polipéptido se pueden sondear adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con marcas prontamente detectables. La unión de dicha molécula de ácido nucleico al fragmento de genoma permite la localización del fragmento al mapa de genoma de P. patens, y, cuando se realizan múltiples líneas con diferentes enzimas, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico al que se une el polipéptido. Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente idénticas a las secuencias de especies relacionadas de modo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos relacionados. Las moléculas de ácido nucleico de SRP de la invención también son útiles para estudios estructurales evolutivos y de polipéptido. Los procesos metabólicos y de transporte en donde las moléculas de la invención participan se utilizan por una amplia variedad de células procarióticas e eucarióticas; al comparar las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención a aquellas que codifican enzimas similares de otros organismos, se puede evaluar la conexión evolutiva de los organismos. De manera similar, dicha comparación permite una evaluación de la cual regiones del polipéptido que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es de valor para estudios de ingeniería de polipéptido y puede dar una indicación de lo que el polipéptido puede tolerar en términos de mutagénesis sin perder función. La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de SRP de la invención puede resultar en la producción de SRPs teniendo diferencias funcionales de los SRPs de tipo silvestre. Estos polipéptidos pueden mejorar en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayores números en la célula de lo usual, o pueden disminuir en eficiencia o actividad. El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum , hongos, alga, o ciliatos en tolerancia a estrés se puede evaluar al crecer el microorganismo modificado o planta bajo condiciones menos que adecuadas y después analizando las características de crecimiento y/o metabolismo de la planta. Dichas técnicas de análisis son bien conocidas a un experto en la técnica, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de polipéptido, síntesis de carbohidrato, síntesis de lípido, velocidades de evapotranspiración, producción de planta y/o cultivo general, floración, reproducción, sembrado de semilla, crecimiento de raíz, velocidades de respiración, velocidades de fotosíntesis, etc. (Applications of HPLC ¡n Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm y otros, 1993, Biotechnology, vol. 3, capítulo III: Product recovery and purification, página 469-714, VCH: Weinheim; Belter y otros, 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley & Sons; Kennedy y Cabral, 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley & Sons; Shaeiwitz y Henry, 1988, Biochemical separations, in: Ulmann's Encylopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, capítulo 11, página 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications). Por ejemplo, vectores de expression de levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o fragmentos de los mismos, se pueden construir y transformar en Saccharomyces cerevisiae usando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes entonces se pueden evaluar para fallar o alterar su tolerancia a estrés por sequía, sal y temperatura. De manera similar, vectores de expresión de planta que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o fragmentos de los mismos, se pueden construir y transformar en una célula vegetal apropiada tal como Arabidopsis, soya, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., usando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes y/o plantas derivadas de ahí entonces se pueden evaluar para fallo o alteración de su tolerancia a estrés por sequía, sal y temperatura. La ingeniería de uno o más genes de SRP de la invención también pueden resultar en SRPs teniendo actividades alteradas que indirectamente impactan la respuesta a estrés y/o tolerancia a estrés de alga, plantas, ciliatos u hongos, u otros microorganismos como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales de metabolismo resultan en la producción de una variedad de productos (por ejemplo, peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno reactivo), que pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos. Por ejemplo, peroxinitrilo es conocido por nitrar cadenas laterales de tirosina, así inactivando algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226-235). Aunque estos productos son excretados típicamente, las células se pueden alterar genéticamente para transportar más productos de lo que es típico para una célula de tipo silvestre. Al optimizar la actividad de uno o más SRPs de la invención que están involucrados en la exportación de moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia a estrés de la célula. Adicionalmente, las secuencias descritas en la presente, o fragmentos de las mismas, se pueden usar para generar mutaciones eliminadas en los genomas de varios organismos, tales como bacteria, células de mamífero, células de levadura y células vegetales (Girke, 1998, The Plant Journal 15: 39-48). Las células eliminadas resultantes entonces pueden ser evaluadas por su habilidad o capacidad de tolerar varias condiciones de estrés, su respuesta a varias condiciones de estrés, y el efecto en el fenotipo y/o genotipo de la mutación. Para otros métodos de inactivación de gen, ver patente de E.U.A. No. 6,004,804 "Non-Chimeric Mutatíonal vectors" y Puttaraju y otros, 1999, Spliceosome-mediated ARN trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17: 246-252. Las estrategias de mutagénesis antes mencionadas para SRPs resultando en crecimiento aumentado bajo condiciones normales o de estrés y/o resistencia a estrés aumentada no deben ser limitantes; variaciones en estas estrategias serán prontamente evidentes a un experto en la técnica. Usando dichas estrategias, e incorporando los mecanismos descritos en la presente, las moléculas de ácido nucleico y polipéptido de la invención pueden utilizarse para generar algas, ciliatos, plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum expresando ácido nucleico de SRP mutado y moléculas de polipéptido de modo que el crecimiento bajo condiciones normales o de estrés y/o resistencia a estrés aumentada no deben ser limitantes; variaciones sobre estas estrategias serán prontamente evidentes a un experto en la técnica. Usando dichas estrategias, e incorporando los mecanismos descritos en la presente, las moléculas de ácido nucleico y polipéptido de la invención se pueden utilizar para generar algas, ciliatos, plantas, hongos u otros microorganismos como moléculas de ácido nucleico y polipéptido de SRP mutadas expresando C. glutamicum de modo que mejora el crecimiento bajo condiciones bajo condiciones normales o de estrés y/o tolerancia a estrés. La presente invención provee también anticuerpos que unen específicamente a un SRP, o una porción del mismo, según se codificó por un ácido nucleico descrito en la presente. Se pueden hacer anticuerpos por muchos métodos bien conocidos (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988). En breve, se puede inyectar antígeno purificado en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmune. Se pueden purificar directamente anticuerpos, o se pueden obtener células de bazo del animal. Las células entonces se pueden fusionar con una línea celular inmortal y clasificar ara secreción de anticuerpo. Los anticuerpos se pueden usar para clasificar bibliotecas de clon de ácido nucleico para células secretando el antígeno. Aquellos clones positivos entonces se pueden secuenciar (ver, por ejemplo, Kelly y otros, 1992, Bio/Technology 10: 163-167; Bebbington y otros, 1992, Bio/Technology 10: 169-175). Las frases "une selecti amente" y "une específicamente" con el polipéptido se refieren a una reacción de unión que es determinante de la presencia del polipéptido en una población heterogénea de polipéptidos y otros biológicos. De esta manera, bajo condiciones de ¡nmunoprueba diseñada, los anticuerpos especificados unidos a un polipéptido particular no se unen en una cantidad significativa a otros polipéptidos presentes en la muestra. La unión selectiva de un anticuerpo bajo dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona para su especificidad para un polipéptido particular. Una variedad de formatos de imunoprueba se puede usar para seleccionar anticuerpos que selectivamente se unen con un polipéptido particular. Por ejemplo, ¡nmunopruebas ELISA de fase sólida se usan de rutina para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunoreactivos con un polipéptido. Ver Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988, para una descripción de formatos de ¡nmunoprueba y condiciones que se podrían usar para determinar unión selectiva. En algunos casos, se desea preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes. Una descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales se pueden encontrar en Stites y otros, eds., "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., cuarta edición) y referencias citadas ahí, y en Harlow y Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988. A lo largo de esta solicitud, se ha hecho referencia a varias publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y aquellas referencias citadas dentro de aquellas publicaciones en sus totalidades se incorporan a la presente por referencia en esta solicitud a fin de describir más completamente el estado de la técnica al que esta invención pertenece. También se debe entender que lo anterior se refiere a modalidades preferidas de la presente invención y que se pueden hacer numerosos cambios ahí sin alejarse del alcance de la invención. La invención además se ilustra por los siguientes ejemplos, que no se deben considerar en ninguna manera como limitaciones sobre el alcance de la misma. Por el contrario, se debe entender claramente que el recurso se pudo haber tenido a varias otras modalidades, modificaciones y equivalentes de las mismas, que, después de leer la descripción en la presente, pueden sugerir a aquellos expertos en la técnica sin alejarse del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens Para este estudio, se usaron plantas de la especie P. patens (Hedw.) B.S.G. de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburg. Se originan de la cepa 16/14 recolectada por H.L.K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que se subcultivó de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446). La proliferación de las plantas se llevó a cabo por medio de esporas y por medio de regeneración de los gametofitos. El protonema desarrollado de la espora haploide como un cloronema rico en cloroplasto y caulonema bajo en cloroplasto, en donde brotes formados después de aproximadamente 12 días. Crecieron para dar gametoforas portando anteridia y arquegonia. Después de la fertilización, el esporofito diploide con un hongo corto y la cápsula de espora resultante, en donde las meyosporas maduraron. Se llevó a cabo el cultivo en una cámara climática a una temperatura de aire de 25°C e intensidad de luz de 55 micromoles-1m-2 (luz blanca; Philips TL 65W/25 tubo fluorescente) y un cambio claro/obscuro de 16/8 horas. El musgo se modificó en cultivo líquido usando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165: 354-358) o cultivado en medio sólido de Knop usando 1% agar oxoide (Unipath, Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas usados para aislamiento de ARN y ADN se cultivaron en cultivos líquidos al aireados. Los protonemas se desmenuzan cada 9 días y se transfieren a medio de cultivo fresco.

