CN103159838B - 一种花生铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2及其编码基因。该花生铁螯合物转运蛋白基因序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了编码上述蛋白对不同铁螯合物的转运能力以及在转录水平该基因表达对铁的响应，同时，本发明证明了该蛋白定位在细胞质膜上，为揭示铁在植物体内转运提供重要的理论基础。运用本发明AhYSL2花生铁螯合物转运蛋白将为获得铁高效利用作物提供必要的技术支撑。

Description

一种花生铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、植物生理学以及基因工程等领域，具体地说，涉及一种花生中铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

铁是植物生长发育所必需的微量元素之一，植物光合作用、呼吸作用等重要的代谢过程都离不开铁元素，植物缺铁会严重抑制植物的生长发育，导致产量和品质下降。尽管铁元素在土壤中的含量较高，在有氧环境中铁的溶解性却很低(Yi等,1994)，不易被植物吸收利用，在石灰性土壤上很多植物面临着缺铁胁迫。因此促进植物对铁的吸收转运效率从而提高作物的耐低铁胁迫能力具有重要的实践意义。

植物在长期进化过程中对于低铁胁迫形成了机理Ⅰ和机理II两种不同的适应性反应机制(Romheld等,1986)。双子叶和非禾本科单子叶植物属于机理Ⅰ植物。此类植物在缺铁时主要的生理反应表现为根系伸长受阻，根尖部分直径增加，并产生根毛，根部形态发生变化，Fe3+还原酶的活性增加，受ATP酶控制的质子分泌增加，使根际pH降低，提高铁的有效性。而禾本科单子叶植物为机理Ⅱ植物，它们在缺铁时无机理Ⅰ植物的明显的根形态上的变化，而是根系中植物铁载体的合成和分泌量增加。随着分子生物学技术的飞速发展，植物吸收利用铁的关键基因也逐渐研究清楚。机理Ⅰ植物以模式植物拟南芥研究得相对清楚，缺铁时通过根表皮细胞质膜上铁还原酶基因AtFRO2将三价铁还原成二价铁（Yi等,1996），然后通过根细胞质膜上的二价铁转运蛋白AtIRT1将二价铁转运到根细胞内供植物吸收利用(Vert等,2002)。而机理Ⅱ植物在缺铁条件下主要通过体内合成并分泌麦根酸类植物铁载体，到目前为止麦根酸合成途径中相关基因都已得到研究确定，禾本科植物根系分泌的麦根酸将根际中难溶性铁螯合，再通过细胞质膜上的YS1转运蛋白将麦根酸铁螯合物转运到根细胞内。YS1转运蛋白首次在玉米中分离得到，因该基因缺失后玉米叶片表现为黄色条纹(yellow stripe)表型命名而来。研究者们通过酵母功能互补试验确定了ZmYS1基因对麦根酸铁螯合物的转运能力(Curie等,2001)。此外研究发现在大麦中HvYS1(Murata等,2006)及水稻中OsYSL15(Inoue等,2009;Lee等,2009)也参与从根际土壤中吸收转运麦根酸铁供植物吸收利用。尽管机理Ⅰ植物中不存在麦根酸，同样也存在YSL(yellow stripe like)同源基因。NA(尼克烟酰胺)为麦根酸类植物铁载体合成的前体，通常与二价金属离子结合形成稳定的复合物在植物体内转运。NA-Fe(II)是铁在植物体内转运的主要方式之一。机理Ⅰ植物YSL基因主要负责NA与金属离子螯合物的转运。目前已有的研究表明在模式植物拟南芥中存在8个YSL基因。AtYSL1对于Fe-NA向籽粒中的运输起到了很重要的作用（Jean等,2005）。通过对AtYSL1AtYSL3双突变体的研究表明AtYSL1AtYSL3对于植物生长及发育过程中铁的平衡都起到了重要的作用（Waters等,2006）。AtYSL2对Fe(II)-NA、Fe(II)-PS及Cu(II)-NA具有转运作用（DiDonato等,2004）。此外，Gendre等人对于超累积植物天蓝遏蓝菜中存在的YSL同源基因进行了一些研究。他们在天蓝遏蓝菜中找到了三个YSL同源基因，根据分别与拟南芥中YSL基因的同源性高低而命名为TcYSL3、TcYSL5、TcYSL7。研究表明TcYSL7主要在植物的花中表达，TcYSL5主要在叶片中表达，而TcYSL3在各器官中表达量都比较均一。进一步通过酵母功能互补实验发现，其中只有TcYSL3对于Fe(II)-NA以及Ni(II)-NA复合物具有运输作用（Gendre等,2007）。

