CN104031922A - 参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一个参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1。以拟南芥中特异调控木质素合成的AtMYB58氨基酸序列为参考序列，利用蔷薇科数据库，通过同源克隆获得。EjMYB1的表达量在枇杷不同组织、不同处理中与木质素的积累呈正相关；EjMYB1可正向调控木质素合成基因EjPAL1、Ej4CL1和Ej4CL5的启动子活性；EjMYB1在烟草中瞬时过量表达时，可极显著提高其叶片木质素含量。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1。
背景技术
MYB是一类存在于真核生物中的功能多样的转录因子。MYB含有高度保守的DNA结构域，称为MYB结构域，是由52个氨基酸组成的4个不完全重复氨基酸序列，根据MYB结构域数量的不同可以分为几类，其中R2R3-MYB为在植物中研究十分广泛的一类，在拟南芥中有126个R2R3-MYB成员，并细分为22个亚家族。R2R3-MYB参与植物特异的生长过程，初生和次生代谢、细胞建成、发育过程和响应生物与非生物胁迫等。
木质素是芳香族类的杂聚物，是次生细胞壁的主要组成之一。木质素可参与植株机械支持、维管系统中的水分和溶质运输、防御病虫害等生命活动。然而，在有些植物中，木质素却是影响其品质的主要因素之一，例如，作为生物能源的柳枝稷，次生细胞壁的另两个组成成分纤维素、木聚糖是作为发酵的主要碳源，而木质素则会影响其生物转化过程；作为果蔬类的枇杷、山竹、竹笋、芹菜等，木质化则严重影响了其食用品质与贮藏品质。
枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）属于蔷薇科，为非跃变型果实，可分为红肉和白肉两大类型。与其他果实采后出现软化的现象不同，红肉枇杷果实在采后会出现木质化现象，使果实硬度上升，粗糙少汁，风味变淡，商品价值下降。因此，分析木质化产生的调控机制，在枇杷果实木质化研究中具有重大意义。在转录调控水平上，多个MYB成员是在木质素合成途径中起转录激活的作用。拟南芥中先后发现AtMYB46、AtMYB83参与次生细胞壁的形成，AtMYB58、AtMYB63为特异参与木质素的合成调控。另外，木本植物中，火炬松的PtMYB1、PtMYB4、PtMYB8，桉树的EgMYB2、杨树的PtrMYB3、PtrMYB20都参与木质素单体的合成。果树研究上，并未涉及类似MYB的研究，枇杷作为木质化现象典型的果实开展此类研究的是十分必要和重要的。
发明内容
本发明的目的是提供一个参与枇杷果实木质素合成调控的MYB转录因子EjMYB1，其核苷酸序列编号为：SEQ ID N0：1。其与拟南芥中特异调控木质素合成的AtMYB58相似度高，基因表达模式与枇杷木质素的合成呈正相关，可正向诱导木质素合成基因EjPAL1、Ej4CL1和Ej4CL5的启动子活性。转录因子EjMYB1具体通过以下步骤获得：
以拟南芥中特异调控木质素合成的AtMYB58氨基酸序列为参考序列，在蔷薇科数据库中（http://www.rosaceae.org）进行比对，选择匹配度最高的三条序列，MDP0000133542(chr5:11008894..11011881),MDP0000435315(chr3:7586759..7588715)和MDP0000230141(chr3:7611165..7613121)，根据这三条序列在苹果基因组上的位置，获得相应核苷酸序列；根据这三条序列设计引物，以枇杷cDNA为模板，获得以MDP0000230141（chr3:7611165..7
613121）为序列的枇杷序列SEQ：NO. 1，命名为EjMYB1。
为了进一步确定序列SEQ：NO. 1的编码区，对其进行RACE扩增。根据SEQ：NO. 1序列设计RACE引物SEQ：NO. 2-5，以枇杷RACE cDNA作为模板，参照SMART RACE cDNA
Amplification（Clontech）说明，进一步确定枇杷上此序列的编码区，获得包含非翻译区的SEQ：NO. 6。
1. EjMYB1表达量与枇杷木质素合成呈正相关：
根据已获得的包含非翻译区的SEQ：NO. 6设计实时定量荧光PCR引物（SEQ：NO. 7-8），产物长度为89bp，其特异性经熔点曲线以及测序结果验证。分析枇杷不同组织（茎、叶、果实）以及不同处理果实（0℃，热激，程序降温）的木质素含量，并提取样品总RNA经TURBO
DNase处理后合成cDNA（RevertAid™ First Strand cDNA，Fermates）。以枇杷cDNA为模板，参照LightCycler
FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I（Roche），利用LightCycler 1.5定量PCR仪（Roche）进行实时定量PCR分析。结合各样品中木质素含量分析，结果显示在木质素含量高的枇杷组织中，EjMYB1的表达量同样较高；经0℃处理的枇杷果实木质素积累增加，同时EjMYB1的表达被迅速强烈诱导；而热激和程序降温处理后果实中木质化进程延缓，且EjMYB1的表达被缓慢诱导。
所述的实时定量PCR参数为：5×LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR
Green I Master Mix 2 μl， 上下游引物（10 μM）各0.5 μl，cDNA模板1 μl，PCR级别的水6 μl，共10 μl体系。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性5 sec，60℃退火5 sec，45个热循环；熔解曲线分析65℃到95℃，每5sec升高1℃，结束。
2. EjMYB1可正向调控木质素合成基因启动子活性：
（1）EjMYB1的表达载体构建：
根据确定的EjMYB1的全长序列（SEQ：NO. 1）设计全长引物（SEQ：NO. 9-10），以枇杷cDNA为模板，参照FastStart High Fidelity PCR System（Roche）进行PCR扩增，产物回收连接到pGEM-T easy载体转化到大肠杆菌DH5α，进行测序确定。确定后将质粒经NotI、SpeI双酶切，连接到表达载体pGreen
SK。重组质粒经测序验证，进而电转到农杆菌GV3101::pSoup中，以甘油菌形式保存于-80℃。
（2） EjMYB1转录调控启动子活性分析：
设计引物（SEQ：NO.
