MX2007005802A

MX2007005802A - Polipeptidos de caseina quinasa relacionados con el estres y metodos de uso en plantas.

Info

Publication number: MX2007005802A
Application number: MX2007005802A
Authority: MX
Inventors: Damian Allen; Oswaldo Da Costa E Silva; Nocha Van Thielen; Amber Shirley; Lori V Mills
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2007-07-16
Also published as: US20080050820A1; US20050066396A1; AR051503A1; WO2006055631A2; CN101102665A; US20090282580A1; EP1814378A2; US7399904B2; CA2587401A1; EP1814378A4; WO2006055631A3; BRPI0517851A; AU2005307824A1; US7795415B2; ZA200704387B; US20080052794A1

Abstract

Una planta transgenica transformada por un acido nucleico codificador de un polipeptido de caseina quinasa relacionado con el estres (CKSRP), en donde la expresion de la secuencia de acido nucleico en plantas da como resultado una mayor tolerancia al estres del medio ambiente en comparacion con una variedad de la planta de tipo salvaje. Tambien se proveen productos agricolas, incluyendo semillas, producidos por las plantas transgenicas. Tambien se proveen CKSRP aislados y acido nucleico aislado codificador de CKSRP, y vectores y celulas huesped que contienen a estos ultimos.

Description

POLIPEPTIDOS DE CASEÍNA QUINASA RELACIONADOS CON EL ESTRÉS Y MÉTODOS DE USO EN PLANTAS REFERENCIAS CRUZADAS CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud es una solicitud de continuación parcial de la Solicitud de los Estados Unidos N.° 09/828.313, presentada el 6 de abril de 2001 para reivindicar el beneficio de la prioridad de la Solicitud de patente provisoria de los Estados Unidos N.° de serie 60/196.001, presentada el 7 de abril de 2000, en donde los contenidos completos de ambas de solicitudes se incorporan asi como referencia. La presente solicitud también es una solicitud de continuación parcial de la Solicitud de los Estados Unidos N.° 10/292.408, presentada el 12 de noviembre de 2002, para reivindicar el beneficio de la prioridad de la Solicitud de patente provisoria N.° de serie 60/346.096, presentada el 9 de noviembre de 2001, en donde los contenidos completos de ambas de solicitudes se incorporan así como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención. La presente invención se refiere en general a secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos asociados con respuestas a estrés abiótico y tolerancia a estrés abiótico en plantas. En particular, la presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que confieren a la planta aumento de tolerancia a sequía, frió y/o contenido salino.

Antecedentes en el arte . Las tensiones ambientales abióticas, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor y estrés por frió, son factores limitantes importantes del crecimiento vegetal y la productividad. Las pérdidas de cosechas y las pérdidas de rinde de cosechas de los principales cereales tales como poroto de soja, arroz, maiz, algodón, y trigo causadas por estos estreses representan un significativo factor económico y político, y contribuyen a la falta de alimento en muchos paises subdesarrollados.

En general, las plantas se ven expuestas durante su ciclo de vida a condiciones de reducción del contenido de agua ambiental. La mayoria de las plantas desarrollaron estrategias para protegerse contra estas condiciones de desecación. Sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiado importantes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento, y el rendimiento de la mayoria de las plantas cerealeras son profundos. La exposición continua a las condiciones de sequia causan alteraciones importantes en el metabolismo vegetal, que en última instancia conducen a la muerte celular y las consecuentes pérdidas de rendimiento.

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que implica la posibilidad de solucionar o mediar al menos parte de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de cultivo de plantas, con el objeto de desarrollar nuevas lineas de plantas que exhiben resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren lineas resistentes especificas para el cruzamiento con la linea buscada. Los limitados recursos de germoplasma para la tolerancia al estrés y la incompatibilidad de los cruzamientos entre especies de plantas con relaciones distantes representan problemas significativos que se encuentran en los cultivos convencionales. Además, los procesos celulares conducentes a la tolerancia a sequia, frío y sales en plantas modelo de tolerancia a sequía, frío y/o contenido salino sales son de naturaleza compleja e incluyen múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas vías metabólicas . Esta naturaleza multicomponente de la tolerancia al estrés no sólo ha hecho que el cultivo para tolerancia fracase en gran parte, sino que además limitó la capacidad para someter a ingeniería genética las plantas tolerantes al estrés mediante métodos biotecnológicos Los estreses por sequía, por calor, por frío y por contenido salino comparten una importante relación con el crecimiento vegetal, referida a la disponibilidad de agua. Tal como se analizó con anterioridad, la mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra condiciones de desecación; sin embargo, si la severidad y la duración de las condiciones de sequía son muy intensas, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento y el rendimiento vegetal de la mayoría de los cultivos son profundos. Además, la mayoría de los cultivos son muy susceptibles a concentraciones en el suelo. Dado que el elevado contenido salino en algunos suelos implica que haya menor cantidad de agua disponible para la captación por las células, la elevada concentración de sales tiene un efecto sobre las plantas similar al efecto que tiene sobre ellas la sequía. Además, con temperaturas de congelación, las células vegetales pierden agua como consecuencia de la formación de hielo que comienza en el apoplasto y extrae agua del simplasto. Los mecanismos moleculares de respuesta de una planta a cada una de estas condiciones de estrés son comunes, y las proteína quinasas tales como caseína quinasas, juegan un papel esencial en estos mecanismos moleculares.

Las proteina quinasas representan una superfamilia, y los miembros de esta superfamilia catalizan la transferencia reversible de un grupo fosfato de ATP de las cadenas laterales de los aminoácidos serina, treonina y tirosina en los polipéptidos blanco. Las proteina quinasas son elementos primarios en los procesos de señales en plantas y se ha informado que desempeñan funciones cruciales en la percepción y transducción de señales que permiten a una célula (y la planta) responder a los estímulos ambientales. En particular, las proteínas caseína quinasa I son proteína quinasas monoméricas de tipo serina/treonina que contienen un dominio central altamente conservado de quinasa. Los miembros de esta familia tienen extensiones N terminal y C terminal divergentes . La región N terminal es responsable del reconocimiento del sustrato y la extensión C terminal es importante para la interacción de la quinasa con sustratos. También se cree que la extensión C terminal e importante para mediar la regulación por autofosforilación (Gross y Anderson, 1998 Cell Signal 10:699-711; Graves y Roach, 1995, J Biol Chem 270:21689-21694).

Si bien se han caracterizado algunos genes que intervienen en las respuestas a estrés y el uso eficiente de agua en plantas, la caracterización y la clonación de genes vegetales que confieren tolerancia a estrés y eficiencia de uso de agua aún son en gran medida incompletos y fragmentarios. Por ejemplo, ciertos estudios indican que la sequía y el estrés por contenido salino en algunas plantas se pueden deber a efectos genéticos aditivos, en contraste con otras investigaciones, que indican que los genes específicos se activan por transcripción en tejidos vegetativos de las plantas en condiciones de estrés osmótico. Si bien en general se presupone que las proteínas inducidas por estrés tienen un papel importante en la 5 tolerancia, aún se carece de evidencias directas, y se desconocen las funciones de muchos genes que responden a estrés.

En todos los organismos fotosintéticos O terrestres hay una compensación fundamental restringida por medios fisicoquímicos entre la absorción de C02 y la pérdida de agua (Taiz y Zeiger 1991 Plant Physiology, Benjamin/Cummings Publishing Co, p94) . C02 debe estar en solución acuosa para la '^ acción de enzimas fijadoras de C02 tales como Rubisco (Ribulosa 1 , 5-bisfosfatocarboxilasa/oxigenasa) y PEPC ( fosfoenolpiruvatocarboxilasa) . Dado que se requiere una superficie celular húmeda para la difusión de C02, es inevitable que haya evaporación cuando la humedad 0 es inferior al 100% (Taiz y Zeiger 1991 Plant Physiology, Benjamin/Cummings Publishing Co p257). Las plantas poseen numerosos mecanismos fisiológicos para reducir la pérdida de agua (por ejemplo, cutículas serosas, cierre de los estomas, hojas pilosas, fosas de estomas hundidas) . Dado que estas barreras no discriminan entre el flujo de agua y C02, estas medidas de conservación de agua también actúan como resistencia a la captación de C02 (Kramer 1983 Water Relations of Plants, Academic Press p305). La captación fotosintética de C02 es un requisito absoluto para el crecimiento de las plantas y la acumulación de biomasa en plantas fotoautotróficas . La eficiencia de uso del agua (WUE) es un parámetro de uso frecuente para estimar la compensación entre el consumo de agua y la captación de C02/crecimiento (Kramer 1983 Water Relations of Plants, Academic Press p405) . Se ha definido y medido WUE de muchas maneras. Un enfoque consiste en calcular la proporción de peso seco de la planta entera, respecto del peso de agua consumida por la planta durante su vida (Chu et al., 1992, Oecologia, 89:580). Otra variación consiste en usar un intervalo de tiempo más corto cuando se miden la acumulación de biomasa y el uso de agua (Mian et al., 1998, Crop Sci. 38:390). A menudo se usan medidas a partir de partes restringidas de la planta, por ejemplo, sólo la medición del crecimiento aéreo y el uso de agua (Nienhuis et al., 1994, Amer. J. Bot. 81:943) . También se definió WUE como la relación entre la captación de C02 y la pérdida de vapor de agua de una hoja o una porción de una hoja, a menudo medido durante un período muy corto (segundos/minutos) (Kramer 1983, Water Relations of Plants, Academic Press p. 406) . También se usó la relación entre 13C/12C fijo en el tejido vegetal, y medido con un espectrómetro de masa con relación isotópica, para estimar WUE en plantas mediante la fotosíntesis de C3 (Martin et al., 1999, Crop Sci. 1775).

El aumento de WUE indica una eficiencia relativamente mejorada del crecimiento y el consumo de agua, pero esta información aislada no indica si uno de los dos procesos cambió o si cambiaron ambos. En la selección de rasgos para mejorar los cultivos, un aumento de WUE debido a disminución del uso de agua, sin un cambio en el crecimiento tendría particular mérito en un sistema agrícola con irrigación, en el cual los costos de ingreso de agua son elevados. Un aumento de WUE debido sobre todo a un aumento del crecimiento sin el correspondiente incremento de uso de agua sería aplicable a todos los sistemas agrícolas. En muchos sistemas agrícolas en los cuales la provisión de agua no es limitante, un aumento del crecimiento, aún a expensas de un aumento del uso de agua (es decir, sin cambio de WUE), también puede aumentar el rendimiento. En consecuencia, se requieren nuevos métodos para aumentar WUE y la acumulación de biomasa para mejorar la productividad agrícola. Dado que WUE integra muchos procesos fisiológicos referidos al metabolismo primario y el uso de agua, en general es un rasgo muy poligénico con un gran genotipo con interacción ambiental (Richards et al., 2002, Crop Sci. 42:111) . Por estas y otras razones, pocos intentos tendientes a seleccionar cambios de WUE en los programas tradicionales de cultivo han tenido éxito .

En consecuencia, hay una necesidad de identificar genes adicionales expresados en plantas tolerantes al estrés y/o plantas con uso eficiente de agua que tengan capacidad para conferir resistencia al estrés y eficiencia de uso de agua a la planta huésped y a otras especies vegetales. Las plantas tolerantes al estrés recién desarrolladas tendrán muchas ventajas, tales como un aumento del rango en el cual se pueden cultivar plantas de cereales, por ejemplo, al disminuir los requisitos de agua de una especie vegetal. Otras ventajas de interés incluyen el aumento de la resistencia al cultivo, la flexión de los brotes o tallos en respuesta al viento, la lluvia, las plagas o las enfermedades .

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención cubre en parte la necesidad de identificar nuevas y singulares caseína quinasas capaces de conferir tolerancia a estrés a plantas por su sobreexpresión. La presente invención describe un nuevo género de ácidos nucleicos codificadores polipéptidos de caseína quinasa relacionados con estrés (CKSRP) y CKSRP de importancia para la modulación de la respuesta a una planta a un estrés ambiental. Más particularmente, a la sobreexpresión de esos ácidos nucleicos codificadores de CKSRP en una planta, que dan por resultado el aumento de tolerancia a un estrés ambiental.

En consecuencia, la presente invención incluye una célula vegetal aislada que comprende un ácido nucleico que codifica CKSRP en donde la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la célula vegetal da por resultado mayor crecimiento de la planta y/o mayor tolerancia al estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal. De preferencia, las CKSRP provienen de Physcomi trella pa íens , Sa ccharomyces cerevisiae, o Brassica napus . A saber, en la presente se describen las proteinas de Physcomi írella pa tens caseína quinasa-4 (PpCK-4 o EST 289) , de Physcomi trella pa tens caseína quinasa-1 (PpCK-1 o EST 194), de Physcomi trella pa tens caseína quinasa-2 (PpCK-2 o EST 263), de Physcomi trella pa íens proteína quinasa-4 (PpPK-4 o EST 142), de Saccharomyces cerevisiae caseína quinasa-1 (ScCK-1 o ORF 760) , de Brassica napus caseína quinasa-1 (BnCK-1) , de Brassica napus caseína quinasa-2 (BnCK-2) , de Brassica napus caseína quinasa-3 (BnCK-3), de Brassica napus caseína quinasa-4 (BnCK-4), y de Brassica napus caseína quinasa-5 (BnCK-5).

La invención provee que en algunas formas de realización los CKSRP y los ácidos nucleicos codificadores son los que se encuentran en miembros de los géneros Physcomi írella , Saccharomyces o Brassica . En otra forma de realización de preferencia, los ácidos nucleicos y polipéptidos provienen de una planta de Physcomi írella pa tens o Brassica napus o una levadura Saccharomyces cerevisiae . La invención provee que el estrés ambiental puede ser estrés por salinidad, sequía, temperatura, metal, químico, patogénico y oxidativo, o sus combinaciones. En una forma de realización de preferencia, el estrés ambiental se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste en sequia, alto contenido salino, y baja temperatura .

La invención también provee una semilla producida por una planta transgénica transformada por ácidos nucleicos codificadores de CKSRP en donde las plantas son cultivos verdaderos para aumentar la tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta.

La invención también provee un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas, partes de plantas o semillas descritas más adelante. La invención también provee un CKSRP aislado como se describe más adelante. La invención también provee un ácido nucleico codificador de CKSRP aislado en donde el ácido nucleico codificador de CKSRP codifica un CKSRP como se describe más adelante.

La invención también provee un vector de expresión recombinante aislado que comprende ácidos nucleicos codificadores de CKSRP como se describen más adelante, en donde la expresión del vector en una célula huésped da por resultado aumento de la tolerancia a un estrés ambiental comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped. La invención también provee células huésped que contienen el vector y las plantas que contienen las células huésped.

La invención también provee un método para producir plantas transgénicas con un ácido nucleico codificador de CKSRP en donde la expresión del ácido nucleico en las plantas da por resultado un aumento del crecimiento y/o incremento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificador de CKSRP y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con un incremento del crecimiento y/o incremento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. En una forma de realización de preferencia, los ácidos nucleicos codificadores de CKSRP y CKSRP son como se describe más adelante.

La presente invención también provee un método para identificar un nuevo CKSRP, que comprende (a) generar una respuesta de anticuerpo específica contra un CKSRP, o su fragmento, como se describe más adelante; (b) la búsqueda de posible material de CKSRP con el anticuerpo, en donde la fijación especifica del anticuerpo al material indica la presencia de un posible nuevo CKSRP; y (c) identificar desde el material fijado un nuevo CKSRP en comparación con los CKSRP. conocidos. Como alternativa, la hibridación con sondas de ácidos nucleicos como se describe más adelante se pueden usar para identificar los ácidos nucleicos codificadores de nuevos CKSRP.

La presente invención también provee métodos para modificar la tolerancia al estrés de una planta que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico de CKSRP en la planta, en donde el CKSRP es como se describe más adelante. La invención provee que este método se puede llevar a cabo de manera tal que la tolerancia al estrés está aumentada o disminuida. De preferencia, la tolerancia al estrés aumenta en una planta a través de la sobreexpresión de un ácido nucleico de CKSRP.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los resultados de un análisis de estrés por sequia con lineas de plantas de Arabidopsis transgénicas que sobreexpresan PpCK-1 y lineas de tipo salvaje. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran lineas transformantes individuales.

La Figura 2 muestra los resultados de un análisis de estrés por congelación con lineas de plantas de Arabidopsis transgénicas que sobreexpresan PpCK-1 y lineas de tipo salvaje. Las lineas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran lineas transformantes individuales.

La Figura 3 muestra los resultados de un análisis de estrés por sequia con lineas de plantas de Arabidopsis transgénicas que sobreexpresan PpCK-2 y lineas de tipo salvaje. Las lineas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran lineas transformantes individuales.

La Figura 4 muestra un diagrama que ilustra la homologia relativa de las caseína quinasas descritas de Physcomi írella pa íens y Saccharomyces cerevisiae y otras caseína quinasas conocidas.

La Figura 5 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las cinco caseína quinasas descritas de Physcomi írella pa íens y Saccharomyces cerevisiae con las secuencias de aminoácidos de otras caseína quinasas conocidas (SEQ ID NOS 10, 47-48, 6, 4, 2, 49-52, 8, y 53, en el orden respectivo de aparición) . Los residuos de aminoácidos conservados entre cada una de las secuencias, y los residuos de aminoácidos que son idénticos o similares en parte o la totalidad de las secuencias se indican con sombreado.

La Figura 6 muestra un diagrama que ilustra la homología relativa de las cinco caseína quinasas descritas de Physcomi írella pa íens y Saccharomyces cerevisiae con las caseína quinasas descritas de Bra ssica napus , semilla de lino, trigo, cebada, girasol y porotos de soja caseína quinasas.

La Figura 7 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de cinco caseína quinasas con la Brassica napus , semilla de lino, trigo, cebada, girasol y porotos de soja descritas. Para la correlación de ID y SEQ ID NO del gen ver Tabla A. La figura también indica la secuencia de consenso de caseína quinasa I en base a las secuencias alineadas . Los residuos de aminoácidos conservados entre cada una de las secuencias, y los residuos de aminoácidos que son idénticos o similares en parte o la totalidad de las secuencias se indican con sombreado.

Figura 8: PpPK-4, PpCK-4, PpCK-2 o PpCK-1 están sobreexpresados en Arabidopsis íhal iana bajo el control de un promotor constitutivo. Las lineas transgénicas se analizaron para uso eficiente de agua (WUE) , peso seco (DW) , y use de agua por la planta (E) relativos (% de diferencia con los controles).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se puede entender con mayor facilidad en referencia a la siguiente descripción detallada de las formas de realización de preferencia de la invención y los ejemplos que incluye. Sin embargo, antes de describir los presentes compuestos, composiciones, y métodos se debe entender que la presente invención no está limitada a ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos celulares específicos, células huésped especificas, condiciones específicas, o métodos específicos, etc., dado que obviamente pueden variar, y las numerosas modificaciones y variaciones alli serán aparentes para los expertos en el arte. También se debe entender que la terminología allí usada sólo tiene por objeto describir formas de realización especificas y no pretende ser limitante. En particular, la designación de las secuencias de aminoácido tales como "Caseína quinasa Polipéptidos relacionados con estrés" (CKSRP) , de ninguna manera limitan la funcionalidad de dichas secuencias.

La presente invención describe un nuevo género de ácidos nucleicos codificadores de CKSRP y CKSRP de importancia para modular la respuesta de una planta ante un estrés ambiental. Más particularmente, la sobreexpresión de estos ácidos nucleicos codificadores de CKSRP en una planta da por resultado el aumento tolerancia a un estrés ambiental. Miembros representativos del género CKSRP incluyen, sin limitaciones, PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, PpPK-4, ScCK-1, BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5. En una forma de realización de preferencia, todos los miembros del género son caseína quinasas biológicamente activas.

En consecuencia, la presente invención abarca secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de CKSRP y su uso para aumentar la tolerancia de una planta a un estrés ambiental. En una forma de realización, las secuencias CKSRP provienen de una planta, de preferencia una planta de Physcomi írella o una planta de Brassi ca , y con mayor preferencia una planta de Physcomi írella pa tens o una planta de Brassica napus . En otra forma de realización, las secuencias de CKSRP incluyen PpCK-1 (SEQ ID NOS : 3 y 4), PpCK-2 (SEQ ID N0S:5 y 6), PpCK-4 (SEQ ID NOS : 1 y 2), PpPK-4 (SEQ ID N0S:7 y 8), ScCK-1 (SEQ ID NOS : 9 y 10), BnCK-1 (SEQ ID NOS: 11 y 12), BnCK-2 (SEQ ID NOS:13 y 14), BnCK-3 (SEQ ID NOS:15 y 16), BnCK-4 (SEQ ID NOS:17 y 18), y BnCK-5 (SEQ ID NOS:19 y 20). Las secuencias descritas de CKSRP de Physcomi trella pa tens y la secuencia descrita de CKSRP de Saccharomyces cerevisiae tienen significativo porcentaje de identidad con las caseína quinasas conocidas, como se indica en la Tabla 1.

Tabla 1 La presente invención provee una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificador de CKSRP en donde la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la célula vegetal da por resultado un aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal. La invención también provee partes de plantas transgénicas y plantas transgénicas que contienen las células vegetales descritas en la presente. Partes de plantas incluye, sin limitaciones, tallos, raices, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, polen, microsporas, y similares. En una forma de realización, la planta transgénica es macho estéril. También se provee una semilla vegetal producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificador de CKSRP en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificador de CKSRP y en donde la planta es un cultivo verdadero para aumentar la tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención también provee una semilla producida por una planta transgénica que expresa un CKSRP, en donde la semilla contiene el CKSRP, y en donde la planta es cultivo verdadero para aumentar la tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención también provee un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas descritas más adelante, partes de plantas, y semillas de plantas. Los productos agrícolas incluyen, sin limitaciones, extractos de plantas, proteinas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares.