YSL基因家族在机理Ⅰ植物及机理Ⅱ植物中广泛存在，这些基因不但对于铁在土壤中的吸收运输起到很重要的作用，而且有的也负责了铁向地上部及籽粒中的运输，对于植物体内铁营养平衡起到了至关重要的作用。花生是重要的油料作物，但是在我国北方石灰性土壤上花生缺铁黄化成为限制其产量和品质的重要因子（Zuo等,2000）。对于花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2基因的获得与研究将为从分子育种或基因工程培育耐低铁胁迫花生品种提供重要的理论基础，具有深远的指导及实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种花生铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明从豆科植物花生中分离到铁螯合物转运蛋白基因AhYSL2，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，共有3066bp，包括5'端非编码区，一个完整的开放阅读框和包含ployA尾巴的3'端非编码区，表明是完整的核苷酸编码序列，SEQ ID No.2所述序列自5'端第785-2806碱基为该基因的编码区，编码了SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，该AhYSL2蛋白由674个氨基酸组成，具有12个跨膜区域。

本发明还提供了含有编码前述花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2基因或其片段的载体及含有该载体的宿主。

本发明进一步提供编码前述花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2的基因在提高植物铁利用率，从而提高植物耐低铁胁迫能力中的应用。

本发明提供的AhYSL2基因在花生的根系、新叶及老叶中都有表达，且在叶片中的表达量相对较高。在花生根系及新叶中AhYSL2基因表达在加铁条件下显著高于缺铁条件。通过酵母功能互补试验，将AhYSL2基因转入铁缺陷酵母突变体中，在供给NA-Fe(II)的介质中转入AhYSL2基因的酵母明显比转入空载体的酵母长势好，而供给NA-Fe(III)时转入AhYSL2基因的酵母也稍微比转入空载体的酵母长势好，但不如前两者。结果表明AhYSL2基因对NA-Fe(II)具有明显的转运能力，同时对NA-Fe(III)也具有一定的转运作用。此外，对AhYSL2与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白定位研究表明AhYSL2基因定位在细胞质膜上。综上表明，本发明获得的AhYSL2基因是一个铁螯合物转运蛋白，且位于细胞质膜上，可能对铁在植物体内的转运与分配起到重要的作用。

本发明首次公开了一种花生铁螯合物转运蛋白，并获得了编码该蛋白的基因全序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了该花生AhYSL2基因在转录水平表达受供铁水平的影响，且是一个定位于细胞质膜上具有转运各种铁螯合物的转运蛋白，同时基于此研究结果，为通过基因工程或分子育种提高植物铁利用效率和籽粒铁的富集提供了必要的理论依据和技术支持，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明花生根系AhYSL2基因片段扩增结果。

图2为本发明花生根系AhYSL2基因的5’RACE PCR扩增结果。

图3为本发明花生根系AhYSL2基因的3’RACE PCR扩增结果。

图4为AhYSL2蛋白TMHMM跨膜区域分析。

图5为AhYSL2与其它植物YSL基因进化树分析。

图6为本发明酵母表达载体pDR195-AhYSL2的图谱。

图7为AhYSL2基因在转录水平表达受铁供应水平的影响。

图8为AhYSL2基因酵母功能互补试验结果。

图9为AhYSL2基因洋葱表皮细胞定位结果，其中N代表细胞核。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2基因的获得

1.1水培花生的培养

所用花生品种为‘鲁花14’(购于中国农业科学院)，将花生种子用10%双氧水消毒20-30分钟后，清洗置于饱和硫酸钙溶液中通气8小时，然后置于铺有吸水纸的托盘中并盖好避光于人工培养室中。培养室设置条件为光照14小时30℃，黑暗10小时22℃。1-2天左右花生发芽后移入石英砂中培养，待长出1-2片叶子后转入水培营养液中培养。水培营养液配方如下：KH₂PO₄(0.5mM)、K₂SO₄（0.75mM)、KCl(0.1mM)、MgSO₄.7H₂O(0.65mM)、CaSO₄.2H₂O(2mM)、H₃BO₃(1μM）、MnSO₄.4H₂O(1μM）、ZnSO₄.7H₂O(1μM)、CuSO₄.5H₂O(0.1μM)、(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O(0.005μM)、EDTA-Fe(80μM)，pH为5.8~6。正常培养一周后缺铁处理约一周取花生根系，迅速放入液氮中，并于-80℃冰箱保存备用。

