CN102787121A

CN102787121A - 一种转录因子基因功能验证的方法

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Publication number: CN102787121A
Application number: CN2012101954215A
Authority: CN
Inventors: 陈昆松; 殷学仁; 刘小芬; 徐昌杰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: CN102787121B

Abstract

本发明提供一种转录因子基因功能验证的方法，利用拟南芥中调控花青苷合成的bHLH于构建转录本信息库，并进行电子克隆，得到可调控杨梅花青苷合成的MrbHLH1和MrbHLH2全长序列，再对电子克隆到的序列作验证，利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在杨梅果实发育过程中的表达模式，应用烟草叶片双萤光素酶瞬时表达技术分析该基因与已确认的可调控杨梅花青苷合成的MrMYB1和MrMYB1d转录因子的互作，及这四个转录因子与花青苷合成关键结构基因DFR启动子的互作，根据互作结果即可判断转录因子是否具有调控杨梅花青苷合成的功能。本方法同样适用于杨梅以外的植物，以及其他转录基因。

Description

一种转录因子基因功能验证的方法

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种转录因子基因功能验证的方法。

背景技术

转录因子是一类可通过识别结构基因启动子中特异的顺式作用元件而调节结构基因转录的调控因子。在模式植物拟南芥的基因组中，有5%的基因编码1500多个转录因子，它们参与植株各种生物代谢的调节过程，亦是植株适应各种生物或非生物胁迫所必需的调控因子，在生命活动中起着不可替代的作用。因此，不同转录因子基因功能的验证已成为目前研究的热点，是各种生理机制解析研究必需做的功课。

bHLH（basic helix-loop-helix）蛋白拥有众多成员，仅在拟南芥中就有160多个成员，是第二大植物转录因子，可调控植物果实开裂性状，心皮、花药和表皮细胞的发育，植物色素信号，黄酮类次生代谢物质合成，激素信号以及胁迫响应等。然而仅有拟南芥和玉米中少数bHLH成员的基因功能得到验证，它们主要分布在 Ⅲf亚组，功能涉及黄酮类化合物合成的调控、表皮毛和根毛的形成调控。

花青苷属于黄酮类化合物，广泛存在于绝大部分陆生植物的液泡中，是红色、蓝色和紫色果面色泽的主要构成物。花青苷除作为天然色素外，还具有很强的抗氧化、清除氧自由基的能力，能防治许多疾病，是具有保健功能的天然活性物质，被誉为继水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质之后的第七大必需营养，因而成为天然色素中最具有发展前景的一类色素。

果实因花青苷含量不同而色泽差异较大，多态性丰富，是探讨果实花青苷代谢的良好试材。另外，杨梅在我国栽培面积达30万～40万公顷，总产量达80～100万吨，年产值达100亿元，有着重要的经济与生态价值。因此，对杨梅花青苷合成调控进行研究具有重要意义。

bHLH转录因子对植物花青苷合成的调控已有所涉及，如矮牵牛bHLH可直接活化花青苷合成基因DFR的表达；将拟南芥bHLH基因导入紫罗兰白花突变体可激活花中花青苷合成基因表达从而促进花青苷积累；栽培水稻中bHLH基因突变导致籽粒不能积累花青苷。然而果树学研究中，对花青苷合成调控的研究多涉及MYB转录因子，bHLH的研究相对薄弱。但是在杨梅上的研究表明，只有与拟南芥或苹果的bHLH共表达时，杨梅MrMYB1基因对花青苷合成基因表达的激活作用才得到充分发挥。因此bHLH是杨梅花青苷合成中必不可少的转录因子，研究意义重要。

本发明就以杨梅果实中可调控花青苷合成的4个转录因子基因功能的验证为例，阐述一种适用于多种植物、多种转录因子的基因功能验证方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种转录因子基因功能验证的方法，以杨梅果实中已确认可调控花青苷合成的MrMYB1 和MrMYB1d以及可能参与花青苷合成调控的MrbHLH1 和MrbHLH2 为例，对该发明方法进行具体阐述。本发明方法同样适用于杨梅以外的植物，以及其他转录基因。

本发明的具体实施步骤如下：

（1）电子克隆：根据已公布的或者自行构建的待测物种的转录本信息库进行电子克隆，自行构建该物种的转录本信息库时，所选样本要尽可能多且具有代表性，本发明以杨梅不同成熟度的果实以及不同组织为样本，抽提总RNA后进行深度测序，构建成杨梅转录本信息库。本发明以此转录本信息库，根据bHLH转录因子的保守序列，采用Blast生物信息学手段，程序中阈值（E-value）设为1×10^-5，从海量Unigene中筛出属于bHLH家族的117个Unigene。利用拟南芥中已确定的可调控花青苷合成的AtTT8 (AT4G09820)序列信息，进一步分析这117个Unigene，筛出7个可能与杨梅花青苷合成相关的Unigene。将这7个Unigene进行序列重叠性分析，得到2条拼接序列，分别命名为MrbHLH1 （SEQ：NO. 5）和MrbHLH2（SEQ：NO. 6）。首先采用普通PCR技术，对拼接的MrbHLH1和MrbHLH2进行验证，所用引物分别为SEQ：NO. 1和SEQ：NO. 2及SEQ：NO. 3和SEQ：NO. 4。然后再利用在线blastn算法，分析得到的MrbHLH1和MrbHLH2与其他物种中基因序列的同源性。采用Clustal对MrbHLH1和MrbHLH2及其他物种中调控花青苷合成的bHLH进行序列比对，分析MrbHLH1和MrbHLH2是否具有与其他物种中调控花青苷合成的bHLH相同的结构域。应用Mega 5.0分析MrbHLH1和MrbHLH2与其他物种中调控花青苷合成的bHLH的亲缘关系，进一步预测MrbHLH1和MrbHLH2是否具有调控花青苷合成的功能。