Tal como se usa en la presente, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas en una especie que comparte caracteres constantes que las separa de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de dicha especie. Si bien posee al menos un rasgo distintivo, una variedad también se caracteriza por tener cierta variación entre individuos entre la variedad, en base principalmente a la segregación mendeliana de rasgos entre la progenie de sucesivas generaciones. Una variedad se considera "cultivo verdadero" para un rasgo particular si es genéticamente homocigota para ese rasgo hasta el grado en que, cuando la variedad de cultivo verdadero se autopoliniza, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo se origina en la expresión transgénica de una o más secuencias de ADN introducida en una variedad vegetal.

La presente invención describe por primera vez que los CKSRP de Physcomi írella pa íens , PpCK-1, PpCK-2, PpCk-4, y PpPK-4; los CKSRP de Sa ccharomyces cerevisiae ScCK-1; y los CKSRP de Brassica napus, BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5 son útiles para aumentar la tolerancia al estrés ambiental de una planta. Tal como se usa en la presente, el término polipéptido se refiere a una cadena de al menos cuatro aminoácidos unidos por enlaces peptidicos. La cadena puede ser lineal, ramificada, circular, o sus combinaciones. En consecuencia, la presente invención provee los CKSRP aislados seleccionados de PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, PpPK-4, ScCK-1, BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5, y sus homólogos. En formas de realización de preferencia, los CKSRP se seleccionan de: 1) un polipéptido de caseína quinasa-1 (PpCK-1) Physcomi írella pa íens como se define en SEQ ID NOM), un polipéptido de caseína quinasa-2 (PpCK-2) de Physcomi trella pa tens como se define en SEQ ID NO: 6), un polipéptido de caseína quinasa-4 (PpCK-4) de Physcomi trella pa tens como se define en SEQ ID N0:1) un polipéptido de proteina quinasa-1 (PpCK-1) de Physcomi trella pa tens como se define en SEQ ID NO: 8) un polipéptido de caseína quinasa-1 (ScCK-1) Saccharomyces cerevisiae como se define en SEQ ID NO:10), un polipéptido de caseína quinasa-1 (BnCK-1) de Brassica napus como se define en SEQ ID NO: 12; un polipéptido de caseína quinasa-2 (BnCK-2) de Brassica napus como se define en SEQ ID NO: 14; un polipéptido de caseína quinasa-3 (BnCK-1) de Brassica napus como se define en SEQ ID NO: 16; un polipéptido de caseína quinasa-4 (BnCK-4) de Brassica napus como se define en SEQ ID NO: 18; un polipéptido de caseína quinasa-5 (BnCK-5) de .Brassica napus como se define en SEQ ID NO: 20; y sus homólogos y ortólogos. Los homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácido se definen más adelante.

Los CKSRP de la presente invención de preferencia se producen mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido en un vector de expresión (como se describe más adelante) , en donde el vector de expresión se introduce en una célula huésped (como se describe más adelante) y el CKSRP se expresa en la célula huésped. El CKSRP luego se puede aislar de las células por un adecuado esquema de purificación mediante técnicas estándar de purificación de polipéptido. A los fines de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que se ha alterado, reordenado, o modificado por ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, y los polinucleótidos ligados o unidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones en polinucleótidos que son resultado de eventos naturales, tales como mutaciones espontáneas. Como alternativa para la expresión recombinante, un CKSRP, o su péptido, se pueden sintetizar químicamente mediante técnicas de síntesis estándar de péptidos. Además, los CKSRP nativos se pueden aislar de células (por ejemplo, células de Physcomi trella pa tens, Saccharomyces cerevisiae, o Brassica napus) , por ejemplo mediante un anticuerpo anti-CKSRP, que se puede producir mediante las técnicas estándar que utilizan un CKSRP o su fragmento.

Tal como se usa en la presente, el término "estrés ambiental" se refiere a condiciones subóptimas asociadas con estreses de salinidad, sequia, temperatura, metal, químicos, patógenos y oxidativos, o sus combinaciones. En formas de realización de preferencia, el estrés ambiental se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste en salinidad, sequia, o temperatura, o sus combinaciones, y en particular, se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste en alta salinidad, bajo contenido de agua o baja temperatura. También se debe entender que tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "una" puede significar uno o más, según el contexto en el cual se usa. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que al menos se puede utilizar una célula. Tal como también se usa en la presente, el término "uso eficiente de agua" se refiere a la cantidad de materia orgánica producida por una planta dividido por la cantidad de agua usada por la planta en su producción, es decir, el peso seco de una planta en relación con el uso de agua por la planta .

Tal como también se usa en la presente, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a ARN o ADN lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o uno de sus híbridos. El término también incluye híbridos de ARN/ADN. Estos términos también abarcan secuencias no traducidas ubicadas en los extremos 3' y 5' de la región codificadora del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia corriente arriba del extremo 5' de la región codificadora y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de secuencia corriente debajo del extremo 3' de la región codificadora del gen. También se pueden usar bases menos comunes, tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina, y otras, para el apareamiento antisentido, dsARN, y de ribozimas. Por ejemplo, se ha demostrado que los polinucleótidos que contienen análogos de propino C-5 de uridina y citidina se unen a ARN con gran afinidad y que son poderosos inhibidores antisentido de la expresión génica. También se pueden hacer otras modificaciones, tales como la modificación del esqueleto fosfodiéster, o del 2' -hidroxi en el grupo azúcar de la ribosa del ARN. Los polinucleótidos antisentido y las ribozimas pueden consistir totalmente en ribonucleótidos, o pueden contener ribonucleótidos mixtos y desoxirribonucleótidos. Los polinucleótidos de la invención se pueden producir por cualquier medio, tal como preparaciones genómicas, preparaciones de cADN, síntesis in vi tro, RT-PCR, y transcripción in vi tro o in vivo .

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácidos nucleicos, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, las secuencias codificadoras de otros polipéptidos). De preferencia, un ácido nucleico "aislado" está libre de algunas secuencias, que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el replicón natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. En diversas formas de realización, la molécula de ácido nucleico de CKSRP aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquea la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de Physcomi írella pa íens, una célula de Sa ccharomyces cerevisiae, o una célula de Brassica napus) . Un ácido nucleico también se considera aislado si ha sido alterado por intervención humana, o ubicado en un sitio o ubicación que no es su sitio natural, o si se introduce en una célula por agroinfección . Más aún, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de cADN, puede estar libre de otro material celular con el que naturalmente se asocia, o un medio, de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Se excluyen específicamente de la definición de "ácidos nucleicos aislados" los cromosomas naturales (tales como las dispersiones de cromosomas) , las bibliotecas de cromosomas artificiales, las bibliotecas genómicas, y bibliotecas de cADN que existen como preparación m vi tro de ácido nucleico o como preparación transfectada/transformada de célula huésped, en donde las células huésped son preparaciones m vi tro heterogéneas o plaqueadas como población heterogénea de colonias únicas También se excluyen específicamente las bibliotecas anteriores en donde un ácido nucleico específico representa menos de 5% de la cantidad de inserciones de ácidos nucleicos en las moléculas de vector También se excluyen específicamente las preparaciones de ADN genómico o de ARN de células enteras (incluso las preparaciones de células enteras desgastadas mecánicamente o digeridas enzimáticamente) También específicamente se excluyen las preparaciones de células enteras que se encuentran en una preparación m vi tro o como mezcla heterogénea separada por electroforesis en donde el ácido nucleico de la invención no se ha separado de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de electroforesis (por ejemplo, por separación por escisión de una única banda de la población de bandas heterogéneas en gel de azarosa o nailon blot) .

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido de SEQ ID NO 1, SEQ ID MO: 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO" 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, o una de sus porciones, se puede aislar mediante técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia provista en la presente. Por ejemplo, se puede aislar cADN de CKSRP P . pa tens de una biblioteca de P . pa tens con la totalidad o una porción de una de las secuencias descritas en la presente. Además, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO- 19 por la reacción de cadena de pollmerasa mediante cebadores de oligonucleótidos diseñado en base a esta secuencia. Por ejemplo, se puede aislar mARN de células vegetales ( por ejemplo, por el procedimiento de extracción de tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al , 1979, Biochemistry 18 5294-5299), y se puede preparar cADN mediante transcpptasa inversa (por ejemplo, transcpptasa inversa Moloney MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD o AMV transcriptasa inversa, disponible de Seikaguku America, Inc , St Petersburg, FL) Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación por reacción en cadena de pollmerasa se pueden diseñar en base a una de las secuencias de nucleotidos mostradas en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, Y SEQ 19 Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede amplificar mediante cADN o, como alternativa, ADN genómico, como plantilla, y adecuados cebadores de oligonucleótidos de acuerdo con técnicas estándar de amplificación de PCR La molécula de ácido nucleico así amplificada se puede clonar en un vector adecuado y caracterizar por análisis de secuencia de ADN Además, se pueden preparar los oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos de CKSRP por técnicas de síntesis estándar, por ejemplo, mediante un smtetizador automático de ADN En una forma de realización de preferencia, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NOX, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 19. Estos cADN pueden comprender secuencias codificadoras de CKSRP, (es decir, la "región codificadora") , además de secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Como alternativa, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender la región codificadora de cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NOX, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, o comprender fragmentos genómicos enteros aislados del ADN genómico. La presente invención también incluye ácidos nucleicos codificadores de CKSRP que codifican los CKSRP como se describe en la presente. De preferencia, es un ácido nucleico codificador de CKSRP que codifica un CKSRP seleccionado del grupo que consiste en PpCK-1 (SEQ ID NO:4), PpCK-2 (SEQ ID NO:6), PpCK-4 (SEQ ID NOX), PpPK-4 (SEQ ID NOX), ScCK-1 (SEQ ID NO:10), BnCK-1 (SEQ ID NO:12), BnCK-2 (SEQ ID NO:14), BnCK-3 (SEQ ID N0:16), BnCK-4 (SEQ ID N0:18), y BnCK-5 (SEQ ID NO: 20) .

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una porción de la región codificadora de una de las secuencias que se muestran en SEQ ID NO:l, SEQ ID NOX, SEQ ID NO:5, SEQ ID NOX, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO:19, por ejemplo, un fragmento que se puede usar como sonda o cebador o fragmento codificador de una porción biológicamente activa de un CKSRP. Las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación de un gen de CKSRP proveniente de Physcomi trella pa íens, Sa ccharomyces cerevisiae, y Brassica napus permite generar sondas y cebadores diseñados para el uso en la identificación y/o la clonación de homólogos de CKSRP en otros tipos celulares y organismos, además de homólogos de CKSRP provenientes de otros musgos y especies relacionadas. La porción de la región codificadora también puede codificar un fragmento biológicamente activo de un CKSRP.

Tal como se usa en la presente, el término "porción biológicamente activa" de un CKSRP pretende incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo de un CKSRP que participa en la modulación de la tolerancia a estrés en una planta, y con mayor preferencia, tolerancia a sequia. A los fines de la presente invención, modulación de la tolerancia a estrés se refiere al menos al 10% de aumento o disminución de la tolerancia a estrés de una planta transgénica que comprende un cásete de expresión de CKSRP (o vector de expresión) comparado con la tolerancia a estrés de una planta control no transgénica. Los métodos para cuantificar el crecimiento y/o la tolerancia a estrés se proveen al menos en el Ejemplo 7 más adelante. En una forma de realización de preferencia, la porción biológicamente activa de un CKSRP aumenta la tolerancia de la planta a un estrés por sequia.

Las porciones biológicamente activas de un CKSRP incluyen péptidos que comprenden la secuencia de aminoácido derivada de la secuencia de aminoácidos de un CKSRP, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOX, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO:6, SEQ ID NOX, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO:20, o o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido idéntico a un CKSRP, que incluye menos aminoácidos que un CKSRP de longitud total o el polipéptido de longitud total que es idéntico a un CKSRP, y exhibe al menos una actividad de un CKSRP. En general, las porciones biológicamente activas (por ejemplo, péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de un CKSRP. Además, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas en las cuales se eliminan otras regiones del polipéptido mediante técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades descritas en la presente. De preferencia, las porciones biológicamente activas de un CKSRP incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o sus porciones con actividad biológica, por ejemplo el dominio de quinasa central conservado, como se muestra en las Figuras 5 y 7. En una forma de realización de preferencia, el dominio de quinasa central conservado comprende cuatro regiones conservadas, en donde la primera región comienza con un residuo de glicina en la posición 1 y tiene una glicina en la posición 3 y un reisuo fenilalanina en la posición 5; la segunda región se ubica corriente debajo respecto de la primera región, comienza con un residuo valina en la posición 1, y tiene una lisina en la posición 4, un residuo glutamato en la posición 6, un residuo glutamina en la posición 14, un residuo leucina en la posición 15, un residuo glutamato en la posición 18, un residuo tirosina en la posición 22, un residuo prolina en la posición 32, un residuo glicina en la posición 38, un residuo asparagina en la posición 44, un residuo leucina en las posiciones 50 y 51, un residuo glicina en la posición 52, un residuo prolina en la posición 53, un residuo leucina en la posición 55, un residuo leucina en la posición 58, un residuo fenilalanina en la posición 59, un residuo cisteina en la posición 62, un residuo fenilalanina en la posición 66, un residuo lisina en la posición 69, un residuo treonina en la posición 70, un residuo glutamina en la posición 77, un residuo isoleucina en la posición 79, un residuo histidina en la posición 86, un residuo arginina en la posición 93, un residuo ácido aspártico en la posición 94, un residuo lisina en la posición 96, un residuo prolina en la posición 97, un residuo asparagina en la posición 99, un residuo fenilalanina en la posición 100, y un residuo leucina en la posición 101; la tercera región se encuentra corriente debajo de la segunda región, que comienza con un residuo ácido aspártico en la posición 1, y tiene un residuo alanina en la posición 5, un residuo lisina en la posición 6, un residuo tirosina en la posición 8, un residuo ácido aspártico en la posición 10, un residuo treonina en la posición 13, un residuo histidina en la posición 16, un residuo isoleucina en la posición 17, un residuo prolina en la posición 18, un residuo tirosina en la posición 19, un residuo arginina en la posición 20, un residuo lisina en la posición 23, un residuo glicina en la posición 27, un residuo treonina en la posición 28, un residuo alanina en la posición 29, un residuo arginina en la posición 30, un residuo tirosina en la posición 31, un residuo serina en la posición 33, un residuo asparagina en la posición 35, un residuo histidína en la posición 37, un residuo glicina en la posición 39, un residuo glutamato en la posición 41, un residuo serina en la posición 43, un residuo arginina en la posición 44, un residuo arginina en la posición 45, un residuo ácido aspártico en la posición 46, un residuo ácido aspártico en la posición 47, un residuo glutamato en la posición 49, un residuo glicina en la posición 52, un residuo tirosina en la posición 57, un residuo fenilalanina en la posición 58, un residuo leucina en la posición 63, un residuo prolina en la posición 64, un residuo triptófano en la posición 65, un residuo glutamina en la posición 66, y un residuo glicina en la posición 67, y la cuarta región se encuentra corriente de la tercera región, comienza con un residuo prolina en la posición 1, y tiene un residuo arginina en la posición 12, un residuo leucina en la posición 14, un residuo fenilalanina en la posición 16, un residuo prolina en la posición 20, un residuo ácido aspártico en la posición 21, un residuo tirosina en la posición 22, un residuo ácido aspártico en la posición 41, un residuo ácido aspártico en la posición 45, y un residuo triptófano en la posición 46.

La invención también provee polipéptidos CKSRP quiméricos o de fusión. Tal como se usa en la presente, un "polipéptido quimérico" o "polipéptido de fusión" CKSRP comprende un CKSRP ligado operativamente a uno no CKSRP. Un CKSRP se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos correspondiente a un CKSRP, mientras que uno no CKSRP se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente idéntico a CKSRP, por ejemplo, un polipéptido diferente de CKSRP y derivado del mismo organismo o uno diferente. Respecto del polipéptido de fusión, el término "ligado operativamente" pretende indicar que el CKSRP y el no CKSRP se fusionan entres i de manera tal que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia usada. El no CKSRP se puede fusionar a N terminal o el C terminal del CKSRP, o alternativamente, los fragmentos del CKSRP tales como la región N terminal (o sus fragmentos), el dominio central (o sus fragmentos), la región C terminal (o sus fragmentos) o combinaciones de la región N terminal, el dominio central, y la región C terminal, o fragmentos de estas regiones/dominios. Por ejemplo, en una forma de realización, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión GST- CKSRP en el cual las secuencias CKSRP están fusionadas al C terminal de las secuencias GST. Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de los CKSRP recombinantes. En otra forma de realización, el polipéptido de fusión es un CKSRP que contiene una secuencia señal heteróloga en su N terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamifero), se puede aumentar la expresión y/o secreción de un CKSRP mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.

De preferencia, un polipéptido quimérico o de fusión CKSRP de la invención se produce mediante técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN codificadores de las diferentes secuencias de polipéptido se ligan entre si dentro del marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo mediante el empleo de terminales de extremos romos o escalonados para la ligación, digestión de enzimas de restricción para proporcionar terminales adecuadas, con el relleno adecuado de los extremos cohesivos, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones no deseadas y ligaduras enzimáticas. En otra forma de realización, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales tales como sintetizadores automáticos de ADN. Como alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos de gen se puede llevar a cabo mediante cebadores de anclaje que dan origen a superposiciones complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que luego se pueden fusionar y reamplificar para generar una secuencia de genes quiméricas (Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons, 1992) . Además, muchos vectores de expresión disponibles en el comercio ya codifican un residuo de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico codificador de CKSRP se puede clonar en un vector de expresión de manera tal que el residuo de fusión se liga dentro del marco con CKSRP.

Además de los fragmentos y polipéptidos de fusión del CKSRP descrito en la presente, la presente invención incluye homólogos y análogos de CKSRP y CKSRP naturales codificados por los ácidos nucleicos de una planta. "Homólogos" se define en la presente como dos ácidos nucleicos o polipéptidos con similares, o "idénticas" secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, paralogos, agonistas, y antagonistas de CKSRP como se define más adelante. El término "homólogo" también abarca las moléculas de ácidos nucleicos que difieren de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID N0:1, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:13, SEQ ID NOX5, SEQ ID NO:17, y SEQ ID NO:19 (y sus porciones) debido a la degeneración del código genético y en consecuencia codifica el mismo CKSRP que el codificado por las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO:l, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, o SEQ ID NO:19. Por ejemplo, se describen los homólogos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NOX3, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, o SEQ ID NO:19 en SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 76.

Tal como se usa en la presente, un CKSRP "natural" se refiere a una secuencia de aminoácidos que aparece en la naturaleza. De preferencia, un CKSRP natural comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX0, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0X4, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, y SEQ ID NO:20.

Un agonista del CKSRP puede retener sustancialmente las mismas, o un subconjunto, de las actividades biológicas de CKSRP. Un antagonista de CKSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma natural de CKSRP. Por ejemplo, el antagonista CKSRP se puede unir competitivamente a un elemento corriente abajo o corriente arriba de la cascada metabólica de componentes de la membrana celular que incluye el CKSRP, o se une a CKSRP que media el transporte de compuestos a través de dichas membranas, por lo que impide que ocurra translocación.

Las moléculas de ácidos nucleicos correspondientes a las variantes alélicas naturales y los análogos, ortólogos, y paralogos de un cADN de CKSRP se puede aislar en base a su identidad con los ácidos nucleicos de CKSRP de Physcomi trella pa tens, Saccharomyces cerevisiae, o Brassica napus descritos en la presente mediante los cADN de CKSRP, o una de sus porciones, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones rigurosas de hibridación. En una forma alternativa de realización, los homólogos de CKSRP se pueden identificar mediante bibliotecas de búsqueda combinatoria de mutantes, por ejemplo, mutantes por truncación, de CKSRP para la actividad agonista o antagonista de CKSRP. En una forma de realización, se genera una biblioteca variada de variantes de CKSRP por mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y es codificado por una biblioteca de genes variados. Se puede producir una biblioteca variada de variantes de CKSRP, por ejemplo, por ligadura enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos con secuencias génicas tales como un conjunto degenerado de posibles secuencias de CKSRP donde se expresa como polipéptidos individuales, o como alternativa, con conjunto de polipéptidos por fusión más grandes (por ejemplo, por despliegue de fago) que contienen el conjunto de secuencias de CKSRP. Se puede usar una variedad de métodos para producir bibliotecas de posibles homólogos de CKSRP a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador automático de ADN, y luego se liga el gen sintético en un adecuado vector de expresión. El uso de un conjunto degenerado de genes permite proveer, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de posibles secuencias de CKSRP. Los métodos para sintetizar los oligonucleótidos degenerados se conocen en el arte (ver, por ejemplo, Narang, S.A., 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983, Nucleic Acid Res. 11:477).

Además, las bibliotecas de los fragmentos de las regiones codificadoras de CKSRP se pueden usar para generar una población variada de fragmentos de CKSRP para la búsqueda y posterior selección de homólogos de un CKSRP. En una forma de realización, se puede generar una biblioteca de fragmentos codificadores de secuencia por tratamiento de un fragmento bicatenario de PCR de una secuencia codificadora de CKSRP con una nucleasa en condiciones en las cuales sólo se producen muescas aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizar el ADN, renaturalizar el ADN para formar ADN bicatenario, lo cual puede incluir pares con sentido/antisentido de distintos productos con muescas, eliminar porciones monocatenarias de dobletes reformados por tratamiento con SI nucleasa, y ligar la biblioteca de fragmentos obtenida en un vector de expresión. Por este método se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica el N terminal, el C terminal, y los fragmentos internos de diversos tamaños de CKSRP.

En el arte se conocen diversas técnicas para analizar los productos génicos de bibliotecas combinatorias formadas por mutaciones puntuales o truncación, y para analizar bibliotecas de cADN por productos génicos con una propiedad seleccionada. Dichas técnicas se adaptan para la búsqueda rápida de las bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatoria de homólogos de CKSRP. Las técnicas más ampliamente usadas, susceptibles de dicho análisis, para el análisis de grandes bibliotecas génicas en general incluye la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, para transformar adecuadas células con la biblioteca de vectores obtenida, y expresa los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad buscada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de ensamblado recursivo (REM) , una técnica que aumenta la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de búsqueda para identificar los homólogos de CKSRP (Arkin y Yourvan, 1992, PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Polipeptide Engineering 6 (3) : 327-331) . En otra forma de realización, se puede aprovechar los ensayos basados en células, con el fin de analizar una biblioteca variada de CKSRP, mediante métodos bien conocidos en el arte. La presente invención también provee un método para identificar un nuevo CKSRP, que comprende a) generar una respuesta especifica de anticuerpo contra un CKSRP, o uno de sus fragmentos, como se describe en la presente; b) analizar el posible material de CKSRP con el anticuerpo, en donde la unión especifica del anticuerpo con el material indica la presencia de un posible nuevo CKSRP; y c) analizar el material fijado en comparación con los CKSRP conocidos, para determinar su novedad.