11-28），以GenomeWalker™ Universal Kit试剂盒（Clontech，USA）制备的枇杷DNA为模板，扩增枇杷木质素合成基因EjPAL、Ej4CLs和EjCADs的启动子序列（SEQ：NO. 29-37），分别重组到pGreen LUC表达载体上，重组质粒经测序验证。将含有pGreen SK、pGreen
SK-EjMYB1、pGreen LUC-EjPAL1、pGreen LUC-Ej4CLs和pGreen
LUC-EjCADs启动子的重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μg/ml庆大霉素和50 μg/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h后，刮取部分农杆菌涂布到相同的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中（10 mM
MES，10 mM MgCl2，150 mM 乙酰丁香酮，pH 5.6），并调整OD600到0.75。将pGreen SK和pGreen SK-EjMYB1分别与pGreen LUC-EjPAL1、pGreen
LUC-Ej4CLs、pGreen LUC-EjCADs以10：1的比例混合注射到约4周大小的本氏烟叶片上。3 d后，进行双荧光素酶检测，即检测叶片中REN和LUC的荧光值，计算LUC/REN的比值判断EjMYB1是否具有调控木质素合成基因EjPAL、Ej4CLs和EjCADs启动子活性的效应。结果显示：EjMYB1可正向诱导EjPAL1、Ej4CL1和Ej4CL5启动子的活性，进而增强枇杷木质素的积累。
所述的双荧光素酶检测方法为：应用Dual-Luciferase® Reporter
Assay System（Promega）和荧光检测仪分析LUC和REN的表达。用半径2 mm的打孔器在注射口附近取样，放在100 μl PBS缓冲液中磨碎，吸取上清液50 μl，加入50 μl Luciferase
Assay Buffer避光反应10min后检测LUC荧光发光信号值，再加入50 μl Stop & Glo
Buffer避光反应10min后检测REN荧光发光信号值。
本发明的另一个目的是提供所述MYB转录因子EjMYB1在调控采后枇杷果实木质化中的应用。以烟草为例，EjMYB1瞬时过量表达时显著提高烟草叶片木质素含量，可增强烟草叶片木质素合成，证实其参与木质素合成的调控，同时为枇杷果实木质化这一产业问题提供理论基础。具体通过以下步骤实现：
将含pGreen SK或pGreen
SK-EjMYB1重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μg/ml庆大霉素和50 μg/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h，刮取部分农杆菌到新的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中（10 mM
MES，10 mM MgCl2，150 mM 乙酰丁香酮，pH 5.6），并调整OD600到0.75。将含pGreen SK或pGreen SK-EjMYB1的农杆菌分别注射到约4周大小的普通烟草相同叶片的两边。5 d后，取注射的叶片冻于液氮中用于后续的木质素含量的测定。结果显示：瞬时过量表达EjMYB1的烟草叶片中木质素含量极显著高于对照叶片，证实EjMYB1在烟草体内具有生物活性，参与了木质素的合成过程。
现有延缓枇杷果实木质素合成的技术，多集中在不同储藏条件的尝试上，工作量大，经济效益低。而本发明提供一个正向参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1及其调控机制，结果显示，抑制EjMYB1表达的储藏条件即可显著抑制或延缓枇杷果实木质素的合成。本发明结果可有效指导枇杷果实的采后储藏，为解决枇杷果实木质化这一产业问题提供有力的理论支撑。
附图说明
图1是枇杷不同组织中木质素含量与EjMYB1表达量的变化。
图2是不同处理中枇杷果实木质素含量的变化。
图3是不同处理中枇杷果实EjMYB1表达量的变化。
图4是EjMYB1调控木质素合成基因启动子活性分析。
图5是EjMYB1调控木质素合成的功能验证。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
实施例 1：EjMYB1全长序列的获得
（一） 实验方法
1. 序列查找：在蔷薇科（http://www.rosaceae.org）的Apple Genome V1.0 predicted peptides数据库中，应用blastp算法，以AtMYB58的氨基酸序列进行查找；选择匹配度最高的前三条序列：MDP0000133542（chr5:11008894..11011881），MDP0000435315(chr3:7586759..7588715)，MDP0000230141(chr3:7611165..76131 21)，根据这三条序列在苹果基因组上的位置，获得相应核苷酸序列，设计引物，以枇杷cDNA为模板，获得了以MDP0000230141（chr3:7611165..7
613121）为参考序列的枇杷序列SEQ：NO. 1
2. EjMYB1序列扩增：根据查找到的核苷酸序列扩增获得一条序列SEQ：NO. 1，命名为EjMYB1。以枇杷cDNA为模板，应用SEQ：NO. 9-10为引物扩增，参照FastStart High
Fidelity PCR System（Roche）进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物回收连接到pGEM-T easy载体转化到大肠杆菌DH5α，进行测序确定。
3. EjMYB1非编码区序列扩增：参照SMART RACE cDNA Amplification（Clontech）说明，设计RACE引物SEQ：NO. 2-5。以枇杷RACE cDNA作为模板，以ExTaq聚合酶（Takara）进行PCR扩增，进行2次PCR。第一次PCR反应条件为: 反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，72℃，150 s，5个循环；94℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸150 s，5个循环；94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸150 s，25个循环；最后72℃延伸10 min。第二次反应以第一次反应的产物为模板进行，参数为：10×ExBuffer 2 μL，2.5mmol/L dNTPs 1.6 μl,内测引物NUP 2 μL，10 μmol/L特异内测引物0.5 μl，ExTaq聚合酶0.1 μL，加灭菌的双蒸水至20 μL。94℃预变性5 min；；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物回收连接到pGEM-T easy载体转化到大肠杆菌DH5α，进行测序确定。
（二） 实验结果
获得了EjMYB1的序列SEQ：NO. 1，进一步通过RACE扩增，得到了该序列的5’、 3’末端的非翻译区，即SEQ：NO. 6，其中SEQ：NO. 1为EjMYB1的编码区。
实施例 2：EjMYB1在枇杷不同组织以及不同处理的果实中的表达模式分析
（一） 实验方法
1. 样品处理
成熟度一致，大小均匀，无病虫害的枇杷果实进行以下处理：0℃，即直接将果实贮藏在0℃环境；热激处理，即40℃处理4 h后，再贮藏到0℃环境；程序降温处理，即5℃下放置6 d以后，再贮藏在0℃环境。果肉切成块状后迅速放在液氮中，之后放在-80℃保存。叶片、茎组织用液氮冻后，放在-80℃保存。
2.