所述步骤（1）中电子克隆的方法为：将Blast程序中阈值设为1×10^-5，程序结束后筛选出117个相关Unigene；进一步分析数据库中这117个Unigene信息，根据功能注释筛出可能与花青苷合成相关的7个Unigene；将这7个Unigene进行序列重叠性分析，发现它们中有些首尾存在重复序列，即可以拼接成两条完整序列。

（2）实时定量荧光PCR分析转录因子基因表达模式：根据已确认的MrbHLH1 （SEQ：NO. 5）和MrbHLH2（SEQ：NO. 6）的全长和3’端非编码区序列分别设计实时定量PCR特异引物，序列分别为SEQ：NO. 7和SEQ：NO. 8及SEQ：NO. 9和SEQ：NO. 10，PCR产物包含终止密码子，长度分别为109bp和162bp。引物的特异性通过普通PCR和序列测定双重手段进行验证。提取杨梅不同成熟度的果实RNA，取1 μl逆转录合成cDNA，然后稀释10倍，再将所用引物稀释至2.5 μM。参照Fermentas公司生产的Maxima

SYBR Green/ROX qPCR Master Mix试剂盒说明书，配制PCR反应体系：SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 12.5 μl，2.5 μM上下游引物各3 μl，cDNA模板 6.5 μl，终体积为25 μl。应用iCycler iQ Q-PCR仪器（Bio-Rad，USA），反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，40个热循环；熔解曲线分析65 ℃到95 ℃，每5 sec升高1 ℃；反应结束后，根据每个模板对应的Ct值（Cycle threshold），以内参基因为标准将各成熟度果实的cDNA模板原液按照10×2^-(Ct-25)公式进行稀释，使所有模板Ct值均为25左右。以确认完毕的实时定量特异引物和内参基因的特异引物（SEQ：NO. 11和SEQ：NO. 12）进行荧光定量PCR，依据两者扩增效率的差异判断转录因子的相对表达量。

所述步骤（2）中各发育阶段模板cDNA浓度的调整方法为：首先将1μl由RNA逆转录的cDNA稀释10倍，内参基因的上下游扩增引物（SEQ：NO. 11和SEQ：NO. 12）分别稀释至2.5μM。将适量的SYBR Green/ROX qPCR Master Mix和引物配制成PCR Mix，分装到每个反应管，最后于相应的反应管内加入对应的cDNA模板，进行qPCR。反应结束后，根据每个模板对应的Ct值（Cycle threshold），再次对模板原液按照10×2^-(Ct-25)公式进行稀释，使所有模板Ct值均为25左右。

（3）超表达载体构建：根据已确认MrbHLH1 （SEQ：NO. 5）和MrbHLH2（SEQ：NO. 6）全长序列分别设计含限制性内切酶酶切位点的引物SEQ：NO. 13和SEQ：NO. 14及SEQ：NO. 15和SEQ：NO. 16，扩增两个基因的开放性阅读框。以杨梅成熟果实cDNA为模板，参照PrimeSTAR HS DNA polymerase说明书加以改动，配制终体积为20 μl PCR体系：HS DNA polymerase（2.5 U/μl）0.2 μl，5×Buffer 4 μl，2.5 mmol/l dNTP 1.6 μl，10 μM/l引物各0.5 μl，50 ng/μl cDNA模板1.0 μl，加ddH₂O至终体积20 μl。按照其推荐的PCR程序进行产物扩增，反应条件为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 sec，58 ℃退火5 sec，72 ℃延伸2 min 30 sec，35个热循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收后经相应限制性内切酶处理，酶切产物再次用1%琼脂糖凝胶电泳，回收，然后连接到同样经相应限制性内切酶处理的pGreenⅡ0029 62-SK表达载体上。将重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用不含任何抗生素的LB液体于37 ℃ 150 rpm培养细胞1 h后，然后将其均匀涂布于含50 μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，用pGreenⅡ0029 62-SK表达载体自带的检测引物（SEQ：NO. 17和SEQ：NO. 18）对阳性克隆进行菌液PCR验证，最后选取含目的基因的阳性克隆菌液送上海Invitrogen公司进行测序验证。根据公司测序结果，将正确的阳性克隆菌液置于37 ℃、150 rpm恒温摇床上过夜培养后进行质粒抽提，应用相应限制性内切酶处理抽提到的质粒，再次确认载体构建的正确性。将最终确认正确构建的表达载体通过电击导入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，菌液均匀涂布于含25μg/ml庆大霉素、5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆。用20%灭菌甘油保存筛选到的阳性克隆，存放于-80℃。