Tal como se estableció con anterioridad, la presente invención incluye CKSRP y sus homólogos. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX0, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, y SEQ ID NOXO, y una de sus formas mutantes), las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir brechas en la secuencia de un polipéptido para la alineación óptima con el otro polipéptido o ácido nucleico) . Luego se comparan los residuos de aminoácido en las correspondientes posiciones de aminoácido. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, y SEQ ID NOXO) está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la correspondiente posición en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de la secuencia de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO), entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Se puede realizar el mismo tipo de comparación entre dos secuencias de ácidos nucleicos .

El porcentaje de identidad de secuencia entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencia = cantidad de posiciones idénticas/cantidad total de posiciones x 100). De preferencia, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención tienen al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con mayor preferencia aún al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o más identidad con toda una secuencia de aminoácidos mostrados en los residuos 2-304 de SEQ ID NO , los residuos 77-368 de SEQ ID NOX, los residuos 2-294 de SEQ ID NOX, los residuos 77-368 de SEQ ID NOX, los residuos 77-336 de SEQ ID NOXO, los residuos 1-296 de SEQ ID NOX2, los residuos 1-296 de SEQ ID NOX4, los residuos 5-300 de SEQ ID NOX6, los residuos 1-295 de SEQ ID NOX8, o los residuos 25-327 de SEQ ID NOXO. En otra forma de realización, el homólogo de aminoácidos aislado de la presente invención es codificado por un ácido nucleico como definen los nucleótidos en las posiciones 4 a 912 de SEQ ID NO , los nucleótidos en las posiciones 229 a 1104 de SEQ ID NOX, los nucleótidos en las posiciones 4 a 882 de SEQ ID NOX, los nucleótidos en las posiciones 229 a 1104 de SEQ ID NOX, los nucleótidos en las posiciones 229 a 1008 de SEQ ID NOX, los nucleótidos en las posiciones 1 a 888 de SEQ ID NO: 11, los nucleótidos en las posiciones 1 a 888 de SEQ ID NOX3, los nucleótidos en las posiciones 13 a 900 de SEQ ID NOX5, los nucleótidos en las posiciones 1 a 885 de SEQ ID NO: 17, o los nucleótidos en las posiciones 73 a 981 de SEQ ID NOX9.

En otra forma de realización de preferencia, los homólogos aislados de los ácidos nucleicos incluidos en la presente invención tienen al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con mayor preferencia aún al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor identidad con toda una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NOXO. Por ejemplo, los homólogos de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, SEQ ID NOXO se describen en SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 77.

En aún otra forma de realización, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención tienen al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con mayor preferencia aún al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor identidad con toda una secuencia de aminoácidos codificados por una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, SEQ ID NOX9 o sus homólogos, por ejemplo, como se especifica en SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74 o SEQ ID NO: 76.

En otras formas de realización, los aminoácidos homólogos de CKSRP tienen identidad de secuencia en al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, con mayor preferencia al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, y con mayor preferencia al menos 35 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NOXO o con homólogos de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOX, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NO:12, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, SEQ ID NOXO como se describe en SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 77.

En otra forma de realización de preferencia, un homólogo aislado de ácidos nucleicos de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 40-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con mayor preferencia aún al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más identidad con una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 19, o con una porción que comprende al menos 60 de sus nucleótidos consecutivos. La comparación de longitud de secuencia de preferencia para ácidos nucleicos es de al menos 75 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 100 nucleótidos, y con mayor preferencia aún la longitud total de la región codificadora. Es aún más preferible que los homólogos de ácidos nucleicos codifican proteinas con homologia con SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO en el dominio central de quinasa mostrado en las Figuras 5 y 7.

También se prefiere que el homólogo de ácidos nucleicos aislados de la invención codifica un CKSRP, o una de sus porciones, que es al menos 70% idéntica con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO y que actúa como modulador de crecimiento y/o de una respuesta de estrés ambiental en una planta. En una forma de realización de mayor preferencia, la sobreexpresión del homólogo del ácido nucleico en una planta aumenta el crecimiento y la tolerancia de la planta a un estrés ambiental. En otra forma de realización de preferencia, el homólogo de ácido nucleico codifica un CKSRP que actúa como caseína quinasa.

A los fines de la invención, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos o polipeptidicas se determina con el paquete de software Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Se usa una tolerancia de apertura de brecha de 15 y una tolerancia de extensión de brecha de 6, 66 para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos. Se usa una tolerancia de apertura de brecha de 10 y una tolerancia de extensión de brecha de 0,1 para determinar el porcentaje de identidad de dos polipéptidos. Todos los demás parámetros se fijan con valores predeterminados. A los fines de una alineación múltiple (algoritmo Clustal W) , la tolerancia de apertura de brecha de 10, y la tolerancia de extensión de brecha es de 0,05 con la matriz blosum62. Se debe entender que a los fines de determinar la identidad de secuencia cuando se compara una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo.

En otro aspecto, la invención provee un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que hibrida el polinucleótido de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NO: 19 en condiciones rigurosas. Más particularmente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones rigurosas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NOX9. En otras formas de realización, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250, o más nucleótidos de longitud. De preferencia, un homólogo de un ácido nucleico aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad a las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NOX5, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO : 19 y actúa como modulador de tolerancia de estrés en una planta. En otra forma de realización de preferencia, la sobreexpresión del homólogo de ácido nucleico aislado en una planta aumenta el crecimiento de una planta y tolerancia a un estrés ambiental. En una forma de realización de aún mayor preferencia, el homólogo de ácido nucleico aislado codifica un CKSRP que actúa como caseína quinasa .

Tal como se usa en la presente respecto de la hibridación para ADN en un ADN blot, el término "condiciones rigurosas" se refiere a la hibridación durante la noche a 60°C en solución 10X de Denhart, 6X SSC, 0,5% SDS, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los blots se lavan en secuencia a 62 °C durante 30 minutos cada vez en 3X SSC/0,1% SDS, seguido de IX SSC/0,1% SDS, y por último 0,1X SSC/0,1% SDS. En una forma de realización de preferencia, la frase "condiciones rigurosas" se refiere a hibridación en una solución 6X SSC a 65°C. Tal como también se usa en la presente, "condiciones muy rigurosas" se refiere a hibridación durante la noche a 65°C en solución 10X de Denhart, 6X SSC, 0,5% SDS, y 100 µg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los blots se lavan en secuencia a 65°C durante 30 minutos cada vez en 3X SSC/0,1% SDS, seguido de IX SSC/0,1% SDS, y finalmente 0,1X SSC/0,1% SDS. Los métodos para las hibridaciones de ácidos nucleicos se describen en Meinkoth y Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al. Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 1995; y Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, Nueva York, 1993. De preferencia, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que se hibrida en condiciones rigurosas o muy rigurosas a una secuencia de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID N0X7, o SEQ ID NO: 19 corresponde a una molécula natural de ácido nucleico. Tal como se usa en la presente, una molécula "natural" de ácido nucleico se refiere a una molécula de ARN o ADN con una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, que codifica un polipéptido natural) . En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica un CKSRP de Physcomi trella pa tens, un CKSRP de Sa ccharomyces cerevisiae, o un CKSRP de Brassica napus .

Mediante los métodos antes descritos, y otros conocidos por los expertos en el arte, un experto en el arte puede aislar homólogos de los CKSRP que comprenden las secuencias de aminoácido mostrados en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NO:14, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, SEQ ID NOXO. Dichos homólogos se especifican por ejemplo en SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 77.

La Tabla A correlaciona el gen ID con SEQ ID NO en el listado de secuencia. Tabla A Tal como se usa en la presente, el término "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de un CKSRP y que existen en una población natural (por ejemplo, una especie o variedad vegetal) . Dichas variaciones alélicas naturales en general resultan en un 1-5% de varianza en un ácido nucleico de CKSRP. Las variantes alélicas se pueden identificar mediante la determinación de la secuencia de los ácidos nucleicos de interés en varias plantas diferentes, lo cual se puede realizar con facilidad mediante sondas de hibridación a fin de identificar el mismo sitio genético de CKSRP en esas plantas. Todas estas variaciones de ácidos nucleicos y los resultantes polimorfismos o variaciones de aminoácidos en un CKSRP que son consecuencia de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de un CKSRP, se pretenden abarcar en el alcance de la invención.

Además, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican CKSRP a partir de la misma especie u otras especies tales como análogos, ortólogos, y paralogos de CKSRP, pretenden incluirse en el alcance de la presente invención. Tal como se usa en la presente, el término "análogos" se refiere a dos ácidos nucleicos con función igual o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. Tal como se usa en la presente, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de diferentes especies, pero que han evolucionado de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos con funciones iguales o similares. Tal como también se usa en la presente, el término "paralogos" se refiere a dos ácidos nucleicos relacionados por duplicación en un genoma. Los paralogos por lo general tienen distintas <. funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas (Tatusov, R.L. et al., 1997, Science 278 (5338 ): 631-637 ) . Los análogos, ortólogos, y paralogos de un CKSRP natural pueden diferir del CKSRP natural por modificaciones posteriores a la ¡0 traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambos. Las modificaciones posteriores a la traducción incluyen la derivación química in vivo e in vi tro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, o 15 glicosilación, y dichas modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o el procesamiento de polipéptidos o después del tratamiento con enzimas modificadoras aisladas. En particular, los ortólogos de la invención generalmente exhiben al menos 80-85%, con Q mayor preferencia, 85-90% o 90-95%, y con mayor preferencia aún 95%, 96%, 97%, 98%, o incluso 99% de identidad, o 100% de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de una secuencia de aminoácidos de CKSRP, y exhibe una función similar a un CKSRP. De preferencia, un ortólogo de CKSRP de la presente invención actúa como modulador de respuesta a estrés ambiental en una planta y/o actúa como caseína quinasa. Con mayor preferencia, un ortólogo de CKSRP aumenta la tolerancia a estrés de una planta. En una forma de realización, los ortólogos de CKSRP mantienen la capacidad de participar en el metabolismo de los compuestos necesarios para la construcción de las membranas celulares en una planta, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas.

Además de las variantes naturales de una secuencia de CKSRP que pueden existir en la población, el artesano experto apreciará también que se pueden introducir cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NOX9, lo cual conduce a cambios en la secuencia de aminoácido del CKSRP codificado, sin alterar la actividad funcionales de CKSRP. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos "no esenciales" de aminoácidos en una secuencia de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NOX9. Un residuo "no esencial" de aminoácidos es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo salvaje de un CKSRP sin alterar la actividad de dicho CKSRP, mientras que un residuo "esencial" de aminoácido es requerido para la actividad de CKSRP. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo, (por ejemplo, los no conservados o sólo semiconservados en el dominio con actividad CKSRP) pueden no ser esenciales para la actividad y el consecuencia pueden ser susceptibles a alteración sin alterar la actividad de CKSRP.

En consecuencia, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican CKSRP que contienen cambios en los residuos de aminoácido no esenciales para la actividad de CKSRP. Dichos CKSRP difieren en secuencia de aminoácidos respecto de una secuencia contenida en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NOXO, aunque retienen al menos una de las actividades de CKSRP descritas en la presente. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 50% de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO. De preferencia, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico tiene al menos aproximadamente 50-60% de identidad con la región central de proteina quinasa de una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO, con mayor preferencia al menos aproximadamente 60-70% de identidad con la región central de proteina quinasa de una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO, con aún mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95% de identidad con la región central de proteina quinasa de una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID N0X6, SEQ ID N0X8, o SEQ ID NOXO, y con mayor preferencia aún al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la región central de proteina quinasa de una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO. En otra forma de realización, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico tiene al menos aproximadamente 50-60% de identidad con una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NOXO, con mayor preferencia al menos aproximadamente 60-70% de identidad con una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO, con aún mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95% de identidad con una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID N0X4, SEQ ID N0X6, SEQ ID N0X8, o SEQ ID NOXO. Los homólogos de CKSRP de preferencia de la presente invención de preferencia participan en la respuesta de tolerancia a estrés en una planta, o más particularmente, participan en la transcripción de un polipéptido que interviene en una respuesta de tolerancia a estrés en una planta, y/o actúa como caseína quinasa.

Se puede crear una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un CKSRP con identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NOXO al introducir una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NO: 19, respectivamente, de manera tal que se introducen una o más sustituciones, adiciones, o deleciones de aminoácidos en el polipéptido codificado. Se pueden introducir mutaciones en una de las secuencias de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NOX9 mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. De preferencia, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno a más residuos previstos de aminoácidos no esenciales. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo aminoácido con una cadena lateral similar.

Las familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares se han definido en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . En consecuencia, un residuo previsto de aminoácido no esencial en un CKSRP de preferencia es reemplazado por otro residuo de aminoácido proveniente de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, en otra forma de realización, se pueden introducir mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o partes de una secuencia codificadora de CKSRP, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden analizar para la actividad de CKSRP descrita en la presente, con el fin de identificar los mutantes que retienen la actividad de CKSRP. Después de la mutagénesis de la secuencia de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NOX9, el polipéptido codificado se puede expresar por recombinación y la actividad del polipéptido se puede determinar por análisis del crecimiento y/o la tolerancia a estrés ambiental de una planta que expresa el polipéptido, como se describe en el Ejemplo 7.

Además, se pueden crear ácidos nucleicos optimizados de CKSRP. De preferencia, un ácido nucleico optimizado de CKSRP codifica un CKSRP que modula el crecimiento de una planta y/o la tolerancia de una planta a un estrés ambiental, y con mayor preferencia aumenta el crecimiento de una planta y/o la tolerancia a un estrés ambiental tras su sobreexpresión en la planta. Tal como se usa en la presente, "optimizado" se refiere a un ácido nucleico sometido a ingeniería genética para aumentar su expresión en determinad planta o animal. Para proveer ácidos nucleicos optimizados de CKSRP vegetales, se puede modificar la secuencia de ADN de un gen a fin de: 1) comprender codones preferidos por los genes vegetales con alta expresión; 2) comprender un mayor contenido de A+T de composición de bases de nucleótido respecto de la sustancialmente hallada en plantas; 3) formar una secuencia de iniciación vegetal; o 4) eliminar secuencias que causen desestabilización, poliadenilación inadecuada, degradación y terminación de ARN, o que formen horquillas de estructuras secundarias o sitios de empalme de ARN. Se puede lograr la mayor expresión de ácidos nucleicos de CKSRP en plantas al utilizar la frecuencia de distribución de uso de codones en las plantas en general o en una planta particular. Los métodos para optimizar la expresión de ácidos nucleicos en plantas se pueden hallar en EPA 0359472; EPA 0385962; Solicitud de PCT NX WO 91/16432; patente de los Estados Unidos NX 5.380.831; patente de los Estados Unidos NX 5.436.391; Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328; y Murray et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17: 477-498.

Tal como se usa en la presente, "frecuencia de preferencia de uso de codón" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped especifica por el uso de codones de nucleótido para especificar determinado aminoácido. A fin de determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, se divide la cantidad de apariciones de dicho codón en el gen por la cantidad total de apariciones de todos los codones que especifican el mismo aminoácido en el gen. De modo similar, se puede calcular la frecuencia de la preferencia de uso de codón exhibida por una célula huésped, al promediar la frecuencia de preferencia de uso de codón en gran cantidad de genes expresados por la célula huésped. De preferencia, se limita este análisis a los genes con alta expresión en la célula huésped. La desviación porcentual de la frecuencia de preferencia de uso de codón para un gen sintético respecto del empleado por una célula huésped se calcula primero a través de la determinación de la desviación porcentual de la frecuencia de uso de un único codón respecto del de la célula huésped, seguido de obtener la desviación promedio para todos los codones. Tal como se define en la presente, este cálculo incluye codones singulares (es decir, ATG y TGG) . En términos generales, la desviación promedio global de uso del codón de un gen optimizado, respecto del de una célula huésped se calcula mediante la ecuación ÍA = n = 1 Z Xn - Yn Xn por 100 Z en donde Xn = frecuencia de uso del codón en la célula huésped; Yn = frecuencia de uso del codón n en el gen sintético; n representa un codón individual que especifica un aminoácido; y la cantidad total de codones es Z. La desviación global de frecuencia de uso de codón, A, para todos los aminoácidos de preferencia debería ser inferior a aproximadamente 25%, y con mayor preferencia inferior a aproximadamente 10%.

En consecuencia, se puede optimizar un ácido nucleico de CKSRP de manera tal que su frecuencia de distribución de uso de codones no se desvie, de preferencia, más del 25% respecto de los genes de las plantas con alta expresión y, con mayor preferencia, no más de aproximadamente 10%. Además, se considera el porcentaje del contenido de G+C de la tercera base degenerada (las monocotiledóneas parecen preferir G+C en esta posición, a diferencia de las dicotiledóneas). También se reconoce que el nucleótido XCG (en donde X es A, T, C, o G) es el codón de menor preferencia en dicotiledóneas, mientras que el codón XTA se evita en monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos optimizados de CKSRP de la presente invención también de preferencia tienen índices de evitación de dobletes de CG y TA muy cercanos a los de la planta huésped elegida (por ejemplo, Physcomi trel la pa íens, Brassica napus, Gl icina max, o Oryza sa íiva ) . Con mayor preferencia, estos índices se desvian respecto de los del huésped en no más de aproximadamente 10-15%.

Además de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los CKSRP descritos antes, otro aspecto de la presente invención se refiere a las moléculas aisladas de ácidos nucleicos que son antisentido a ellos. Los polinucleótidos antisentido parecen inhibir la expresión génica de un polinucleótido blanco por unión especifica con el polinucleótido blanco e interferir con la transcripción, el empalme, el transporte, la traducción, y/o la estabilidad del polinucleótido blanco. Se describen métodos en el arte previo para dirigir el polinucleótido antisentido al ADN del cromosoma, a una transcripción primaria de ARN, o a un mARN procesado. De preferencia, las regiones blanco incluyen sitios de empalme, codones de inicio de la traducción, codones de terminación de la traducción, y otras secuencias dentro del marco de lectura abierto.

El término "antisentido" a los fines de la invención, se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido con suficiente complementariedad con la totalidad o una porción de un gen, transcripción primaria, o mARN procesado, como para interferir con la expresión del gen endógeno. Los polinucleótidos "complementarios" son los con capacidad para aparear sus bases de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Específicamente, las purinas se aparean por las bases con las pirimidinas, para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con timina (A:T) en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleótidos se pueden hibridar entre sí aún si no tienen complementariedad completa entre ellas, siempre que cada una tenga al menos una región que es sustancialmente complementaria con la otra. El término "ácido nucleico antisentido" incluye casetes de expresión de ARN monocatenario y de ADN bicatenario que se pueden transcribir para obtener un ARN antisentido. Los ácidos nucleicos antisentido "activos" son moléculas de ARN antisentido capaces de hibridarse selectivamente con una transcripción primaria o mARN que codifica un polipéptido con al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO.

El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a toda una cadena codificadora de CKSRP, o sólo a una porción de ella. En una forma de realización, una molécula antisentido de ácido nucleico es antisentido respecto de una "región codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica un CKSRP. El término "región codificadora" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen a residuos de aminoácidos. En otra forma de realización, la molécula antisentido de ácido nucleico es antisentido a una "región no codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica un CKSRP. El término "región no codificadora" se refiere secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora no traducida a aminoácidos (es decir, también denominadas regiones 5' y 3' no traducidas) . La molécula antisentido de ácido nucleico puede ser complementaria a toda la región codificadora de mARN de CKSRP, pero con mayor preferencia es un oligonucleótido que es antisentido sólo a una porción de la región codificadora o no codificadora del mARN de CKSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del mARN de CKSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 nucleótidos de longitud. En general, las moléculas antisentido de la presente invención comprenden un ARN con 60-100% de identidad de secuencia con al menos 14 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NOX9, o o un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO. De preferencia, la identidad de secuencia será de al menos 70%, con mayor preferencia al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98%, y con mayor preferencia aún de 99%.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención se pueden construir mediante reacciones de síntesis química y ligadura enzimática mediante procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) mediante nucleótidos naturales o nucleótidos con diversas modificaciones, diseñadas para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o aumentar la estabilidad fisica del doblete formado entre los ácidos nucleicos antisentido y con sentido, por ejemplo, se pueden usar nucleótidos derivados de fosforotioato y sustituidos con acridina.

Entre los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar el ácido nucleico antisentido se incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetolaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanine, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometi1-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metilico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5- metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil ) uracilo, (acp3)w, y 2 , 6-diaminopurina . Como alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente mediante un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (es decir, el ARN transcripto a partir del ácido nucleico insertado tendrá orientación antisentido respecto de un ácido nucleico blanco de interés, descrito mejor en la siguiente subsección) .

En aún otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el cual, a diferencia de las habituales unidades ß, las cadenas transcurren paralelas entre sí (Gaultier et al., 1987, Ácido nucleicos. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2 ' -o-metilribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15:6131-6148) o un análogo quimérico ARN-ADN (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330) .

Las moléculas antisentido de ácidos nucleicos de la invención se administran en general a una célula o se generan in si íu , de manera tal que se hibridan o se unen al mARN celular y/o el ADN genómico que codifica un CKSRP y asi inhiben la expresión del polipéptido, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad convencional de nucleótidos para formar un doblete estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula antisentido de ácido nucleico que se une a los dobletes de ADN, a través de especificas interacciones en la cavidad principal de la doble hélice. La molécula antisentido se puede modificar de manera tal que se une específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, por unión de la molécula antisentido de ácido nucleico a un péptido o un anticuerpo que se une a un receptor de superficie celular o antígeno. La molécula antisentido de ácido nucleico también se puede entregar a las células mediante los vectores descritos en la presente. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vector en las cuales la molécula antisentido de ácido nucleico se coloca bajo el control de un fuerte promotor procarionte, viral, o eucarionte (incluso vegetal) .