EJEMPLO 2 Aislamiento de ADN total de plantas Los detalles para el aislamiento de ADN total se refieren al desarrollo de un peso de gramo fresco de material de planta. Los materiales usados incluyen los siguientes reguladores: regulador CTAB: 2% (p/v) bromuro N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB); 100 mM Tris HCI pH 8.0; 1.4 M NaCI; 20 mM EDTA; regulador de N-Laurilsarcosina: 10% (p/v) N-laurilsarcosina; 100 mM Tris HCI pH 8.0; 20 mM EDTA. Se trituró el material de planta bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a recipientes 2 mi Eppendorf. El material de planta congelado entonces fue recuperado con una capa de 1 mi de regulador de descomposición (1 mi regulador de CTAB, 100 µ? de regulador de N-laurilsarcosina, 20 µ? de ß-mercaptoetanol, y 10 µ? de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) e incubado a 60°C durante una hora con agitación continua. El homogeneizado obtenido se distribuyó en dos recipientes de Eppendorf (2 mi) y extraído dos veces por agitación con el mismo volumen de cloroformo/alcohol de isoamilo (24:1). Para separación de fase, se llevó a cabo centrifugación a 8000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El ADN entonces se precipitó a -70°C durante 30 minutos usando isopropanol helado. El ADN precipitado se sedimentó a 4°C y 10,000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 µ? de regulador de TE (Sambrook y otros 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación adicional, el ADN fue tratado con NaCI (1.2 M concentración final) y precipitado una vez más a -70°C durante 30 minutos usando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con 70% de etanol, el ADN se secó y posteriormente fue absorbido en 50 µ? de H20 + ARNsa (50 mg/ml concentración final). El ADN se disolvió durante la noche 1 4°C y la digestión de ARNsa se llevó a cabo posteriormente a 37°C durante 1 hora. El almacenamiento del ADN ocurrió a 4°C.

EJEMPLO 3 Aislamiento del ARN total y poli-(A)+ ARN y construcción de biblioteca de cADN de Physcomitrella patens Para la investigación de transcriptos, tanto ARN como po I i- ( A) + ARN total se aislaron. El ARN total se obtuvo de protonemata de 9 días de tipo silvestre siguiendo el método de GTC (Reski y otros 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-529). El poli(A)+ ARN se aisló usando Dyna BeadsR (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. Después de la determinación de la concentración del ARN o del poli(A)+ ARN, el ARN se precipitó por adición de 1/10 volúmenes de 3M acetato de sodio pH 4.6 y 2 volúmenes de etanol y se almacenó a -70°C. Para construcción de biblioteca de cADN, se logró primera síntesis de cadena usando transcriptasa de reversa de virus de leucemia murina (Roche, Mannheim, Alemania) y olig-d(T)-cebadores, segunda síntesis de cadena por incubación con ADN polimerasa I, enzima de Klenow y digestión de ARNsaH a 12°C (2 horas), 16°C (1 hora) y 22°C (1 hora). La reacción se detuvo por incubación a 65°C (10 minutos) y posteriormente se transfirió a hielo. Se desafilaron moléculas de ARN de cadena doble por T4-ADN-polimerasa (Roche, Mannheim) a 37°C (30 minutos). Se eliminaron nucleótidos por extracción de fenol/cloroformo y columnas giratorias Sephadex G50. Se ligaron adaptadores Ncori (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos de cADN por T4-ADN-ligadas (Roche, 12°C, durante la noche) y fosforilaron por incubación con polinucleótido kinasa (Roche, 37°C, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación sobre un gel de agarosa de baja fundición. Las moléculas de ADN más grandes de 300 pares base fueron eludidas del gel, extraídas con fenol, concentradas en columnas Elutip-D (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania), y ligadas a brazos de vector y empacadas en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP- Express usando el equipo Gigapack Gold (Stratagene, Amsterdam, Holanda) usando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 4 Secuenciación y anotación de función de ESTs de Physcomitrella patens Bibliotecas de cADN como se describió en el ejemplo 3 se usaron para secuenciación de ADN de conformidad con métodos estándar, y en particular, por el método de terminación de cadena usando el equipo ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). Se llevó a cabo secuenciación aleatoria posterior a recuperación de plásmido preparativa de bibliotecas de cADN vía escisión de masa in vivo, retransformación, y chapado posterior de DH10B en placas de agar (material y detalles de protocolo de Stratagene, Amsterdam, Holanda). Se preparó ADN de plásmido de cultivos de E. coli crecidos durante la noche en medio Luria-Broth conteniendo ampicilina (ver Sambrook y otros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de ADN Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se usaron cebadores de secuenciación con las siguientes secuencias de nucleótido: 5'-CAGGAAAC AGCTATGACC-3' SEC ID N0:7 5'-CTAAAGGG AACAAAAGCTG-3' SEC ID N0:8 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' SEC ID N0:9 Se procesaron y anotaron secuencias usando el paquete de software EST-MAX comercialmente disponible por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos de bioinformática importantes para caracterización funcional y estructural de secuencias de proteína. Para referencia, ver el sitio web en pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA (búsquedas de base de datos de secuencias muy sensibles con estimados de importancia estadística; Pearson, 1990, Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA, Methods Enzymol. 183: 63-98); BLAST (búsquedas de base de datos de secuencias muy sensibles con estimados de importancia significativa; Altschul y otros, Basic local aiignment search tool, Journal of Molecular Biology 215: 403-10); PREDATOR (predicción de estructura secundaria de alta precisión de secuencias individuales y múltiples; Frishman y Argos, 1997, 75% de precisión en predicción de estructura secundaria de proteína. Proteins 27: 329-335); CLUSTALW (alineación de secuencia múltiple; Thompson y otros, 1994, CLUSTAL W (mejorar la sensibilidad de alineación de secuencia múltiple progresiva a través de peso de secuencia, penalidades de hueco especificas de posiciones y elección de matriz de peso), Nucleic Acids Research 22: 4673-4680); TMAP (Predicción de región de transmembrana de secuencias multiplicadas alineadas; Persson y Argos, 1994, Predicción de segmentos de transmembrana en proteínas utilizando alineaciones de secuencia múltiple, J. Mol. Biol. 237: 182-192); ALOM2 (predicción de región de transmembrana de secuencias sencillas; Klein y otros, predicción de función de proteína de propiedades de secuencia: un análisis discriminado de una base de datos. Biochim. Biophys. Acta 787: 221-226 (1984). Versión 2 por Dr. K. Nakai); PROSEARCH (detección de parejas de secuencia de proteína PROSITE; Kalakowski y otros, 1992, ProSearch: búsqueda rápida de secuencias de proteína con patrones de expresión regulares relacionados con estructura y función de proteína. Biotechniques 13, 919-921); BLIMPS (búsquedas de similitud contra una base de datos de bloques sin huecos, Wallace y Henikoff, 1992); PATMAT (una búsqueda y programa de extracción para secuencia, patrón y búsquedas de bloque y bases de datos, CABIOS 8: 249-254. Escrito por Bill Alford).

EJEMPLO 5 Identificación de ORFs de Physcomitrella patens correspondiente a Pp T-3 Se identificaron cADNs (ESTs) parciales de P. patens en el programa de secuenciación EST de P. patens usando el programa EST-MAX a través de análisis BLAST. La secuencia de ADN de nucleótido de longitud completa de PpAKT-3 se define como SEC ID NO:1. El ORF de PpAKT-3 (EST472) codifica el polipéptido de 825 aminoácidos mostrado en SEC ID NO:2, incluyendo el dominio transportador de potasio de la posición 78 de aminoácidos a la posición 772 de aminoácidos de SEC ID NO:2. La identidad y similitud de la secuencia de aminoácidos de PpAKT-3 a secuencias de proteína conocidas se muestran en la tabla 1.

TABLA 1 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpAKT-3 y otras proteínas homologas # acceso de Nombre de Especie Identidad de Similitud de base de proteína secuencia secuencia datos pública (%) (%) Q8VXB2 transportador de Oryza Sativa 51.8 66.9 potasio putativo Q8VXB1 transportador de Oryza Sativa 50.5 67.1 potasio putativo Q653B6 transportador de Oryza Sativa 51.9 67.2 potasio putativo g86436 proteína Arabidopsis 51.0 66.5 transportadora thaliana EJEMPLO 6 Clonación del PpAKT-3 codificando cADN de P. patens de longitud completa Para aislar el PpAKT-3 que codifica clon (SEC ID NO:1) de P. patens, se crearon bibliotecas de cADN con equipo SMART RACE cDNA Amplificaron (Clontech Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se usó ARN aislado total como se describió en el ejemplo 3 como el molde. Los cultivos fueron tratados antes del aislamiento de ARN de la siguiente manera: Estrés de sal: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio suplementado con 1-M NaCI; Estrés de frío: 4°C por los mismos puntos de tiempo como para la sal; Estrés de sequía: los cultivos se incubaron en papel de filtro seco por los mismos puntos de tiempo como para la sal.

Protocolo 5'RACE Las secuencias EST identificadas de la búsqueda de la base de datos como se describió en el ejemplo 4 se usaron para diseñar oligos para RACE (ver tabla 2). Las secuencias extendidas para estos genes se obtuvieron al realizar amplificación rápida de reacción en cadena de poiimerasa de extremos de cADN (RACE PCR) usando el equipo Advantage 2 PCR (Clontech Laboratories) y el equipo SMART RACE cDNA amplificación (Clontech Laboratories) usando un Biometra T3 Thermocycler siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias obtenidas de las reacciones de RACE correspondieron a la región codificadora de longitud completa y se usaron para diseñar oligos para clonación de longitud completa del gen respectivo (ver a continuación amplificación de longitud completa).