（4）烟草叶片双萤光素酶瞬时表达分析：将存放于-80℃的甘油菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28℃培养48 h，挑取少量菌落涂布到另一个含相同抗生素的LB固体培养基上，28 ℃培养24 h。刮取生长良好的菌落，用10 mM MgCl₂，10 mM MES（生物缓冲液），150 mM 乙酰丁香酮，pH 为5.6的渗透液悬浮，使其OD₆₀₀为0.75。含不同转录因子的菌株渗透液等比例混匀，再加入混合液1/10体积的含结构基因启动子的菌株渗透液，然后用无针头注射器将渗透液注入6周大的、有6-8片真叶的本氏烟草叶片中，3天后检测叶片中两种荧光素酶的比值：应用Promega提供的Dual-Luciferase

Reporter Assay System和发光荧光检测仪分析LUC和REN的表达。将叶片于100μl 1×PBS缓冲液中磨碎，吸取50μl上清液，加入50μl Luciferase Assay Buffer避光反应10min后检测LUC荧光发光信号，再加入50μl Stop & Glo

Buffer避光反应10min后检测REN荧光发光信号。据此可分析不同转录因子间、转录因子与启动子间是否存在互作，即可验证转录因子在该代谢途径中是否具有调控作用。

所述步骤（4）中烟草叶片双萤光素酶比值检测方法为：将含结构基因启动子的pGreenⅡ0800-LUC质粒农杆菌菌株和含转录因子的农杆菌菌株同时注入烟草叶片，3天后，取样。应用Promega提供的Dual-Luciferase

Buffer避光反应10min后检测REN荧光发光信号。

本发明利用拟南芥中调控花青苷合成的bHLH于构建好的杨梅转录本信息库中进行电子克隆，得到可能调控杨梅花青苷合成的MrbHLH1和MrbHLH2全长序列，然后应用普通PCR技术对电子克隆到的序列进行验证，再利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在杨梅果实发育过程中的表达模式，应用烟草叶片双萤光素酶瞬时表达技术分析该基因与已确认的可调控杨梅花青苷合成的MrMYB1和MrMYB1d转录因子的互作，及这四个转录因子与花青苷合成关键结构基因DFR启动子的互作，根据互作结果即可判断转录因子是否具有调控杨梅花青苷合成的功能。本发明公布了转录因子基因功能验证的一整套完善体系，具有重要的应用价值。本发明方法使得快速、准确验证转录因子的基因功能成为可能。

附图说明

图1：MrbHLH1和MrbHLH2在杨梅果实不同发育阶段的表达模式。

图2：烟草叶片双荧光素酶瞬时表达分析MrbHLH1和MrbHLH2与转录因子MrMYB1、MrMYB1d的互作，以及它们对花青苷合成基因DFR启动子的调控效应。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。

下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版）。

实施例1：实时定量荧光PCR分析MrbHLH1和MrbHLH2在杨梅果实不同发育阶段中的表达模式；

（一）实验方法

1、杨梅果实总RNA提取

新鲜果实样品去核后迅速用液氮冷冻，保存于-80℃。提取RNA时，称取1g冻样加液氮充分研磨后，分2-3次加入到有4ml 65℃ CTAB/β-巯基乙醇提取缓冲液的离心管中，涡旋混合使细胞彻底破裂，65℃加热1min；然后向离心管中加入4ml氯仿：异戊醇（24：1）抽提液，涡旋混合；15℃ 10000rpm离心10min，小心吸取上清液到新的离心管，重新抽提一次；得到的上清液小心吸取到新的离心管中，加入3/10体积的8mol/l的LiCl₂，4℃冰箱放置过夜；4℃ 10000rpm离心20min，倒掉上清液，将离心管倒置于纸巾上以去除多余的溶液；加入500μl 65℃SSTE，溶解沉淀；再加入500μl氯仿：异戊醇（24：1）抽提液，涡旋混合；将液体彻底吸入1.5ml离心管中20℃ 10000rpm离心10min，吸上清液到新的离心管中加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min以上；4℃ 10000rpm离心25min，倒掉上清液，短暂离心后吸出残余液体，将沉淀在通风橱晾干（约5-10min）；每管加入20μl DEPC水溶解沉淀，得到总RNA样品；用1%琼脂糖凝胶电泳检测所得样品完整性，结果显示样品有两条带，亮度为上条：下条=2：1，说明RNA样品完整无降解；用紫外分光光度计检测所得样品纯度，吸取1μl RNA样品用69μl DEPC水稀释后，检测OD₂₆₀和OD₂₈₀，分析得到OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.0，说明RNA纯度符合标准。根据公式OD₂₆₀×40（RNA浓度系数）×70（样品稀释倍数）即可计算出样品RNA的浓度（ng/μl），进行下一步研究。