Como alternativa a los polinucleótidos antisentido se pueden usar ribozimas, polinucleótidos con sentido, o ARN bicatenario (dsARN) para reducir la expresión de un polipéptido CKSRP. Tal como se usa en la presente, el término "ribozima" se refiere a una enzima catalítica con base de ARN con actividad de ribonucleasa, que es capaz de escindir un ácido nucleico monocatenario, por ejemplo un mARN, con el cual tiene región complementaria. Las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas en cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334:585-591) se pueden usar para escindir catalíticamente las transcripciones de mARN de CKSRP y asi inhibir la traducción de mARN de CKSRP. Se puede diseñar una ribozima con especificidad por un ácido nucleico codificador de CKSRP, en base a la secuencia de nucleótidos de un cADN de CKSRP, como se describe en la presente (es decir, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID N0X3, SEQ ID N0X5, SEQ ID N0X7, o SEQ ID N0X9) o en base de una secuencia heteróloga aislada de acuerdo con métodos enseñados en la presente invención. Por ejemplo, se puede construir un derivado de ARN de Teírahymena L-19 IVS en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementario a la secuencia de nucleótidos escindida en un mARN que codifica CKSRP. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.os 4.987.071 y 5.116.742 de Cech et al. Como alternativa, se puede usar mARN de CKSRP para seleccionar un ARN catalítico con actividad especifica de ribonucleasa proveniente de un pool de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W., 1993, Science 261:1411-1418. En formas de realización de preferencia, la ribozima contiene una porción con al menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 nucleótidos, y con mayor preferencia 7 o 8 nucleótidos, con 100% de complementariedad con una porción del ARN blanco. Los métodos para preparar ribozimas con conocidos por los expertos en el arte. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N . os 6.025.167; 5.773.260; y 5.496.698.

El término "dsARN," tal como se usa en la presente, se refiere a híbridos de ARN que comprenden dos cadenas de ARN. Los dsARN pueden ser lineales o circulares en estructura. En una forma de realización de preferencia, el dsARN es especifico para un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID N0X2, SEQ ID NOX4, SEQ ID N0X6, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NOXO, o un polipéptido con al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO en el dominio central de proteína quinasa. Los ARN hibridados pueden ser sustancialmente o completamente complementarios. Por "sustancialmente complementarios" se entiende que cuando dos ARN hibridados se alinean óptimamente mediante el programa BLAST como se describió antes, las porciones hibridadas son al menos 95% complementarias. De preferencia, el dsARN tendrá al menos 100 pares de bases de longitud. En general, los ARN hibridados serán de idéntica longitud, sin sobrantes en los extremos 5' o 3' y sin brechas. Sin embargo, se pueden usar los dsARN con sobrantes 5' o 3' de hasta 100 nucleótidos en los métodos de la invención.

Los dsARN pueden comprender ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos tales como residuos 2'-0-metilribosilo, o sus combinaciones. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.os 4.130.641 y 4.024.222. Se describe un dsARN de ácido polirriboinosinico : ácido polirribocitidilico en la patente de los Estados Unidos N.° 4.283.393. Los métodos para preparar y usar dsARN son conocidos en el arte. Un método comprende la transcripción simultánea de dos cadenas complementarias de ADN, in vivo, o una mezcla de reacción única in vi tro . Ver , por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 5.795.715. En una forma de realización, se puede introducir dsARN en una planta o célula vegetal directamente por procedimientos estándar de transformación. Como alternativa, se puede expresar dsARN en una célula al transcribir dos ARN complementarios.

Otros métodos para la inhibición de la expresión de genes endógenos, tal como la formación de triple hélice (Moser et al., 1987, Science 238:645-650 y Cooney et al., 1988, Science 241:456-459) y cosupresión (Napoli et al., 1990, The Plant Cell 2:279-289) son conocidos en el arte. Se han usado cADN de longitud total y parcial para la cosupresión de genes vegetales endógenos. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.os 4.801.340, 5.034.323, 5.231.020, y 5.283.184; Van der Kroll et al., 1990, The Plant Cell 2:291-299; Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genetics 224:477-481; y Napoli et al., 1990, The Plant Cell 2:279-289.

Para la supresión con sentido, se cree que la introducción de un polinucleótido con sentido bloquea la transcripción del correspondiente gen blanco. El polinucleótido con sentido tendrá al menos 65% de identidad de secuencia con el gen vegetal blanco o ARN. De preferencia, el porcentaje de identidad es al menos 80%, 90%, 95%, o mayor. El polinucleótido con sentido introducido no necesita tener la longitud total respecto del gen o transcripción blanco. De preferencia, el polinucleótido con sentido tendrá al menos 65% de identidad de secuencia con al menos 100 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID N0X3, SEQ ID N0X5, SEQ ID N0X7, o SEQ ID NO: 19. Las regiones de identidad pueden comprender intrones y/o exones y regiones no traducidas. El polinucleótido con sentido introducido puede estar presentes en la célula vegetal en forma transitoria, o se puede integrar en forma estable en un cromosoma vegetal o un replicón extracromosómico.

Como alternativa, se puede inhibir la expresión del gen de CKSRP al dirigir las secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleótidos de CKSRP (por ejemplo, un promotor y/o incentivador de CKSRP) para formar estructuras triples helicoidales que impiden la transcripción de un gen de CKSRP en las células blanco. Ver en general, Helene, C, 1991, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J., 1992, Bioassays 14 ( 12 ): 807-15.

Además de los ácidos nucleicos de CKSRP y los polipéptidos antes descritos, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y polipéptidos adosados a un residuo. Estos residuos incluyen, sin limitaciones, residuos de detección, residuos de hibridación, residuos de purificación, residuos de provisión, residuos de reacción, residuos de fijación, y similares. Un grupo tipico de ácidos nucleicos con residuos adosados son las sondas y los cebadores. En general, las sondas y los cebadores comprenden un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido en general comprende una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas al menos a aproximadamente 12, de preferencia aproximadamente 25, con mayor preferencia aproximadamente 40, 50, o 75 nucleótidos consecutivos de una cadena con sentido de la secuencia establecida en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 19; una secuencia antisentido de la secuencia establecida en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 19; o sus mutantes naturales. Los cebadores basados en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NO , SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX1, SEQ ID NOX3, SEQ ID NOX5, SEQ ID NOX7, o SEQ ID NOX9 se pueden usar en reacciones de PCR para clonar homólogos de CKSRP. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de CKSRP se pueden usar para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifican polipéptidos iguales o sustancialmente idénticos. En formas de realización de preferencia, la sonda también comprende un grupo de rótulo adosado, por ejemplo, el grupo de rótulo puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima. Dichas sondas se pueden usar como parte de un equipo de prueba de marcador genómico para identificar las células que expresan un CKSRP, por ejemplo al medir un nivel de un ácido nucleico codificador de CKSRP, en una muestra de células, por ejemplo, para detectar niveles de mARN de CKSRP o determinar si un gen genómico de CKSRP ha sido mutado o eliminado.

En particular, un método útil para asegurar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mARN disponible para la traducción del producto génico) consiste en realizar Northern blot (como referencia ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) . La información del Northern blot demuestra al menos en parte el grado de transcripción del gen transformado. Se puede preparar ARN celular total a partir de células, tejidos u órganos por varios métodos, todos bien conocidos en el arte, como los descritos en Bormann, E.R. et al., 1992, Mol. Microbiol. 6:317-326. Para evaluar la presencia o cantidad relativa de un polipéptido traducido de este mARN, se pueden emplear técnicas estándar, tales como Western blot. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en el arte. (Ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York) .

La invención también provee un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de CKSRP como se describió antes, en donde la expresión del vector en una célula huésped da por resultado la tolerancia a estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped. Tal como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido," que se refiere a un lazo de ADN circular bicatenario en el cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula huésped a la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos con origen de replicación bacteriana y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamifero) se integran en el genoma de la célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y en consecuencia son replicados junto con el genoma del huésped. Además ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente "vectores de expresión." En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se pueden usar indistintamente, dado que el plásmido es la forma de uso más común de vector. Sin embargo, la invención también pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus con replicación defectuosa, adenovirus, y virus adenoasociados ) , que tiene funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras seleccionadas en base a las células huésped que se usan para la expresión, que están ligados operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que se desea expresar. Tal como se usa en la presente con respecto a un vector de expresión recombinante, "ligado operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vi tro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped) . El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, incentivadores, y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick y Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Ratón, Florida, incluidas sus referencias. Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y los que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células huésped o en ciertas condiciones. Los expertos en el arte apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se desea transformar el nivel de expresión del polipéptido buscado, etc. El vector de expresión de la invención se puede introducir en células huésped, para asi producir polipéptidos o péptidos, incluso polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en la presente (por ejemplo, CKSRP, formas mutantes de CKSRP, polipéptidos de fusión, etc. ) .

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de CKSRP en células procariontes o eucariontes. Por ejemplo, se pueden expresar los genes de CKSRP en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insectos (con vector de expresión de baculovirus), levaduras y otras células fúngicas (Ver Romanos, M.A. et al., 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C. A.M. J.J. et al., 1991, Heterologous gene expression in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M. J.J. & Punt, P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3) : 239-251) , ciliados de los tipos: Holotrichia , Peri írichia , Spiroírichia , Suctoria , Tetrahymena , Parameci um, Colpidi um, Gla ucoma , Platyophrya , Poíomacus , Pseudocohnilembus , Euploíes, Engelmaniella , y Síylonychia , especialmente del género Síylonychia lemnae con vectores que siguen un método de transformación como se describe en la solicitud de PCT N.° WO 98/01572, y células vegetales multicelulares (Ver Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium íumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis íhal iana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, chapter 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225 y sus referencias citadas), o células de mamiferos. Las células huésped adecuadas se analizan en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) . Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vi íro, por ejemplo mediante secuencias reguladoras de promotor T7 y T7 polimerasa.

La expresión de polipéptidos en procariontes con frecuencia se lleva a cabo con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión agregan cierta cantidad de aminoácidos a un polipéptido codificado, generalmente al terminal amino del polipéptido recombinante, pero también al C terminal o se fusiona con las regiones adecuadas de los polipéptidos . Dichos vectores de fusión en general cumplen tres fines: 1) aumentar la expresión de un polipéptido recombinante; 2) aumentar la solubilidad de un polipéptido recombinante; y 3) contribuir a la purificación de un polipéptido recombinante al actuar como ligando en una purificación por afinidad. A menudo en los vectores de expresión por fusión, se introduce un sitio de escisión proteolitica en la unión del residuo de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante del residuo de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias cognadas de reconocimiento, incluyen Factor Xa, trombina, y enterocinasa.

Los típicos vectores de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Bíolabs, Beverly, MA) , y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutation-S-transferasa (GST) , polipéptido fijador de maltosa E, o polipéptido A, respectivamente, al polipéptido recombinante blanco. En una forma de realización, la secuencia codificadora de CKSRP se clona en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica un polipéptido de fusión que comprende, desde el N terminal al C terminal, el polipéptido del sitio X de escisión de GST-trombina . El polipéptido de fusión se puede purificar por cromatografía por afinidad con glutatión-resina de agarosa. Se puede recuperar CKSRP recombinante no fusionado con GST por escisión del polipéptido de fusión con trombina.

Los ejemplos de adecuados vectores de expresión inducibles no de fusión de E . coli incluyen pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69:301-315) y pET lid (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión del gen blanco desde el vector pTrc depende de la transcripción de la ARN polimerasa del huésped por un promotor híbrido de la fusión trp-lac. La expresión del gen blanco desde el vector pET lid depende de la transcripción desde el promotor de fusión T7 gnlO-lac mediado por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gnl) . Esta polimerasa viral es provista por las cepas huésped BL2KDE3) o HMS174(DE3) desde un profago residente ? que alberga un gen T7 gnl bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión del polipéptido recombinante consiste en expresar el polipéptido en una bacteria huésped con capacidad deteriorada para escindir proteoliticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128) . Otra estrategia consiste en alterar la secuencia del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de manera tal que los codones individuales para cada aminoácido son los utilizados de preferencia en la bacteria elegida para la expresión, tal como C. gl uíamicum (Wada et al., 1992, Nucleic Acid Res. 20:2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácidos nucleicos de la invención se puede llevar a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN estándar.

En otra forma de realización, el vector de expresión de CKSRP es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores de expresión en la levadura S . cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Los vectores y los métodos para la construcción de vectores adecuados para el uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: Van den Hondel y Punt, 1991, "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi," en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Como alternativa, los CKSRP de la invención se pueden expresar en células de insectos con vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de polipéptidos en células cultivadas de insectos (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al., 1983, Mol.

Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989, Virology 170:31-39).

En aún otra forma de realización, un ácido nucleico de CKSRP de la invención se expresa en células de mamíferos mediante un vector de expresión mamifero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamiferos incluyen pCDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195). Cuando se usan en células de mamiferos, las funciones de control del vector de expresión a menudo son provistas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus, y Simian Virus 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procariontes y eucariontes, ver capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, latest ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra forma de realización, el vector de expresión mamifero recombinante tiene capacidad para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de preferencia en un tipo celular particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico) . Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en el arte. Entre los ejemplos de promotores específicos de tejido adecuados se incluyen el promotor de albúmina (especifico de higado; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de tejidos linfoides (Caíame y Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733), e inmunoglobulinas (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen y Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989, PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), y promotores específicos de glándulas mamarias (por ejemplo, promotor de suero de leche; patente de los Estados Unidos NX 4.873.316 y solicitud de publicación europea N.° 264.166). También abarca los promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss, 1990, Science 249:374-379) y el promotor de polipéptido fetal (Campes y Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546).

Para la transfección estable de las células de mamifero es sabido que, según el vector de expresión y la técnica de transfección usadas, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño a su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, en general se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos o herbicidas) en las células huésped, junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables de preferencia incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina, y metotrexato, o en plantas que confieren resistencia a un herbicida tal como glifosato, glufosinato, o imidazolinona. Las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica un CKSRP o se pueden introducir en otro vector. Las células transfectadas en forma estable con la molécula de ácido nucleico se pueden identificar, por ejemplo, por selección con herbicida (por ejemplo, las células que incorporaron el marcador seleccionable sobreviven, mientras que las otras mueren) .

En una forma de realización de preferencia de la presente invención, los CKSRP se expresan en plantas y células vegetales tales como células vegetales unicelulares (por ejemplo, algas) (Ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 y sus referencias) y células vegetales de plantas superiores (por ejemplo, los espermatofitos , tales como plantas cerealeras) . Un CKSRP puede ser "introducido" en una célula vegetal por cualquier medio, tal como transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección, y similares. Un método de transformación conocido por los expertos en el arte consiste en sumergir una planta con flor en una solución de Agrobacíeria , en donde la Agroba cteria contiene el ácido nucleico de CKSRP, seguido del cultivo de los gametos transformado.

Otros métodos adecuados para transformar o transfectar las células huésped incluso las células vegetales se pueden hallar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, latest ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterí um protocols, ed: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que el aumento del crecimiento y la mayor tolerancia a estrés biótica y abiótica es un rasgo general que se desea heredar en una amplia variedad de plantas tales como maiz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, poroto de soja, mani, algodón, semilla de colza, cañóla, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas tales como papa, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, arvejas, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), Especies de Salix, árboles (palmera aceitera, nuez de coco), pastos perennes, y cereales forrajeros, Estas plantas cerealeras también son plantas blanco de preferencia para ingeniería genética como otra forma de realización de la presente invención. Los cereales forrajeros incluyen, sin limitaciones, Wheatgrass, Canarygrass, Bromegrass, centeno salvaje Grass, Bluegrass, Orchardgrass, Alfalfa, Salfoin, Birdsfoot Trefoil, Alsike Clover, trébol rojo, y trébol dulce.

En una forma de realización de la presente invención, se logra la transfección de un CKSRP en una planta mediante transferencia géníca mediada por Agrobacterium . La transformación vegetal mediada por Agrobacterium se puede realizar por ejemplo con las cepas GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) Agrobacteri um tumefa ciens . La transformación se puede realizar por técnicas de transformación estándar y regeneración (Deblaere et al., 1994, Nucí. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Ratón: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la semilla de colza se puede transformar por transformación de cotiledón o hipocotilo (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8:238-242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para la selección de Agroba cíerium y de plantas depende del vector binario y de la cepa de Agrobacíerium usada para la transformación. La selección de semilla de colza normalmente se lleva a cabo con canamicina como marcador seleccionable vegetal. La transferencia de genes a lino mediada por Agroba cíeri um se puede realizar, por ejemplo, mediante una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Además, la transformación de poroto de soja se puede realizar por ejemplo con una técnica descrita en la patente europea N.° 0424 047, la patente de los Estados Unidos N.° 5.322.783, la patente europea NX0397 687, la patente de los Estados Unidos N.° 5.376.43, o la patente de los Estados Unidos NX 5.169.770. La transformación de maíz se puede lograr por bombardeo de partículas, captación de ADN mediada por polietilenglicol, o por la técnica de fibra de carburo de silicio. (Ver, por ejemplo, Freeling y Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7) . Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la patente de los Estados Unidos N.° 5.990.387, y un ejemplo específico de transformación de trigo se encuentra en la solicitud de PCT NX WO 93/07256.

De acuerdo con la presente invención, el CKSRP introducido se puede mantener en la célula vegetal en forma estable si se incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o se integra en los cromosomas de la planta. Como alternativa, el CKSRP introducido puede estar presente en un vector autónomo no cromosómico no replicante y se puede expresar en forma transitoria o ser activo transitoriamente.

En una forma de realización, se puede crear un microorganismo homólogo recombinante en donde se integra CKSRP en un cromosoma, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un CKSRP en el cual se ha introducido una deleción, adición, o sustitución para así alterar, por ejemplo, alterara funcionalmente el gen de CKSRP. De preferencia, los CKSRP son genes CKSRP de Physcomi írella pa tens, Brassica napus, Glicina max, o Oryza sa tiva pero pueden ser homólogos de una planta relacionada o incluso de una fuente de mamífero, levadura, o insecto. En una forma de realización, el vector se diseña de manera tal que tras la recombinación homologa, el gen endógeno CKSRP está funcionalmente alterado (es decir, ya no codifica un polipéptido funcional; también se denomina vector knock-ou í ) . Como alternativa, el vector se puede diseñar de manera tal que tras la recombinación homologa, el gen endógeno CKSRP está mutado o de otro modo alterado pero aún codifica un polipéptido funcional (por ejemplo, se puede alterar la región reguladora corriente arriba para así alterar la expresión del CKSRP endógeno) . Para crear una mutación puntual por recombinación homologa, se pueden usar híbridos ADN-ARN en una técnica denominada quimeraplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acid Research 27 (5) X323-1330 y Kmiec, 1999, Gene Therapy American Scientist 87 (3 ): 240-247 ) . Los procedimiento de recombinación homologa en Physcomiírella pa tens también son bien conocidos en el arte y se contemplan para el uso en la presente.

Mientras que en el vector de recombinación homólogo, la porción alterada del gen CKSRP está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por una molécula adicional de ácido nucleico del gen CKSRP para permitir que tenga lugar la recombinación homologa entre el gen exógeno de CKSRP transportado por el vector y un gen endógeno de CKSRP, en un microorganismo o planta. La molécula adicional flanqueadora de ácido nucleico de CKSRP tiene longitud suficiente para el éxito de la recombinación homologa con el gen endógeno. En general, se incluyen varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN flanqueador (en los extremos 5' y 3' ) en el vector (Ver por ejemplo, Thomas, K.R., y Capecchi, M.R., 1987, Cell 51:503 para una descripción de un vector de recombinación homólogo o Strepp et al., 1998, PNAS, 95 (8 ): 4368-4373 para recombinación basada en cADN en Physcomi trella pa tens) . El vector se introduce en un microorganismo o célula vegetal (por ejemplo, a través de ADN mediado por polietilenglicol), y se seleccionan las células en las cuales el gen de CKSRP introducidos se recombinó homogéneamente con el gen endógeno de CKSRP, mediante técnicas conocidas en el arte.

En otra forma de realización, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten regular la expresión del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen CKSRP en un vector que lo coloca bajo el control del operón lac permite la expresión del gen CKSRP sólo en presencia de IPTG. Dichos sistemas reguladores son bien conocidos en el arte.

Ya sea que esté presente en un vector extracromosómico no replicante o en un vector que se integra en un cromosoma, el polinucleótido CKSRP de preferencia reside en un cásete de expresión vegetal. Un cásete de expresión vegetal de preferencia contiene secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en células vegetales que están ligadas operativamente de manera tal que cada secuencia puede cumplir su función, por ejemplo, la terminación de la transcripción por las señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación de preferencia son las que se originan en tADN de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 denominado octopinasintetasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) o sus equivalentes funcionales, pero también son adecuados todos los demás terminadores funcionalmente activos en plantas. Dado que la expresión génica en plantas muy a menudo no se limita a los niveles de transcripción, un cásete de expresión vegetal de preferencia contiene otras secuencias ligadas operativamente tales como incrementadores de la traducción tales como la secuencia de dirección en exceso que contiene la secuencia guía 5 ' no traducida del virus de mosaico del tabaco que incentiva la relación polipéptido por ARN (Gallie et al., 1987, Nucí. Acids Research 15:8693-8711). Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen los detallados en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformación, Nucí. Acid. Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering y Utilization, eds.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

La expresión de genes vegetales se debe ligar operativamente a un promotor adecuado que confiere la expresión génica oportuna en forma específica de célula o de tejidos. Los promotores de utilidad en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal. Dichos promotores incluyen, sin limitaciones, los que se pueden obtener de plantas, virus vegetales, y bacterias que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacteri um y Rhizobium .