Amplificación de longitud completa Se obtuvieron clones de longitud completa correspondientes a PpAKT-3 (SEC ID NO:1) al realizar reacción en cadena de poiimerasa (PCR) con cebadores específicos de gen (ver tabla 2) y el EST original como molde. Las condiciones para la reacción fueron condiciones estándar con PWO ADN poiimerasa (Roche). Se realizó PCR de acuerdo con condiciones estándar y de acuerdo con los protocolos del fabricante (Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Biometra T3 Thermocycler). Los parámetros para la reacción fueron: cinco minutos a 94°C seguido por cinco ciclos de un minuto a 94°C, un minuto a 50°C y 1.5 minutos a 72°C. Esto fue seguido por veinticinco ciclos de un minuto a 94°C, un minuto a 65°C y 1.5 minutos a 72°C. Los fragmentos amplificados fueron extraídos de gel de agarosa con un equipo QIAquick Gel Extraction (Qiagen) y ligados en TOPO pC 2.1 vector (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes fueron transformados en células Top10 (Invitrogen) usando condiciones estándar (Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las células transformadas fueron seleccionadas para un LB agar que contiene 100 g/ml de carbenicilina, 0.8 mg X-gal (5-brom ?-4-cloro-3-¡ndolil- -D-galatcosida), y 0.8 mg de IPTG (isopropiltio- -D-galactosida) crecido durante la noche a 37°C. Se seleccionaron colonias blancas y se usaron para inocular 3 mi de LB líquido conteniendo 100 pg/ml de ampicilina y crecieron durante la noche a 37°C. Se extrajo ADN plásmido usando el equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Análisis de clones posteriores y mapeo de restricción se realizaron de acuerdo con las técnicas de biología molecular estándar (Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

TABLA 2 Esquema y cebadores usados para la clonación de los clones de longitud completa EJEMPLO 7 Identificación de homólogos de PpAKT-3 Cosecha de tejido, aislamiento de ARN y construcción de biblioteca de cADN Se hicieron crecer plantas de soya, trigo y cañóla bajo una variedad de condiciones y tratamientos y se cosecharon diferentes tejidos en varias etapas de desarrollo. El crecimiento y cosecha de plantas se hicieron en una manera estratégica de modo que se maximizó la probabilidad de cosechar todos los genes de expresión en por lo menos una o más de las bibliotecas resultantes. El mARN se aisló como se describió en el ejemplo 3 de cada una de las muestras recolectadas, y se construyeron bibliotecas de cADN. Ningún paso de amplificación se usó en el proceso de producción de biblioteca a fin de minimizar la redundancia de genes dentro de la muestra y retener información de expresión. Todas las bibliotecas fueron 3' generadas de mARN purificado en columnas oligo dT. Se escogieron de forma aleatoria colonias de la transformación de la biblioteca de cADN de E. coli y se colocaron en placas de microtítulo.

Hibridación de sonda Se aisló ADN plásmido de colonias de E. coli y después se mancharon en membranas. Una batería de 288 oligonucleótidos 7-mer radiomarcados 33P se hibridaron en secuencia a aquellas membranas. Para aumentar producción, se procesaron membranas duplicadas. Después de cada hibridación, se capturó una imagen de transferencia durante una ecografía de fosforimagen para generar un perfil de hibridación para cada oligonucleótido. Esta imagen de fecha cruda se transfirió automáticamente vía LIMS a una computadora. Se mantuvo identidad absoluta al pasar por código de barras el cásete de imagen, filtro y orientación dentro del cásete. Los filtros después fueron tratados usando condiciones relativamente suaves para arrancar las sondas unidas y regresarlas a las cámaras de hibridación por otra ronda de hibridación. La hibridación y cíelo de imagen se repitió hasta completar la serie de 288 oligómeros. Después de completar las hibridaciones, se generó un perfil para cada mancha (representando un inserto de cADN), en cuanto a cual de los 288 oligonucleótidos 7-mer radiomarcados 33P se unieron a esa mancha particular (inserto de cADN), y a qué grado. Este perfil se define como la firma generada de ese clon. Cada firma de clon se comparó con todas las otras firmas generadas del mismo organismo para identificar grupos de firmas relacionadas. Este proceso "clasifica" todos los clones de un organismo en grupos antes de secuenciar.

Aislamiento de gen Los clones se clasificaron en varios grupos con base en sus firmas de hibridación idénticas o similares. Un grupo debe ser indicativo de la expresión de un gen individual o familia de genes. Un sub-producto de este análisis es un perfil de expresión para la abundancia de cada gen en una biblioteca particular. La secuenciación de un camino del extremo 5' se usó para predecir la función de los clones particulares por similitud y búsquedas de motivo en bases de datos de secuencias. La secuencia de ADN de longitud completa del PpAKT-3 de P. patens (SEC ID NO:1) se explotó contra bases de datos propietarias de soya, trigo y cañóla de valor E de E-10 (Altschul, Stephen y otros, Gapped BLAST and PSI_BLAST: a new generation of proteína datábase search program, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se analizaron todos los golpes de clonación para las secuencias de longitud completa putativas, y los clones más largos representando los clones solapados de longitud completa putativos se secuenciaron por completo. Se identificaron una secuencia de soya y una secuencia de trigo. Estas son GmAKT-2 y TaAKT-1. La homología de las secuencias de aminoácidos de GmAKT-2 y TaAKT-1 a la secuencia de técnica anterior conocida más cercana se indica en las tablas 3 y 4.

TABLA 3 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de GmAKT-2 y una proteína similar TABLA 4 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de TaAKT-1 y una proteína similar TABLA 5 de identidad de aminoácidos de proteínas de PpAKT-3, -2 y TaAKT-1 El ORF de GmAKT-2 (GM59666231 ) codifica el polipéptido de 821 aminoácidos mostrado en SEC ID NO:4, incluyendo el dominio transportador de potasio de la posición 43 de aminoácidos a la posición 768 de aminoácidos. El ORF de TaAKT-1 (TA59824966) codifica el polipéptido de 785 aminoácidos mostrado en SEC ID NO:6, incluyendo el dominio transportador de potasio de la posición 82 de aminoácidos a la posición 732 de aminoácidos.

EJEMPLO 8 Clonación de los genes de AKT en un vector binario Los fragmentos que contienen los genes de AKT de P. patens (por ejemplo, PpAKT-3) se subclonaron de los vectores PCR2.1 TOPO recombinantes por digestión doble con enzimas de restricción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento posterior se cortó de gel de agarosa con un equipo QIAquick Gel Extraction Gel (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y ligado en un vector binario que contiene un gen marcador que se puede seleccionar. El vector recombinante resultante contuvo el gen de AKT correspondiente en la orientación de sentido bajo el súper promotor constitutivo.

Transformación de agrobacteria Los vectores recombinantes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

Transformación de planta Se hicieron crecer y transformar plantas de A. thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar (Bechtold, 1993, Acad. Sci. Paris. 316: 1194-1199; Bent y otros, 1994, Science 265: 1856-1860).

Clasificación de plantas transformadas Se clasificaron plantas T1 para resistencia al agente de selección conferido por el gen marcador que se puede seleccionar, y se recolectaron semillas T1. Las semillas T1 se esterilizaron de acuerdo con protocolos estándar (Xiong y otros, 1999, Plant Molecular Biology Repórter 17: 159-170). Se chaparon semillas en medio 1/2 Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich) pH 5.7 con KOH, 0.6% agar y suplementado con 1% de sacarosa, 0.5 g/L 2-[N-Morfoiino] ácido etanosulfonico (MES) (Sigma-Aldrich), 50-150 pg/ml agente de selección, 500 pg/ml carbenicilan (Sigma-Aldrich) y 2 g/ml benomilo (Sigma-Aldrich). Se vernalizaron semillas en placas durante cuatro días a 4°C. Las semillas fueron germinadas en una cámara climática a una temperatura de aire de 22°C e intensidad de luz de 40 micromoles"1 m"2 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo de longitud de día de 16 horas de luz y 8 horas oscuro. Se seleccionaron semillas transformadas después de 14 días y se transfirieron a medio 1/2 MS pH 5.7 con KOH 0.6% placas de agar suplementadas con 0.6% agar, 1% sacarosa, 0.5 g/L MES (Sigma-Aldrich), y 2 pg/ml benomilo (Sigma-Aldrich) y se dejó recuperar durante cinco a siete días.

Clasificación de crecimiento bajo condiciones limitadas en agua El gen de PpAKT-3 se sobreexpresó en A. thaliana bajo el control de un promotor constitutivo. Se clasificaron T2 y/o T3 para resistencia al agente de selección conferido por el gen marcador que se puede seleccionar en placas, y plantas positivas se transpiantaron en tierra y crecieron en una cámara de crecimiento durante 3 semanas. Se mantuvo la humedad de la tierra a lo largo de este tiempo a aproximadamente 50% de la capacidad de tierra de mantener agua al máximo. Se midió la pérdida de agua total (transpiración) por la planta durante este tiempo. Después de 3 semanas, se recolectó el material de planta sobre tierra entero, se secó a 65°C durante 2 días y se pesó. Los resultados se muestran en las tablas 6 y 7. La relación de peso seco de planta sobre tierra (DW) a uso de agua de planta es Eficiencia de Uso de Agua (WUE). Las tablas 6 y 7 presentan WUE y DW, respectivamente, para hechos de transformación independiente (líneas). Se presentan promedios cuadrados mínimos, errores estándar, y valor significativo (p) de una línea comparada a controles de tipo silvestre de un Análisis de Variancia. La mejora en porcentaje de plantas de control de tipo silvestre para WUE (tabla 6) y DW (tabla 7) para PpAKT-3 (EST 472) sobreexpresando plantas también se presentan.

