ES2708199T3 - Microorganismos genéticamente modificados capaces de producir beta-glucanos y procedimientos para producir beta-glucanos - Google Patents

Microorganismos genéticamente modificados capaces de producir beta-glucanos y procedimientos para producir beta-glucanos Download PDF

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Abstract

Un microorganismo genéticamente modificado capaz de producir un polímero que consiste en una cadena principal lineal de unidades ß-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad ß-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad ß-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificación promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo genéticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad 1,3-ß-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipéptido que tiene actividad 1,3-ß-Dglucano sintasa, en comparación con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polímero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.

Description

DESCRIPCION
Microorganismos geneticamente modificados capaces de producir beta-glucanos y procedimientos para producir beta-glucanos
La presente invencion se refiere a microorganismos geneticamente modificados capaces de producir beta-glucanos (tambien denominados en el presente documento, p-glucanos), caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa. Actividad D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
La presente invencion tambien se refiere al uso de tales microorganismos para producir tales p-glucanos. Ademas, la presente invencion se refiere a procedimientos para producir tales p-glucanos que comprenden la introduccion de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo capaz de sintetizar p-glucanos. En el ambito de la presente invencion, el termino "p-glucanos" comprende particularmente polfmeros que consisten en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3) -glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3.
Los p-glucanos son componentes bien conservados conocidos de las paredes celulares en varios microorganismos, particularmente en hongos y levaduras (Novak, Endocrine, Metabol & Immune Disorders - Drug Targets (2009), 9: 67-75). Bioqmmicamente, los p-glucanos comprenden polfmeros no celulosicos de p-glucosa unidos a traves de enlaces p(1-3) glucosfdicos que muestran un cierto patron de ramificacion con moleculas de glucosa p (1-6) unidas (Novak, loc cit). Un gran numero de p-glucanos estrechamente relacionados muestran un patron de ramificacion similar, tal como el esquizofilano, escleroglucano, pendulano, cineriano, laminarina, lentinano y pleurano, todos ellos muestran una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3) -glucopiranosilo con una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3 (Novak, loc cit; EP-B1 463540; Stahmann, Appl Environ Microbiol (1992), 58: 3347-3354; Kim, Biotechnol Letters (2006), 28: 439-446; Nikitina, Food Technol Biotechnol (2007), 45: 230-237). Aunque estos pglucanos estan estrechamente relacionados estructuralmente, sus respectivos productores microbianos no lo estan. Ejemplos de microorganismos que producen estos p-glucanos estrechamente relacionados estructuralmente son Schizophyllum commune (para esquizofilano; Martin, Biomacromolecules (2000), 1: 49-60; Rau, Methods in Biotechnol (1999), 10: 43-55, DOI: 10.1007/978-1-59259-261-6_4); Sclerotium rolfsii, Sclerotium glucanicum y Sclerotium delphinii (para escleroglucano; Survase, Food Technol Biotechnol (2007), 107-118); Porodisculus pendulus (para pendulano; EP-B1 463540); Botrytis cinerea (para cineriano; Stahmann, loc cit) especies de Laminaria (para laminarina; Kim, loc cit); y Lentinula edoles (para lentinano; Nikitina, loc cit). Al menos dos de dichos p-glucanos - esquizofilano y escleroglucano - incluso comparten una estructura identica y difieren solo ligeramente en su masa molecular, es decir, en su longitud de cadena (Survase, loc cit).
Dichos p-glucanos se utilizan ampliamente como espesantes y se aplican en varias aplicaciones tal como la industria alimentaria y en particular la industria del petroleo (recuperacion mejorada de petroleo, EOR) (Survase, loc cit). Asimismo, dichos p-glucanos se utilizan en la industria farmaceutica en formulaciones de comprimidos y excipientes, asf como en inmunoterapia como agentes antivirales (Survase, loc cit).
La produccion industrial de p-glucanos se realiza principalmente mediante procesos de fermentacion utilizando sus productores microbianos naturales. Las formas clasicas de mejorar la smtesis de p-glucanos, por ejemplo, de esquizofilano se basan en la manipulacion del desarrollo de S. commune (Rau, Habilitation, Braunschweig 1997). El enfoque mas comun es convertir celulas dicarioticas a traves de la generacion de protoplastos en celulas monocarioticas (Rau, Habilitation, Braunschweig 1997). Otro enfoque es cruzar diferentes celulas monocarioticas para formar una nueva celula dicariotica (Rau, Habilitation, Braunschweig 1997). Otros posibles enfoques comprenden, por ejemplo, una mutagenesis clasica basada en el azar usando radiacion UV, mutagenesis de transposon o usando productos qmmicos adecuados (por ejemplo, nitrosoguanidina (NTG o N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), 2-aminofluoreno (2-AF), 4-nitro-o-fenilendiamina (NPD), 2-metoxi-6-cloro-9- (3- (2-cloroetil) aminopropilamino) acridina x 2HCl (ICR-191), 4-nitroquinolona-N-oxido (NQNO), benzo [a] pireno (B[alfa]p) o azida de sodio (SA)) (Czyz, J Appl Genet (2002), 43(3): 377-389). Debido a la reorganizacion del material genetico dentro del evento de cruce, es posible seleccionar cepas que muestran una mayor productividad de p-glucanos (esquizofilano).