总RNA提取
分别称取存放在-80℃的枇杷叶片、茎各0.2 g，果实1 g，按以下步骤提取总RNA：样品在液氮中充分研磨，加入到65℃预热的装有4 ml CTAB/80 μl β-巯基乙醇提取缓冲液的10 ml离心管中，涡旋混合放到65℃加热2 min；再向离心管中加入4 ml氯仿：异戊醇（24：1）抽提液，涡旋混合；15℃ 10000 rpm离心10 min，吸取上清到新的10 ml离心管中，再次加入4 ml氯仿：异戊醇（24：1）抽提液，涡旋，10000 rpm离心10 min，吸取上清到新的10 ml离心管中；加入1/4体积的10 mol/l的LiCl2，放置在4℃冰箱过夜。次日，4℃ 10000 rpm离心30 min，倒上清，用枪头轻轻吸去残余的液体，加入400 μl 65℃预热的SSTE溶液，溶解沉淀；再加入500 μl氯仿：异戊醇（24：1）抽提液，涡旋混合，将液体全部转移到1.5 ml离心管中，10000
rpm离心10 min，吸取上清至新的1.5
ml的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30
min以上；4℃
10000 rpm离心25 min，倒掉上清液，用枪头轻轻吸去残余的液体，加入20 μl DEPC水溶解沉淀。即为总RNA。
3. 基因表达模式分析
将提取的总RNA用TURBO
DNase去除其中的DNA后，参照Fermates公司提供的RevertAid™ First Strand
cDNA合成试剂盒合成cDNA。使用LightCycler
FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I染料试剂盒说明书，应用LightCycler
1.5定量PCR仪用内参基因ACT将各个模板浓度调整到相对一致水平Ct=22~23左右。调整后的cDNA作为模板，用EjMYB1实时定量引物SEQ：NO. 7-8和内参基因ACT进行荧光定量PCR，得到相应的Ct值。不同组织的表达量采用绝对定量的方法计算，即2- △ Ct，其中△Ct为Ct（EjMYB1）与Ct（ACT）之差。三个处理的表达量用相对定量的计算方法，即2- △△ Ct ，即△Ct为Ct（EjMYB1）与Ct（ACT）之差，△△Ct为△Ct（某天处理值）与△Ct（第0天值）之差。
（二） 实验结果
在不同组织中，木质素含量高的组织中，EjMYB1表达量也较高（附图1）。0℃处理过程中随着木质素含量上升，EjMYB1迅速响应，表达量上升，而热激和程序降温处理可以减缓果实木质素含量的升高（附图2），并抑制EjMYB1表达的上升趋势（附图3）。EjMYB1的表达量与木质素含量的变化呈正向相关，由此推测EjMYB1参与枇杷木质素的合成。
实施例 3：EjMYB1转录调控木质素合成基因启动子活性分析
（一） 实验方法
1. 枇杷木质素合成基因启动子载体构建
设计引物（SEQ：NO.
11-28），以GenomeWalker™ Universal Kit试剂盒（Clontech，USA）制备的枇杷DNA为模板，使用Platinum® Taq DNA Polymerase体系进行2轮PCR，扩增枇杷木质素合成基因EjPAL、Ej4CLs和EjCADs的启动子序列（SEQ：NO. 29-37）。第一轮进行PCR反应程序为94℃变性25s，72℃，3 min，7个循环；94℃变性25s，67℃，3 min，32个循环；67℃延伸7min。 以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，反应程序为94℃变性25 s，72℃，3 min，7个循环；94℃变性25 s，67℃,3 min，32个循环；67℃延伸7 min。回收后连接到pGEM-T easy载体并转化到大肠杆菌DH5α，进行测序确定。
用SalI/NcoI双酶切已连到pGEM-T easy载体上的启动子，连接到pGreen
LUC载体上。转化到大肠杆菌DH5α，进行测序确定。将启动子的重组质粒电转到农杆菌GV3101中，挑取阳性克隆，并保存在75%甘油中。
2.
注射烟草
将含有pGreen SK、pGreen
SK-EjMYB1、pGreen LUC-EjPAL1、pGreen LUC-Ej4CLs和pGreen
LUC-EjCADs启动子的重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μg/ml庆大霉素和50 μg/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h后，刮取部分农杆菌涂布到相同的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中（10 mM
MES，10 mM MgCl2，150 mM 乙酰丁香酮，pH 5.6），并调整OD600到0.75。将pGreen SK、pGreen SK-EjMYB1分别与pGreen LUC-EjPAL1、pGreen
LUC-Ej4CL1、pGreen LUC-Ej4CL5以10：1的比例混合注射到约4周大小的本氏烟叶片上，每株注射三片叶子。生长3 d后进行荧光值检测。
3.