TABLA 6 TABLA 7 Clasificación de tolerancia a sequía Se transfirieron semillas T1 a papel de filtro estéril, seco en un plato petri y se dejaron disecar durante dos horas a 80% RH (humedad relativa) en un gabinete Percieval Growth Cabinet MLR-350H, m ¡cromóles"1 m2 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25). La RH después disminuyó a 60% y las semillas se disecaron a través de ocho horas. Entonces se eliminaron semillas y se colocaron en placas de agar de 1/2 MS 0.6% suplementadas con 2 g/ml de benomilo (Sigma-Aldrich) y 0.5 g/L MES (Sigma-Aldrich) y se calificaron después de cinco días.

EJEMPLO 9 Detección del transgen de AKT en las líneas de Arabidopsis transgénicas Prueba de número de copia Taqman Se aisló ADN genómico para pruebas de número de copia TaqMan de muestras de hoja en placas de 96 pozos bien profundos conteniendo una bola de cromo-acero, las placas se colocaron en un congelador a -80°C durante más de 30 minutos y/o liofilizaron durante la noche. Los tejidos congelados contenidos en placas bien profundas fueron molidos. Se extrajo ADN genómico usando el equipo de extracción Magnesil® Genomic DNA Extraction kit (Promega, Madison, Wl) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se diseñaron cebadores de PCR y sondas usando el software Primer Express® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se diseñaron cebadores y sondas para gen de control endógeno así como una región específica del transgen presente en la construcción. Se marcaron sondas en su extremo 5' con otro fluoroforo reportero para el control endógeno y otro fluoroforo reportero para los transgenes, y ambos fueron marcados en el extremo 3' con un saciador. Se llevaron a cabo reacciones en cadena de polimerasa como se describe por Ingham y otros (BioTechniques 31: 132-140, 2001) e Ingham (Methods ¡n Molecular Biology 286: 273-289, 2004).

EJEMPLO 10 Detección del mARN de transgen de AKT en líneas de Arabidopsis transgénicas Prueba qRT-PCR Se aisló ARN total para pruebas qRT-PCR de muestras de hoja en pozos de placas de 1.2 mi 96 pozos bien profundos (Corning) conteniendo una bola de cromo-acero, las placas se colocaron en un congelador a -80°C durante más de 30 minutos y/o liofilizaron durante la noche. Los tejidos congelados contenidos en placas bien profundas fueron molidos. Se extrajo ARN usando el equipo de extracción Magnesil® Genomic DNA Extraction kit (Promega, Madison, Wl) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN entonces fue tratado con DNasa usando el equipo libre de ADN (Ambion, Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se diseñaron cebadores de PCR y sondas usando el software Primer Express® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se diseñaron cebadores y sondas para gen de control endógeno así como una región especifica del transgen presente en la construcción. Se marcaron sondas en su extremo 5' con otro fluoroforo reportero para el control endógeno y otro fluoroforo reportero para los transgenes, y ambos fueron marcados en el extremo 3' con un saciador. Se llevaron a cabo reacciones en cadena de polimerasa en placas de reacción de 96 pozos (Applied Biosystems, Foster City, CA). La mezcla de un paso one-step SYBR Green I qRT-PCR mastermix (Eurogentec, San Diego, CA) se usó siguiendo las instrucciones del fabricante. La diferencia de veces de expresión se calculó utilizando los valores de umbral (Ct) de ciclo exportado como se describe por Ingham y otros (BioTechniques 31: 132-140, 2001) e Ingham (Methods in Molecular Biology 286: 273-289, 2004).

EJEMPLO 11 Manipulando plantas de colza/canola tolerantes a estrés al sobreexpresar un gen de AKT Se usan petioles cotiledonarios de semillas jóvenes de 4 días como explantas para cultivo de tejido y se transforman de acuerdo con la patente EP1566443. El cultivo comercial Westar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar usada para transformación, pero se pueden usar otras variantes. Se usa Agrobacterium tumefaciens GV3101 :pMP90RK conteniendo un vector binario para transformación de cañóla. El vector binario estándar para transformación es pSUN (patente WO 02/00900), pero se han describo muchos sistemas de vector binario diferentes para transformación de planta (por ejemplo, An, G. in Agrobacterirum Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 44, pp 47-62, Gartland KMA y MR Davey eds., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey). Un cásete de expresión de gen vegetal consiste de por lo menos dos genes - un gen marcador de selección y un promotor de planta que regula la transcripción del cADN o ADN genómico del gen de rasgo. Se pueden usar varios genes marcadores de selección incluyendo el gen de Arabidopsis que codifica una enzima sintasa de ácido acetohidroxi mutada (AHAS) (patentes de E.U.A. Nos. 5767366 y 6225105). De manera similar, se pueden usar varios promotores para regular el gen de rasgo para proveer regulación de tejido o ambiental, constitutiva, de desarrollo de transcripción de gen. En este ejemplo, el promotor 34S (GenBank números de acceso M59930 y X16673) se usa para proveer expresión constitutiva del gen de rasgo. Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie en 70% de etanol durante 2 minutos, se incuban durante 15 minutos en agua de la llave tibia a 55°C y después en 1.5% de hipoclorito de sodio durante 10 minutos, seguido por tres enjuagues con agua destilada esterilizada. Entonces se colocaron semillas en medio S sin hormonas, conteniendo vitaminas B5 Gamborg, 3% de sacarosa y 0.8% de Oxoidagar. Se germinaron semillas a 24°C durante 4 días en luz baja (< 50 µ???/p^e) a 16 horas de luz. Las explantas de cotiledón petiol con el cotiledón fijo se cortan de la semillas in vitro, y se inoculan con Agrobacterium al sumergir el extremo cortado de la explanta petiol en la suspensión bacteriana. Las explantas se cultivan entonces durante 3 días en medio MS ind. vitaminas que contienen 3.75 mg/l BAP, 3% de sacarosa, 0.5 g/l MES, pH 5.2, 0.5 mg/l GA3, 0.8% Oxoidagar a 24°C, 16 horas de luz. Después de tres días de co-cultivo con Agrobacterium, las explantas de petiol se transfieren a medio de regeneración que contiene 3.75 mg/l BAP, 0.5 mg/l GA3, 0.5 g/l MES, pH 5.2, 300 mg/l de timentina y agente de selección hasta regeneración de brote. Tan pronto como las explantas comienzan a desarrollar brotes, se transfieren a medio de alargamiento de brote (A6, conteniendo medio MS de fuerza completa incluyendo vitaminas, 2% de sacarosa, 0.5 Oxoidagar, 100 mg/l mio-inositol, 40 mg/l adenina sulfato, 0.5 g/l MES, pH 5.8, 0.0025 mg/l BAP, 0.1 mg/l IBA, 300 mg/l timentina y agente de selección). Las muestras de material in vitro y de invernadero de las plantas transgénicas primarias (T0) se analizan por qPCR usando sondas TaqMan para confirmar la presencia de T-ADN y para determinar el número de integraciones de T-ADN. Se produce semilla de las plantas transgénicas primarias por auto-polinización. Las plantas de segunda generación se crecen en condiciones de invernadero y se auto-polinizan. Las plantas se analizan por qPCR usando sondas TaqMan para confirmar la presencia de T-ADN y para determinar el número de integraciones de T-ADN. Se comparan plantas transgénicas homozigóticas, transgénicas heterozigóticas y azigóticas (no transgénicas) por sus características de crecimiento y producción.

EJEMPLO 12 Manipulación de plantas de maíz tolerantes a estrés al sobreexpresar un gen de AKT Células de agrobacteria albergando los genes y el gen de maíz ahas en el mismo plásmido se hicieron crecer en medio YP suplementado con antibióticos apropiados durante 1-3 días. Un lazo de células de agrobacteria se recolectaron y suspendieron en medio de 2 mi M-LS 002 (LS-inf) y el tubo que contiene células de agrobacteria se mantuvo en un agitador durante 1-3 horas a 1,200 rpm . Se cultivaron elotes (genotipo J553x(HIIIAxA188)] a 7-12 días después de polinización. Los elotes se esterilizaron en 20% de solución Clorox durante 15 minutos seguido por enjuague completo con agua estéril. Se disectaron embriones inmaduros con tamaño de 0.8-2.0 mm en el tubo que contiene células de agrobacteria en solución LS-inf. Se llevó a cabo agro-infección al mantener el tubo horizontalmente en la tapa laminar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de la agro infección se vertió en una placa que contiene el medio de co-cultivo (M-LS-011 ). Después de pipetear la agro-solución líquida, los embriones se colocaron en el medio de co-cultivo con el schutelo boca arriba y cultivado en la obscuridad a 22°C durante 2-4 días.

Se transfirieron embriones a medio M-MS-101 sin selección. Siete a diez días, se transfirieron embriones a medio M-MS-401 conteniendo 0.75 µ? imazethapyr y crecieron durante 4 semanas para seleccionar células de callo transformadas. Se inició la regeneración de planta al transferir callo resistente a medio M-LS-504 suplementado con 0.75 µ? imazethapyr y crecieron bajo luz a 2°C durante dos a tres semanas. Después se transfirieron brotes regenerados a caja de raíz con medio M-MS-607 (0.5µ? imazethapyr). Se transfirieron plántulas con raíces a mezcla encapsulada y crecieron en una cámara de crecimiento durante una semana, después transplantada a macetas más grande y se mantuvieron en invernadero hasta madurar.