2、MrbHLH1和MrbHLH2表达模式分析

首先采用Fermentas公司提供的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit将各样品RNA进行DNA消除后，逆转录合成cDNA；然后将逆转录得到的cDNA吸取1μl稀释10倍，内参基因的上下游扩增引物SEQ：NO. 11和SEQ：NO. 12分别稀释至2.5 μM；将适量的SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（12.5μl×反应数）、SEQ：NO. 11（3μl×反应数）和SEQ：NO. 12（3μl×反应数）配制成PCR Mix，操作过程避光；Mix经充分混匀后，分装到每个反应管；再于相应的反应管内加入对应的稀释10倍的cDNA模板（6 μl）；短暂离心将反应液收集到管底，进行qPCR；程序为50℃ 2min；95℃预变性2min；95℃变性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个热循环；熔解曲线分析65℃到95℃，每5sec升高1℃；结束；根据每个模板对应的Ct值（Cycle threshold），再次对模板原液按照10×2^-(Ct-25)公式进行稀释，使所有模板Ct值均为25左右。

将MrbHLH1和MrbHLH2实时定量PCR引物SEQ：NO. 7和SEQ：NO. 8及SEQ：NO. 9和SEQ：NO. 10，分别稀释至2.5 μM，配制两种分别含内参基因引物和MrbHLH1或MrbHLH2特异引物的PCR Mix，即PCR Mix1为SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（12.5μl×反应数）、SEQ：NO. 11（3μl×反应数）和SEQ：NO. 12（3μl×反应数），PCR Mix2为SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（12.5μl×反应数）、基因特异引物（3μl×反应数）；充分混匀后后分装到每个反应管，最后于相应反应管内加入对应的Ct值为25左右的cDNA模板，此时每个模板都包含一个内参基因引物反应和一个基因特异引物反应，进行qPCR，程序与之前一致；反应结束后，根据每个模板得到的两个Ct值（内参基因引物的Ct1，基因特异性引物的Ct2），运用公式2^-(Ct2-Ct1)即可得到该基因的相对表达量。

（二）实验结果

1、杨梅果实富含糖和多酚类物质，应用该方法提取的样品总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，显示两条带清晰，说明RNA完整无降解；紫外分光光度计检测结果显示，所有样品RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8-2.0范围内，说明RNA纯度符合标准。本方法与其他常用RNA提取手段相比较，更适用于多酚多糖含量的果实RNA的提取。

2、实时定量荧光PCR结果显示，MrbHLH1的表达模式与果实花青苷合成呈正相关，即随着果实成熟，花青苷合成逐渐积累，MrbHLH1的相对表达量逐渐上升，于果实成熟时达到最高表达；MrbHLH2的表达模式与果实花青苷合成没有较好的相关性，可能不参与杨梅果实发育阶段的花青苷合成调控（图2）。

实施例2：烟草叶片双荧光素酶瞬时表达分析

（一）实验方法

1、烟草种植

首先配制烟草种植基质，比例为泥炭土:珍珠岩:蛭石:草木灰=5:1:1:1；然后将本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种子撒播到基质上，与暗中25℃培养1周；待幼苗破土后，将其移至光下培养，条件为光照:黑暗=16h:8h，湿度为75%；待烟草生出6-8片真叶时，即可用于瞬时表达分析。

2、瞬时表达分析

将含有不同转录因子和基因启动子的GV3101::pSoup甘油菌株划线到含25 μg/ml庆大霉素、2.5 μg/ml四环素和50 μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基上，28 ℃培养48 h；挑取少量菌落涂布到新的含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28 ℃培养24 h；刮取生长良好的菌落，用10 mM MgCl₂，10 mM MES（生物缓冲液），150 mM 乙酰丁香酮，pH 为5.6的渗透液悬浮，使其OD₆₀₀为0.75，渗透液现用现配；若只分析单个转录因子对目的基因启动子的调控效果时，将含该转录因子的菌株渗透液与其1/10体积的含目的基因启动子的菌株渗透液混合，用无针头注射器将渗透液注入6周大的、有6-8片真叶的本氏烟草叶片中；若分析不同转录因子间的互作时，则先将含不同转录因子的菌株渗透液等比例混合，再加入混合液1/10体积的含目的基因启动子的菌株渗透液，然后注入烟草叶片；每次实验中，都要设计严格的阴性对照，即将含pGreenⅡ0029 62-SK空载体的农杆菌菌株渗透液与其1/10体积的含目的基因启动子的菌株渗透液混合，然后注入烟草叶片；注射时，每株烟草注射3-4片幼嫩叶片，同一株烟草注射的渗透液是相同的。

注射3天后，用内径直径为6 mm的打孔器于每片注射过的叶片上取两次样，每株烟草共计6个样；应用Promega提供的Dual-Luciferase Reporter Assay System，取下的叶片于100 μl 1×PBS缓冲液中磨碎，吸取50 μl上清液，加入50 μl Luciferase Assay Buffer避光反应10 min后，与荧光发光检测仪上检测LUC荧光发光信号；再加入50 μl Stop & Glo