1.2花生总RNA提取

将保存于-80℃冰箱的花生根系样品放入已经用液氮预冷的研钵中，迅速加入液氮研磨植物样品直至成粉末状，取出约0.1克粉末样品于1.5μl无RNase离心管中，加入1mlRNA提取液Trizol（购自Invitrogen），立即涡旋震荡15秒，使核蛋白充分解离，室温静置5分钟，加入200μl氯仿，充分混匀，静置5分钟，放入事先已经预冷到4℃的离心机中以12000×g的速度离心15分钟，取上清液入新的1.5ml的离心管中，加入500μl异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10分钟，然后4℃12000×g离心10分钟，取出后倒掉上清液，加入1ml75%的乙醇，4℃7500×g离心5分钟，重复洗涤两次，取出后倒掉乙醇，并吸出所有上清液后置于超净台中室温下风干。加入适量的DEPC水和RNA酶抑制剂后放于-20℃或-80℃冰箱中贮存备用。

1.3RT-PCR获得YSL基因cDNA序列

取已提好的花生根系RNA样品约2μg，利用invitrogen公司的SuperScriptⅡ逆转录酶试剂盒，以Oligo（dT）₁₅为引物，42℃反应1.5小时进行cDNA第一条链的合成，根据拟南芥等其它已知的YSL基因序列比对结果，选择保守性区域设计引物，以得到的cDNA第一条链为模板扩增花生YSL基因片段，设计的正反向引物分别为：

AhYSL-1F  5-’ATGAACATGGCTTACAACTA-3’

AhYSL-1R  5-’GTCTTGAAATCATGCATCA-3’

PCR反应体系为：反转后的根系cDNA稀释5倍后用2μl，10×反应缓冲液2μl，dNTPs(10mM)0.5μl，MgCl₂（50mM）0.5μl，正向引物Ahnramp-F（0.01mM）0.5μl，反向引物Ahnramp-R（0.01mM）0.5μl，ddH₂O 13.7μl，Taq DNA聚合酶（TIANGEN公司）0.3μl.将上述混合后进行PCR反应。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸10min。PCR反应后琼脂糖凝胶电泳得到152bp DNA条带（图1），进行胶回收纯化，然后将回收得到的DNA连接到pMD20-T载体（TaKaRa公司），16℃过夜反应，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞（TIANGEN公司），涂于含Amp抗生素的LB板后37℃过夜培养，挑单克隆于LB液体37℃过夜摇菌，菌落PCR确定条带正确后送菌液测序（上海生物工程公司），得到AhYSL2片段序列。

用测序得到的AhYSL2片段序列设计引物，通过Clonetech公司RACE试剂盒(SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒)进行PCR反应，分别克隆测序得到AhYSL2基因5’及3’端（方法参见所述试剂盒说明书）。

5’端克隆引物为：

AhYSL2-5’-GSP  5-’TCCCAGTGCCGATTGCTTGGCTTAG-3’

3’端克隆引物为：

AhYSL2-3’-GSP    5-’TGACGGTGTCGTTGCAGGGCTTGT-3’

扩增分别得到2325bp的5’端序列（图2）和893bp的3’端序列（图3），再将所得到的序列拼接得到理论全长序列。利用拼接的理论全长序列，设计扩增该基因编码区全长的引物，如下：

AhYSL2-F  5-’GAATTAAGCGGTGAGGATTTGAT-3’

AhYSL2-R  5-’GGGAGATTCTGAAATACTACTTGGA-3’

应用高保真DNA聚合酶（Invitrogen公司）进行PCR反应，切胶回收后连接到pMD20-T载体（TaKaRa公司），然后转化获得正确的克隆进行测序。经测序最终确定，AhYSL2核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。利用DNAman软件翻译得到其编码的氨基酸序列，如SEQ IDNo.1所示。应用TMHMM跨膜区域分析软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对AhYSL2转运蛋白序列进行分析表明该AhYSL2蛋白具有12个跨膜区域（图4）。通过NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找其它植物YSL基因家族蛋白序列，应用BioEdit分析软件构建基因进化树，表明该AhYSL2基因与拟南芥AtYSL3基因比较接近（图5）。