Sin embargo, todos estos enfoques no estan dirigidos y no permiten la modificacion dirigida de los microorganismos productores de p-glucanos. De hecho, los resultados y la eficacia de tales enfoques no son predecibles y la identificacion y seleccion de cepas mejoradas es laboriosa y costosa.
Este problema tecnico se ha resuelto mediante los medios y procedimientos descritos en el presente documento a continuacion y como se define en las reivindicaciones.
En particular, como se ha encontrado sorprendentemente en contexto con la presente invencion, la sobreexpresion de la 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo productor de p-glucanos tal como, por ejemplo, S. commune o S. rolfsii conduce a rendimientos significativamente mas altos del respectivo p-glucano. Este hallazgo fue realmente inesperado dado el hecho de que la ruta biosintetica de la smtesis de p-glucanos era poco conocida y, ademas, para la mayona de los microorganismos productores de p-glucanos (como Schizophyllum commune), no habfa propuesta ninguna ruta de biosmtesis de p-glucanos disponible en absoluto. Ademas, en el contexto de aquellos microorganismos cuya ruta de biosmtesis de p-glucanos se investigo al menos (como Pediococcus parvulus), se asumio que enzimas como la a-fosfoglucomutasa (a-PGM) y particularmente UDP-glucosa pirofosforilasa (UGP) representan un cuello de botella en la smtesis de p-glucanos (Velasco, Int J Food Microbiol (2007), 115: 325-354). En consecuencia, se supoma que la sobreexpresion de estas enzimas aumentaba los rendimientos de la smtesis de p-glucanos (Velasco, loc cit). Sin embargo, como se ha encontrado en contexto con la presente invencion, la sobreexpresion de UGP en S. commune no dio como resultado un aumento del rendimiento del p-glucano esquizofilano. En agudo contraste, como se describe adicionalmente en el presente documento y en los Ejemplos, se ha encontrado en el contexto de la presente invencion que S. commune posee dos copias de la 1,3-p-D-glucano sintasa (secuencia del genoma conocida de Ohm, Nature Biotech (2010), 28: 957-963) y, de forma sorprendente, la sobreexpresion de cualquiera de las dos copias de la 1,3-p-D-glucano sintasa en S. commune conduce a rendimientos significativamente mas altos en la produccion de esquizofilano. Dado que el esquizofilano tiene una estructura que esta estrechamente relacionada con otros p-glucanos como el escleroglucano, pendulano, cineriano, laminarina, lentinano y pleurano (todos ellos son polfmeros que consisten en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3) -glucopiranosilo con una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3), parece probable que la sobreexpresion de polipeptidos que tienen actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en microorganismos correspondientes, como tambien se describe en el presente documento, puede dar como resultado rendimientos mas altos de esos pglucanos.
En consecuencia, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3) -glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
Dicho polinucleotido puede ser endogeno o exogeno. Por ejemplo, en contexto con la presente invencion, la sobreexpresion de dicho polinucleotido puede ser el resultado de la introduccion de un promotor fuerte (por ejemplo, constitutivo o inducible) cadena arriba de dicho polinucleotido, aumentando, de este modo, el nivel de expresion de dicho polinucleotido o, preferentemente, de la introduccion de al menos una copia de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa. En una realizacion, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3) -glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, y en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune. Dicho microorganismo geneticamente modificado es preferentemente capaz de mantener y expresar de manera estable el polinucleotido adicional que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa. Dicho microorganismo geneticamente modificado puede originarse a partir de un microorganismo no modificado correspondiente que preferentemente contiene per se, es decir, naturalmente, un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa. Asimismo, dicho microorganismo geneticamente modificado es preferentemente per se, es decir, antes de la modificacion, capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6 ) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3 como se describe en el presente documento. En dicho microorganismo geneticamente modificado, se puede haber introducido un promotor fuerte o al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa. Ejemplos no limitantes de medios y procedimientos para la introduccion de una secuencia promotora en un microorganismo pueden comprender, inter alia, recombinacion homologa como se conoce en la tecnica (Ohm, World J Microbiol Biotechnol (2010), 26: 1919-1923). Asimismo, en contexto con la presente invencion, el microorganismo se puede haber modificado de modo que se exprese mas polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, por ejemplo, insertando un promotor fuerte como se describe en el presente documento, agregando intrones en un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, adaptando el uso del codon, mejorando el sitio de union al ribosoma para una mejor iniciacion de la traduccion, introduciendo elementos en el ARNm que lo estabilizan, o insertando un polinucleotido con un mayor nivel de transcripcion que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en el microorganismo (cf. Ohm, loc cit).
