CN103215271A

CN103215271A - 一种植物启动子及其应用

Info

Publication number: CN103215271A
Application number: CN2013101633986A
Authority: CN
Inventors: 张博森; 宋素胜; 齐天从; 樊萌; 田海霞; 田翠丽; 彭文; 谢道昕
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: CN103215271B

Abstract

本发明公开了一种植物启动子及其应用。本发明所提供的启动子是如下1）-3）中任一种：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。实验证明，本发明提供的启动子可以驱动目的基因在植物的根、叶及花组织中表达。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物特别是十字花科的蔬菜花卉的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种植物启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物启动子及其应用，特别涉及一种能驱动基因在拟南芥的根、叶及花器官表达的启动子。

背景技术

拟南芥（Arabidopsis thaliana）属于十字花科植物，被广泛用于植物分子生物学、发育生物学、和遗传学的研究，因为其生长世代时间短、基因组小等特点使其成为了一种典型的模式植物。

bHLH（basic/helix-loop-helix）蛋白是植物中的一大类转录因子，其关键结构域含有约60个较保守的氨基酸。bHLH因子可以识别基因组上的保守序列，进而在动植物及一些高等真核生物的基因转录调控中起作用。在拟南芥中至少含有130个编码bHLH蛋白的基因，这些基因在调控植物的生长发育，抗逆、响应激素等方面都起着重要的作用。

启动子（Promoter）是基因组基因的一个重要组成部分，它像“开关”一样，在转录水平上基本决定其控制下的编码基因是否表达、何时表达、何处表达和表达强度。因此，对拟南芥bHLH蛋白的编码基因及其启动子的克隆将具有十分重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的DNA分子，来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana）品种Columbia-0生态型，为如下1）-3）中任一种：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由2502个核苷酸组成。

含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

在本发明的中，所述重组载体为在pCAMBIA1391Z载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为Pst I和BamH I。

所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因（来源于pCAMBIA1391Z载体）；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于pCAMBIA1391Z载体）。

所述DNA分子在启动目的基因在植物表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥（如拟南芥Columbia-0）。

在上述应用中，所述表达为在如下三个器官至少一种中的表达：根、叶和花。

利用所述DNA分子培育转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，该方法包括如下步骤：

1）构建目的基因重组表达载体：将目的基因插入携带有所述DNA分子的所述重组载体，使所述DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；

2）将步骤1）构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到表达所述目的基因的转基因植物。

在上述方法中，所述表达为在如下三个器官至少一种中的表达：根、叶和花。

将所述目的基因重组表达载体导入所述目的植物的方法可为农杆菌介导法、Ti质粒法、Ri质粒法、植物病毒载体法、直接DNA转化法、显微注射法、电导法等，在本发明的实施例中具体采用的为农杆菌介导法。

另外，扩增所述DNA分子全长或任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明提供的启动子可以驱动目的基因在植物的根、叶及花组织中表达。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物特别是十字花科的蔬菜花卉的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为在重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS中，插入bHLH启动子部分的结构示意图。

图2为bHLH pro转基因拟南芥及对照野生型拟南芥的根、叶及花器官GUS染色情况。其中，A为GUS染色的bHLH pro转基因拟南芥根；B为GUS染色的bHLH pro转基因拟南芥叶；C为GUS染色的bHLH pro转基因拟南芥花；D为GUS染色的野生型拟南芥根；E为GUS染色的野生型拟南芥叶；F为GUS染色的野生型拟南芥花。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

拟南芥Columbia-0生态型：Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，种子号：CS6673。

农杆菌GV3101：记载在“The bHLH Transcription Factor MYC3Interacts with theJasmonate ZIM-Domain Proteins to Mediate Jasmonate Response in Arabidopsis。ChengZhiwei,Sun Li,Qi Tiancong,Zhang Bosen,Peng Wen,Liu Yule,Xie Daoxin.MolecularPlant,1-10.2010”一文中，公众可以从清华大学获得。

pCAMBIA1391Z载体：此载体可从Cambia institute获得。http://www.cambia.org/daisy/cambia/2062.html?branch=1&language=1，网址为pCAMBIA1391Z载体的图谱。