El promotor puede ser constitutivo, inducible, de preferencia de estadio de desarrollo, de preferencia de tipo celular, de preferencia de tejido, o de preferencia de órgano. Los promotores constitutivos son activos en la mayoria de las condiciones. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen los promotores CaMV 19S y 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), el promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302) el promotor Sepl, el promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), el promotor de actina de Arabidopsis, el promotor ubiquitano (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689), pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), el promotor de virus mosaico de higuera 35S, el promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J 3:2723-2730), el promotor GRP1-8, el promotor cinamilalcoholdeshidrogenasa (patente de los Estados Unidos NX 5.683.439), los promotores de T-ADN de Agroba cíeri um, tales como manopinasintetasa, nopalinasintetasa, y octopinasintetasa, la subunidad menor de ribulosabifosfatocarboxilasa (ssuRUBISCO) , y similares.

Los promotores inducibles de preferencia son activos en ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frió, luz, ataque de patógeno, condiciones anaeróbicas, y similares. Por ejemplo, el promotor hsp80 de Brassica es inducido por shock de calor; el promotor PPDK es inducido por luz; los promotores PR-1 de tabaco, Arabidopsis, maiz son inducibles por infección con un patógeno; y el promotor Adhl es inducido por hipoxia y estrés por frió. La expresión del gen vegetal también se puede facilitar mediante un promotor inducible (Para una revisión ver Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Los promotores inducibles por guimicos son especialmente adecuados si se desea la expresión génica en forma específica de tiempo. Los ejemplos de dichos promotores sen un promotor inducible por ácido salicilico (Solicitud de PCT NX WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclinas (Gatz et al., 1992, Plant J. 2:397-404), y un promotor inducible por etanol (Solicitud de PCT NX WO 93/21334).

En una forma de realización de preferencia de la presente invención, el promotor inducible es un promotor inducible por estrés. A los fines de la invención, los promotores inducibles por estrés de preferencia son activos en uno o más de los siguientes estréses : condiciones subóptimas asociadas con estrés por salinidad, sequía, temperatura, metal, químicos, patógenos, y oxidativo. Los promotores inducibles por estrés incluyen, sin limitaciones, Cor78 (Chak et al., 2000, Planta 210:875-883; Hovath et al., 1993, Plant Physiol. 103:1047-1053), Corl5a (Artus et al., 1996, PNAS 93 (23) X3404-09) , Rci2A (Medina et al., 2001, Plant Physiol. 125:1655-66; Nylander et al., 2001, Plant Mol. Biol. 45:341-52; Navarre y Goffeau, 2000, EMBO J. 19:2515-24; Capel et al., 1997, Plant Physiol. 115:569-76), Rd22 (Xiong et al., 2001, Plant Cell 13:2063-83; Abe et al., 1997, Plant Cell 9:1859-68; Iwasaki et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 247:391-8), cDet6 (Lang y Palve, 1992, Plant Mol. Biol. 20:951-62), ADHl (Hoeren et al., 1998, Genetics 149:479-90), KAT1 (Nakamura et al., 1995, Plant Physiol. 109:371-4), KST1 (Müller-Rober et al., 1995, EMBO 14:2409-16), Rhal (Terryn et al., 1993, Plant Cell 5:1761-9; Terryn et al., 1992, FEBS Lett. 299 (3) : 287-90) , ARSK1 (Atkinson et al., 1997, # de acceso a GenBank L22302, y solicitud de PCT N.° WO 97/20057), PtxA (Plesch et al., # de acceso a GenBank # X67427), SbHRGP3 (Ahn et al., 1996, Plant Cell 8:1477-90), GH3 (Liu et al., 1994, Plant Cell 6:645-57), el promotor génico inducible por patógeno PRP1 (Ward et al., 1993, Plant. Mol. Biol. 22:361-366), el promotor inducible por calor hsp80 de tomate (patente de los Estados Unidos N.° 5187267), promotor inducible por frío de alfa-amilasa de papa (solicitud de PCT N.° WO 96/12814), o el promotor inducible por lesión pinll (patente europea N.° 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequia, frió, y sales, tales como el promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozalei et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 236:331-340.

Los promotores de preferencia de estadio de desarrollo se expresan preferentemente en ciertos estadios de desarrollo. Los promotores de preferencia de tejido y órgano incluyen los que se expresan preferentemente en ciertos tejidos y órganos, tales como hojas, raíces, semillas, o xilema. Los ejemplos de promotores de preferencia de tejido y de preferencia de órgano incluyen, sin limitaciones promotores de preferencia de fruto, de preferencia de óvulo, de preferencia de tejido masculino, de preferencia de semilla, de preferencia de integumento, de preferencia de tubérculo, de preferencia de tallo, de preferencia de pericarpio, y de preferencia de hoja, de preferencia de estigma, de preferencia de polen, de preferencia de anteras, de preferencia de pétalos, de preferencia de sépalos, de preferencia de pedicelo, de preferencia de silique, de preferencia de tronco, de preferencia de raiz, y similares. Los promotores de preferencia de semilla se expresan preferentemente durante el desarrollo y/o la germinación de la semilla. Por ejemplo, los promotores de preferencia de semillas pueden ser promotores de preferencia de embrión, de preferencia de endosperma, y de preferencia de cubierta de la semilla. Ver Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Los ejemplos de promotores de preferencia de semilla incluyen, sin limitaciones, celulosasintetasa (celA) , Ciml, gamma-zeína, globulina-1, zeina de maíz 19 kD (cZl9Bl), y similares.

Otros promotores de preferencia de tejido o de preferencia de órgano adecuados incluyen el promotor de gen de napina de semilla de colza (patente de los Estados Unidos N.° 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225 (3) : 59-67 ) , el promotor de oleosina de Arabidopsis (solicitud de PCT N.° WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseol us vulgarís (patente de los Estados Unidos N.° 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (solicitud de PCT N.° WO 91/13980), o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2) X33-9), además de promotores que confieren expresión especifica de semilla en plantas monocotiledóneas tales como maiz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados destacados son el promotor de gen lpt2 o lptl de cebada (solicitud de PCT N.° WO 95/15389 y solicitud de PCT N.° WO 95/23230) o los descritos en la solicitud de PCT N.° WO 99/16890 (promotores de gen de hordeina de cebada, gen de glutelina de arroz, gen de orizina de arroz, gen de prolamina de arroz, gen de gliadina de trigo, gen de glutelina de trigo, gen de glutelina de avena, gen de casirina de sorgo, y gen de secalina de centeno) .

Otros promotores de utilidad en los casetes de expresión de la invención incluyen, sin limitaciones, el principal promotor de proteinas fijadoras de clorofila a/b, promotores de histona, el promotor Ap3, el promotor ß-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lecitina de poroto de soja, el promotor de zeina de maiz de 15kD, el promotor de zeina 22kD, el promotor de zeina de 27kD, el promotor de ?-zeína, los promotores de ceroso, rugoso 1, rugoso 2, y bronce, el promotor Zml3 (patente de los Estados Unidos N.° 5.086.169), los promotores de poligalacturonasa de maiz (PG) (patentes de los Estados Unidos N.° 5.412.085 y 5.545.546), y el promotor SGB6 (patente de los Estados Unidos N.° 5.470.359), además de promotores sintéticos u otros naturales.

Se puede obtener flexibilidad adicional al controlar la expresión génica heteróloga en plantas mediante el uso de dominios de unión de ADN y elementos de respuesta de fuentes heterólogas (es decir, dominios fijadores de ADN de fuentes no vegetales) . Un ejemplo de dicho dominio fijador de ADN heterólogo es el dominio fijador de ADN LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43: 729-736 La invención también provee un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de CKSRP de la invención clonado en el vector de expresión en orientación antisentido. Es decir, la 10 molécula de ADN está ligada operativamente a una secuencia reguladora que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido a un mARN CKSRP. Las secuencias reguladoras ligadas operativamente a una '-* molécula de ácido nucleico clonada en orientación antisentido se pueden elegir para dirigir la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos celulares. Por ejemplo, los promotores y/o incentivadores virales, las secuencias 0 reguladoras se pueden elegir para dirigir la expresión directa constitutiva, especifica de tejido, especifica de tipo celular del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagémico, o virus atenuado en donde se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región reguladora se puede determinar por el tipo celular en el cual se introduce el vector. Para el análisis de la regulación de la expresión génica con genes antisentido, ver Weintraub, H. et al., 1986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1), y Mol et al., 1990, FEBS Letters 268:427-430.

Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped en los cuales se introdujo un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan indistintamente en la presente. Se entiende que dichos términos se refieren no sólo a la célula sujeto particular sino que se aplica a la progenie o la posible progenie de dicha célula. Dado que se pueden producir ciertas modificaciones en las sucesivas generaciones debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún asi se incluye en el alcance del término tal como se usa en la presente. Una célula huésped puede ser cualquier célula procarionte o eucarionte. Por ejemplo, se puede expresar CKSRP en células bacterianas tales como C. gl uíamicum, células de insectos, células fúngicas, o células de mamifero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células vegetales, fúngicas, o de otros microorganismos tales como C. gl u íamicum . Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en el arte.

Una célula huésped de la invención, por ejemplo una célula procarionte o eucarionte en cultivo, se puede usar para producir (es decir, expresar) un CKSRP. En consecuencia, la invención también provee métodos para producir CKSRP mediante las células huésped de la invención. En una forma de realización, el método comprende el cultivo de la célula huésped de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un CKSRP, o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica un CKSRP de tipo salvaje o alterado) en un medio adecuado hasta producir el CKSRP. En otra forma de realización, el método también comprende aislar CKSRP del medio o de la célula huésped.

Otro aspecto de la invención se refiere a CKSRP aislados, y sus porciones biológicamente activas. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o su porción biológicamente activa está libre de parte del material celular cuando se produce por técnicas con ADN recombinante, o precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. El término "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de CKSRP en las cuales el polipéptido se separa de parte de los componentes celulares de las células en las cuales se produce naturalmente o por medios recombinantes. En una forma de realización, el término "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un CKSRP con menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de material distinto de CKSRP (también denominado en la presente como "polipéptido contaminante") , con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de material distinto de CKSRP, con aún mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de material distinto de CKSRP, y con mayor preferencia aún menos de aproximadamente 5% de material distinto de CKSRP.

Cuando el CKSRP o su porción biológicamente activa se produce por medios recombinantes, de preferencia también está libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, con mayor preferencia menos de aproximadamente 10%, y con mayor preferencia menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de polipéptido. El término "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de CKSRP en las cuales el polipéptido se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que intervienen en la síntesis del polipéptido. En una forma de realización, el término "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de un CKSRP con menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos químicos distintos de CKSRP, con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o compuestos químicos distintos de CKSRP, con aún mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o compuestos químicos distintos de CKSRP, y con mayor preferencia aún menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o compuestos químicos distintos de CKSRP. En formas de realización de preferencia, los polipéptidos aislados, o sus porciones biológicamente activas carecen de polipéptidos contaminantes del mismo organismo del cual deriva el CKSRP. En general, dichos polipéptidos se producen por la expresión recombinante de, por ejemplo, un CKSRP de Physcomi írella pa íens o Saccharomyces cerevisiae en plantas distintas de Physcomi írella pa íens o Sa ccharomyces cerevisiae, o en microorganismos tales como C. gl utamicum , ciliados, algas, u hongos.

Las moléculas de ácidos nucleicos, polipéptidos, homólogos de polipéptido, polipéptidos de fusión, cebadores, vectores, y células huésped descritas en la presente se pueden usar en uno o más de los siguientes métodos: identificación de Physcomi trella pa íens o Saccharomyces cerevisiae y organismos relacionados; mapeo de genomas de organismos relacionados con Physcomi írella pa íens o Saccharomyces cerevisiae; identificación y localización de secuencias de interés en Physcomi írella pa tens o Saccharomyces cerevisiae estudios evolutivos; determinación de regiones de CKSRP requeridas para la función; modulación de la actividad de CKSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte transmembrana de uno o más compuestos; modulación de resistencia al estrés; y modulación de la expresión de ácidos nucleicos de CKSRP. En una forma de realización de estos métodos, CKSRP actúa como activa proteína de transporte de potasio. En otra forma de realización de estos métodos, el CKSRP actúa como transportador de zinc.

El musgo Physcomi trella pa tens está relacionado con otros musgos tales como Cera todon purpureus que es capaz de crecimiento en ausencia de luz. Los musgos como Cera íodon y Physcomi írella comparten alto grado de identidad de secuencia a nivel de secuencia de ADN y de polipéptidos, lo cual permite el uso de análisis heterólogo de moléculas de ADN con sondas que evolucionan desde otros musgos u organismos, lo cual permite la derivación de una secuencia de consenso adecuada para la búsqueda heteróloga o la notación y la predicción de las funciones del gen en terceras especies. La capacidad para identificar dichas funciones en consecuencia puede tener significativa relevancia, por ejemplo, la predicción de la especificidad de sustrato de las enzimas. Además, estas moléculas de ácidos nucleicos pueden servir como puntos de referencia para el mapeo de genomas de musgos, o de genomas de organismos relacionados .

La molécula de ácido nucleico de CKSRP de la invención tiene diversos usos. Más importante, las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la presente invención se pueden usar para transformar plantas, y así incrementar la tolerancia a estrés tales como por sequía, alta salinidad, y frío. La presente invención en consecuencia provee una planta transgénica transformada con un ácido nucleico de CKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta da por resultado el aumento de tolerancia de la planta a estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención también provee que la planta transgénica se puede seleccionar de maiz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, poroto de soja, maní, algodón, semilla de colza, cañóla, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, papa, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, arvejas, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palmera aceitera, nuez de coco, pasto perenne, y cereales forrajeros, por ejemplo.

En consecuencia, la invención provee un método para producir una planta transgénica. En particular, la presente invención describe el uso de la expresión de PpCk-1, PpCK-2, PpCK-4, y PpPK-4 de Physcomi trella pa tens; ScCK-1 e Saccharomyces cerevisiae; y BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5 e Brassica napus para obtener por ingeniería plantas tolerantes a sequia, tolerantes a contenido salino y/o tolerantes al frió. Esta estrategia se demostró en la presente para Arabídopsis íhaliana , semilla de colza/Canola, porotos de sojas, maiz y trigo, pero su aplicación no está restringida a estas plantas. En consecuencia, la invención provee una planta transgénica que contiene un CKSRP por ejemplo el PpCK-1 como se define en SEQ ID NOX, PpCK-2 como se define en SEQ ID NOX, PpCK-4 como se define en SEQ ID NOX, PpPK-4 como se define en SEQ ID NOX, ScCK-1 como se define en SEQ ID NOXO, BnCK-1 como se define en SEQ ID NO: 12, BnCK-2 como se define en SEQ ID NO: 14, BnCK-3 como se define en SEQ ID NO: 16, BnCK-4 como se define en SEQ ID NO: 18, y BnCK-5 como se define en SEQ ID NOXO, en donde la planta tiene aumentada la tolerancia a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequia, aumento del contenido salino, o disminución o aumento de temperatura. En formas de realización de preferencia, el estrés ambiental es sequia o disminución de la temperatura.

En consecuencia, la invención provee un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico codificador de CKSRP en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da por resultado un aumento de la tolerancia al estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: a) introducir en una célula vegetal un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de CKSRP, y b) generar de dicha célula vegetal una planta transgénica con aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. La célula vegetal incluye, sin limitaciones, un protoplasto, una célula productora de gametos, y una célula que se ^ regenera en una planta entera. Tal como se usa en la presente, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula vegetal, callo, tejido vegetal, o parte de plantas, que contiene todo o al menos parte de un polinucleótido recombinante. En 0 muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante se integra en forma estable a un cromosoma o elemento estable extracromosómico, por lo que se pasa a las generaciones sucesivas. En las formas de realización de preferencia, el ácido 5 nucleico de CKSRP codifica una proteína que comprende el polipéptido de SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO. o La presente invención también provee un método para modular la tolerancia a un estrés ambiental que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico codificador de CKSRP en la planta. La tolerancia al estrés ambiental de la planta se puede incrementar o disminuir según se logre aumentar o disminuir la expresión de un CKSRP, respectivamente. De preferencia, se aumenta la tolerancia al estrés ambiental de la planta al aumentar la expresión de un ^ CKSRP. La expresión de un CKSRP se puede modificar por cualquier otro método conocido por los expertos en el arte. Los métodos para aumentar la expresión de CKSRP se pueden usar en donde la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en que la planta es 0 transgénica, la planta se puede transformar con un vector que contiene cualquiera de los anteriores descritos ácidos nucleicos codificadores de CKSRP, o la planta se puede transformar con un promotor que dirige la expresión de CKSRP nativo en la planta, por 5 ejemplo. La invención provee que dicho promotor puede ser de preferencia de tejido, regulado por el desarrollo, inducible por estrés, o una de sus combinaciones. Como alternativa, las plantas no transgénicas pueden tener modificada la expresión o nativa de CKSRP al inducir un promotor nativo. La expresión de PpCK-1 como se define en SEQ ID NOX, PpCK-2 como se define en SEQ ID NOX, PpCK-4 como se define en SEQ ID NOX, PpPK-4 como se define en SEQ ID NOX, ScCK-1 como se define en SEQ ID NOXO, BnCK-1 como se define en SEQ ID NO: 12, BnCK-2 como se define en SEQ ID NO: 14, BnCK-3 como se define en SEQ ID NO: 16, BnCK-4 como se define en SEQ ID NO: 18, o BnCK-5 como se define en SEQ ID NOXO en las plantas blanco se puede lograr, sin limitaciones, por uno de los siguientes ejemplos: a) promotor constitutivo, b) promotor inducible por estrés, c) promotor inducible por químicos, y d) sobreexpresión del promotor por ingeniería, por ejemplo, con factores de transcripción derivados de dedos de zinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275 : 657 ) .

En una forma de realización de preferencia, la transcripción del CKSRP se modula mediante factores de transcripción derivados de dedos de zinc (ZFP) como se describe en Greisman y Pabo, 1997, Science 275:657 y fabricado por Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFP comprenden un dominio de reconocimiento de ADN y un dominio funcional que causa la activación o la represión de un ácido nucleico blanco tal como un ácido nucleico de CKSRP. En consecuencia, se pueden crear activaciones y represiones de ZFP que reconocen específicamente los promotores de CKSRP antes descritos y usados para aumentar o disminuir la expresión de CKSRP en una planta, y asi modular la tolerancia al estrés de la planta. La presente invención también incluye la identificación de los homólogos dePpCK-1 como se define en SEQ ID NO , PpCK-2 como se define en SEQ ID NOX, PpCK-4 como se define en SEQ ID NOX, PpPK-4 como se define en SEQ ID NOX, ScCK-1 como se define en SEQ ID NOXO, BnCK-1 como se define en SEQ ID NO: 12, BnCK-2 como se define en SEQ ID NO: 14, BnCK-3 como se define en SEQ ID NO: 16, BnCK-4 como se define en SEQ ID NO: 18, y BnCK-5 como se define en SEQ ID NOXO en una planta blanco, además del promotor del homólogo. La invención también provee un método para aumentar la expresión de un gen de interés en una célula huésped, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a un CKSRP, que comprende: a) transformar la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido codificador de CKSRP, y b) expresar el CKSRP dentro de la célula huésped, para así incrementar la expresión del gen transcripto en respuesta a CKSRP, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped.

Además de introducir las secuencias de ácidos nucleicos de CKSRP en plantas transgénicas, estas secuencias también se pueden usar para identificar un organismo como Physcomi írella pa tens, Brassica napus, Saccharomyces cerevisiae, o a cióse relative thereof. o una especie estrechamente relacionada. También se pueden usar para identificar la presencia de Physcomi trella pa íens, Brassica napus, Sa ccharomyces cerevisiae, o una especie relacionada en una población mixta de microorganismos. La invención provee las secuencias de ácidos nucleicos de numerosos genes de Physcomi írella pa íens, Brassica napus, y Sa ccharomyces cerevisiae al usar una sonda con el ADN genómico extraído de un cultivo de una población singular o mixta de microorganismos en condiciones rigurosas con una sonda que cubre una región del gen de Physcomi írella pa íens, Brassica napus, o Sa ccharomyces cerevisiae que es singular para ese organismo, es posible asegurar la presencia de ese organismo.

Además, las moléculas de ácido nucleico y de polipéptido de la invención pueden servir como marcadores de regiones específicas del genoma. Esto es de utilidad no sólo para el mapeo del genoma, sino también en estudios funcionales de polipéptidos de Physcomi írella pa íens, Brassica napus, o Sa ccharomyces cerevisiae polipéptidos. Por ejemplo, para identificar la región del genoma al cual se une polipéptido particular fijador de ADN de Physcomi írella pa íens se puede digerir el genoma de Physcomi írella pa tens e incubar los fragmentos con el polipéptido fijador de ADN. Estos fragmentos que fijan el polipéptido también se pueden sondar con las moléculas de ácidos nucleicos de la invención, de preferencia con rótulos detectables con facilidad. La unión de dichas moléculas de ácido nucleico al fragmento del genoma permite localizar el fragmento en el mapa del genoma de Physcomi trella pa tens, y cuando se realizan muchas veces con distintas enzimas, se facilita la rápida determinación de la secuencia de ácidos nucleicos a la que se une el polipéptido. Además, la molécula de ácidos nucleicos de la invención puede ser suficientemente idéntica a las secuencias de especies relacionadas, por lo que estas moléculas de ácidos nucleicos pueden actuar como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos relacionados .

Las moléculas de ácidos nucleicos de CKSRP de la invención también son de utilidad para estudios de estructura evolutiva y de polipéptidos. Los procesos de tránsito vesicular en los cuales participan las moléculas de la invención se utilizan en una amplia variedad de células procariontes y eucariontes; al comparar las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención con las que codifican proteinas similares de otros organismos, se puede evaluar la relación evolutiva de los organismos. De modo similar, dicha comparación permite evaluar cuáles regiones de la secuencia están conservadas y cuales no, lo cual puede contribuir a determinar las regiones del polipéptido que son esenciales para el funcionamiento del factor de transcripción. Este tipo de determinación es valioso para estudios de ingeniería del polipéptido y puede indicar lo que el polipéptido puede tolerar en términos de mutagénesis, sin perder función.

La manipulación de la molécula de ácido nucleico de CKSRP de la invención puede dar por resultado la producción de CKSRP con diferencias funcionales respecto de los CKSRP de tipo salvaje.