实施例2花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2基因表达对铁的响应

1.1样品准备

水培培养花生，在正常条件下培养约一周后转入缺铁的营养液中培养，同时设置正常供铁作为对照。处理4、7、11天后分别取根系、新叶及老叶样品，然后提取花生根系及叶片RNA，利用DNase消化去除可能污染的基因组DNA，然后进行反转录，通过相对定量RT-PCR方法，利用Ahubiquitin基因作为内参基因，分析AhYSL2基因在缺铁条件下其转录水平表达量的变化。

1.2相对定量RT-PCR

在制备标准曲线时，首先需要分别含有AhYSL2基因及内参基因Ahubiquitin基因的质粒。构建过程如下：首先用KOD-plus DNA聚合酶（购自TOYOBO）进行PCR反应。反应体系为KOD-plus DNA聚合酶0.4μl，10×KOD-plus缓冲液2μl，2mM dNTPs 2μl，25mMMgSO₄0.8μl，正反向引物10μM各0.6μl，花生根系cDNA 1μl，最后用灭菌水补足到20μl体系。PCR反应程序为94℃2min，94℃15s，55℃30s，68℃30s，30个循环，72℃10min。PCR反应后电泳检测，鉴定得到单一条带且条带大小无误后利用Zero Blunt Topo PCR克隆试剂盒（购自Invitrogen公司），将剩下的PCR产物取1μl，加0.5μl盐溶液，1μl灭菌水，及0.5μLPCR Blunt TOPO载体，室温连接约30分钟，然后将3μl连接反应液加到Topo10感受态细胞中（购自Invitrogen公司）进行转化，冰上放置30分钟左右，然后42℃水浴放置约45秒，迅速放到冰上，3分钟后加200μl LB，置于37℃摇床摇1小时，然后把该菌液涂到含有卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上，37℃培养箱过夜培养约13-15小时后，可见单一的小菌落，挑单菌落于2ml LB培养基中在37℃摇床摇12小时左右，提取质粒，进一步测序鉴定分析，保证所有碱基序列无误后选择该质粒待用。

把构建好的分别含有AhYSL2基因及内参基因Ahubiquitin基因的质粒稀释成不同的浓度梯度，使拷贝数分别为10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，分别以此为模板1μl作标准曲线时用，同时用花生的根系及叶片样品RNA反转录后的cDNA稀释5倍加2μl为模板，反应体系为TaKaRa SYBR Green premix 6.25μl，ROX Reference Dye 0.25μl，正向反向引物各0.2μmol，然后以灭菌水补足到12.5μl体系，应用Applied Biosystems StepOne Plus^TMRT-PCR系统进行PCR反应。PCR反应程序为95℃预变性2min30s;95℃变性15s;58℃退火30s;72℃延伸30s，同时收集荧光；40个循环；溶解曲线95℃15s，60℃1min，95℃15s。PCR后仪器将自动通过用质粒作为模板所做的标准曲线得出在不同模板条件下AhYSL2基因及内参基因Ahubiquitin基因的拷贝数。最后通过计算用AhYSL2基因拷贝数/内参基因Ahubiquitin基因的拷贝数得到AhYSL2基因在不同处理下的相对表达值。结果如图7所示。结果表明该花生AhYSL2基因的表达在缺铁处理4、7、11天时都显著低于加铁条件下的表达，在新叶中缺铁处理7、11天时其表达量也都低于加铁条件，但在老叶中的表达趋势与根系及新叶中不一致，在缺铁7天时加铁与缺铁条件对其表达量没有影响，在缺铁11天时其表达量却在缺铁处理下显著高于正常供铁条件。

相对定量RT-PCR引物内参基因Ahubiquitin基因引物参照文献Luo等,2004，AhYSL2基因引物通过引物设计软件primer premier5.0及结合oligo6软件设计获得，引物为：

QYSL2-F  5’-AGCCGCAGATTGAGGGTGAG-3’

QYSL2-R  5’-CCGAGTGAAAGGTGTTGAAATAATA-3’

实施例3花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2基因酵母功能互补

1.1酵母功能互补载体构建

在AhYSL2基因序列编码区两端设计引物，包括起始密码子与终止密码子，并在正反向引物5’端分别加上酶切位点NotI和BamHI，引物为：

NotI-YSL-F  5’-TGCGGCCGCATGAATCCAATGGAAATC-3’

BamHI-YSL-R 5’-CCGCGGATCCCTACTTGGATGTAAAGAAGCT-3’