实施例1、bHLH启动子序列的获得

以拟南芥Columbia-0生态型的叶片为材料，提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用Forward-PstI和Reverse-BamHI组成的引物对，在高保真的PFU酶的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

Forward-PstI：5’-aaCTGCAGcatacgatgagctttaagttttggtc-3’（大写字母部分为Pst I的识别位点，其后的序列为序列1的第1-26位）；

Reverse-BamHI：5’-cgcGGATCCcaacaaaaaggaaagacttttaag-3’（大写字母部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列1的第2479-2502位的反向互补序列）。

将PCR扩增所得产物进行测序，测序结果表明PCR产物的序列为“aaCTGCAG+序列1+GGATCCgcg”。将序列表的序列1所示的DNA命名为bHLH启动子（bHLHpro）。

实施例2、转基因拟南芥的获得和鉴定

一、重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS的构建

1、用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切实施例1得到的PCR扩增产物，得到酶切产物。

2、用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切pCAMBIA1391Z载体，回收约11.3kb的载体骨架。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS。在重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS中，插入bHLH启动子部分的结构示意图见图1。根据测序结果，对重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS进行结构描述如下：在pCAMBIA1391Z载体的Pst I和BamH I酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA片段后得到的重组质粒。

二、bHLHpro转基因拟南芥的获得

（1）将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS电击转化农杆菌GV3101，得到的重组农杆菌记作GV3101/pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS。

（2）28℃过夜培养步骤1得到的重组农杆菌，并调整菌液浓度至约为OD600=0.8。

（3）通过花浸泡法（花浸在步骤（2）的菌液中约30秒）将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS导入80株拟南芥Columbia-0生态型，收获的种子即为T0代拟南芥的种子。

（4）将T0代拟南芥的种子播种于含25mg/L潮霉素（pCAMBIA1391Z载体带有潮霉素抗性）的MS培养基上进行筛选，得到40株具有潮霉素抗性的T1代拟南芥（编号依次为1-40）。

（5）待T1代拟南芥长至5-6片叶子时将其移栽到蛭石上生长45天（24℃；16小时/光照+8小时/黑暗），分别提取40株T1代拟南芥叶子的DNA，用F1（载体上引物）和Reverse-BamHI（bHLH pro的反向引物）组成引物对进行PCR鉴定，如果显示约2600bp的PCR扩增产物，则植株为bHLH pro转基因植株。

F1：5’-tgttgtgtggaattgtgagc-3’；

结果表明，40株T1代拟南芥均为bHLH pro转基因拟南芥。

三、GUS染色分析

将步骤二中在蛭石上生长45天的鉴定阳性的bHLH pro转基因拟南芥（40株）进行GUS染色分析。具体如下：

（1）将待检测的拟南芥根、叶和花及阴性对照材料（拟南芥Columbia-0生态型）均加入GUS染色液【配方为：200mM PBS(PH7.0)；100mM亚铁氰化钾；100mM铁氰化钾；0.5mM EDTA(PH8.0)；X-Gluc(10mg/ml)；吐温20】中，37℃保温数小时或过夜。

（2）样品（根、叶和花）用70％乙醇脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。

（3）显微镜观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。

结果显示，40株bHLH pro转基因拟南芥的根、叶及花器官均显示蓝色，而作为对照的拟南芥Columbia-0生态型植株的根、叶和花均未被染色，部分染色结果见图2。以上结果表明，序列表中序列1所示的bHLH启动子（bHLH pro）确实可以驱动GUS基因在拟南芥植株的根、叶及花中表达。

Claims

1.DNA分子，为如下1）-3）中任一种：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pCAMBIA1391Z载体的多克隆位点处插入权利要求1所述DNA分子后得到的重组质粒。

4.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

5.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在植物表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为十字花科植物；

所述十字花科植物具体为拟南芥。

7.利用权利要求1所述的DNA分子培育转基因植物的方法，包括如下步骤：

1）构建目的基因重组表达载体：将目的基因插入权利要求2或3所述重组载体，使权利要求1所述的DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为十字花科植物；

所述十字花科植物具体为拟南芥。

9.扩增权利要求1所述DNA分子全长或任一片段的引物。