EJEMPLO 13 Clasificación de tolerancia a estrés de invernadero para plantas transgénicas de AKT Clasificación de funcionamiento de sequía de alta producción Se plantaron semillas de maíz transgénicas segregando para un hecho de transformación en macetas pequeñas. Cada una de estas plantas se marcó únicamente, mostró y analizó para número de copia de transgen. Se marcaron y acoplaron plantas positivas y negativas transgénicas con tamaños similares para transplantar juntas a macetas más grandes. Esto proveyó un ambiente uniforme y competitivo para las plantas positivas y negativas transgénicas. Las macetas grandes fueron regadas a cierto porcentaje de la capacidad de agua del campo de la tierra dependiendo de la severidad de estrés a agua deseada. El nivel de agua de la tierra se mantuvo al regar cada otro día. El crecimiento de planta y rasgos de fisiología tales como altura, diámetro de tallo, enrollamiento de hoja, marchitamiento de planta, velocidad de extensión de hoja, estado de agua de hoja, contenido de clorofila y velocidad de fotosíntesis se midieron durante el periodo de crecimiento. Después de un periodo de crecimiento, la porción sobre tierra de las plantas se cultivó, y el paso fresco y peso seco de cada planta fueron tomados. Una comparación de fenotipo entre las plantas positivas y negativas transgénicas entonces se hizo.

Prueba de Eficiencia de Uso de Agua (WUE) Se transplantaron semillas de maíz positivas y negativas transgénicas para un caso de transformación en una maceta con una cantidad dada de tierra y agua. Las macetas son cubiertas con tapas que permiten a las semillas crecer pero minimizan la pérdida de agua. Cada maceta fue pesada periódicamente y se agregó agua para mantener el contenido de agua inicial. Al final del experimento, el peso fresco y seco de cada planta fue medido, el agua consumida por cada planta fue calculada y se computó la WUE de cada planta. El crecimiento de planta y rasgos fisiológicos tales como WUE, altura, diámetro de tallo, enrollamiento de hoja, marchitamiento de planta, velocidad de extensión de hoja, estado de agua de hoja, contenido de clorofila y velocidad de fotosíntesis fueron medidos durante el experimento. Entonces se hizo una comparación de fenotipo entre las plantas positivas y negativas transgénicas.

Prueba de desecación Se plantaron semillas de maíz transgénicas segregantes para un caso de transformación en macetas pequeñas. Estas macetas se mantuvieron en un área en el invernadero que tuvo condiciones ambientales uniformes, y se cultivaron óptimamente. Cada una de estas plantas se marcó únicamente, probó, y analizó para número de copia de transgen. Las plantas se dejaron crecer bajo estas condiciones hasta que alcanzaron una etapa de crecimiento predefinida. Después se mantuvo el agua. El crecimiento de planta y rasgos fisiológicos tales como altura, diámetro de tallo, enrollamiento de hoja, marchitamiento de planta, velocidad de extensión de hoja, estado de agua de hoja, contenido de clorofila y velocidad de fotosíntesis fueron medidos conforme aumenta la intensidad de estrés. Después se hizo una comparación del fenotipo entre plantas positivas y negativas transgénicas.

Prueba de sequía en ciclo Se plantaron semillas de maíz transgénicas segregantes para un caso de transformación en macetas pequeñas. Estas macetas se mantuvieron en un área en el invernadero que tuvo condiciones ambientales uniformes, y se cultivaron óptimamente. Cada una de estas plantas se marcó únicamente, probó, y analizó para número de copia de transgen. Las plantas se dejaron crecer bajo estas condiciones hasta que alcanzaron una etapa de crecimiento predefinida. Después las plantas se regaron repetidamente a saturación a un intervalo de tiempo fijo. Este ciclo de agua/sequía se repitió durante la duración del experimento. El crecimiento de planta y rasgos fisiológicos tales como altura, diámetro de tallo, enrollamiento de hoja, marchitamiento de planta, velocidad de extensión de hoja, estado de agua de hoja, contenido de clorofila y velocidad de fotosíntesis fueron medidos durante el periodo de crecimiento. Al final del experimento, las plantas se cultivaron para peso fresco y seco sobre tierra. Después se hizo una comparación del fenotipo entre plantas positivas y negativas transgénicas.

EJEMPLO 14 Clasificación de tolerancia a estrés de campo para plantas transgénicas de AKT Clasificación de tolerancia a sequía de maíz segregadora bajo condiciones libres de lluvia Se usa estrés de sequía en una sola ubicación o múltiples ubicaciones. La disponibilidad de agua de cultivo se controla por cinta de goteo o irrigación superior en una ubicación que tiene menos de 10 cm de lluvia y temperaturas mínimas mayores de 5°C esperadas durante una temporada promedio de 5 meses, o una ubicación con precipitación en temporada esperada interceptada por un "refugio sin lluvia" automático, que se retracta para proveer condiciones de campo abierto cuando no se requieren. Las prácticas agronómicas estándar en el área son seguidas para preparación de tierra, plantación, fertilización, y control de pestes. Cada parcela es sembrada con semilla segregando para la presencia de un caso de inserción transgénico individual. Una prueba de número de copia de transgen TaqMan (como se describió en el ejemplo 9) se usa en muestras de hoja para diferenciar los transgénicos de plantas de control no segregadoras. Las plantas que se han genotipado en esta manera también se califican para un rango de fenotipos relacionados con tolerancia a sequía, crecimiento y producción. Estos fenotipos incluyen altura de la planta, peso de grano por planta, número de grano por planta, número de oreja por planta, peso seco sobre tierra, conductancia de hoja a vapor de agua, absorción de C02 de hoja, contenido de clorofila de hoja, parámetros de fluorescencia de clorofila relacionados con fotosíntesis, eficiencia de uso de agua, potencial de agua de hoja, contenido de agua relativo a hoja, velocidad de flujo de albura de tallo, conductividad hidráulica de tallo, temperatura de hoja, reflectancia de hoja, absorción de luz de hoja, área de hoja, días para florecer, intervalo de antesis-aguas, duración de relleno de grano, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamaño de raíz, velocidad de extensión de hoja, ángulo de hoja, enrollamiento de hoja y supervivencia. Todas las medidas se hacen con instrumentación comercialmente disponible para fisiología de campo, usando los protocolos estándar provistos por los fabricantes. Se usan plantas individuales como la unidad de réplica por evento.

Clasificación de tolerancia a sequía de maíz no segregadora bajo condiciones libres de lluvia Se usa estrés de sequía en una sola ubicación o múltiples ubicaciones. La disponibilidad de agua de cultivo se controla por cinta de goteo o irrigación superior en una ubicación que tiene menos de 10 cm de lluvia y temperaturas mínimas mayores de 5°C esperadas durante una temporada promedio de 5 meses, o una ubicación con precipitación en temporada esperada interceptada por un "refugio sin lluvia" automático, que se retracta para proveer condiciones de campo abierto cuando no se requieren. Las prácticas agronómicas estándar en el área son seguidas para preparación de tierra, plantación, fertilización, y control de pestes. El diseño de prueba se diseña para acoplar una parcela que contiene un caso transgénico no segregador con una parcela adyacente de controles no segregadores. La progenie (o líneas derivadas de la progenie) de una planta transgénica no contiene el transgen debido a segregación Mendeliana. Se distribuyen parcelas en pares replicadas adicionales para un caso particular alrededor de la prueba. Un rango de fenotipos relacionados con tolerancia a sequía, crecimiento y producción se califican en las parcelas acopladas y se estiman al nivel de la parcela. Cuando la técnica de medición solamente se pudo aplicar a plantas individuales, se seleccionaron al azar cada vez desde la parcela. Estos fenotipos incluyen altura de la planta, peso de grano por planta, número de grano por planta, número de oreja por planta, peso seco sobre tierra, conductancia de hoja a vapor de agua, absorción de C02 de hoja, contenido de clorofila de hoja, parámetros de fluorescencia de clorofila relacionados con fotosíntesis, eficiencia de uso de agua, potencial de agua de hoja, contenido de agua relativo a hoja, velocidad de flujo de albura de tallo, conductividad hidráulica de tallo, temperatura de hoja, reflectancia de hoja, absorción de luz de hoja, área de hoja, días para florecer, intervalo de antesis-aguas, duración de relleno de grano, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamaño de raíz, velocidad de extensión de hoja, ángulo de hoja, enrollamiento de hoja y supervivencia. Todas las medidas se hacen con instrumentación comercialmente disponible para fisiología de campo, usando los protocolos estándar provistos por los fabricantes. Se usan plantas individuales como la unidad de réplica por evento.