用KOD-plus DNA聚合酶PCR扩增加酶切位点AhYSL2基因全长，PCR反应体系为10×KOD-plus缓冲液2μl，2mM dNTPs 2μl，25mM MgSO₄0.8μl，正向反向引物分别10μM 0.6μl，花生根系cDNA0.5μl，KOD-plus DNA聚合酶0.4μl，加灭菌水至20μl体系。PCR反应程序为94℃2min；94℃15s，60℃30s，68℃2min，共30个循环；72℃10min。PCR反应后电泳检测鉴定条带大小正确后，取1μlPCR产物，利用Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit进行连接反应，然后转化涂板，提取质粒，测序确定该质粒序列无误（具体同前）。将构建好的质粒用NotI和BamHI进行酶切，双酶切体系为：质粒20μl，缓冲液M 5μl，NotI和BamHI酶各2μl，灭菌水21μl以补足到50μl体系。并同时酶切载体质粒PDR195，体系同上，电泳并切胶回收双酶切后含有AhYSL2全长的目的条带。

将酶切后的空载体质粒PDR195进行碱性磷酸酶处理，体系为45μl酶切后质粒，5μl H缓冲液，1μl碱性磷酸酶（购自NEB，NewEngland Biolabs），49μl灭菌水，37℃放置1小时。然后用苯酚氯仿异戊醇抽提，无水乙醇沉淀及70%乙醇洗涤，干燥沉淀后用20μl的灭菌双蒸水溶解。随后用Takara ligation Kit Mix连接酶切去磷酸化处理后的载体PDR195和酶切切胶回收后的全长目的条带。连接反应体系为pDR195载体0.5μl，AhYSL2切胶回收产物4μl，ligation Kitsolution 4.5μl，连接反应过夜。然后转化到大肠杆菌，提取质粒，酶切鉴定，测序确定序列的正确性，获得PDR195-AhYSL2载体质粒（图6）。

1.2酵母转化

主要试剂配制

10×TE：0.1M Tris,10mM EDTA调节PH至7.5，121℃高压灭菌20min。

10×LiAc：即1M醋酸锂，称取10.2g醋酸锂加适量高纯水溶解，用冰醋酸调节PH值到7.5，定容到100ml，121℃高压灭菌20min。

50%PEG：50g PEG加水定容到100ml，120℃高压灭菌20min。

YPD培养基：20g蛋白胨、10g酵母提取物、20g葡萄糖，加水定容到1L，调节PH为4.7。

SD平板（1L）：(NH₄)₂SO₄ 5g、MgSO₄ 500mg、NaCl 500mg、CaCl₂500mg、KH₂PO₄ 850mg、K₂HPO₄ 150mg、H₃BO₃ 500μg、CuSO₄ 40μg、KI 100μg、FeCl₃ 200μg、MnSO₄ 400μg、Na₆Mo₇O₂₄ 200μg、ZnSO4400μg、生物素20μg、泛酸2mg、叶酸2μg、肌醇10mg、烟酸400μg、对氨基苯酸200μg、维生素B6400μg、核黄素200μg、维生素B1400μg、色氨酸20mg、亮氨酸100mg、组氨酸20mg、葡萄糖20g、琼脂粉20g，加水定容至1L，121℃高压灭菌后倒约30个平板。

将高亲和力及低亲和力铁转运基因fet3、fet4缺失的酵母突变体菌株DEY1453接种少量加入4ml YPD，pH为4.7的培养液中，30℃摇16-18小时至饱和，测定OD600值，再用三角瓶装50mlYPD中加适量该菌液使OD600值调节至0.2-0.3，30℃摇3-4小时使OD600约为0.4-0.6，把得到的菌液1000g 5min 25℃离心，去上清加8ml TE，混匀后1000g 5min 25℃离心，去上清后在沉淀的菌中加入1200μl灭菌水、150μl 10×TE及150μl 10×LiAc，震荡数秒使菌株悬浮起来。取PDR195，PDR195-AhYSL2载体质粒分别10μl加入80μl灭菌水和10μl已经过煮沸处理的鲑鱼精DNA，然后加入前述已处理好的酵母突变株菌悬浮液100μl，震荡混匀，加480μl 50% PEG、60μl 10×TE及60μl 10×LiAc后30℃摇30min，再加70ul二甲基亚砜温和混匀，42℃水浴15min，冰上放置90s，短暂离心后去上清，加200μl灭菌双蒸水并轻轻混匀。取100μl涂于加铁的SD平板上。约2天左右长出菌落。