En contexto con la presente invencion, el promotor puede introducirse en dicho microorganismo cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa y de tal manera que dicho promotor aumenta o potencia la expresion de dicho polinucleotido. Ejemplos no limitantes de medios y procedimientos para la introduccion de un polinucleotido en un microorganismo pueden comprender transformacion, transduccion y transfeccion como se conoce comunmente en la tecnica y tambien se ejemplifica en el presente documento (Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Current Protocols in Molecular Biology, Actualizacion del 9 de mayo de 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; van Peer, Applied Environ Microbiol (2009), 75: 1243-1247; Schmid, "Genetics of Scleroglucan Production by Sclerotium rolfsii", dissertation Technische Universitat Berlin, D83 (2008)). Ejemplos no limitantes de medios y procedimientos para la introduccion de una secuencia promotora en un microorganismo pueden comprender, inter alia, recombinacion homologa como se conoce en la tecnica (Ohm, World J Microbiol Biotechnol (2010), 26: 1919-1923). Los promotores fuertes a introducir cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en contexto con la presente invencion pueden comprender, inter alia, promotores constitutivos tales como, por ejemplo, promotor tef1 (factor de traduccion y elongacion 1a, S. commune, A. niger), promotor gpdA (gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa, S. commune, A. niger; Schuren, Cur Genet (1998), 33: 151-156), promotor trpC (biosmtesis de triptofano, Aspergilus nidulans) o promotores inducibles tales como, por ejemplo, promotor glaA (glucoamilasa, A. niger), alcA (alcohol deshidrogenasa, A. nidulans) cbhl (celobiohidrolasa I, Trichoderma reesei; Knabe, disertacion "Untersuchung von Signalkomponenten der sexuellen Entwicklung bei dem Basidiomyceten Schizophyllum commune" (2008)) thiA (biosmtesis de tiamina, Aspergillus oryzae) (Moore, Biotechnology, Vol. III, Genetic Engeneering of Fungal Cells, Enceclopedia of Life Support Systems (2007)). En contexto con la presente invencion, los promotores preferidos comprenden tef1 y gdpA.
En general, en contexto con la presente invencion, el polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa puede introducirse en el microorganismo en cualquier forma adecuada, por ejemplo, comprendido en un vector, un plasmido, o como acido nucleico desnudo como se describe y ejemplifica adicionalmente en el presente documento. El polinucleotido introducido en el microorganismo puede, por lo tanto, ser exogeno, en un vector/plasmido dentro del microorganismo (es decir, fuera del (de los) cromosoma(s) microbiano(s), o puede incorporarse en el (los) cromosoma(s) microbiano(s) mediante, por ejemplo, recombinacion aleatoria (ectopica) u homologa o cualquier otro procedimiento adecuado como se conoce en la tecnica. En contexto con la presente invencion, el polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa que se ha introducido en el microorganismo (es decir, la copia adicional al polinucleotido endogeno natural que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa de una cepa no modificada correspondiente) no necesariamente tiene que tener la misma secuencia de nucleotidos que el polinucleotido endogeno natural que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa de una cepa no modificada correspondiente, siempre que tenga actividad 1,3-p-D-glucano sintasa como se describe en el presente documento.
En una realizacion de la presente invencion, el microorganismo geneticamente modificado es capaz de producir al menos 1,5 veces, mas preferentemente al menos 1,8 veces mas, mas preferentemente al menos 2,0 veces mas y lo mas preferentemente al menos 2,2 veces mas polfmero de p-glucano en comparacion con el correspondiente microorganismo control no modificado. En este contexto, la produccion de, por ejemplo, 1,5 veces "mas" polfmero de p-glucano puede significar que un microorganismo geneticamente modificado produce una cantidad de polfmero de p-glucano que es 1,5 veces mayor en comparacion con la cantidad de polfmero de p-glucano producida al mismo tiempo en las mismas condiciones por un correspondiente microorganismo de control no modificado. Como alternativa, la produccion de, por ejemplo, 1,5 veces mas "polfmero" de p-glucano puede significar que un microorganismo geneticamente modificado produce la misma cantidad de polfmero de p-glucano que un organismo control no modificado correspondiente en las mismas condiciones, sin embargo, 1,5 veces mas rapido. La cantidad de polfmero de p-glucano producido se puede medir por procedimientos conocidos en la tecnica y como tambien se describen en el presente documento.