Estos polipéptidos pueden tener mejorada la eficiencia o la actividad, pueden estar presentes en mayor cantidad en la célula de lo habitual, o pueden estar disminuidos en eficiencia y en actividad.

Existen numerosos mecanismos por los cuales la alteración de un CKSRP de la invención puede afectar directamente la respuesta a estrés y/o la tolerancia a estrés. En el caso de las plantas que expresan CKSRP, el aumento del transporte puede conducir a mejorar la partición del contenido salino y/o soluto en el tejido y los órganos de la planta. Al aumentar la cantidad o la actividad de las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas de la célula puede ser posible afectar la tolerancia al contenido salino de la célula.

El efecto de la modificación genética en plantas, C. gl utamicum, hongos, algas, o ciliados sobre o la tolerancia al estrés se puede evaluar mediante el cultivo de los microorganismos o plantas modificadas en condiciones inferiores a las adecuadas y luego analizar las caracteristicas del crecimiento y/o metabolismo de la planta. Dichas técnicas de análisis son bien conocidas por los expertos en el arte, y incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de polipéptidos, síntesis de hidratos de carbono, síntesis de lipidos, tasas de evaporación y transpiración, rendimientos generales de la planta y/o el cultivo, la floración, la reproducción, la formación de semillas, el crecimiento de la raiz, las tasas de respiración, las tasas de fotosíntesis, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, vol. 3, Chapter III: Product recovery and purification, page 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988, Bioseparations : downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988, Biochemical separations, en: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, los vectores de expresión de levaduras que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o sus fragmentos, se pueden construir y transformar en Sa ccharomyces cerevisiae por protocolos estándar. Las células transgénicas obtenidas se pueden analizar para detectar fallas o alteraciones en su tolerancia a estrés por sequia, sales, y temperatura. De modo similar, los vectores de expresión vegetal que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o sus fragmentos, se pueden construir y transformar en una célula vegetal adecuado tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago írunca íula , etc., mediante protocolos estándar. Las células transgénicas obtenidas y/o las plantas derivadas luego se pueden ensayar para detectar fallas o alteraciones de la tolerancia a estrés por sequía, contenido salino y temperatura.

El tratamiento por ingeniería de uno o más genes de CKSRP de la invención también puede generar CKSRP con actividades alteradas, que impactan indirectamente sobre la respuesta a estrés y/o la tolerancia a estés de algas, plantas, ciliados u hongos, u otros microorganismos tales como C. gl uíamicum . Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del metabolismo inducen la preparación de diversos productos (por ejemplo, peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno reactivo) , que pueden interferir activamente en los mismos procesos metabólicos. Por ejemplo, es sabido que el peroxinitrito nitrifica cadenas laterales de tirosina, por lo que inactiva algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J.T., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2) X26-235) . Si bien en general estos productos se excretan, es posible alterara genéticamente las células para transportan mayor cantidad de productos de lo que es característico de una célula de tipo salvaje. Al optimizar la actividad de uno o más CKSRP de la invención que intervienen en la exportación de moléculas especificas, tales como las moléculas de sales, puede ser posible mejorar la tolerancia a estrés de la célula.

Además, las secuencias descritas en la presente, o sus fragmentos, se pueden usar para generar mutaciones knockouí en los genomas de diversos organismos, tales como bacterias, células de mamíferos, células de levaduras, y células vegetales (Girke, T., 1998, The Plant Journal 15:39-48). Las células knockouí obtenidas luego se pueden evaluar por su capacidad para tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta a diversas condiciones de estrés y el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo de la mutación. Para otros métodos de inactivación de genes, ver patente de los Estados Unidos N° 6.004.804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraju et al., 1999, Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17:246-252.

Las antes mencionadas estrategias de mutagénesis para CKSRP dan por resultado un aumento del crecimiento y resistencia al estrés que no se pretenden limitantes; las variaciones de estas estrategias serán rápidamente aparentes para los expertos en el arte. Mediante dichas estrategias, y al incorporar los mecanismos descritos en la presente, las moléculas de ácido nucleico y de polipéptido de la invención se pueden utilizar para generar algas, ciliados, plantas, hongos, u otros microorganismos tales como C. gl uíamicum que expresan las moléculas mutadas de ácido nucleico y polipéptido de CKSRP de manera tal que aumente la tolerancia a estrés .

La presente invención también provee anticuerpos que se unen específicamente a CKSRP, o a una de sus porciones, como esté codificado por un ácido nucleico descrito en la presente. Los anticuerpos se pueden preparar por muchos métodos bien conocidos (Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, "Antibodies; A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)) . Brevemente, el antígeno purificado se puede inyectar en un animal en una cantidad y a intervalos suficientes para generar una respuesta inmune. Los anticuerpos se pueden purificar directamente o se pueden obtener células esplénicas del animal. Las células luego se pueden fusionar con una linea de células inmortales y se analiza la secreción de anticuerpos. Los anticuerpos se pueden usar para analizar bibliotecas clonadas de ácidos nucleicos para buscar las células que secretan el antigeno. Luego se puede determinar la secuencia de los clones positivos. (Ver, por ejemplo, Kelly et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10:169-175) .

Las frases "se fija selectivamente" y "fija específicamente" con el polipéptido se refieren a la reacción de unión que determina la presencia del polipéptido en una población heterogénea de polipéptidos y otras sustancias biológicas. En consecuencia, en determinadas condiciones de inmunoensayo, los anticuerpos específicos unidos a un polipéptido particular no se unen en cantidad significativa a los demás polipéptidos presentes en una muestra. La fijación selectiva de un anticuerpo en dichas condiciones puede requerir un anticuerpo seleccionado por su especificidad para un polipéptido particular. Se puede usar una variedad de inmunoensayos para seleccionar los anticuerpos que se unen selectivamente a un polipéptido particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de fase sólida por ELISA se usan de rutina para seleccionar anticuerpos con inmunorreacción selectiva para un polipéptido. Ver Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988), para una descripción de los formatos de inmunoensayos y condiciones que se pueden usar para determinar la fijación selectiva.

En algunos casos, es conveniente preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes . Se puede hallar una descripción de las técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales en Stites et al., eds., "Basic and Clinical Immunology, " (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., cuarta Edición) y sus referencias alli citadas, y en Harlow y Lañe, 1988, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988.

En toda esta solicitud se hizo referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de todas esas publicaciones y esas referencias citadas en esas publicaciones se incorporan asi a la presente en su totalidad como referencia, a los fines de describir en forma más completa el estado del arte al cual pertenece la presente invención.

También se debe entender que lo anterior se refiere a las formas de realización de preferencia de la presente invención y que se pueden hacer muchos cambios sin apartarse del alcance de la invención. La invención también se ilustra con los siguientes ejemplos, que de ninguna manera se deben interpretar como limitantes del alcance de la presente. Por el contrario, debe entenderse con claridad que se puede recurrir a muchas otras formas de realización, modificaciones, y equivalentes que después de leer la descripción de la presente, pueden sugerir a los expertos en el arte sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Ejemplo 1 - Desarrollo de cul tivos de Physcomi írella pa íens . Para este estudio se usaron plantas de las especies Physcomi írella pa íens (Hedw.) B.S.G. de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo. Se originaron en la cepa 16/14 reunida por H.L.K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fue un subcultivo de una espora de Engel (1968, Am. J. Bot. 55:438-446). Se realizó la proliferación de las plantas mediante esporas y mediante la regeneración de los gametofitos. El protonema se desarrolló de la espora haploide como cloronema rico en cloroplastos y caulonema bajo en cloroplastos, en los cuales se formaron brotes tras aproximadamente 12 días. Estos crecieron para dar anteridias y arquegonias portadores de gametóforos . Después de la fertilización, se obtuvo el esporófito diploide con una seta corta y la cápsula de la espora, en la que maduraron los meiosporos .

Se realizó el cultivo en una cámara climatizada con temperatura del aire de 25°C e intensidad de la luz de 55 micromol m2 s"1 (luz blanca; Philips TL 65W/25 tubo fluorescente) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo se modificó en cultivo liquido con medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Plant 165: 354-358) o se cultivó en medio sólido de Knop con 1% de azúcar oxoide (Unipath, Basingstoke, Inglaterra) . Los proteonemas usados para el aislamiento de ARN y ADN se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se cambiaron cada 9 dias y se transfirieron a un medio de cultivo fresco.

Ejemplo 2 - Aislamien ío de ADN íoíal de plan tas . Los detalles del aislamiento de ADN total se refieren al procesamiento de un gramo de peso fresco de material vegetal. Los materiales usados incluyen los siguientes buffer: buffer CTAB: 2% (p/v) bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB); 100 mM de Tris HCl pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM de EDTA; buffer de N-Laurilsarcosina : 10% (p/v) N-laurilsarcosina; 100 mM Tris HCl pH 8,0; y 20 mM EDTA.

El material vegetal se trituró en nitrógeno liquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a frascos de Eppendorf de 2 mL . Luego se cubrió el material vegetal congelado con una capa de 1 ml de buffer de descomposición (1 ml de buffer CTAB, 100 µl de buffer de N-laurilsarcosina, 20 µl de ß-mercaptoetanol, y 10 µl de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60°C durante una hora con agitación continua. El homogenado obtenido se distribuyó en dos vasos de Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por agitación con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamilico (24:1). Para la separación de fases se realizó centrifugación a 8000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. Luego se precipitó el ADN a -70°C durante 30 minutos con isopropanol helado. El ADN precipitado se sedimentó a 4°C y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 µl de buffer TE (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0- 87969-309-6) . Para ulterior purificación se trató el ADN con NaCl (1,2 M de concentración final) y se volvió a precipitar a -70°C durante 30 minutos con dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con 70% de etanol, se secó el ADN y luego se recuperó con 50 µl de H2O + RNAsa (50 mg/ml de oncentración final) . El ADN se disolvió durante la noche a 4°C, y luego se realizó la digestión con ARNsa a 37°C durante 1 hora. Se almacenó el ADN a 4°C.

Ejemplo 3 - Aislamien to de ARN íoíal y consírucción de biblioíeca de pol i - (A) + ARN y cADN bibl ioíeca de Physcomi trella pa tens . Para la investigación de las transcripciones se aisló ARN total y ARN poli- (A) +. El ARN total se obtuvo de protonema de tipo salvaje de 9 días, después del método de GTC- (Reski et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-359). Se aisló el ARN Poli (A) + mediante Dyna BeadsR (Dynal, Oslo, Noruega) según las instrucciones del protocolo del fabricante. Después de determinar la concentración del ARN o del ARN poli(A)+, se precipitó ARN por adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M pH 4 , 6 y 2 volúmenes de etanol, y se almacenó a -70°C.

Para la construcción de la biblioteca de cADN se logró la síntesis de la primera cadena mediante transcriptasa inversa de virus de leucemia murina (Roche, Mannheim, Alemania) y oligo-d (T) -cebadores , la síntesis de la segunda cadena por incubación con DNA polimerasa I, enzima de Klenow y digestión con RNAseH a 12°C (2 horas), 16°C (1 hora), y 22°C (1 hora). La reacción se detuvo por incubación a 65°C (10 minutos) y luego se transfirió sobre hielo. Las moléculas de ADN bicatenario se unieron mediante T4-ADN- (Roche, Mannheim) a 37°C (30 minutos). Se retiraron los nucleótidos por extracción con fenol/cloroformo y columnas de huso de Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos del cADN mediante la T4-ADN-ligasa (Roche, 12°C, durante la noche) y se fosforilaron por incubación con la polinucleótido cinasa (Roche, 37°C, 30 minutos) . Esta mezcla se sometió a separación en gel de agarosa de bajo punto de fusión. Las moléculas de ADN mayores de 300 pares de bases se eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, se concentraron con columnas de Elutip-D (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania), y se ligaron a los brazos del vector y se empaquetaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express con Gigapack Gold Kit (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) con el material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4 - Deíerminación de secuencia y no íación de la función de EST de Physcomi írella pa íens . Las bibliotecas de cADN descritas en el Ejemplo 3 se usaron para determinar la secuencia de ADN de acuerdo con métodos estándar, y en particular, mediante el método de terminación de cadena con ABl PRISM Big Dye Terminator Ciclo Sequencing Ready Reacción Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania) . Se realizaron determinaciones de secuencias al azar después de preparar la recuperación del plásmido de preparación a partir de las bibliotecas de cADN mediante escisión de masa in vivo, retransformación, y posterior plaqueado de DH10B en placas de agar (material y detalles del protocolo de Stratagene, Amsterdam, Paises Bajos) . Se preparó ADN plásmido a partir de cultivo de 24 horas de E . col i cultivados en medio Luria-Broth que contiene ampicilina (Ver Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de ADN Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo los protocolos del fabricante. Se usaron cebadores de secuencia con las siguientes secuencias de nucleótidos : 5 ' -CAGGAAACAGCTATGACC-3 SEQ I D N0 X 1 5 ' -CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3 ' SEQ I D NO : 22 5 ' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' SEQ ID NOX3 Las secuencias se procesaron y se anotaron con paquete de software EST-MAX provisto en el comercio por Bio-Max (Munich, Alemania) . El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos de importancia para la caracterización funcional y estructural de la secuencia de proteínas. Como referencia, ver el sitio web de pedan i . mips . biochem . mpg. de . Los principales algoritmos incorporados en EST-MAX son: FASTA (Very sensitive sequence datábase searches with estimates of statistical significance; Pearson, 1990, Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA, Métodos Enzymol. 183:63-98); BLAST (Very sensitive sequence datábase searches with estimates of statistical significance; Altschul et al., Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215:403-10); PREDATOR (High-accuracy secondary structure prediction from single and múltiple sequences; Frishman y Argos, 1997, 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins 27:329-335); CLUSTAL W (Múltiple sequence alignment; Thompson et al., 1994, CLUSTAL W (improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Research 22:4673-4680); TMAP (Transmembrane región prediction from múltiple aligned sequences; Persson y Argos, 1994, Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing múltiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237:182-192); ALOM2 (Transmembrane región prediction from single sequences; Klein et al., Prediction of protein function from sequence properties: A discrimínate analysis of a datábase. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Versión 2 by Dr. K. Nakai); PROSEARCH (Detection of PROSITE sequence of protein patterns; Kolakowski et al., 1992, ProSearch: fast searching of sequence of protein with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919-921); BLIMPS (Similitud searches against a datábase of ungapped blocks, Wallace y Henikoff, 1992); PATMAT (a searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8:249-254. Escrito por Bill Alford) .

Ejemplo 5 - Iden tificación de ORF de Physcomi trella pa tens correspondien tes a PpCK-1 , PpCK-2, PpCK-4 , y PpPK-4 . Se identificaron cADN parciales de Physcomi trella pa tens (EST) para PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, y PpPK-4 parciales Physcomi trella pa tens usando el programa EST-MAX a través del análisis BLAST. Estos clones particulares, que según se demostró codifican proteínas quinasas, se eligieron para continuar con los análisis.

Tabla 2 Grado de identidad de aminoácido y similitud de PpCK-1 y otras quinasas (se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Tabla 3 Grado de identidad de aminoácido y similitud de PpCK-2 y otras qumasas (se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Tabla 4 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpCK-4 y Otras quinasas (Se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Tabla 5 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpPK-4 y otras quinasas (Se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0.1; matriz de puntaje: blosum62) Ejemplo 6 - Clonación del cADN de longi tud toial de Physcomiírella pa iens que codifica PpCK-1 , PpCK-2, PpCK-4 , y PpPK-4 . Para aislar los clones que codifican PpCK-1 (SEQ ID NOX), PpCK-2 (SEQ ID NOX), PpCK-4 (SEQ ID NO ), y PpPK-4 (SEQ ID NOX) de longitud total de Physcomi trella pa tens , se crearon bibliotecas de cADN con el kit de amplificación de cADN SMART RACE (Clontech Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó como plantilla el ARN total aislado como se describió en el Ejemplo 3. Los cultivos se trataron antes del aislamiento de ARN de la siguiente manera: Estrés salino: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio suplementado con NaCl 1 M; estrés al frío: 4 °C en los mismos momentos que para la sal; estrés por sequía: los cultivos se incubaron en un papel filtrante seco en los mismos puntos temporales que anteriormente.

Protocolo 5' RACE - Se usaron las secuencias PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, y PpPK-4 identificadas a partir de la búsqueda en la base de datos tal como se indica en el Ejemplo 4, para designar oligos para RACE (ver Tabla 6) . Las secuencias extendidas para estos genes se obtuvieron llevando a cabo una rápida amplificación de los extremos de cADN por reacción en cadena de polimerasa (RACE PCR) , haciendo uso del equipo Advantage 2 PCR (Clontech Laboratories) y el equipo de amplificación de cADN SMART RACE (Clontech Laboratories) con un termociclador Biometra T3 según las instrucciones del fabricante. Las secuencias obtenidas de las reacciones de RACE contenían el extremo 5' de las regiones codificadoras de PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, y PpPK-4 y se usaron para designar oligos para clonación de longitud total del respectivo gen (ver más abajo en "amplificación de longitud total") .

Amplificación de longitud total. Se obtuvieron clones de longitud total correspondientes a PpCK-1, PpCK-2, y PpCK-4 al llevar a cabo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores específicos de genes (Ver Tabla 6) y EST original como plantilla. Las condiciones para la reacción eran condiciones estándar con polimerasa de ADN PWO (Roche) . La PCR se llevó a cabo de acuerdo con las condiciones estándar y según los protocolos del fabricante (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.° Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Biometra T3 Thermociclor ) . Los parámetros para la reacción fueron: cinco minutos a 94 °C seguido de cinco ciclos de un minuto a 94 °C, un minuto a 50 °C y 1,5 minutos a 72°C.

Se aislaron clones de longitud total para PpPK-4 (SEQ ID NO ) al repetir el método RACE, pero con los cebadores específicos de gen dados en la Tabla 6.

Los fragmentos amplificados se extrajeron de gel de agarosa con un equipo de extracción de gel QIAquick (Qiagen) y se ligaron a un vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transformaron los vectores recombinantes en células ToplO (Invitrogen) usando condiciones estándar (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2.° Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Las células transformadas se seleccionaron para agar LB que contenía 100 µg/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactósido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-ß-D-galactóxido) cultivado durante la noche a 37 °C . Se seleccionaron las colonias blancas y se usaron para inocular 3 ml de LB liquido que contenía 100 µg/ml de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C . Los ADN de plásmido se extrajeron usando el equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo análisis de los clones posteriores y el mapeo de restricción de acuerdo con las técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2° edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) .

Tabla 6 Esquema y cebadores usados para la clonación de clones de longitud total Ejeemplo 7 - Identificación de ORF de Saccharomyces cerevísiae correspondien te a ScCK-1 . El gen ORF 760 de Sa ccharamyces cerevisiae , codificador de caseína quinasa I, fue descrita por primera vez en la solicitud de patente europea NX 03022225.1 por Metanomics, Inc., presentada el 30 de setiembre de 2003. Así se incorpora la solicitud de patente de Metanomics en su totalidad como referencia. El gen ORF 760 se aisló con el protocolo estándar de Pfu ADN polimerasa o una mezcla de PfuITaq ADN polimerasa (Herculase) para el procedimiento de la amplificación. Los fragmentos amplificados de ORF se analizaron mediante electroforesis en gel . Cada cebador consistió en un extremo 5' universal y un extremo 3' ORF, por lo que las secuencias universales difieren en los cebadores hacia delante y de reversa (la secuencia hacia delante contiene un EcoRI para levaduras o Smal para E. coli y la secuencia cebadora de reversa Smal para levaduras o Sacl para E. coli) lo cual permite una clonación a unidireccional. Las reacciones de PCR para la amplificación incluyen: lx buffer PCR, 2 mM de dNTP, 100 ng de ADN genómico de Sa ccharomyces cerevisiae (S288C) o 60 ng de ADN genómico de Escherichia col i K-12 (MG1655) , 25 pmol de cebador de reversa, 2,5 u ADN polimerasa Pfu o Herculase. 1 ciclo durante 3' a 94°C; seguido de 25 ciclos de 30" a 94°C, 30" a 55°C, y 5-6' a 72°C; seguido de 1 ciclo durante 610' a 72°C, luego a 4°C indefinidamente. La secuencia hacia adelante para ScCK-1 (ORF 760) es 5'-GGAATTCCAGCTGACCACCA TGTCCCAACGATCTTCACAACAC-3' (SEQ ID NOX3). La secuencia de reversa para ScCK-1 (ORF 760) es 5'-GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAAAAAAAAAAAGGAAAAA GAGAAAAG-3' (SEQ ID NOX4).

Ejemplo 8 - Iden tificación de ORF de Brassica napus correspondien te a BnCK-1 , BnCK-2 , BnCK-3 , BnCK-4 , y BnCK-5 : cosecha de tejido, aislamiento de ARN, y construcción de biblioteca de cADN . Se cultivaron plantas de cañóla en diversas condiciones y tratamientos, y se cosecharon diferentes tejidos en distintos estadios de desarrollo. El cultivo y la cosecha de plantas se llevaron a cabo en forma estratégica, a fin de maximizar la probabilidad de cosechar todos los genes expresables genes en al menos una o más de las bibliotecas obtenidas. El mARN se aisló como se describe en el Ejemplo 3 a partir de cada una de las muestras reunidas, y se construyeron las bibliotecas de cADN . No se usaron pasos de amplificación en el proceso de producción de la biblioteca a fin de minimizar la redundancia de genes dentro de la muestra y retener la información de la expresión. Todas las bibliotecas se generaron a partir de 3' con mARN purificado en columnas de oligo dT . Las colonias de la transformación de la biblioteca de cADN en E . col i se juntaron al azar y se colocaron en placas de microtitulación.

Hibridación de sondas. El ADN de plásmido se aisló de colonias de E . coli y luego se aplicó sobre membranas. Se híbrido en secuencia una batería de 288 oligonucleótidos 7mer con marca radiactiva 33P a estas membranas. A fin de aumentar el resultado se procesaron membranas por duplicado. Después de cada hibridación se capturó una imagen de blot durante un barrido de imágenes de fósforo, a fin de generar un perfil de hibridación para cada oligonucleótido. Esta imagen de datos en crudo ser transfirió automáticamente vía LIMS a una computadora. Se mantuvo la identidad absoluta mediante código de barras del cásete de imagen, el filtro y la orientación dentro del cásete. Los filtros luego se trataron con condiciones levemente moderadas, a fin de separar las sondas ligadas y se volvieron a las cámaras de hibridación para otra ronda de hibridación. El ciclo de hibridación y de imagen se repitió hasta completar el conjunto de 288 oligómeros.