双荧光素酶检测分析
用半径2 mm的打孔器在注射口附近取样，每片叶子取2个圆片，一共6个圆片。圆片放在100 μl PBS缓冲液中磨碎，吸取上清液50 μl，加入50 μl Luciferase Assay Buffer避光反应10min后检测LUC荧光发光信号值，再加入50 μl Stop & Glo Buffer避光反应10min后检测REN荧光发光信号值。通过比较pGreen SK-EjMYB1和阴性对照pGreen SK的LUC/REN比值，判断EjMYB1是否具有调控启动子活性的效应。
（二） 实验结果
EjPAL，Ej4CL，EjCAD是枇杷木质素合成的关键结构基因，在Ej4CL 基因家族中Ej4CL1和Ej4CL5两个成员参与木质素的合成。本发明结果证实EjMYB1可增强EjPAL1，Ej4CL1和Ej4CL5启动子的活性分别达到3倍，14倍和4倍（附图4），进而参与枇杷木质素的合成调控。
实施例 4：EjMYB1调控木质素合成的功能验证
（一） 实验方法
1. 烟草注射
将含pGreen SK或pGreen
SK-EjMYB1重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μg/ml庆大霉素和50 μg/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h后，刮取部分农杆菌到涂布到相同的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中（10 mM
MES，10 mM MgCl2，150 mM 乙酰丁香酮，pH 5.6），并调整OD600到0.75。使用无针头注射器将菌液注射到约4周大小的普通烟的叶片上，每株植株注一片叶子，在同一片叶子的两侧分别注射含pGreen
SK或pGreen SK-EjMYB1重组质粒的农杆菌菌液。生长5 d后，取注射过的叶片进行木质素含量的测定。
2.
木质素含量测定
样品的洗涤：烟草叶片冻样置于液氮中磨成粉末，装入到5 mL洗液（100 mM的K2HPO4/KH2PO4，0.5% Triton X-100，0.5%
PVP，pH 7.8）中，在室温下振荡洗涤30
min，10000 g，20
min离心，用洗液重悬浮沉淀，重复洗两次，再用100%甲醇洗4次，每次洗的时间均为0.5 h，同样10000 g，20 min离心。沉淀在80℃烘箱中烘干过夜。木质素含量的测定：精确称取10 mg的经洗涤烘干后的粉末于10 mL的带盖的管子，加入1 mL的2 M HCl和0.1 mL的巯基乙酸，沸水浴8 h后置冰上冷却，15000 g，4℃离心20 min；沉淀用蒸馏水清洗、过夜烘干后重悬浮于2 mL的1 M的NaOH中，室温下轻微振荡反应18 h，再用15000 g，离心20 min；取0.5 mL的上清液于新的试管中，加入100 μL的浓盐酸，置4℃下4 h以沉淀巯基乙酸结合的木质素，用15000 g，4℃离心20 min，沉淀溶于1 mL的1 M的NaOH。经过适当稀释后，用紫外-可见分光光度计测定280 nm处的吸光值。以NaOH溶液为空白对照。单位为×103 A280/kg FW，重复3次。
（二） 实验结果
注射含pGreen SK表达载体的农杆菌烟草叶片中木质素含量为3.01×103 A280/kg FW，而注射含pGreen
SK-EjMYB1重组质粒的农杆菌烟草叶片的木质素含量达到了3.74×103 A280/kg FW，极显著地高于阴性对照（附图5）。本发明结果证实了，EjMYB1具有调控木质素合成的功能。
对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110> 浙江大学
<120> 参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1及应用
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<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
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ATGGGGAGAGCTCCTTGCTGTGAGAAGATGGGATTGAAGAAGGGGCCATGGACCTCTGAAGAAGATCAAATTCTTACATCCTTCATCCAAAAATATGGCCATGGAAATTGGCATGCCCTGCCAAAGCAAGCTGGATTGTTGAGATGTGGAAAGAGCTGCCGACTCCGGTGGACAAACTATTTGAGGCCGGATATTAAGAGAGGAAACTTCACAAGAGAAGAAGAGGAAGCTATCATTAAGTTGCATGAAATGCTGGGTAACAGGTGGTCAGCAATTGCAGCTAGATTACCAGGACGCACCGATAACGAAATAAAAAATGTATGGCACACCCACTTGAAAAAAAGACTCAAAGATCATACTACAACAACATCACAAACAAGAAGTAGTAGTAACAGTACTTCCAATGTCACAAGCCAATTTGCTGATGAACCTGAAAATTTGAATTATCCACAACCATCTTCTAGTGATGTTTCCTCCTCATTCACAGAAGTCTCAGCTGCATTGAGTACCGATCAGGACACAATCGTCGTCAAGGACGAAAACATGGAGTTGTCGGAAACCTTCCCCGATGTTGATGACAGCTTCTGGCCAGAGGCACTTTCAACTGATAATTCCAGCGTCCCATTACAATGTCCAAAGGCTTCAAATGATGAACCAATATCGGAGTTTCCCATCACCAAAAACGATTCGGAGGAATTTGGTTTTAGATTTGGTCTAAACATGGATGATGGCATGGAAATTTTGGTATGA
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<211> 26
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> CDS
<222> (95)...(841)
<400>
6