Tolerancia a sequía de maíz de multi-locación y clasificación de producción Se seleccionan cinco a veinte ubicaciones que abarcan regiones de crecimiento de maíz principales. Se distribuyen ampliamente para proveer un rango de disponibilidades de agua de cosecha esperadas con base en temperatura promedio, humedad, precipitación y tipo de tierra. La disponibilidad de agua de cosecha no se modifica más allá de las prácticas agronómicas estándar. El diseño de prueba se diseña para acoplar una parcela que contiene un caso transgénico no segregador con una parcela adyacente de controles no segregadores. Un rango de fenotipos relacionados con tolerancia a sequía, crecimiento y producción se califican en las parcelas acopladas y se estiman al nivel de la parcela. Cuando la técnica de medición solamente se pudo aplicar a plantas individuales, se seleccionaron al azar cada vez desde la parcela. Estos fenotipos incluyen altura de la planta, peso de grano por planta, número de grano por planta, número de oreja por planta, peso seco sobre tierra, conductancia de hoja a vapor de agua, absorción de C02 de hoja, contenido de clorofila de hoja, parámetros de fluorescencia de clorofila relacionados con fotosíntesis, eficiencia de uso de agua, potencial de agua de hoja, contenido de agua relativo a hoja, velocidad de flujo de albura de tallo, conductividad hidráulica de tallo, temperatura de hoja, reflectancia de hoja, absorción de luz de hoja, área de hoja, días para florecer, intervalo de antesis-aguas, duración de relleno de grano, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamaño de raíz, velocidad de extensión de hoja, ángulo de hoja, enrollamiento de hoja y supervivencia. Todas las medidas se hacen con instrumentación comercialmente disponible para fisiología de campo, usando los protocolos estándar provistos por los fabricantes. Se usan plantas individuales como la unidad de réplica por evento.