Buffer避光反应10 min后检测REN荧光发光信号；由于REN荧光素酶编码基因由35S启动子启动，表达量相对恒定，而LUC荧光素酶编码基因由目的基因启动子启动，当所研究的转录因子对目的基因启动子有调控作用时，LUC荧光素酶的表达量会相应的增强或减弱，因此通过比较注射转录因子的烟草和空载体的烟草的LUC/REN，即可获得该转录因子对目的基因的启动子是否存在调控，不同转录因子间是否存在互作。

（二）实验结果

烟草叶片双荧光素酶瞬时表达分析结果显示，四个转录因子MrMYB1、MrMYB1d、MrbHLH1和MrbHLH2单独作用时，和MrMYB1 与MrbHLH2、MrMYB1d 与MrbHLH1或 MrMYB1d 与MrbHLH2两两互作时，对花青苷合成基因DFR启动子的诱导活性较弱，而当MrMYB1 与MrbHLH1两者共同作用时，DFR启动子活性被强烈诱导，说明：MrMYB1 与MrbHLH1两者间以及MrMYB1、MrbHLH1与DFR启动子间存在相互作用；而对花青苷合成无调控作用的MrMYB1d，即使与MrbHLH1混合，也无法对DFR启动子起诱导作用。这与他人在花青苷合成调控中的研究结果一致，即植物花青苷的合成调控需要bHLH和MYB两种转录因子中的特定成员同时起作用。

应用本方法得到的结果，即MrMYB1 与MrbHLH1两者间以及MrMYB1、MrbHLH1与DFR启动子间存在相互作用，与前人利用转基因技术得到的结果相同，说明本方法的可行性与可靠性较高。除此之外，与转基因技术相比，本方法在基因功能验证试验中，实验周期大大缩短：本方法可在6周内验证出基因的功能，而转基因技术最短需耗时3个月及以上。

对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

<110> 浙江大学

<120>一种转录因子基因功能验证的方法

<160> 18

<210> 1

<211> 23

<212> 碱基序列

<213> 人工序列

<400> 1

ATTTGATACGAAGGAGCTAGCTC

<210> 2

<211> 22

<212> 碱基序列

<213>人工合成

<400> 2

AAACCAATTTAATCTTACATGG

<210> 3

<211> 20

<212> 碱基序列

<213> 人工合成

<400> 3

ATGGCCAATGGCACTCAAAC

<210> 4

<211> 22

<212> 碱基序列

<213>人工合成

<400> 4

TCAACACCTGCAAGCGATTTTC

<210> 5

<211> 2130

<212> DNA

<213> 杨梅（Myrica rubraSieb. and Zucc.）

<400> 5

ATGGCTGCACCGCCGAGTAGCCAGCTTCAGAGTATGCTGCAGGCGGCGGTGCAATCGGTTCAATGGACTTACAGTCTCTTCTGGCAACTCTGTCCGCAACAAGGGATCTTAGTTTGGGCAGATGGGTATTACAATGGAGCAATTAAGACTCGGAAGACGGTGCAGCCCATGGAGGTTAGCGCCGAGGAGGCATCCCTACAGAGAAGCCAGCAGCTTAGGGAGCTCTACGATTCTTTGTCCGCCGCGGAGACAAACCAGCCCGCGCGGCGGCCTTGTGCTGCCTTGTCACCTGAAGACTTGACCGAATCGGAATGGTTCTACTTGATGTGCGTCTCGTTCTCTTTTCCTCCTGGGGTTGGGATACCGGGAAAAGCATATGCGAGGCGGCAGCATGTATGGCTCACCGGCGCAAATGATGTGGATAGCAAAACTTTCTCTAGAGCCATTCTTGCCAAGAGTGCTCGTATTCAGACTGTAGTTTGCATTCCCCTACTGGATGGAGTCGTGGAGTTCGGCACAACGGATAAGGTGCAAGAAGACCTTGGCTTTGTCCAACATGTCAAGACTTTCTTCACTGAGCATCCCCACCACCATCAACCTCTCCCACCAAAACCCGCTCTGTCTGAGCACTCCACTTCCAATCGTGCCACGTCTTCCGACCATAGCCGTTTCCACTCTCCTCCAATCCCGGCCATGTATGCTGTGGCGGATCCACCAGTCAATGCAAACCCAGATGACGAGGAGGAAGAAGAGGAGGACGAGGATGAGGACGGCGAGTCTGACTCGGAAGCCGAAACTGGTCGTAACAATCGAGCAATTGAAGCAGCCCAAAGCCCTCAAGGGACAGCAGCACCACCACCAGCTGAGCCGAGCGAACTCATGCAGCTTGAGATGTCGGAGGACATCAGGCTTGGCTCACCGGATGACGGGTCTAATAATTTGGACTCAGATTTTCACATGCTTGCTGTGAGGCAGTCGGCAAACCCGATGAATCACCAGCACCAAGCCGACCTGTACCGAGCTGAGTCTACTCGAAGATGGCCACTAATGCAAGAACCATTGGGTAGCGGGATTCAACATGAACAACCCTCAGGACCCCCATCCCTAGAGGAGCTGACACAGGAGGACACCCACTACTCTCAAACGGTCTCCACCATCCTCCAAACCCAGCCCAGCCGATGGACGGATGCCTCCTCCACCGCCTACGTACCCTACTCCACCCAATCAGCATTTGTCAAGTGGACAACTCGTGCTGAACACCACCTCCACGTCCCCATGGAAGGTACCTCCCAGTGGCTCCTCAAGTACATTCTGTTCAGCGTACCCTTCCTCCACACCAAGTACCGCGACGAAAACTCTCCGAAACTGCGGGACGGCGATGCAACCACTCGGTTCAAGAAGGGAACTCCGCAGGACGAGCTCAGCGCCAATCACGTCCTCGCCGAGCGCCGCCGCCGTGAGAAGCTCAACGAGAGGTTCATTATACTCAGGTCGCTGGTCCCTTTCGTGACCAAAATGGACAAGGCCTCGATCTTAGGTGACACGATCGAGTACCTGAAGCAACTGCGTAAGAAGATTCAGGATCTGGAGGCACGTTACCGACAGATGGAGATTGATCAACGGTCGAGATTAGGGGACCTACAAAGGTCTAGCAGCTTGGGGGACCTACAAAGGTCCAGTAGTTTGAAGGAGCAGCGGAGCGGGGTGACTGCGGTGGAGCGGACCCGAGCGGGAACGGACCGAACGCGGGCGGTTCAAATACCCGGGCCGGATAAGAGGAAGTTGAGGATTGTGGAGGGGAGCGGAGGGTGTGCGAAACCCAAGACGGTTGAGTCGCCACCGCCACCTCCATCGCCGACGTCGACGGGAACCACGGTGCAGGTATCAATCATAGAGAGGGACGCGTTGTTGGAGCTGCAATGCCCGTACAAGGAAGGGCTGTTGCTTGACGTCATGCAAATGCTGCGAGAGCTCCGGATAGAGACCACCACTGTCCAGTCTTCGTTGACCAATGGGCTATTCGTAGCTGAGTTAAGAGCCAAGGTGAAGGAGAACGTGAATGGGAAGAAAACAAGCATTGTGGAGGTGAAGAGGGCAATAAATGAAATTATACCCCACAATGACTCGTAG