Después de completar las hibridaciones se generó un perfil para cada mancha (que representa una inserción de cADN) referido a los 288 oligonucleótidos 7-mer con marca radiactiva 33P unidos a esa mancha particular (inserción de cADN) , y el grado. Este perfil se define como la firma generada a partir de dicho clon. Se comparó la firma de cada clon con todas las demás firmas generadas a partir del mismo organismo, a fin de identificar cúmulos de firmas relacionadas. Este proceso "clasifica" todos los clones provenientes de un organismo en cúmulos antes de realizar la secuencia.

Aislamiento del gen. Los clones se clasificaron en diversos cúmulos en base a firmas de hibridación idénticas o similares. Un cúmulo deberla indicar la expresión de cada gen individual o familia de genes. Un subproducto de dicho análisis es un perfil de expresión para la abundancia de cada gen en una biblioteca particular. Se usó determinación de secuencia de una via a partir del extremo 5', a fin de predecir la función de los clones particulares por búsquedas de similitud y motivos en bases de datos de secuencias .

La secuencia de ADN de longitud total de ScCK-1 de Sa ccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO ) se comparó con bases de datos contig propios de cañóla con valor E de E-10. (Altschul, Stephen et al., Gapped BLAST y PSI_BLAST: a new generación of protein datábase search program, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Todos los aciertos contig se analizaron para determinar las posibles secuencias de longitud total, y se determinaron en su totalidad las secuencias de los clones más largos que representan los posibles contig de longitud total. Cinco de dichos contig aislados de las bases de datos contig propias son BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5. La homologia de las secuencias de aminoácidos BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5 con el arte previo mejor conocido se indica en las Tablas 8-12.

Tabla 8 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de BnCK-1 y una proteína similar (Se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Tabla 9 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de BnCK-2 y una proteína similar (Se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Tabla 10 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de BnCK-3 y una proteína similar (Se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Tabla 11 Grado de identidad y similitud de aminoácidos de BnCK-4 y una proteina similar (Se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Tabla 12 ? Grado de identidad y similitud de aminoácidos de BnCK-5 y una proteína similar (Se usó comparación por pares: penalidad de brecha: 10; penalidad de extensión de brecha: 0,1; matriz de puntaje: blosum 62) Ejemplo 9 - Plantas de Arabidopsis tolerantes a estrés por ingeniería por sobreexpresión de los genes de PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, PpPK-4, ScCK-1, BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5: Construcción de vector binario: pBPS-JHOOl. Las construcciones de plásmido pLMNC53 (Mankin, 2000, tesis de doctorado, University of North Carolina) se digirieron con HindIII (Roche) y extremos romos rellenos con enzima de Klenow y 0,1 mM de dNTP de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este fragmento se purificó con gel de agarosa y se extrajo mediante el equipo de extracción QIAquick Gel (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado luego se digirió con EcoRI (Roche) , se purificó con gel de agarosa y se extrajo mediante el equipo de extracción QIAquick Gel (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de 1,4 kilobases obtenido, el cásete de gentamicina, incluyó el promotor nos, el gen aacCI, y el terminador gl .

El vector pBlueScript se digirió con EcoRI y Smal (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el fragmento obtenido se extrajo de gel de agarosa con un equipo de extracción QIAquick Gel (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El vector pBlueScript digerido y los fragmentos del cásete gentamicina se ligan T4 ADN Ligasa (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, por lo que se unen los dos respectivos sitios EcoRI y el sitio de extremo romo HindIII con el sitio Smal .

El vector recombinante (pGMBS) se transformó en células ToplO (Invitrogen) mediante condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionan en agar LB que contiene 100 µg/ml de carbenicilina, 0,8 mg X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactósido) y 0,8 mg IPTG (isopropiltio-ß-D-galactósido) , cultivados durante la noche a 37°C. Se seleccionan colonias blancas y se usan para inocular 3 ml de LB liquido que contiene 100 µg/ml de ampicilina y se cultivan durante la noche a 37°C. El ADN plásmido se extrae con QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron análisis de los clones obtenidos y el mapeo de restricción de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2° Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) .

Los vectores pGMBS y plbxSuperGUS se digirieron con Xbal y Kpnl (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, por lo que se extrae el cásete de gentamicina de pGMBS y se produce el esqueleto del vector plbxSuperGUS . Los fragmentos obtenidos se extraen de gel de agarosa con un equipo de extracción QIAquick Gel (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos dos fragmentos se ligan mediante T4 ADNligasa (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El vector recombinante obtenido (pBPS-JHOOl) se transformó en células ToplO (Invitrogen) mediante condiciones estándar. Se seleccionan las células transformadas en agar LB que contiene 100 µg/ml de carbenicilina, 0,8 mg X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactósído) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-ß-D-galactósido) cultivado durante la noche a 37 °C . Se seleccionaron colonias y se usaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenia 100 µg/ml de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C . Los ADN de plásmido se extrajeron usando el equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo análisis de los clones posteriores y el mapeo de restricción de acuerdo con las técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2° Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) .

Subclonación de PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, PpPK-4, ScCK-1, BnCK-1, BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4, y BnCK-5 en el vector binario. Los fragmentos que contenían las diferentes proteinas G de tránsito vesicular de Physcomi trella pa tens se extrajeron de los vectores recombinantes PCR2.1 TOPO por doble digestión con enzimas de restricción (ver Tabla 13) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Los posteriores fragmentos se retiraron del gel de agarosa con un equipo de extracción de gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se ligaron con los vectores binarios, se escindieron con enzimas adecuadas (Ver Tabla 13) , y se desfosforilaron antes de la ligadura. Los vectores recombinantes obtenidos contenían las correspondientes caseína quinasa en la orientación con sentido bajo el control del superpromotor constitutivo.

Tabla 13 Se enumeran los nombre de las construcciones de las caseína quinasas de Physcomi irella pa iens usadas para la transformación de plantas.

Subclonación de ScCK-1 en el vector binario. El gen ScCK-1 se clonó en un vector binario que contiene el gen bar impulsado por el promotor masl en su T-ADN (Velten et al., 1984, EMBO J. 3: 2723-2730; Mengiste, et al., 1997, Plant J., 12: 945-948). El T-ADN contenia un promotor constitutivo en frente a un cásete de clonación seguido del terminador nos (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 ( 6) : 561-573 ) . El cásete de clonación consistió en la secuencia: 5'-GGAATTCCAGCTGACCACCATGGC AATTCCCGGGGATC -3' (SEQ ID NO: 37) . Otros sistemas de selección y promotores son conocidos en el arte y capaces de modo similar de ser usados en la presente invención (por ejemplo, marcador AHAS, promotor de ubicuitina (Callis et al., J. Biol. Chem. 1990, 265:12486-12493; US 5.510.474; US 6.020.190; Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684), promotor 34S (Números de acceso de GenBank M59930 y X16673) .

El vector binario y el gen ORF 760 (100 ng) se digirieron con EcoRI y Smal mediante el protocolo estándar provisto por el proveedor (MBI Fermentas, Alemania) . El gen ORF 760 se purificó con una columna Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania) , y se ligó con el vector binario de restricción digerido (30 ng) mediante procedimientos estándar (Maniatis et al.).

Transformación de Agrobacterium . Los vectores recombinantes se transformaron en Agrobacteri um íumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990; Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396).

Transformación de plantas. Se cultivaron plantas de Arabidopsis . thaliana ecotipo C24 y se transformaron de acuerdo con condiciones estándar (Bechtold, 1993, Acad. Sci. Paris. 316:1194-1199; Bent et al., 1994, Science 265:1856-1860).

Control de plantas transformadas que comprenden genes de Physcomi trella . Las semillas TI se esterilizaron de acuerdo con protocolos estándar (Xiong et al., 1999, Plant Molecular Biology Repórter 17: 159-170) . Las semillas se plaquearon en medios Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich), 0,6% de agar y se suplementaron con 1% de sacarosa y 2 µg/ml benomilo (Sigma-Aldrich) . Se vernalizaron semillas en placas durante cuatro días a 4 °C . Las semillas germinaron en una cámara climática a una temperatura ambiente de 22 °C y una intensidad lumínica de 40 micromoles m2s (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Se seleccionaron plantines transformados después de 14 días y se transfirieron a placas con medio ^ MS suplementado con 0,6% de agar, 1% de sacarosa, y se dejaron recuperar durante cinco a siete días.

Control de tolerancia a sequia de plantas transformadas que comprenden genes de Physcomi írella . Semillas TI germinadas se transfirieron a papel de filtro seco estéril en una placa de Petri y se dejaron secar durante dos horas a 80% RH (humedad relativa) en un Gabinete de crecimiento Sanyo MLR-350H, micromoles rrf2 s"1 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) . Luego se disminuyó la RH a 60%, y se desecaron las semillas germinadas durante otras ocho horas. Luego se retiraron las semillas germinadas y se colocaron en placas con medio MS 0,6% de agar suplementado con 2 µg/ml de benomilo (Sigma-Aldrich) y se calificaron después de cinco días. Luego se determinó en las plantas transgénicas el aumento de la tolerancia a sequía.

En condiciones de estrés por sequía, las plantas de Arabidopsis íhaliana con sobreexpresión de PpCK-1- mostraron una tasa de supervivencia del 50% al estrés por sequia (5 sobrevivientes de 10 plantas sometidas a estrés), las plantas de Arabidopsis íhal iana con sobreexpresión de PpCK-2 mostraron una tasa de supervivencia del 52% al estrés por sequia (16 sobrevivientes de 31 plantas sometidas a estrés), y las plantas de Arabidopsis íhal iana con sobreexpresión de PpCK-4 mostraron una tasa de supervivencia del 14% al estrés por sequía (1 sobreviviente de 7 plantas sometidas a estrés) , comparado con el 11% de tasa de supervivencia demostrado por las plantas control no transformadas (1 sobreviviente de 9 plantas sometidas a estrés) .

Las plantas transgénicas de Arabidopsis que comprenden el gen ScCK-1 se controlaron por su tolerancia a sequia en tres experimentos diferentes. En el primer experimento, las plantas se sometieron a un período de doce días de condiciones de sequía.

Después de doce días, se controlaron las plantas transgénicas para determinar el aumento de tolerancia a sequia. Las plantas transgénicas que contienen un transgen ScCK-1 (11 plantas) retuvieron viabilidad, tal como se demuestra por su aspecto túrgido y el mantenimiento del color verde, durante un promedio de 2,2 días después de la planta control de tipo salvaje no transformada.

En el segundo experimento se usó una planta de varias líneas transgénicas independientes. Plantas transgénicas de tres semanas que contenían el transgén ScCK- se sometieron a condiciones de estrés por sequia. Las plantas transgénicas que contenían el transgen ScCK-1 (6 plantas) retuvieron la viabilidad, como se demuestra por su aspecto túrgido y el mantenimiento del color verde, durante un promedio de 0,3 dias después de la planta control de tipo salvaje no transformada.

En el tercer experimento se usaron varias plantas de una línea transgénica independiente. Plantas transgénicas de tres semanas que contenían el transgen ScCK-1 se sometieron a condiciones de estrés por sequía. Los resultados se muestran en la Tabla 14. Las plantas transgénicas que contenían el transgen ScCK-1 retuvieron un rendimiento fotosintético significativamente superior a la planta control de tipo salvaje no transformada. Para ScCK-1, se listan los resultados promedio de 5 réplicas de plantas; para las plantas de tipo salvaje, se listan los resultados promedio de 20-25 plantas.

Tabla 14 Control de tolerancia al congelamiento de plantas transformadas que comprenden genes de Physcomi írella . Las semillas germinadas se llevaron a placas de Petri que contenían MS 0,6% de agar suplementado con 2% de sacarosa y 2 µg/ml de benomilo. Después de cuatro días, se incubaron las semillas germinadas a 4°C durante 1 hora y luego se cubrieron con hielo picado. Luego se colocaron las semillas germinadas en una cámara ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron durante 3,5 horas, desde -1,0°C, y con disminuciones de -1°C cada hora. Luego se incubaron las semillas germinadas a -5,0°C durante 24 horas y luego se dejaron descongelar a 5°C durante 12 horas. Se volcó el agua y se calificaron las semillas germinadas después de 5 días.

Las plantas transgénicas se controlaron para determinar su mayor tolerancia a frió, lo cual demuestra que la expresión transgénica confiere tolerancia al frió. En condiciones de estrés por congelamiento, las plantas de Arabidopsis ihal iana con sobreexpresión de PpCK-1 demostraron un 100% de tasa de supervivencia al estrés por congelamiento (14 sobrevivientes de 14 plantas sometidas a estrés), comparado con la tasa de supervivencia del 2% demostrado por las plantas control no transformadas (1 sobreviviente de 48 plantas sometidas a estrés).

Análisis de tolerancia a contenido salino. Las semillas germinadas se transfirieron a papel de filtro humedecido en MS y se colocaron en MS con 0,6% de agar suplementado con 2 µg/ml de benomilo la noche antes del control de tolerancia a salinidad. Para el control de tolerancia a salinidad, el papel de filtro con las semillas germinadas se movieron a pilas de papel de filtro humedecidas en 50 mM de NaCl, en una placa de Petri. Después de dos horas se llevó el papel de filtro con las semillas germinadas a pilas de papel de filtro humedecido con 200 mM de NaCl, en una placa de Petri . Después de dos horas se llevó el papel de filtro con las semillas germinadas a pilas de papel de filtro humedecido con 600 mM NaCl, en una placa de Petri. Después de 10 horas, las semillas germinadas se llevaron a placas de Petri que contienen MS con 0,6% de agar suplementado con 2 µg/ml de benomilo. Las semillas germinadas se calificaron después de 5 dias .

Las plantas transgénicas que sobreexpresan el transgén se controlan para determinar el aumento de la tolerancia a salinidad, por lo que se demuestra que la expresión del transgén confiere tolerancia a salinidad. En condiciones de estrés por congelamiento, las plantas de Arabidopsis íhal iana con sobreexpresión de PpCK-1 demostraron un 0% de tasa de supervivencia al estrés por congelamiento (0 sobrevivientes de 20 plantas sometidas a estrés), las plantas de Arabidopsis íhaliana con sobreexpresión de PpCK-2 demostraron un 10% de tasa de supervivencia al estrés por congelamiento (1 sobrevivientes de 10 plantas sometidas a estrés), y las plantas de Arabidopsis thal iana con sobreexpresión de PpCK-4 demostraron un 0% de tasa de supervivencia al estrés por congelamiento (0 sobrevivientes de 6 plantas sometidas a estrés), comparado con el 13% de tasa de supervivencia demostrado por las plantas control no transformadas (3 sobrevivientes de 23 plantas sometidas a estrés) .

Control del crecimiento en condiciones limitadas de agua. Los genes PpCK-1, PpCK-2, PpCK-4, y PpPK-4 mostraron sobreexpresión de Arabidopsis thaliana bajo el control de un superpromotor constitutivo. Las líneas transgénicas se analizaron para determinar la eficiencia de uso de agua (WUE) , y algunas de las lineas se analizaron para el ciclado de biomasa tras la sequía (Figura 8). SC024 representa el control de vector vacío, y BPS C24 representa el ecotipo de Arabidopsis usado para la transformación. DW indica peso seco, y E denota uso de agua por las plantas. Las letras en la columna de ensayos representan experimentos independientes .

Con un promotor constitutivo que impulsa la expresión y para las líneas transgénicas estudiadas, las lineas transgénicas EST 289 (PpCK-4) mostraron significativos aumentos en peso seco. Las líneas transgénicas EST 142 (PpPK-4) mostraron significativos aumentos en WUE y biomasa en condiciones de ciclos de sequia. EST194 (PpCK-1) mostraron significativos aumentos de biomasa en condiciones de ciclos de sequía. Para todos los transgenes aumentó la media de cada parámetro, comparado con los controles, 5-8% para WUE, 11-19% para DW, y 6-9% para E. La variación de fenotipo entre genes se puede explicar por la variación en el nivel de expresión de transgenes y el sitio de inserción del transgén. Se asignó una letra exclusiva para cada ensayo independiente.

Tabla 15 Se sobreexpresó ScCK-1 (ORF 760) en Arabidopsís thalíana bajo el control de un promotor constitutivo. Las lineas transgénicas se analizaron para determinar la tolerancia a desecación, al medir la cantidad promedio de días de supervivencia después de que murieran los controles de tipo salvaje.

Ejemplo 10 - Detección de los transgenes en las líneas transgénicas de Arabidopsis . A fin de verificar la presencia de transgenes en las líneas transgénicas de Arabidopsis, se realizó PCR en ADN genómico, que contamina las muestras de ARN obtenidas como se ejemplificó con anterioridad. Se usaron 2,5 microlitros de la muestra de ARN en una reacción de 50 µl PCR con Taq ADN polimerasa (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

El plásmido de vector binario con cada gen clonado se usó como control positivo, y se usó el ADN genómico C24 de tipo salvaje como control negativo en las reacciones de PCR. Se analizaron 10 µl de la reacción de PCR en 0,8% de gel de agarosa/ bromuro de etidio .

PpCK-1: Los cebadores usados en las reacciones son: GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC (SEQ ID NO: 38) GCGTTAACATGCCCATCTTCTCATACTCAGACC (SEQ ID NO : 39 ) El programa de PCR usado fue el siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 62°C y 4 minutos a 70°C, seguidos de 10 minutos a 72°C. Se obtuvo un fragmento de 1,7 kb del control positivo y las plantas transgénicas .

PpCK-2 : Los cebadores usados en las reacciones son : GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC (SEQ ID NO O) GCGTTAACCTTAGGAATCGTATGGCAGAGAGCT (SEQ ID NO : 41 ) El programa de PCR usado fue el siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 62°C y 4 minutos a 70°C, seguidos de 10 minutos a 72°C. Se obtuvo un fragmento de 1,9 kb del control positivo y las plantas transgénicas.

PpPK-4 : Los cebadores usados en las reacciones son : 5?TCCCGGGAGGCATTGAACTACCTGGAGTGAG3' (SEQ ID NO: 42) 5 ' GCGATATCGTTGAACTAGTAATCTGTGTTAACTTTATC3 ' (SEQ ID NOX3) El programa de PCR usado fue el siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 62°C y 4 minutos a 70°C, seguidos de 10 minutos a 72°C. Se obtuvo un fragmento de 1,7 kb del control positivo y las plantas transgénicas .

El transgén se amplificó con éxito a partir de las lineas transgénicas TI, pero no del tipo salvaje C24. Este resultado indica que las plantas transgénicas TI contienen al menos una copia del transgén. No hubo indicación de la existencia de genes idénticos o muy similares en el control no transformado de Arabidopsis íhal iana que se pudiera amplificar con este método a partir de las plantas de tipo salvaje.

Ejemplo 11 - Plañías de poroio de soja iol eranies a estrés por ingeniería , con sobreexpresión de los genes PpCK-1 , PpCK-2 , PpCK-4 , PpPK-4 , ScCK-1 , BnCK-1 , BnCK-2, BnCK-3, BnCK-4 , o BnCK-5. Semillas de poroto de soja se esterilizaron en superficie con 70% de etanol durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido de 20% (v/v) de Clorox suplementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos con agitación continua. Luego se enjuagaron las semillas 4 veces con agua destilada y se colocaron sobre papel de filtro humedecido en una placa de Petri temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Se pelaron las cubiertas de las semillas y se separaron los cotiledones del eje del embrión. Se examinó el eje del embrión para asegurar que no estaba dañada la región meristemática . Los ejes extraídos de los embriones se juntaron en una placa de Petri estéril semiabierta y se secaron al aire hasta un contenido de humedad inferior al 20% (peso fresco) en una placa de Petri sellada hasta su uso ulterior.

Se preparó el cultivo de Agrobacterium tumefa ciens a partir de una única colonia en medio LB sólido más los adecuados agentes de selección, seguido del crecimiento de la colona aislada en medio LB líquido hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,8. Luego se centrifugó el cultivo bacteriano a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 100 µM de acetosiringona . Los cultivos bacterianos se incubaron en este medio de preinducción durante 2 horas a temperatura ambiente antes de su uso. Los ejes de embriones de semillas cigóticas de poroto de soja con aproximadamente 15% de contenido de humedad se imbibieron durante 2 horas a temperatura ambiente con la suspensión del preinducido de Agroba cteri um . Los embriones se extrajeron del cultivo de imbibición y se transfirieron a placas de Petri que contienen medio MS sólido suplementado con 2% de sacarosa y se incubaron durante 2 días en la oscuridad a temperatura ambiente. Como alternativa, se colocaron los embriones sobre papel de filtro estéril humedecido (medio MS liquido) en una placa de Petri y se incubaron en las mismas condiciones antes descritas. Tras este período, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido suplementado con 500 mg/L de carbenicilina o 300 mg/L de cefotaxima para matar la Agrobacteria . El medio líquido se usa para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25°C, con un fotoperíodo de 150 µmol m"2sec_1 y 12 horas. Una vez que las semillas germinadas produjeron raíces, se transfirieron a suelo estéril metromix. El medio de las plantas in vi tro se lavó antes de transferir las plantas a tierra. Las plantas se mantuvieron bajo cubierta plástica durante 1 semana para favorecer el proceso de aclimatación. Luego se transfirieron las plantas a una sala de crecimiento donde se incubaron a 25°C, con 150 µmol m"2sec_1 de intensidad de luz y fotoperiodo de 12 horas durante aproximadamente 80 días .

Las plantas transgénicas se analizaron para determinar el aumento de tolerancia a sequía, contenido salino, y/o frió de acuerdo con el método de análisis descrito en el Ejemplo 9, para demostrar que la expresión del transgén confiere tolerancia a estrés y/o aumento de la eficiencia de uso de agua.