APÉNDICE Secuencia de nucleótido de PpAKT-3 de Physcomitrella patens (EST 472) (SEC ID NO:1): ATCCCGGGCG ATTGCCTGCTCTGAATGATCAGTGTGGTGAGTGAAGG AACTGTGGCTAGTGTGCCCGCC ATTGTGCTCGCCGTCTG AGGATCAT GTCGACCACTACGGTGTCGGAGGACGCCGAAGATGGGAG AGGTGGTC GCAACGGCCAGCAGGCCAACCAAGGGCGCCTGTGGGACATGGATCA GCGGATCGACCAGCCGCTGGGTGCCGAAGCCGACCATGTTAGGTCCA TGTATCGCGACCAG ACTATGCCTCCGAGTGTGGTGTTGTGCCTAGCGT TTCAGAGCCTTGGGGTGGTCTACGGAGACTTGGGCACATCACCGTTG TATGTTTTCAAGAGCACGTTTGCTAATGGAGGAGTGAGGAACGAGGAT GACATCATTGGAGCTCTATCCCTC ATTATCTAC ACCCTCACC ATTATCC CCTTGATTAAATACGTCTTCATCGTGCTCAGAGCAAATGACAATGGCG AAGGGGGTTCTTTCGCTCTCTATTCATTGCTGTGTCGTTACTGTAATAT AAGCGCCCTGCCAAATCAACACCCTTCCG ATGCGGAGCTTACCACGTA TGTCGTAGACAACGCCCGCCGCAAAACCTGGATTC AG AGGAAGCTGG AAAGTAGTGTGCTTGCGCAGCAAGTGTTGTTGGTTATTGTGCTCTTCG GGACTTGCATGGTTATCGGCGACGGCATATTAACCCCGTCTATCTC AG TCTTATCGGCAGTTGTTGGAATTAAAGCTGCTTCTTCCTCCTTGGATAC TAATTTGGTGACAGGC ATTTCGTGCGTCATCTTAGTCATCCTCTTTAGC GTACAGCGCTTCGGCACAGCGAAAATCTC AGTCTTGTTCGCACCGATT TTCTTGGTTTGGTTCCTATCTCTTGCCTGTATCGGCTGCTAC AAC ATAA TC AAATGGGAGAAATCAATCTTCTTAGCCTTC AATCCCCTTCAAATCGT ACACTTCTTCAGACGGAATGGAAGACAGGGGTGGGAGCATCTCGGAG GCATCGTGCTGTGTATGACAGGGACTGAAGCGTTGTTTGCCGACTTGG GCCTTTCAGTTGTCGGTCTATTC AGATTGTCTTCACTTCTCTAGTGTAC CCGTGCTTATTTCTGACTTACCTCGGGCAAGCTGCTTACCTCGTGGAA CATATGGAAGACGTTAACG ATCCTTTTATTCCTC ACTGCCG AGTAGTAT TTACTGGCC AATCTTCGTGCTGGC AAC AATATC AGCCATG ATAGCG AG CCG AGCC ATG ATCTCCGCCACGTTTTCTATCGTGAAGCAGGCG AC AG CTCTGGG ATGCTTTCCTCG AGTGAAGGTTGTGCACACATCAAATAATG TTGC AGG AC AGGTGTATATCCCCG AAATC AACTGGATTCTTATGGTTC TCTGCCTCTGCGTCACAGCTGGTTTCCGAG ACACGGACCAAATCGGAA ATGCTTACGGTATCGCCGTGGTGATGGTC ATGATCGTCACC ACCCTCC TGATGACCCTAGTGATAATC ATCATTTGGCGG AAGCACTTCCTCCTTG CCTTGCTATTCCTTGTCGTGTTCGC ATC AATCG AGGG AATTTATGTCA GTGCGGTCCTATTC AAGACAACTC AAGGAGGCTGGGTGCCGCTGGTC ATTTCGGTGGTCTTCGGC AC AGTCATGGGCACATGGCATTACGGAACC TTGAAACGCTACCAGTATG AG ATGCCAC AAGGTTTCAGTGGGATGGTT GCTTGGGCTTGGACCTAGCCTCGGCCTCGTTCGTGTCCCCGGAATCG GTCTCATGTACACAG ATCTCGCTCATGGAGTGCCGCCGCTATTCTCGC ATTTCATCACCAATCTCCCCGCCATCCATTCCACCGTAGTCTTCGTCT GCGTTAAATACCTGCC AGTG AAC ACGGTACC ACAAGATGAG AG ATTTC TAATCCGTCGC ATCGGTTC AAG AGCTTATTCC ATGTACGTTGTGC AGC ACGTTACGGCTACATAGACCTCCACAAGAAAGATGACAACTTCGAGCA ACTGCTAATTC AAAGCTTAATCAGTTTCGTCG AGATTGAGTCTATGAGA GAGAGCTCAGGCCGGG AGTCCATGGCTGC AAGCTGGACCCCAGATCA AC AGCCG ATGG AGGAGGCC ACGGTGCC AACTACGTCG ACG ATC ACTC C AAACCGGCTTC AGTTGCAAAG AATGCTG AG ATTACACAGTCTG ATGG GCGGAGGCAACAGCGTCGGCGACGGTTATTCCACTCAGTACTCCCAG ACCGCCTCGAACTCGGTCGAGATGTCTGCTAACCAGGAATGCAGTATT CCAAACCTGAGCGTCAACGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCCCGCATCC GCAAGACGAAGTTGCCTTCCTGAATGCATGC AAAGATGCTGGCGTGGT GTACATACTCGGTAACAACATCGTGAAAGCGAGAAAGGATGCAGGATT TTTCAAGAAGCTGGTGATCAACTACATGTATACCTTTCTGCGAAGGATA AGCCGAGACAGCAGCGTGGTGCTCAACATCCCGCACGAGTGCCTACT TCATGTCGGCATGGTGTACTATGTTTGATTCTTTTGGGTCTG AGTTTTG TACAGGGCGACGTTAACGC Secuencia deducida de aminoácido de PpAKT-3 de Physcomitrella patens (SEC ID NO:2): MSTTTVSEDAEDGRGGRNGQQANQGRLWDMDQRIDQPLGAEADHVRS MYRDQTMPPS VVLCLAFQSLG VVYGDLGTSPLYVFKSTFANGGVR EDD I IGALSLI I YTLTI I PLI KYVFI VLRANDNGEGGSFALYSLLCRYCN I SALPNQ HPSDAELTTYVVDNARRKTWIQRKLESSVLAQQVLLVI VLFGTCMVIGDGI LTPSISVLSAVVGIKAASSSLDTNLVTGISCVILVI LFSVQRFGTAKISVLFA PIFLVWFLSLACIGCYNIIKWEKSI FLAFNPLQI VHFFRRNGRQGWEHLGG IVLCMTGTEALFALDGHFSCRSIQIVFTSLVYPCLFLTYLGQAAYLVEHME DVNPF YSSLPSSI YWPI FVLATI SA ISRAMI SATFSI VKQATALGCFPRV VVHTSNNVAGQVYIPEI WILMVLCLCVTAGFRDTDIGNAYGIAVVMVMIV TTLLMTLVI IIIWRKHFLLALLFLVVFASIEGI YVSAVLFKTTQGGWVPLVIS VVFGTVMGTWHYGTLKRYQYEMQHKVSVGWLLGLGPSLGLVRVPGIGL M YTDLAHGVPPLFSH FIT LPAI HSTVVFVCV YLPVNTVPQ DERFLI RRI GSRAYSMYRCAARYGYIDLHKKDDNFEQLLIQSLISFVEIESMRESSGRE SMAASWTPDQQPMEEATVPTTSTITPNRLQLQRMLRLHSLMGGGNSVG DGYSTQYSQTASNSVEMSANQECSIPNLSVNGSNSSSSPHPQDEVAFLN ACKDAGVVYILG NIVKARKDAGFFKKLVINY YTFLRRISRDSSVVLNIP HECLLHVGMVYYV* Secuencia de nucleótido de GmAKT-2 (GM59666231) de Glycine max (SEC ID NO:3): ATTA A AGG AATC ATCC AAAGGG AACTC AAAATGAAATGAAATGG AAAT GTAAG AAGTAGTACTG AAAACTG AACTC AACTAACTCGTG ACTCGTCA G AG AG A AG AAAAG AATATCGTTCGTTCGCTCTTACCTTCTTC ACCTTCC TTCCTCTCTCTCTCTAG AG AATGG AACCGG AATCCGGAACTTCG ACTT CTC GG AATC CTTCTC AGTTGTCTTGGGTG AATCTGTCTAGG AATTTATT ATTAGCGTATCAAAGCTTTGGTGTGGTGTATGGAGATCTGAGCACTTC TC CTCTCTATGTCTTC AC AAGC ACCTTCAAGGGG AAGTTGCAGAATCA CC ATGACGAGGAAACTATATTCGGCACGTTTTCGTTGATTTTTTGGAC CCTTACTTTG ATTCCGTTGCTTAAGTATGTATTC ATCCTATTG AGTGCT GATG AC AACGGGGAAGGTGGAACATTCGCTCTTTATTCGCTGCTCTGT AGG CATGCCAAGTTTAATTTGCTCCCC AATC AAC AAGC AGCTGATGAG G AGTTATC ATCCTATAAATATGGTCCCTCTTC AC AGGCTATAGCCTCTT CTC CTCTAAAG AGGTTTCTGGAG AAAC ATAAAAGGTTAAGAAC AGCCC TGCTTGTTGTGGTATTGTTTGGTGCTTGCATGGTCATTGGTGATGGTG TGCTTACTCC AGC AATTTCGGTTCTAGCATC AGTCTCAGG ACTAAAAG TTAC AG AAAAAAAATTAAC AG ATGGTGAGCCAAATCTC ATTTATTCCTT TTTTTTTGTTCTC ATC ATTGCTTTTGTTATGCTAAGGGCAAATTGGTTG C AG GTG AACTTG AGAAATTTC ATGTTGTTTGC AGGTGAACTTGTCCTG CTTGCCTGTGTCATATTGGTTGGACTGTTTGCTCTCC AACATTGTGGC ACACACAAAGTTGCAGTTATGTTTGCACCAATTGTAATAATCTGGCTTG TATCAATATTTTCTATTGGGGTGTATAATACAATTCATTGGAATCCAAA AATAGTCCGTGCTATATCGCCATATTATATCATCAAGTTTTTTAGCAGG ACTGGTAAAGAAGGTTGGGTTTCTCTTGGAGGG ATACTTCTTTGTATC ACTGGAACTGAAGCTATGTTTGCGGATCTTGGTCATTTC ACTGCTTCG TCAATAAGGCTTGCATTTGCGTTTGTTATATACCCGTGTTTAGTGGTAC AGTATATGGGTC AAGCTGCTTTCTTGTCTAAAAATCTCGACTCTGTTG A TAACGGTTTTTATGACTCAATACCTGACCCTGTGTTTTGGCCTGTTTTC ATAATCGCCACCCTTGCTGCAATTGTTGGG AGTCAAGCTGTTATAACT GCAACTTTCTCCATCATCAAGCAGTGTCATGCGCTTGGTTGCTTTCCG CGAGTCAAAGTTGTACAC ACCTCAAAAC ATATATATGGAC AG ATCTATA TCCCAGAAATC AATTGGAATACTTATGATCCTAACTCTTGC AATAACCA TTGGATTTCAGGACACGACCATAATTGGAAATGCTTATGGGTTGGCTT GTATGACAGTTATGTTCATAACTACATTTCTG ATGACACTAGTCGCAAT CTTTGTCTGGCAGAAAAGTGTCTTGATTGCTGTTGTATTTCTTTTATTC CTTTGGGTGATAGAGGGCGTATATCTATCAGCAGCTTTCATCAAAGTG CCTCAGGGAGGATGGGTACCTCTAGTCTTATCATTC ATCTTC ATGATT GTTATGTACGTGTGGCATTATGGAACTCGTAGGAAGTACAGCTATGAT CTGCAC AACAAAGTTTCATTGAAATGGTTACTGGGCTTGGGCCC AAGC CTTGGCATTGTTCGTGTACCTGGGATTGGTCTCATCTACACTG AACTG GC AAC AGGCATACCTGCAATATTTTCCC ATTTTGTAAC AAATCTTCCTG CATTTCACCAGGTGTTGGTTTTTGTTTGTGTAAAATCGTTCCTGTTCCA TATGTTTCACCGGAAGAACGTTTCCTTATTGGGCGAGTTTGCCCC AGA CC ATATCGAATGTATAGGTGCATTGTCAG ATATGGTTAC AAGG ACATT CAAAGGGATGATGGAGATTTTGAGAATC ATCTTATACAGAGTATAGCA GAATTTATCCAAATGGAAGCAGTGCAACCTCAGTTCTCAAGTTCCGAA GCTTCTTCTTCACTTGATGGGAGGATGGCCGTTATAAGTTCTAGAAAC TATGATTATGCTTCAAGTTTAATAGTTTCTGAGC AGGAGGATATAGGCG TTGACATATCCATCCCTAGCAGCAGATCTGC AACCCTGC AAAGTTTGC AATCGGTTTACGACGATGAAACTCCGCAAGTTAGAAGACG ACG AGTAA GATTTCAGCTACCAGAAAACACTGGTATGGATCCCGATGTTAGGGAAG AGCTTTTGGATTTAATTCAAGCCAAGGAAGCTGGGGTTGCATATATAAT GGGGCACTCATATGTGAAGGCAAGGAAATCATCCTCATTCTTG AAAAA GCTCGTGATTGATATTGGTTACTCATTTCTGCGC AAG AATTGCAGGGG TCCAGCTGTAGCTCTTAACATTCCTCACATTAGTCTTATTGAAGTTGGG ATGATATATTATGTGTAGTTATTGGTGAAATTTACAACTTGATCCTAGTT GCATAGGTAATTAATTGTAGCTCACGGGAAAATG AGTGTCTTTTGGGG CTACGTGTTTATCTTTGCTTTCGCATCTCTCTCCCAATGTAATTAC ATA GTTGCAACAATAAGGTTTTAGAATTATATTTAGGAATC AGAATATTTTC CTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGAGAG AG AGACCGAC ACGC A Secuencia deducida de aminoácido de GmAKT-2 de Glycine max (SEC ID NO:4): MEPESGTSTSR PSQLSWV LSRNLLLAYQSFG VVYGDLSTSPLYVFTS TFKGKQNHHDEETIFGTFSLIFWTLTLIPLLKYVFILLSADDNGEGGTFALY SLLCRHAKFNLLPNQQAADEELSSYKYGPSSQAIASSPLKRFLEKHKRLR TALLVVVLFGACMVIGDGVLTPAISVLASVSGLKVTEKKLTDGEPNLI YSF FFVLIIAFVMLRANWLQVNLRNFMLFAGELVLLACVILVGLFALQHCGTHK VAVMFAPIVIIWLVSIFSIGVYNTIHWNPKIVRAISPYYIIKFFSRTGKEGWV SLGGILLCITGTEA FADLGHFTASSI RLAFAFVI YPCLVVQYMGQAAFLS KNLDSVDNG FYDSI PDPVFWPVFI I ATLAAI VGSQAVITATFSI I KQCHALG CFPRVK VHTSKHI YGQI YIPEINWILMILTLAITIGFQDTTIIGNAYGLAC TVMFITTFLMTLVAI FVWQKSVLI AVVFLLFLWVI EGVYLSAAFI KVPQGG WVPLVLSFI FMIVM YVWHYGTRRKYSYDLH KVSLKWLLGLGPSLGI VRV PGIGLI YTELATGPAIFSHFVTNLPAFHQVLVFVCVKSVPVPYVSPEERFLI GRVCPPRYRMYRCIVRYGYKDIQRDDGDFENHLIQSIAEFIQ EAVQPQF SSSEASSSLDGRMAVISSRN YDYASSLIVSEQEDIGVDISIPSSRSATLQS LQSVYDDETPQVRRRRVRFQLPENTGMDPDVREELLDLIQAKEAGVAYI MGHS YVKARKSSSFL KLVIDIG YSFLRKNCRGPAVALNI PHISLIEVGMI Y YV Secuencia de nucleótido de TaA T-1 (T59824966) de Triticum aestivum (SEC ID NO:5): GTGAGAGAGAGATCATCATCGTACCTTG ACGATGGCTGAGCCTCTGAA GGCAAACGGCAATGGAGCTGCCGAAGGGGGTGCTGCGGGCTCTGCG TTTGCATCGGTGAAGGTGCCGCCGTCGCCGCCAAGGAGGCTGCAGAG GTTCGACTCCCTGCATATGGAGGCCGGGAAGATTCCTGGTGGCCACA GCTATGCAGCCAAGGTTGGCTGGGCGACGACACTGCACTTGGCCTTC CAGAGCCTAGGTGTGGTTTATGGGGACATGGGAACTTCACCCCTCTAT GTGTTCTCCAGC ACCTTTACTGGTGGGATCAAGGACACAGATGACCTC CTTGGTGTCATGTCCTTGATAATCTATACTGTACTTCTCCTTCCATTGA TGAAATATTGTTTCATTGTCTTGAGAGCTAATGACAACGGCGATGGCG GAACATTTGCACTTTATTCCTTGATATCTCGGTATGCTAGGATTAGCTT GATACCAAACCAGC AGGCTGAAGATGCAACAGTCTCTCACTACAAGTT AGAGTCCCCTACGAATCGTGTCAAGCGGGCTCATTGGATTAAGGAAAA GATGGAAAACAGCCCGAAATTTAAGGTCATACTTTTCCTAGTGACAATT CA\TAGCAACATCAATGGTTATTGGTGACGGTGTGCTAACTCCATGTAT TTCAGTGCTTAGTGCAGTTACGGGAATCAAGCAATCAGCAAAGTCGTT AACTCAAGG ACAAATTGCTGGCATCGCAATCGGCATTCTGATCGCCCT CTTTCTTGTCCAGCGCTTTGGCACAGACAAAGTTGGTTACACATTTGG CCCAGTAATCTTTATATGGTTCATCTTAATTGCCGGCATTGGAATTTAT AATTTGATCAAACATGATACTGGAATTCTGAAAGCATTCAACCCACAAT ACATAGTGGAATATTTCCAAAGAAATGGGAAGGACGGCTGGATTTCGC TTGGAGGTGTTATCTTATGCATTACAGGAACCGAAGCAATGTTTGCTG ACCTTGGTCACTTCAATGTGAGAGCAATTCAGATTGGCCTTTCTGCAG TTCTGCTCCCATCAGTATTGCTTGCTTACATGGGACAGGCTGCATATC TTCGCATCCACCCTGAAGATGTTGCAGATACATTCTACAAATCAATCCC AGGTCCATTATATTGGCCAACATTTGTGGTGGCCGTGGCTGCTGCTAT AATTGCAAGCCAAGCTATGATTTCTGGTGCCTTTGCAATCATTGCTCA GTCCCAAGTTCTTGGTTGCTTTCCACGGGTTCGTGTCACTCACACCTC AAAAAAGTATCATGGGCAGGTCTACATCCCTGAGATCAACTATGCATT AATGATCTTATGTGTAGCTGTGACAGCTATTTTCC AAACTACAGAC AAG ATTGGCAATGCATATGGTATCGCTGTCGTCTTTGTGATGTTCATAACAA CACTTCTAGTCACACTGGTAATGGCCATGATATGGAAGACAAGTCTGC TGTGGATTGCACTCTTTCCAATAATATTTGGCGGCGC AGAGCTCGTGT ACTTATCCTCAGCATTCTACAAATTTGTAG AAGGTGGCTACTTGCCACT AGGTTTTGCAGCAATTTTGATGCTTATAATGGGCACATGGCACTATGTT CATGTTCATCGGTACAAATACGAGCTCAAGAACAAAGTGTCAAACAAC TATGTGGCAGATTTGGCAACAAGGAGAAATCTTGCTAGGTTGCCAGGA ATAGGCGTTCTGTACTCTGAGCTTGTGCAAGGAATCCCACCCATACTG CCCCATTTGGTAGAAAAAGTACCTTCCATCCATTCAGTTCTTGTGATTA CCTCAATAAAGTACTTACCAATCAGCAATATAGAAACAAATGAGCGGTT CCTCTTCCGATACGTGGAGCCAAGAGAATACAGGGTATTCCG ATGTGT GGTGCGCTATGGTTACAACAATAAAGTAG AAG ATCCAAGAGAGTTCGA GAACTTGCTTATTGGGAACTTGAAGCAATTCATCCATC AAGAATCACTC TACAGCGAAAGTAGTCATTCCCTTGAAGGAGAAGATAATGCATTCGAA GAATCAGGAG ATGCAATGGAGCCTTCTATTGAAGTTCAAGATGCAAGG TTGCCGAAAAGGTTTTTAGATGGAATCACTGCTAGCCCAGTGAACGGG TTAATGGATGAGATAG AGTTTATTCAGAGAGGGATGGATGATGGTGTT GTCCATCTGCTGGGAGAAACTAATGTGGTGGCGGAGCAAAATGCCGG TTTGGTGAAGAAAATAATAGTTGACTACGCCTACAATTTC ATGAGGAAG AACTTCAGGCAACCAGAGAAGTCACATGTGTCCCTCATAACAGGCTGC TGCGGGTGGGAATGACATACGAGATCTAGAGAGATGCTCAGTGGATT GATCAAATTGACAATAGCTTCAGTTTTCTCAGTACCAAGTGCAGAAAG GATATGCAG AGGAACAGCCTCCTTGACTGAACAGCAG AGGATGGAG A GATTTTATGCGTACAAGTGGTGAAACTACAGTACATGCAATATGTATTT ACCATATAATATTTTTTTTGTTAGGGAAATTCTACTGTATAAGTGTTTGT TAGCAGTAAGTATGCATAGCTGTCAAACCCCTAGTTTGGCCAACTCTT TGCCTTATTGTGGAAAACTC AAAATCTTAGTATGTGCAGTTGTACAC AA AGATTGTAACCTACCGGCAAAAGTTAAACAAATAATAAAGTATGACTTG TGTGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGAG AGAGAGACCGACACGCA Secuencia deducida de aminoácido de TaAKT-1 de Triticum aestivum (SEC ID NO:6): MAEPLKANGNGAAEGGAAGSAFASVKVPPSPPRRLQRFDSLHMEAGKIP GGHS YAAKVGWATTLH LAFQSLG VVYG DMGTS PLYVFSSTFTGG I KDTD DLLGVMSLIIYTVLLLPL KYCFIVLRA DNGDGGTFALYSLISRYARISLIP NQQAEDATVSHYKLESPTNRVKRAHWIKEK ENSPKFKVILFLVTILATS MVIGDGVLTPCISVLSAVTGIKQSAKSLTQGQIAGIAIGILIALFLVQRFGTD KGYTFGPVIFIWFILIAGIGIYNLI KH DTG I LKAF N PQ Yl VE Y FQ RNG KDGWI SLGGVILCITGTEA FADLGHFNVRAIQIGLSAVLLPSVLLAYMGQAAYLRI HPEDVADTFYKSIPGPLYWPTFVVAVAAAI I ASQAMISGAFAI IAQSQVLG CFPPVRVTHTSKKYHGQVYIPEI YAL ILCVAVTAIFQTTDKIGNAYGIAV VFVMFITTLLVTLVMAMIWKTSLLWIALFPI I FGGAELVYLSSAFYKFVEGG YLPLGFAAILMLIMGTWHYVHVHRYKYELKNKVSNNYVADALATRR LAR LPGIGVLYSELVQGIPPILPHLVEKVPSIHSVLVITSIKYLPISNIETNERFLF RYVEPREYRVFRCVVRYGYNNKVEDPREFENLLIGNLKQFIHQESLYSES SHSLEGEDNAFEESGDAMEPSIEVQDARLPKRFLDGITASPVNGLMDEIE FIQRGMDDG VVHLLGETN VVAEQNAGLVKKIIVDYAY FMRKNFRQPEKI TCV HNRLLRVGMTYEI