<210> 6

<211> 1971

<212> DNA

<213>杨梅（Myrica rubraSieb. and Zucc.）

<400> 6

ATGGCCAATGGCACTCAAACCCATGATGGGTTGCCAGAGAACCTAAGAAAGCGGCTTGCGGTTGCTGTGAGGAGCATTCAGTGGAGTTATGCAATTTTCTGGTCACTGTCAACCACACAACAAGGGGTACTGGAATGGGGTGATGGGTACTATAATGGAGACATCAAGACTAGGAAAACAGTCCAAGCGGTGGAACTTAAGGCTGATAAAATCGGCCTACAGAGGAGTGAGCAATTAAGAGAACTTTACCAGTCTCTGTTGGAAGGTGAAGCCGACCAACAAGCCAAGAGGCCTTCTGCAGCATTGTCTCCGGAGGATCTCTCAGATGCTGAGTGGTATTACTTGGTTTGCATGTCCTTCGTATTCAGTCCTGGCGAAGGTTTGCCAGGAAGAGCATTAGCAAATGGCCAAGCCATCTGGTTATGCAATGCTCAATATGCAGACAGTAAAGTATTCTCTCGATCTTTGCTAGCTAAGAGCGCATCTATTCAGACTGTTGTATGTTTTCCCTATCTGGGTGGTGTAATCGAGCTAGGTGTGACCGAACTGGTCTCAGAGGACCCTAGTCTCCTTCAACACATCAAAGCCTCCTTACTAGAGTTGTCAAAGCCTGTATGTTCCGACAAATCTTCCCCTACTCCTCCTAAAGCAGATGATGATGGAGATCCAATCTGTGCCAACGTTAATCTGGAAATAATGGATACTTTGCCTTTGGAGAACCTTTATTCCCCCACAGAAGGGATCGAGTTTGATCGGGAAGGAATCGTTGAATTAGGCGGAAATATCCATGAAGAAATCAACATGGATTCTCCTGATGAATGTTCCAATGGCTGWGAGCACAATCACCAGACGGAAGACTCCTTTATGCTTGATGGCATAAATGGTGGGGCTTCTCAAGTTCAGAGCTGGCATGTTTTGGATGATGACTTTAGCAATGGTGTTCCGGATTCCATGAATTCCAGTGACTGTATATCTGAAGCTTTTGTAAATCAAGAAAAGGCTATCTCTACTCTGAAGAGAGAAGATGTAAATCAACATTTAAAAGAACTTCAAAACTCCAATCACACAAAACTAGGTTCCTTGGATCTAGGAGCTGATGATGACTTACACTACCGAAGAATTCTTTCTGCCATTGTCGGAAGCTCACCACGGTTGATTGAAAATCTACGCTTTCACTATACTGATCACAGATCAAATTTTCTGTGTTGGACGAAAGAAGCACTTGGTGATGCTTATAGGCCACAGGCACAGCAGACAATGCTAAAAAAGATTTTATTTACAGTCCCTTTGATGTATGGTGGTTGCTCTTTTAGGCTCCAGAGGGAAAATTGTGGAAAAGAATGGCTTCGGAAATCAGAAAGTGGTGATATTTGCCTGGGACATGTTTTGTCAGATAATAGAAGAGAGAATGAAAACTTTCTGGCTCTCAAGTCAATGGTTCCTTCTATCAGTGAGATTGATAAAGCATCGATTCTTCGGGACACAATTAAATACTTGAAAGAGCTAGAGGCAAGGGTAGAAGAGTTAGAATCTTGTATGGATTCGGTAGATTATGAGGAAAGAGCTAGAAGGAAATATCTGGATATGGTAGAGCAGATATCAGATAATTGTGACAAGAAAAAGATTGATAATGGCAAGAAGTCTTGGATAAACAAGAGGAAGGCTTGTGAGTTTGACGAAACTGATCCAGAGCTCAACAGAGTTGTTCCTGAAGATAGCCTGCCGTTAGATGTAAAAGTCAGCATAAAAGAGCAAGAGGTACTGATAGAGATGAGATGTCCTTACAGAGAGTATGTTTTGCTCGATGTCATGGATGCAATAAATAATCTGCACTTGGAAGCACACTCTGTCCAATCATCTGCTCCGAATGGCATTCTGACATTGACACTAAAATCTAAGTTTCGAGGAGCGGCAACTGCACCAGTGGGAATGATCAAGCAAGCGCTCTGGAAAATCGCTTGCAGGTGTTGA