CGACGGCCCGGGCTGGTCCTCAGAAATATTGAGCTCTCAAACACAAGTATTGCTGTCTTCTTAGCATTTTTCACCAAAATTAATTAGGAGAGAAATGGGGAGAGCTCCTTGCTGTGAGAAGATGGGATTGAAGAAGGGGCCATGGACCTCTGAAGAAGATCAAATTCTTACATCCTTCATCCAAAAATATGGCCATGGAAATTGGCATGCCCTGCCAAAGCAAGCTGGATTGTTGAGATGTGGAAAGAGCTGCCGACTCCGGTGGACAAACTATTTGAGGCCGGATATTAAGAGAGGAAACTTCACAAGAGAAGAAGAGGAAGCTATCATTAAGTTGCATGAAATGCTGGGTAACAGGTGGTCAGCAATTGCAGCTAGATTACCAGGACGCACCGATAACGAAATAAAAAATGTATGGCACACCCACTTGAAAAAAAGACTCAAAGATCATACTACAACAACATCACAAACAAGAAGTAGTAGTAACAGTACTTCCAATGTCACAAGCCAATTTGCTGATGAACCTGAAAATTTGAATTATCCACAACCATCTTCTAGTGATGTTTCCTCCTCATTCACAGAAGTCTCAGCTGCATTGAGTACCGATCAGGACACAATCGTCGTCAAGGACGAAAACATGGAGTTGTCGGAAACCTTCCCCGATGTTGATGACAGCTTCTGGCCAGAGGCACTTTCAACTGATAATTCCAGCGTCCCATTACAATGTCCAAAGGCTTCAAATGATGAACCAATATCGGAGTTTCCCATCACCAAAAACGATTCGGAGGAATTTGGTTTTAGATTTGGTCTAAACATGGATGATGGCATGGAAATTTTGGTATGATCTTTTCATTAGAACTGGCCATGGGGGAACGCCAGAATTACCAGAATTTTGAGTTTTACAATTTTCTCTCTTTGGAGTTTAGGAGGATATTTTATATTGGTGGTTTGAAAAAGTTTTTAAATATTTTTATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(23)
<400> 7
TGCTGTCTTCTTAGCATTTTTCA
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(20)
<400> 8
CCCCTTCTTCAATCCCATCT
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(22)
<400> 9
ATGGGGAGAGCTCCTTGCTGTG
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(23)
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TCATACCAAAATTTCCATGCCAT
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 11
AGTTCAATGGGTCATGTGTCGCAAGT
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 12
GTTTCCATGGGCTTCCAAGATCACA
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 13
AGTAGGAGTGGAGAGGGAGGTGTTTT
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(29)
<400> 14
TGGGGTAGTTTCTATAGCCATGGCTTGGA
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 15
AGGAGGAGGAGTTTCTGAAGAGGAAG
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 16
ACCCAGATTTCTCCATGGAAGATTGC
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 17
TTAATCAGAGGAGGCATGAGATTGGT
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 18
AGACCATGGTGACTGTTGCTTCTTTG
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(24)
<400> 19
GATTGGAGGAGGGAGAGGGTGAAT
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(24)
<400> 20
GATTCCTCCGCCATGGTTGAAGGT
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 21
GGAGATGTTTTCGAAGCAGTAGGTGT
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
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CTCCATGGGATATGTGTTTGGATGGT
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 23
CTTGACGAGCCATGAAGCAATGTAAC
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400>24
CGCTGCCCATGGCTCTCTCTCTCTCT
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 25
AGTGGCTTTGACGGTATAACCCTTTT
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(30)
<400> 26
GATTCTCCGGTACCCATGGCTCTCTCTAGC
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(26)
<400> 27
CGTTTTGAAGATTCCTTCGGGTAAAC
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<222> (1)...(27)
<400> 28
GCCCATGGTTAATAATTGGGACCCTTA
<210> 29
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<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(923)
<400> 29