Ejemplo 12 - Plan tas de semilla de col za/ cañóla íoleran ies a estrés por ingeniería con sobreexpresión de los genes PpCK-1 , PpCK-2 , PpCK-4 , PpPK-4 , ScCK-1 , BnCK-1 , BnCK-2 , BnCK-3, BnCK-4 , o BnCK-5. El método de transformación vegetal descrito en la presente también se aplica a Brassica y otros cultivos. Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie con 70% de etanol durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido de 20% (v/v) de Clorox suplementado con 0,05 % (v/v) de Tween durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. Luego se enjuagan 4 veces las semillas con agua destilada y se colocan en papel de filtro estéril humedecido en una placa de Petri a temperatura ambiente durante 18 horas. Luego se quitan las cubiertas de las semillas, y se dejan secar las semillas durante la noche en una placa de Petri estéril semiabierta. Durante este período, las semillas pierden aproximadamente 85% de su contenido de agua. Luego se guardan las semillas a temperatura ambiente en una placa de Petri sellada hasta su uso posterior. Las construcciones de ADN y la imbibición de embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Las muestras de plantas transgénicas primarias (TO) se analizan por PCR para confirmar la presencia de T-ADN. Estos resultados se confirman por hibridación Southern, en la cual se somete el ADN a electroforesis en 1% de gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nailon con carga positiva (Roche Diagnostics) . El equipo de síntesis de sondas PCR DIG (Roche Diagnostics) se usó para preparar una sonda con marca de digoxigenina por PCR, y se usó según las recomendaciones del fabricante.

Las plantas transgénicas se analizan para determinar el aumento de tolerancia a estrés de acuerdo con el método de análisis descrito en Ejemplo 9, lo cual demuestra que la expresión transgénica confiere tolerancia a estrés y/o aumento de la eficiencia de uso de agua.

Ejemplo 13 - Plañ ías de maí z ioleran ies a esírés por ingeniería con sobreexpresión de los genes PpCK-1 , PpCK-2, PpCK-4 , PpPK-4 , ScCK-1 , BnCK-1 , BnCK-2 , BnCK-3, BnCK-4 , o BnCK-5. La transformación de maíz (Zea Mays L.) con el gen de interés se realiza por el método descrito por Ishida et al., 1996, Nature Biotech. 14745-50. Se cocultivaron embriones inmaduros con Agroba cterium tumefaciens portadores de vectores "superbinarios", y se recuperaron plantas transgénicas por organogénesis. Este procedimiento provee una eficiencia de transformación de entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se estudian para determinar el aumento de la tolerancia a sequía, contenido salino, y/o frío de acuerdo con los métodos de análisis descritos en el Ejemplo 9, que demuestra que la expresión del transgén confiere tolerancia a estrés y/o aumento de la eficiencia de uso de agua.

Ejemplo 14 - Plan tas de trigo toleran tes a es trés por ingeniería con sobreexpresión de los genes PpCK-1 , PpCK-2, PpCK-4, PpPK-4 , ScCK-1 , BnCK-1 , BnCK-2, BnCK-3 , BnCK-4 , o BnCK-5. La transformación de trigo con el gen de interés se realiza por el método descrito por Ishida et al., 1996, Nature Biotech. 14745-50. Los embriones inmaduros se cocultivaron con Agroba cteri um tumefa ciens portador de vectores "superbinarios", y se recuperaron plantas transgénicas por organogénesis. Este procedimiento provee una eficiencia de transformación de entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se estudian para determinar el aumento la tolerancia a estrés de acuerdo con los métodos de análisis descritos en el Ejemplo 9, que demuestra que la expresión del transgén confiere tolerancia a estrés y/o aumento de la eficiencia de uso de agua.

Ejemplo 15 - Iden tificación de genes homólogos y heierólogos . Se pueden usar las secuencias de genes para identificar genes homólogos y heterólogos de cADN o bibliotecas genómicas. Los genes homólogos (por ejemplo, clones de cADN de longitud total) mediante hibridación de ácidos nucleicos con ejemplo bibliotecas de cADN . Según la abundancia del gen de interés, 100.000 a 1.000.000 bacteriófagos recombinantes se siembran y transfieren a membranas de nailon. Después de desnaturalizar con álcali se inmoviliza el ADN sobre la membrana, por ejemplo, por formación de enlaces cruzados UV. La hibridación ocurre con condiciones de alta rigurosidad. En solución acuosa se realiza hibridación y lavado con una concentración iónica de 1 M de NaCl y una temperatura de 68°C. Las sondas de hibridación se generan, por ejemplo, por marca radioactiva (3 p) de muescas de transcripción (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania) . Las señales se detectan por autorradiografía .

Los genes parcialmente homólogos o heterólogos relacionados pero no idénticos se pueden identificar en forma análoga al procedimiento antes descrito con hibridación de baja rigurosidad y condiciones de lavado. Para la hibridación acuosa, por lo general se mantiene la fuerza iónica en 1 M de NaCl mientras que se reduce gradualmente la temperatura de 68 a 42°C.

El aislamiento de las secuencias de genes con homologías (o identidad/similitud de secuencias) sólo en un dominio diferenciado (por ejemplo 10-20 aminoácidos) se puede llevar a cabo mediante sondas de oligonucleótidos sintéticos con marca radiactiva. Los oligonucleótidos con marca radiactiva se preparan por fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con T4 polinucleótidocinsa . Los oligonucleótidos complementarios se unen y se ligan para formar concatómeros . Los concatómeros bicatenarios luego se marcan con marca radiactiva, por ejemplo, por transcripción de muescas. Normalmente se realiza la hibridación en condiciones de baja rigurosidad mediante elevadas concentraciones de oligonucleótidos.

Solución de hibridación de oligonucleótidos: 6 x SSC 0,01 M de fosfato de sodio 1 mM de EDTA (pH 8) 0,5 % de SDS 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado 0,1 % de leche descremada deshidratada Durante la hibridación, se reduce la temperatura gradualmente a 5-10°C por debajo del Tm estimado del oligonucleótido, o hasta temperatura ambiente, seguido de pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con baja rigurosidad, por ejemplo 3 pasos de lavado con 4 x SSC. Ulteriores detalles se describen en Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 16 - Iden tifica ción de genes homólogos por anál isis de las bibliotecas de expresión con anticuerpos . Se pueden usar clones de cADN para producir proteínas recombinantes por ejemplo en E . col i (por ejemplo, sistema Qiagen QIAexpress pQE) . Normalmente luego se purifican las proteínas recombinantes por afinidad con cromatografía Ni-NTA por afinidad (Qiagen) . Luego se usan las proteínas recombinantes para producir anticuerpos específicos por ejemplo mediante técnicas estándar para la inmunización de conejo. Los anticuerpos se purifican por afinidad mediante una columna de Ni-NTA saturada con antígeno recombinante como se describe en Gu et al., 1994, BioTechniques 17:257-262. El anticuerpo se puede usar para analizar la expresión de las bibliotecas de cADN para identificar genes homólogos y heterólogos mediante análisis inmunológico (Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) .

Ejemplo 17 - Mutagénesis In vivo . Se puede realizar la mutagénesis in vivo de microorganismos por pasaje de ADN de plásmidos (u otro vector) a través de E . coli u otro microorganismo (por ejemplo, Bacill us spp . o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) con capacidad deteriorada para mantener la integridad de su información genética. Las típicas cepas mutantes tienen mutaciones en los genes del sistema de reparación de ADN (por ejemplo, mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia ver Rupp, W.D., 1996, DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella , p. 2277-2294, ASM: Washington.). Dichas cepas son bien conocidas por los expertos en el arte. El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M., 1994, Strategies 7:32-34. La transferencia de moléculas de AND mutado a plantas de preferencia se hace tras la selección y prueba en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de acuerdo con diversos ejemplos dentro de los ejemplos del presente documento.

Ejemplo 18 - Anál isis in vi tro de la función de los genes de Physcomi írella en organismos íransgénicos . La determinación de las actividades y los parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en el arte. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada deben estar hechos a la medida de la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo cual están dentro de la capacidad de un experto en el arte. Las generalidades de las enzimas, asi como los detalles específicos referidos a estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones, y ejemplos para la determinación de muchas de las actividades de las enzimas ser pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes referencias: Dixon, M., y Webb, E.C., 1979, Enzymes. Longmans : London; Fersht, 1985, Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L., 1982, Fundamentáis of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed., 1983, The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., 1994, Enzymkinetik, 2n ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., GraBl, M., eds., 1983-1986, Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; y Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1987, vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.

La actividad de las proteinas que se unen a ADN se puede medir mediante varios métodos bien establecidos, tales como los ensayos de cambio de banda de ADN (también denominados ensayos de retardo de gel) . El efecto de dichas proteínas sobre la expresión de otras moléculas se pueden medir mediante ensayos de genes informadores (tales como el descrito por Kolmar, H. et al., 1995, EMBO J. 14: 3895-3904 y sus referencias citadas). Los sistemas de pruebas de genes informadores son bien conocidos y se han establecido para aplicaciones en células procariontes y eucariontes, mediante enzimas tales como ß-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varios otros .

La determinación de la actividad de proteínas de transporte de membrana se puede realizar de acuerdo con las técnicas descritas en Gennis, R.B., 1989, Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes , Molecular Structure and Function, pp . 85-137, 199-234 y 270-322, Springer: Heidelberg.

Ejemplo 19 - Purificación del producío deseado a pariir de organismos írans formados . La recuperación del producto deseado del material vegetal (es decir, Physcomi trella pa tens o Arabidopsis thal iana ) , hongos, algas, ciliados, células de C. gl uíamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente, o el sobrenadante de los cultivos antes descritos se puede realizar por diversos métodos bien conocidos en el arte. Si el producto deseado no es secretado por las células, se pueden cosechas las células del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y se pueden lisar las células mediante técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o sonicación. Los órganos de las plantas se pueden separar por medios mecánicos de otros tejidos u órganos. Tras la homogenización, se extrae los restos celulares por centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para la ulterior purificación del compuesto buscado. Si el producto es secretado por la célula deseada, entonces se extraen las células del cultivo por centrifugación a baja velocidad y se retiene la fracción sobrenadante para su ulterior purificación .

La fracción sobrenadante de cualquiera de los métodos de purificación es sometida a cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula de interés es retenida en una resina de cromatografía mientras muchas de las impurezas de la muestra no se retienen, o las impurezas son retenidas por la resina, mientras que la muestra no lo es . Dichos pasos de cromatografía se pueden repetir según necesidad, con la misma resina o con resinas de cromatografía diferentes. Un experto en el arte estará bien versado en la selección de las resinas de cromatografía adecuadas y su más eficaz aplicación para purificar una molécula particular. El producto purificado se puede concentrar por filtración o ultrafiltración, y guardar a una temperatura a la cual se maximiza la estabilidad del producto.

Existe una amplia gama de métodos de purificación conocidos en el arte y el anterior método de purificación no pretende ser limitante. Dichas técnicas de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, 1986, D.F. Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-Hill: Nueva York. Además, la identidad y la pureza de los compuestos aislados se pueden evaluar mediante técnicas estándar en el arte. Estas incluyen cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía de capa fina, NIRS, ensayos enzimáticos, o microbiológicos . Dichos métodos de análisis se revisan en: Patek et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al., 1996, Biotekhnologiya 11:27-32; y Schmidt et al., 1998, Bioprocess Engineer. 19:67-70; Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1996, vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581, y p. 581-587; Michal, G., 1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallón, A. et al., 1987, Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol . 17.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula de planta transgénica transformada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido se define en SEQ ID NOX.

2. La célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido como se define en SEQ ID NOX.

3. Una célula de planta transgénica transformada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde la expresión del polipéptido de la célula vegetal da por resultado aumento de tolerancia en la célula vegetal a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequia y temperatura inferior o igual a 0°C, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal; en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas a al menos una secuencia del grupo que consiste en una secuencia de SEQ ID NOX y el complemento de longitud total de la secuencia de SEQ ID NOX; y en donde las condiciones rigurosas comprenden hibridación en una solución 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 65°C.

4. Una célula de planta transgénica transformada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia con un polipéptido como se define en SEQ ID NOX, en donde la expresión del polipéptido en la célula vegetal da por resultado el aumento de tolerancia en la célula vegetal a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C, comparado con la variedad salvaje de la célula vegetal.

5. Una planta transgénica que comprende la célula de planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4.

6. Una semilla que comprende la célula de planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4.

7. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula vegetal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, en donde la semilla comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido, en donde la semilla es un cultivo verdadero para un aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal, y en donde el estrés ambiental se selecciona de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C.

8. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido como se define en SEQ ID NO .

9. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el ácido nucleico comprende el polinucleótido como se define en SEQ ID NO .

10. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, en donde la expresión del polipéptido en la célula vegetal da por resultado el aumento de tolerancia de la célula vegetal a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal; en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas a al menos una secuencia de SEQ ID NO y el complemento de longitud total de la secuencia de SEQ ID NOX; y en donde las condiciones rigurosas comprende hibridación en una solución 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 65°C.

11. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido como se define en SEQ ID NOX, en donde la expresión del polipéptido en la célula vegetal da por resultado el aumento de tolerancia de la célula vegetal a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal.

12. Una semilla que comprende el ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 10 u 11.

13. Un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 10 u 11, en donde la expresión del polipéptido en una célula vegetal da por resultado el aumento de tolerancia en la célula vegetal a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal, y donde el estrés ambiental se selecciona de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C.

14. Un método para producir una planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que comprende, a. transformar una célula vegetal con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 13; y b. generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica que exprese el polipéptido; en donde el polipéptido se define en SEQ ID NO

15. Un método para producir una planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde la expresión del polipéptido en la planta da por resultado el aumento de la tolerancia en la planta a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende a. transformar una célula vegetal con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 13; y b. generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica que exprese el polipéptido; en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas a al menos una secuencia del grupo que consiste en una secuencia de SEQ ID NOX y el complemento de longitud total de la secuencia de SEQ ID NOX; en donde las condiciones rigurosas comprenden hibridación en una solución 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 65°C; y en donde el estrés ambiental se selecciona de uno o más del grupo que consiste en sequía o temperatura inferior o igual a 0°C.

16. Un método para producir una planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde la expresión del polipéptido en la planta da por resultado un aumento a la tolerancia a un estrés ambiental en la planta, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende a. transformar una célula vegetal con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación Claim 13; y b. generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica que exprese el polipéptido, en donde el polipéptido tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido definido en SEQ ID NOX, y en donde el estrés ambiental se selecciona de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C.

17. Una célula de planta transformada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 50% de identidad de secuencia con el dominio central de proteina quinasa de un polipéptido como se define en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO, en donde la expresión del polipéptido en la célula vegetal da por resultado el aumento de tolerancia en una planta a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequía o temperatura inferior o igual a 0°C, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal .

18. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido con un dominio central de proteína quinasa que comprende: a. una primera región que comienza con un residuo glicina en la posición 1 y que tiene un residuo glicina en la posición 3 y un residuo fenilalanina en la posición 5; b. una segunda región corriente debajo de la primera región, que comienza con un residuo valina en la posición 1 y que tiene lisina en la posición 4, un residuo glutamato en la posición 6, un residuo glutamina en la posición 14, un residuo leucina en la posición 15, un residuo glutamato en la posición 18, un residuo tirosina en la posición 22, un residuo prolina en la posición 32, un residuo glicina en la posición 38, un residuo asparagina en la posición 44, un residuo leucina en las posiciones 50 y 51, un residuo glicina en la posición 52, un residuo prolina en la posición 53, un residuo leucina en la posición 55, un residuo leucina en la posición 58, un residuo fenilalanina en la posición 59, un residuo cisteína en la posición 62, un residuo fenilalanina en la posición 66, un residuo lisina en la posición 69, un residuo treonina en la posición 70, un residuo glutamina en la posición 77, un residuo isoleucina en la posición 79, un residuo histidina en la posición 86, un residuo arginina en la posición 93, un residuo ácido aspártico en la posición 94, un residuo lisina en la posición 21E 96, un residuo prolina en la posición 97, un residuo asparagina en la posición 99, un residuo fenilalanina en la posición 100, y un residuo leucina en la posición 101; c. una tercera región que se encuentra corriente debajo de la segunda región, que comienza con un residuo de ácido aspártico en la posición 1, y que tienen un residuo alanina en la posición 5, un residuo lisina en la posición 6, un residuo tirosina en la posición 8, un residuo ácido aspártico en la posición 10, un residuo treonina en la posición 13, un residuo histidina en la posición 16, un residuo isoleucina en la posición 17, un residuo prolina en la posición 18, un residuo tirosina en la posición 19, un residuo arginina en la posición 20, un residuo lisina en la posición 23, un residuo glicina en la posición 27, un residuo treonina en la posición 28, un residuo alanina en la posición 29, un residuo arginina en la posición 30, un residuo tirosina en la posición 31, un residuo serina en la posición 33, un residuo asparagina en la posición 35, un residuo histidina en la posición 37, un residuo glicina en la posición 39, un residuo glutamato en la posición 41, un residuo serina en la posición 43, un residuo arginina en la posición 44, un residuo arginina en la posición 45, un residuo ácido aspártico en la posición 46, un residuo ácido aspártico en la posición 47, un residuo glutamato en la posición 49, un residuo glicina en la posición 52, un residuo tirosina en la posición 57, un residuo fenilalanina en la posición 58, un residuo leucina en la posición 63, un residuo prolina en la posición 64, un residuo triptófano en la posición 65, un residuo glutamina en la posición 66, y un residuo glicina en la posición 67, y d. una cuarta región que se encuentra corriente debajo de la tercera región, que comienza con un residuo prolina en la posición 1, y que tiene un residuo arginina en la posición 12, un residuo leucina en la posición 14, un residuo fenilalanina en la posición 16, un residuo prolina en la posición 20, un residuo ácido aspártico en la posición 21, un residuo tirosina en la posición 22, un residuo ácido aspártico en la posición 41, un residuo ácido aspártico en la posición 45, y un residuo triptófano en la posición 46.

19. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 17.

20. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 18.

21. Una semilla que comprende la célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 17.

22. Una semilla que comprende la célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 18.

23. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la semilla comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido, en donde la semilla es un cultivo verdadero para aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal, y en donde el estrés ambiental se selecciona de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C.

24. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la semilla comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido, en donde la semilla es un cultivo verdadero para aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal, y en donde el estrés ambiental se selecciona de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C.

25. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido con al menos 80% de identidad de secuencia con el dominio central de proteína quinasa de un polipéptido definido en SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOX, SEQ ID NOXO, SEQ ID NOX2, SEQ ID NOX4, SEQ ID NOX6, SEQ ID NOX8, o SEQ ID NOXO, en donde la expresión del polipéptido en la célula vegetal da por resultado el aumento de tolerancia en la célula vegetal a un estrés ambiental que se selecciona de uno o más del grupo que consiste en sequía y temperatura inferior o igual a 0°C, comparado con una variedad salvaje de la célula vegetal.

26. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido con un dominio central de proteina quinasa que comprende: a. una primera región que comienza con un residuo glicina en la posición 1 y que tiene glicina en la posición 3 y fenilalanina en la posición 5; b. una segunda región que se encuentra corriente debajo de la primera región, que comienza con un residuo valina en la posición 1, y que tiene un residuo lisina en la posición 4, un residuo glutamato en la posición 6, un residuo glutamina en la posición 14, un residuo leucina en la posición 15, un residuo glutamato en la posición 18, un residuo tirosina en la posición 22, un residuo prolina en la posición 32, un residuo glicina en la posición 38, un residuo asparagina en la posición 44, un residuo leucina en las posiciones 50 y 51, un residuo glicina en la posición 52, un residuo prolina en la posición 53, un residuo leucina en la posición 55, un residuo leucina en la posición 58, un residuo fenilalanina en la posición 59, un residuo cisteína en la posición 62, un residuo fenilalanina en la posición 66, un residuo lisina en la posición 69, un residuo treonina en la posición 70, un residuo glutamina en la posición 77, un residuo isoleucina en la posición 79, un residuo histidina en la posición 86, un residuo arginina en la posición 93, un residuo ácido aspártico en la posición 94, un residuo lisina en la posición 96, un residuo prolina en la posición 97, un residuo asparagina en la posición 99, un residuo fenilalanina en la posición 100, y un residuo leucina en la posición 101; c. una tercera región que se encuentra corriente debajo de la segunda región, que comienza con un residuo de ácido aspártico en la posición 1, y que tienen un residuo alanina en la posición 5, un residuo lisina en la posición 6, un residuo tirosina en la posición 8, un residuo ácido aspártico en la posición 10, un residuo treonina en la posición 13, un residuo histidina en la posición 16, un residuo isoleucina en la posición 17, un residuo prolina en la posición 18, un residuo tirosina en la posición 19, un residuo arginina en la posición 20, un residuo lisina en la posición 23, un residuo glicina en la posición 27, un residuo treonina en la posición 28, un residuo alanina en la posición 29, un residuo arginina en la posición 30, un residuo tirosina en la posición 31, un residuo serina en la posición 33, un residuo asparagina en la posición 35, un residuo histidina en la posición 37, un residuo glicina en la posición 39, un residuo glutamato en la posición 41, un residuo serina en la posición 43, un residuo arginina en la posición 44, un residuo arginina en la posición 45, un residuo ácido aspártico en la posición 46, un residuo ácido aspártico en la posición 47, un residuo glutamato en la posición 49, un residuo glicina en la posición 52, un residuo tirosina en la posición 57, un residuo fenilalanina en la posición 58, un residuo leucina en la posición 63, un residuo prolina en la posición 64, un residuo triptófano en la posición 65, un residuo glutamina en la posición 66, y un residuo glicina en la posición 67, y d. una cuarta región que se encuentra corriente debajo de la tercera región, que comienza con un residuo prolina en la posición 1, y que tiene un residuo arginina en la posición 12, un residuo leucina en la posición 14, un residuo fenilalanina en la posición 16, un residuo prolina en la posición 20, un residuo ácido aspártico en la posición 21, un residuo tirosina en la posición 22, un residuo ácido aspártico en la posición 41, un residuo ácido aspártico en la posición 45, y un residuo triptófano en la posición 46.