1.3功能互补试验

含Fe(II)-NA及Fe(Ⅲ)-NA的SD平板配制：先分别配制1ml10mM硫酸亚铁、1ml 10mM FeCl₃及1ml 30mM烟酰胺溶液，取30μl10mM的FeSO₄溶液和15μl 30mM烟酰胺溶液混合（配成Fe(II)-NA溶液），30μl10mM FeCl₃溶液和15μl 30mM烟酰胺溶液混合（配成Fe(Ⅲ)-NA溶液），常温放置4小时左右后用0.2μm过滤离心管13500rpm离心10分钟，配制缺铁的SD平板液（同前）30ml并将PH调制7.0后高压灭菌，分成15ml两份然后待灭菌后溶液温度降至60℃左右分别加入离心后的Fe(II)-NA及Fe(Ⅲ)-NA溶液。倒板冷却。

挑单菌落30℃过夜摇菌后，测定OD600值，再用三角瓶装的20mlYPD将OD600值调节稀释为0.2，接着摇4小时左右，测定OD值，分别取1ml菌液离心30s，去上清，加1ml 10×TE涡旋混匀，离心30s，去上清，重复2遍后加1ml灭菌水重复洗2遍，最后加300ul灭菌水涡旋混匀，测定OD600值，用灭菌水将OD600值稀释调节为1，然后依次稀释10倍，得到OD600值分别为1，10^-1，10^-2，10^-3浓度梯度的菌液，然后分别将该菌液依次点5μl于配制好的Fe(II)-NA及Fe(Ⅲ)-NA SD平板，放置30℃培养室培养3-4天左右，比较酵母的生长状况。

结果表明（图8），转入AhYSL2基因的酵母在提供Fe(II)-NA铁的平板上明显比转入空载体的酵母长势好，而在提供Fe(Ⅲ)-NA时转入AhYSL2基因的酵母也稍比转入空载体的酵母长势好，但没有在提供Fe(II)-NA时差异明显，在对照中提供FeCl₃（非螯合态铁）转入空载体与转入含该转基因载体的酵母生长一致。说明该AhYSL2转运蛋白对螯合态铁Fe(II)-NA具有明显的转运作用，对Fe(Ⅲ)-NA也有一定的转运作用。

实施例4花生铁螯合物转运蛋白AhYSL2基因洋葱表皮亚细胞定位

1.1载体构建

首先PCR获得含AhYSL2基因编码区（不包含终止子）全长的序列，所用引物为：

GAhYSL2-F  5’-CACCATGAATCCAATGGAAATC-3’

GAhYSL2-R  5’-CTTGGATGTAAAGAAGCTCATG-3’

用KOD-plus DNA聚合酶进行PCR反应，具体方法同前，然后取0.5μl PCR产物用pENTR^TM Directionalcloning kit（购自Invitrogen公司）将AhYSL2基因克隆到pENTR^TM

载体。取克隆得到的载体质粒2μl，GFP载体质粒pH7FWG2(Karimi等.,2002)1μl及1×TE缓冲液(pH8.0)5μl进行Gateway反应（试剂盒购自Invitrogen公司），具体为将2μl LR Clonase^TMⅡ酶加入以上混合的载体质粒中，混匀后简单离心，25℃放置1小时，加1μl蛋白酶K溶液37℃放置10min终止反应。然后转化到大肠杆菌，获得AhYSL2-pH7FWG2载体质粒，酶切鉴定后测序确定序列准确无误备用。

1.2洋葱表皮细胞定位

用QIAGEN试剂盒（www.qiagen.com）提取高纯度且高浓度的AhYSL2-pH7FWG2载体质粒（浓度约1μg/μl），然后将准备好的质粒1μg进行金粉包裹处理，加10μl金粉，10μl 2.5M CaCl₂及4μl 0.1M亚精胺并充分涡旋混匀。同时做对照处理空载体质粒。利用BiolisticPDS-1000/He Particle Delivery System(Bio-Rad,东京,日本)，将处理好的载体转入洋葱表皮细胞中，28℃避光孵育4小时左右后用激光共聚焦显微镜(LSM510,Karl Zeiss)观察表达的GFP荧光。

结果如图9所示，绿色荧光绕过细胞核表明该AhYSL2基因定位于洋葱表皮细胞细胞质膜上。

AhYSL2基因为烟酰胺铁转运蛋白，烟酰胺铁在铁的地上部分转运过程中发挥了重要的作用，通过转基因技术将该基因过表达到豆科植物中，可促进铁向地上部分的转移或向籽粒中的转移，从而提高豆科植物的铁利用效率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种花生铁螯合物转运蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主。

6.权利要求2或3所述的基因在提高花生铁利用率中的应用。

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