CTGGTATCCAAAATCTTACTACGTTAATGCTGCTAAACTGTAAATCTTGATTATAATTTACATTTACATCATCATAAACTACGCATGTTGTTCTAAAACACACTTGTACGCCATGTGTCATCACTAGAATGGTGTAGTTTACATATTCCAACAAAAATTTACATCATCAAGAATTTACATTTACATTTTTAAAAGTTTAACTGACATAACATGTTACATTTGAATTTAATTCAAGATAATCTCTTTACGGTTTGTACACTTTCTTTACGTTCAATTAAAACCGCTATCGTTTCACCTTAAAAAAAACACCAACACCTTACATCATACGACAATGCAACGGCACCTTGCACGAAGAATTTTATTTGTCATATGAACAATTGTTTTTGCAGAGAAATAGGCTGACGTGCTGCTGTCGTGCCTTAGTTTCCTTCAGAGAGCCTGCTTGCTCACCAACCCCCGCCCCCCTCTTCCCTTCCCATTCGGTTATCATTTGACAAGTAAAAGCCCGCGTTTTTGAACCACACCTAAACTACACATGTTGTTCTCAAACACACATGTACGCCACGTGTCGCCACGTGAACGGTCCTAGATCATGAAGATCCAAGGGCCACCTGCAGTTTTCAACTAACACTTCGGCCTACCCACCTAGCATTCGATGTGGGACGTCGCCTATATAAACGAGACAATTATGGGTGAACCAACTCAGGAAAATACTCGTAAATTTTCCTTTTTACCCCAAATTTAACTCAGAGCTAGCACCACCTCTTTCCATTCCCTTCGTTTCCCAATTCCCATTCCCTTATTGTTTCTCTTCGACCAGGTTTTTACCCCACTGAGTTTTTCCCGGCAAGGTTTTTCTCGGCTCCATTCATTCTCATTGTTTCCTATCCCCATTTTGGTATTGTTTGTGATCTTGGAAGCAA
<210> 30
<211> 604
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(604)
<400> 30
CTGGTAAAAATGCGGTTTGGAAACTTTGACATAAATGGTATAAATCTAACCGCACAAAGCAATTCATTAAATATTCAACCACGGCAAGTAATACAGTAGAATTTTGGTGGAATTTCCAAGTCAGGTATTTGGTAGAATTGTGAAAATCACTTTCACCAAGAAGTTCTGAGACGCGCATCTCCTAAATCATGTCGTTGTGATAGTAGTAGTAGGTAAAGGGCAGTATGGTCTTCGCAGACGCCAATTCCTTTGTCAGCCAGTGGTTGGTGTAAAGCCTCTGCATTTAGAAAATGTCCTGACCCACCGCCACCATCCAAACCCACTTTCACCAACCAAACCCCTTGCACTCGTCCCTTCCGCCTCCGGTCACCTATCACCACCAACCCCGAATGTGTCTTATCAAATTTCCAATCTTTCACCATCACGGTTTCACCCCCAAACAATTCCATAATCCCATTTCCCTCCCCCCCACCAACCACACCTCCAGTTGTATATGAAGAACCCCTATTGACCTCCACTCTTCCCTCAAGCACCAATTCAGCTCAAGATAAACCAACAATTTTGGTGTCTTTTTTCTCATTGGATAATCCCATTTTTCCAAGAG
<210> 31
<211> 1463
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(1463)
<400> 31
CTGGTATTTATTGATATAAAATAAAACGTACAAAACGGAGGATAGTGTGCTTAAATGGGCCTTGGTAAAAACCTTGTCGGGATTTTCAACATGGTCGAAGGGAAAAAGAGCGTCGCGCATGAACAACTAACTTTACCTATCCTCACACCAAGAGAGAAAACAAGAAAAATTATAAAGAGTTGTCTTCCATAAGAGTATCCATCAATAGCTCAGGAGCAGCCCCCCTCCATTGAAATTCATCAATCCTGCCAATGCCAGATCGAACAAGTCGATGGAAGCATTGGTTTATACATTCATTTTAGTCTCAACTCTAGGAATAATTTTTTTTGCCATCTTTTTTCGAGAATCATCTAAAGTTCCAACTAAAAGGTGAAATGACTTGTCATTATCTCAATTGAAGTATAGACTTCAACTGGTCCTTGGGTTCCTCTAATGGATCTCTTAGTTATTGAGAGGGTTGCCCAAAAGCAGTATATAAGGTGTACCCAGGAAAACATACAAGTAAACCAGATAAAGAAATGGCAACTAGGGTTATTGTTTCCAATATTACATAGTTTTAAGACAATATTACTTTTTTATGATACAACAATATATTTACATTAAGAATGTGAAAAGATAAATTAGTTTCGAACCTACCGCACGAAATTCTAACTTATTAATGAAGAACTAAGAAAATTTTACTAAATTACAACCCCGAAATCTAATCCTTCAAAAATGAGAAAAATATAGTTATGAACCTATCCTTGTCGCAATTCATTACTATATGACCACTTGCCTCAAAAGTCTTCACATGTAGATGTAGTTATATTTTTGTCTGAAATTAACATGCAATAGCGTTGAACTTTGCTGATTTATTTTCTATTTGCCACTGCACAAATCCCATCAGTTTCGCCGCCCGTCCGCTATTTTACTTGTCACTTCTGAAAGCAAAAGATATTAAAAAGAAAAATTATAAAAAAATTAACAAAAATTAAAAAAAGAAGTAAAAACCCATCACCCGTATCAGAAGAGAAGAAAAGGCAAAAATTGCGGACCAAGCATGGCGTTCCATTGCCACCCTCCCGCCGTGAAGTACTGAATGAGTGACTGAGTCTTGCGATCCGACGCGAAATACTTGCCGCTTCTCCATGTCTCTTTTGTCCTGTCGCAAATAGTCGTATATCGACACGGAGCAAGAGTTTACACCGAGTTTGTGCCGTGTTTAGCTTGAAGGAAACAAATCTAGCAATCCACTTGAGTTTAAGTTTTACCAACCAGACCGGTAAACATTTCCTAACAGGATCACAGATTCACAGCACCTCCTTAGCAAATCATAAGACAACAACTTTTTGCCGTAAAAAAAGAAACAATCAATACACCTCGATACGTGTGGTACTCCATCACGTATCACATATCACCTCATCCAAATCCCAGAAACCCGAAATTCCAGCTTACCCAGTTGGGCCTCTCCACCGCAATCTTCA
<210> 32
<211> 719
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(719)
<400> 32