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico se selecciona a partir del grupo que consiste de: un polinucleótido como se define en SEC ID NO:1, SEC ID NO-3 o SEC ID NO:5; un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6; - un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5; y un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polipéptido como se define en SEC ID NO:2, SEC IDNO:4 o SEC ID NO:6. 2 - El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido como es define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO.3 o SEC ID NO:5. 3.- El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. 4 - El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. 5 - El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. 6 - El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEC ID NO: 2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. 7.- El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. 8.- El ácido nucleico aislado de conformidad con la rei indicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. 9.- El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. 10.- El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona para aumentar el crecimiento de una planta bajo y/o tolerancia a estrés bajo condiciones normales o de estrés en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. 11.- Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 12. - Una célula vegetal transgénica que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 13. - Una planta transgénica que comprende la célula vegetal de conformidad con la reivindicación 12. 14. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde la planta tiene crecimiento aumentado y/o tolerancia a estrés aumentada bajo condiciones normales o de estrés en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. 15.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde la planta es un monocote. 16. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde la planta es un dicote. 17. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de maíz, trigo, centeno, avena, triticalo, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, colza, cañóla, manihot, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas como papa, tabaco, berenjena, y jitomate, especies Vicia, chícharo, alfalfa, café, cacao, té, especies Salix, palma, coco, pasto perene, y cultivos de forraje. 18. - Una semilla de planta producida por la planta de conformidad con la reivindicación 13, en donde la semilla comprende el ácido nucleico. 19. - La semilla de conformidad con la reivindicación 18, en donde la semilla es de crianza pura para un crecimiento aumentado y/o tolerancia a estrés aumentada bajo condiciones normales o de estrés en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla. 20. - Un método para producir una planta transgénica que contiene un ácido nucleico aislado, en donde la planta tiene crecimiento aumentado y/o tolerancia a estrés aumentada y/o eficiencia de uso de agua aumentada bajo condiciones normales o de estrés en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta que comprende, transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, y generar de la célula vegetal la planta transgénica, en donde el ácido nucleico se selecciona a partir del grupo que consiste de: un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5; - un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6¡ un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5; y - un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polipéptido como se define en SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la planta es un monocote. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la planta es un dicote. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de maíz, trigo, centeno, avena, triticalo, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, colza, cañóla, manihot, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas como papa, tabaco, berenjena, y jitomate, especies Vicia, chícharo, alfalfa, café, cacao, té, especies Salix, palma, coco, pasto perene, y cultivos de forraje. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido como se define en SEC ID NO. 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido como se define en SEC ID NO: 1, SEC ID NO:3 o SEC ID NO:5. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEC ID NO: 2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polipéptido como se define en SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 o SEC ID NO.6. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el vector de expresión comprende un promotor que dirige expresión del ácido nucleico. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde el promotor es especifico de tejido. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde el promotor es regulado en forma de desarrollo.