<210> 7

<211> 21

<212> 碱基序列

<213>人工合成

<400> 7

GGAGGTGAAGAGGGCAATAAA

<210>8

<211> 21

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 8

CACGGCTACTTCTCGATGGTA

<210> 9

<211> 23

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 9

TAAAATCTAAGTTTCGAGGAGCG

<210> 10

<211> 23

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 10

CACAACAAATCAAGAAACAAAGG

<210> 11

<211> 23

<212> 碱基序列

<213>人工合成

<400> 11

AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC

<210> 12

<211> 26

<212> 碱基序列

<213>人工合成

<400> 12

TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA

<210> 13

<211> 29

<212> 碱基序列

<213>人工合成

<400> 13

TAGAATTCATGGCTGCACCGCCGAGTAGC

<210>14

<211> 29

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 14

CGAAGCTTCTACGAGTCATTGTGGGGTAT

<210> 15

<211> 28

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 15

CGGGATCCATGGCCAATGGCACTCAAAC

<210>16

<211> 30

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 16

TAGTCGACTCAACACCTGCAAGCGATTTTC

<210>17

<211> 20

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 17

CCACTATCCTTCGCAAGACC

<210>18

<211> 20

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400> 18

TGGTGATTTCAGCGAATTGG

Claims

1.一种转录因子基因功能验证的方法，通过以下步骤实现：

（1）电子克隆：根据已公布的或者自行构建待验证物种的转录本信息库进行电子克隆，自行构建该物种的转录本信息库时，所选样本要尽可能多且具有代表性，本发明以杨梅不同成熟度的果实以及不同组织为样本，抽提总RNA后进行深度测序，构建成杨梅转录本信息库，以此转录本信息库，根据bHLH转录因子的保守序列，采用Blast生物信息学手段，程序中阈值设为1×10^-5，从海量Unigene中筛出属于bHLH家族的Unigene，进一步分析Unigene，筛出可能与杨梅花青苷合成相关的Unigene，将相关的Unigene进行序列重叠性分析，得到2条拼接序列SEQ：NO. 5和SEQ：NO. 6，分别命名为MrbHLH1和MrbHLH2，首先采用普通PCR技术，对拼接的MrbHLH1和MrbHLH2进行验证，所用引物分别为SEQ：NO. 1和SEQ：NO. 2及SEQ：NO. 3和SEQ：NO. 4，然后再利用在线blastn算法，分析得到的MrbHLH1和MrbHLH2与其他物种中基因序列的同源性，采用Clustal对MrbHLH1和MrbHLH2及其他物种中调控花青苷合成的bHLH进行序列比对，分析MrbHLH1和MrbHLH2是否具有与其他物种中调控花青苷合成的bHLH相同的结构域，应用Mega 5.0分析MrbHLH1和MrbHLH2与其他物种中调控花青苷合成的bHLH的亲缘关系，进一步预测MrbHLH1和MrbHLH2是否具有调控花青苷合成的功能；

（2）实时定量荧光PCR分析转录因子基因表达模式：根据已确认的MrbHLH1和MrbHLH2的全长和3’端非编码区序列分别设计实时定量PCR特异引物，序列分别为SEQ：NO. 7和SEQ：NO. 8及SEQ：NO. 9和SEQ：NO. 10，PCR产物包含终止密码子，长度分别为109bp和162bp，引物的特异性通过普通PCR和序列测定双重手段进行验证，提取杨梅不同成熟度的果实RNA，取1 μl逆转录合成cDNA，然后稀释10倍，再将所用引物稀释至2.5 μM，参照Fermentas公司生产的Maxima