CTGTCGACAGTATGAAGGCTTGGTTGGTTGATGATTGAACGTGTGGTAAGGCATGCTTCTCCTCCTAACCCTTCTACCCCTCAACTTCAACCCCATCTGCCAAATACTCAACACAACCCTCCCCTCCTCCTCTTCTCTCCCTTTCTCTAACATACACAGAGCAACCCTTGTTCCTACCTACCTCCCTCCTCACCCGATAGATTTTCAGTATAACTGATACACAAGATGGTACATCACATGTCACTATACAAATGGTAGGACATGTGTGCTAAACTTAAAAAATAAAATTTCTCACTACTCACATGTATCACTTGTATTCCGTCACAGTTAAAAATTTCTCCTCGTCAACCCGTCTGGCCTCTCCTCCTCGTATTTATTATATCTTACAAACTCCACTTTTTTCTGATAAACAACAACGGCGCACACGTAGCTGCTCTGTCTCACACACACACACACAGAGCAACCCTTGTTCCTACCTACCTCCTCCTTCTTACCCCATCTCCTTGTATTTATTACTTCTCACAAACTCCACTGTTTTTGTGACCAACAACAACAACGCGCACGTAGCTACTCTCTCTCTTCTCTCTGATCATCATTTGATTCATTTCTGGTAGTCTGCTATATTATATCAAGCCTCCCTCTTTCTCAATTCTTATTTTTCTGTATATTTCAATCTGTTTATTGGTCGATATATCACACACAAAGAAGCAACAGTCACC
<210> 33
<211> 726
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(726)
<400> 33
AAATAGAGGGTGTTGAAGTCAACTAAGAAAAGAGTAAGCAGAGAGTAGCAATCTCCTGTTCATATTAAAAATAAAATTACTTTATTATCTTAAACGTTTGTCATCATCAAAATTAATAAAAATTTGAATAAAGAATTCTTAAAATCTAACACATGGATAAATTGGCTGATTATAAAATTTGAAGGGAGAATCCAAATTAAAAATTAGAAGAGAAATTAGTAGCTTCTTATAAATTTAGAAAAACTTTTATGTGTTACCCTTATTTTGTTTAACAAATAATATTATCTACACTAATGAGAGGGTTTATACTAGCAATAATATGATTCAAATTCGTTTTTGGTAAGAATCGAATCTAAAACCTTTCATTTCACTTACAAATGAAGAGAAATATCCCTAAATTGTAGTATTAAGTGACATCTCTTTCACATTTATGGTTTTTTTTTTCAATTTATTTGACATTCAAAAGTAAAAACAATGCGTAAAAATAGAAGAAAAAAATGTGTATAACACCATTCTAAAACGGACATGATGAACCACTAATTTTCAGTGCTCTTAAAGAAAACTGACTTAGTTTCCACAAAAAATAATAATAAGAAAAAAAAAAGAAAAAAGAAAACTGACTTTTTATAGAACACGACAACTCATAATATATTACTCCTCCCGAAGAGAAGCACTTTCAAGTGAAACCTTCAACTTTCTGATCAAAAAATAGGGAAACCTTCAACA
<210> 34
<211> 710
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(710)
<400> 34
CTGGTAAATTCCAAAAAAGATTAATCAACTTTTTCTACGGCAAAAAAACAAATTAAAAAAAAAAACTGGAAATACAATTAAGGAAAATACAAAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAATGTGAATATTTAAGCCAGCCAGCCAGCCATATCTGAGCCAGCAGCCAGTTTTAAGCGAGTGAGCGTGACAACATTACGACGGCACTTGGGCGTGGATTTTTATGTCCATGACTAAGCACTTGTAGTAGGTGAATGGTGTCGCTTACTAGAGTCACCAACCAAGGGACGAGTAATGACTCTGCGTTAGGTGAAGCGTCATACGTGGCAGCCAACTGGTTGGTTTTGGGCTAAAGTGTGCCGCATGTAACCAAATCCATTTCGCTTCCCGAAACCACCAAACATCCCTCACCTATTACATAACGCCACGTGTACTAGAGATGCGAAGCTGACTTAATAAAGAGAAATAAATTGTGTACGTGGAATGGACTGATTGGTCTGCTACTTCGGTGACGGCCATGTGGATGAAAGAGTTGGTGACAAATAAATTAATACCAACCAAGTCCGTTTCCCCCACCACACTTGCTTGTATATTTACTTCAACCAAAACCCAAACCAAAAACCAGGGAGAAGGTCGTCTGAAAGAAACCAACCCAATCCCTACTACCAATTTTCTCTCACATTTTCCCTCACTTTCTCACCATCCAAACACATATCCA
<210> 35
<211> 832
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(832)
<400> 35
ATCCCTAGATACACTAGGATTTACACAATCACATTCCTAATCTAACATCCAATTAGGTTGAAAAAATATAAATATTTAGACTGTGTTTTAGAAGAGCCTAGATTGTGATGATGAATCTTGTGAACGGGCCTTGGCGATGTACTTATAACGTGTTGTAGTAGGCCTATTTTACTGAGAGAAGAAAGAGGGAGATCGGCCAGAGAGAAGAGACAGGAGAGAAGGGCGGCCGAATAGAAGAGAAGGTCTAAAGGAATTCTATGTGTTATTTCTCATGCTCTGTGCCTTTTTTATACTATTAAGGAAGAGATAAATTTACTCTCTAATTAATACAAGTTGTACAAGAAGAGATCATCGAGATCTTATAGGAGTCCTATACGTAATCTTATACTCCAAATAAAATTAGGAATGCAGCATAAATTAGTTTTTTTTGTTTTGACACTTTTTTTTTATTGATTTTTTAATTTCAAACAAACGATATTATCTATACTAAGGGATAAATGATGGATTTAGCTTTACAATATACTAACAATAATGTTGTTCAAATTTACTTTTGATGATAGTCAAAGTTAATACCTATCATTTACAAAAGAAAAAAACACTACAAGACTATACTAGTAAGTGGCGTGGTTGGAGATGTAGTAATAGACTAGATCATCAGCTACGTGCCTACGAATGCCAATACGCAACAATTCCGTTCTGAAACAGACAAAAAGCATTTTACGTAAAAGGAGCTTCGAAACTTCAAAACGTAAGATCTGCAGAGTGAACACACACCCACATATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG
<210> 36
<211> 1335
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(1335)
<400> 36
CTGGTCCTTTTGGGAGCTCACTAGCTTCGGGTTCCGTAGAAACTCCGAAGTTAAGCGAGTAGCGCGTGAGAGCATTCCTATGATGTGTCCACTGGGAAGTTCTTGTGTGAGTTCCTAGAAACAAAACCGTGAGAACGTGGTCGGGGCCGAAAGCGGACAATATTGTGCTACGGTGGTGGAGCGGGCCAGGGATGTGGTGGGGGCCCAGGCCGGGATGTGACATTCGGGATCATCTTAGGCTCCAAAAACGCAATTCAAGCCCAAAACGTCACTTATTCATCCATTTGACCATGTTTTTCTCCAGAAGAAGTCGAAAGTCCTATAATGAAAATACAATTCGAAGTATCAACATTCTTCCAAAATATTAACCAGAATACACTAAGAATAGGGTTAAATATATAATACGAAATGTACTCATCAGAAAGTGAGGAAGAGAGAGAGTGAGGTCTGAGAGAAAGCTGCCACATGGCATGCAATGGGATGGGAGATCCGGGGGAACCAAAATCAAGGGTGGGCCCCTTGGGCATATCATTTAACACCAAAACAATATTTTAAACAAATATCCCACAACCCAAATGAATTTACCAAAAATATCCTTCTGTTTCGTAAAATCCGGGACAAGTTGTCACAAGGAATCTTTGAAGGGAAGCTTTTGGGTAGCATACATAGATTTTTATTATAAGAAAAAAGTAACCTTAATCCCAAGTTAAACAGCGAAATCACTTCATAATCCCTAAATACTGGAGAAGGAATTTTTGAAAGGGAAGCTCACCATGAGCACAGACACCTTTGTAGGCTTCCAACAAAAGTCCCAAAAAACGAAAAACCAGGGTCTTCTAAAATTGAAAACAAAACCAAATTAAACCACCACACGTAGAATCGCAACCACAAACAAAATCCCCAACACAATCCCAAATGGAAGGAAAGGGAAGTGGAAGAAGAAGAGTGGCGACAGAGAGGGAAAGATACAATCCGTTGACCCCACCCTCTCTTTGTAGCCAACACACTCATTCTCTCAACCCTATCCTCAAACCGTGCACCTAATCAACTCTCTTAGTCATTTATCGTACATCGTACAGTCAGAAATCATTTGATTTTTTATTTAAAATTAAACACAAATATTATCTAACGAAAACTAACCGTACAATGTACGATGAACGGCTAAAATGTAGAGATCCTTAGGATCTCTAAAATATGGATCCGGAGATGATCCCCTTCCCCGAGCTGAAGAGCACAAGTTGGCAACATTTACCTTTAAATACCAGATGACTTTTCACCATGAAAAACACAATTCTGAACCAAATTAAGCTTATTAATTCTTAGCTAGAGAGAGAT
<210> 37
<211> 1059
<212> DNA
<213> 枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）
<221> Genomic DNA
<222> (1)...(1059)
<400> 37
CAAAAGTTTGGGATATATATTGTGTGTGTGTGCGCGTGCATACATACATACATACATATATATATATATCTGATATAAATTATAAATTATTTAGATAATGTTTTGTCTTTTTCCTAGGCAAGCATCATTCACATATGTATGTTCTTATATAAGAAATAGTATATTAGTCAATAATTATTTACATTTGATATAGTAAATTTAATTAATTCATAAAATATATAATAAATTTACCTAAATTCGTTTAGATCTCACCTAGCCGCCTAGGCGCTAGGCGCTAACCTGCCACCCGACTAGAGCGTAGCGTTTTGAATCTTGCTTTCCATTGATAATGGTATCTACTTCCTTCCTTATGGGTCATCTATGGATAGTGATGGGTTCAGGTCGAGAAGATTTTCATTGTGACGGGAATATGAATGGTACATTACGTGTTTTTATGTAAGTAATGAAAAATTTTATTTTTTAAGTTATTAACTTTTTTAGAGTAACACGTAGTGTATTTTCTCATATGCTGGTTACACTGAAAAATATCTTTTTCAGGTTAGTCAGGGCAGATTGAATTAGTATAAATTTTGGTGGGAAGGAGTAAGATTCTCTTTCCTCTTATTTTCATTTTCTTCCTTTCCTTTATGTCACACTTTGTTTTTTGTCTTATTATCTTTATAAAATATTAATATATGATATTAGCATAATTTAACTGTAATTATTCAAGTAAAATGAGAGAGAAGAGAAGAGAAAGAaTAGAAAATGAAAGaATCCTCGTCCCCAAGTAAACCTGTTGAAAGGTACCCAGGTACCGAAGTCATCACTGCGTACGTTAATGGAGGTGATCACGCATGCTCTTGCGTCACCCAAAAACCTGCACGTAAGTCTATAAATGGTAAAATAGCATCTCTCGTGACAACCGAAACCCAAAAACTTAAACTGTTCACCAAGATAGAAAAAACCCAAAAACCTAGGGCAAAACGACTATTTTCTCAACAATATCTTTAATTTCTTCCCAATTTCTGGGGAGCCCTCTGCATATTTACAACAAATTATTAAGGGTCCCAATTATTAAGC
Claims (3)
1.参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1，其特征在于，该转录因子EjMYB1的核苷酸序列为：SEQ
ID N0：1。
2.根据权利要求1所述的参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1，其特征在于，所述转录因子EjMYB1通过以下步骤获得：以拟南芥中特异调控木质素合成的AtMYB58氨基酸序列为参考序列，查找蔷薇科植物中的同源序列，首先在蔷薇科数据库网站进行比对，选取匹配度最高的前三个序列，设计引物，获得序列SEQ：NO. 1的转录因子EjMYB1。
3.根据权利要求1所述的参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1在调控采后枇杷果实木质化中的应用。
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