SYBR Green/ROX qPCR Master Mix试剂盒说明书配制PCR反应体系，应用iCycler iQ Q-PCR仪器（Bio-Rad，USA），反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，40个热循环；熔解曲线分析65 ℃到95 ℃，每5 sec升高1 ℃；反应结束后，根据每个模板对应的Ct值，以内参基因为标准将各成熟度果实的cDNA模板原液按照10×2^-(Ct-25)公式进行稀释，使所有模板Ct值均为±25，以序列是SEQ：NO. 11的实时定量特异引物和序列是SEQ：NO. 12的内参基因的特异引物进行荧光定量PCR，依据两者扩增效率的差异判断转录因子的相对表达量；

（3）超表达载体构建：根据MrbHLH1和MrbHLH2全长序列分别设计含限制性内切酶酶切位点的引物序列SEQ：NO. 13和SEQ：NO. 14及SEQ：NO. 15和SEQ：NO. 16，扩增两个基因的开放性阅读框，以杨梅成熟果实cDNA为模板，参照PrimeSTAR

HS DNA polymerase说明书，配制终体积为20 μl PCR体系：2.5 U/μl HS DNA polymerase 0.2 μl，5×Buffer 4 μl，2.5 mmol/l dNTP 1.6 μl，10 μM/l引物各0.5 μl，50 ng/μl cDNA模板1.0 μl，加ddH₂O至终体积20 μl，按说明书推荐的PCR程序进行产物扩增，反应条件为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 sec，58 ℃退火5 sec，72 ℃延伸2 min 30 sec，35个热循环；72℃延伸10 min，4℃保存；

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收后经相应限制性内切酶处理，酶切产物再次用1%琼脂糖凝胶电泳，回收，然后连接到同样经相应限制性内切酶处理的pGreenⅡ0029 62-SK表达载体上；

将重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用不含任何抗生素的LB液体于37 ℃ 150 rpm培养细胞1 h后，然后将其均匀涂布于含50 μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，用pGreenⅡ0029 62-SK表达载体自带的SEQ：NO. 17和SEQ：NO. 18检测引物对阳性克隆进行菌液PCR验证，最后选取含目的基因的阳性克隆菌液送上海Invitrogen公司进行测序验证，根据公司测序结果，将正确的阳性克隆菌液置于37 ℃、150 rpm恒温摇床上过夜培养后进行质粒抽提，应用相应限制性内切酶处理抽提到的质粒，再次确认载体构建的正确性，将最终确认正确构建的表达载体通过电击导入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，菌液均匀涂布于含25μg/ml庆大霉素、5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，用20%灭菌甘油保存筛选到的阳性克隆，存放于-80℃；

（4）烟草叶片双萤光素酶瞬时表达分析：将存放于-80℃的甘油菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28℃培养48 h，挑取少量菌落涂布到另一个含相同抗生素的LB固体培养基上，28 ℃培养24 h，刮取生长良好的菌落，用10 mM MgCl₂，10 mM MES，150 mM 乙酰丁香酮，pH 为5.6的渗透液悬浮，使其OD₆₀₀为0.75，含不同转录因子的菌株渗透液等比例混匀，再加入混合液1/10体积的含结构基因启动子的菌株渗透液，然后用无针头注射器将渗透液注入6周大的、有6-8片真叶的本氏烟草叶片中，3天后检测叶片中两种荧光素酶的比值：应用Promega提供的Dual-Luciferase

Reporter Assay System和发光荧光检测仪分析LUC和REN的表达，将叶片于100μl 1×PBS缓冲液中磨碎，吸取50μl上清液，加入50μl Luciferase Assay Buffer避光反应10min后检测LUC荧光发光信号，再加入50μl Stop &Glo

Buffer避光反应10min后检测REN荧光发光信号，分析不同转录因子间、转录因子与启动子间是否存在互作，验证转录因子在该代谢途径中的调控作用。

2.根据权利要求1所述的一种转录因子基因功能验证的方法，其特征在于，所述步骤（2）中各模板cDNA浓度的调整方法为：首先将1μl由RNA逆转录的cDNA稀释10倍，内参基因的上下游扩增引物序列是SEQ：NO. 11和SEQ：NO. 12，分别稀释至2.5μM，将适量的SYBR Green/ROX qPCR Master Mix和引物配制成PCR Mix，分装到每个反应管，最后于相应的反应管内加入对应的cDNA模板，进行qPCR，反应结束后，根据每个模板对应的Ct值再次对模板原液按照10×2^-(Ct-25)公式进行稀释，使所有模板Ct值均为25左右。

3.根据权利要求2所述的一种转录因子基因功能验证的方法，其特征在于，所述步骤（4）中烟草叶片双萤光素酶比值检测方法为：将含结构基因启动子的pGreenⅡ0800-LUC质粒农杆菌菌株和含转录因子的农杆菌菌株同时注入烟草叶片，3天后，取样，应用Promega提供的Dual-Luciferase

Reporter Assay System和发光荧光检测仪分析LUC和REN的表达，将叶片于100μl 1×PBS缓冲液中磨碎，吸取50μl上清液，加入50μl Luciferase Assay Buffer避光反应10min后检测LUC荧光发光信号，再加入50μl Stop &Glo Buffer避光反应10min后检测REN荧光发光信号。