Ademas, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado como se describe en el presente documento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3.
Ademas, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D- (1-3)-glucopiranosilo que tiene una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir en un microorganismo capaz de sintetizar dicho polfmero
(i) un promotor fuerte (por ejemplo, constitutivo o inducible) cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, aumentando, de este modo, la expresion de dicho polinucleotido o, preferentemente,
(ii) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho poUmero del medio, en el que dicho poUmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
Con respecto a la etapa (c) del procedimiento descrito y proporcionado en el presente documento, se observa que en algunos casos (por ejemplo, cuando se usan p-glucanos como el esquizofilano para fines de perforacion petrolera), el caldo de cultivo tambien se puede usar directamente (por ejemplo, bombeado en el orificio de perforacion), sin recuperacion previa del p-glucano puro. Como tal, el paso de recuperacion (c) es opcional. Los promotores fuertes a introducir cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en contexto con la presente invencion pueden comprender, inter alia, promotores constitutivos tales como, por ejemplo, promotor tefl (factor de traduccion y elongacion 1a, S. commune, A. niger), promotor gpdA (gliceraldehndo-3-fosfato, S. commune, A. niger), promotor trpC (biosmtesis de triptofano, Aspergilus nidulans) o promotores inducibles tales como, por ejemplo, promotor glaA (glucoamilasa, A. niger), alcA (alcohol deshidrogenasa, A. nidulans) cbhl (celobiohidrolasa I, Trichoderma reesei) thiA (biosmtesis de tiamina, Aspergillus oryzae), siendo promotores preferidos tefl y gdpA. En contexto con la presente invencion, el promotor se introduce preferentemente en dicho microorganismo cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa y de tal manera que dicho promotor aumenta o potencia la expresion de dicho polinucleotido. Dicho promotor o dicho polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa puede introducirse en dicho microorganismo por cualquier medio y procedimiento conocido en la tecnica, Preferentemente de una manera que despues de la introduccion el promotor pueda aumentar la expresion de dicho polinucleotido o que dicho polinucleotido pueda mantenerse y expresarse de manera estable por el microorganismo, respectivamente. Los ejemplos no limitantes de medios y procedimientos para la introduccion de una secuencia promotora en un microorganismo pueden comprender, inter alia, homologfa recombinante como se conoce en la tecnica (Ohm, loc cit). Ejemplos no limitantes de tales procedimientos para la introduccion de un polinucleotido en un microorganismo pueden comprender transformacion, transduccion y transfeccion como se conoce comunmente en la tecnica y tambien se ejemplifica en el presente documento (Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Current Protocols in Molecular Biology, Actualizacion del 9 de mayo de 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; van Peer, Applied Environ Microbiol (2009), 75: 1243­ 1247; Schmid, "Genetics of Scleroglucan Production by Sclerotium rolfsii", dissertation Technische Universitat Berlin, D83 (2008)).
En contexto con la presente invencion, el promotor fuerte introducido en un microorganismo cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa preferentemente aumenta el nivel de expresion de dicho polinucleotido al menos 1,5 veces, mas preferentemente al menos 1,8 veces, mas preferentemente al menos 2,0 veces, y lo mas preferentemente al menos 2,2 veces. En este contexto, el nivel de expresion de un polinucleotido puede evaluarse facilmente por el experto en la materia mediante procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, por RT-PCR cuantitativa, transferencia Northern (para evaluar la cantidad de niveles de ARNm expresados), transferencia de puntos, micromatriz y similares.
En general, el termino "sobreexpresion", tal como se usa en el presente documento, comprende tanto la sobreexpresion de polinucleotidos (por ejemplo, a nivel transcripcional) como la sobreexpresion de polipeptidos (por ejemplo, a nivel de traduccion). En consecuencia, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3) -glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune. En contexto con la presente invencion, un microorganismo geneticamente modificado debe considerarse como "sobreexpresion" de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa si expresa al menos 1,5 veces, mas preferentemente al menos 1,8 veces, mas preferentemente al menos 2,0 veces, y lo mas preferentemente al menos 2,2 veces de dicho polinucleotido en comparacion con un microorganismo control no modificado de la misma cepa. En este contexto, el nivel de expresion de un polinucleotido puede evaluarse facilmente por el experto en la materia mediante procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR), transferencia Northern (para evaluar la cantidad de niveles de ARNm expresados), transferencia de puntos, micromatriz y similares(vease, por ejemplo, Sambrook, loc cit; Current Protocols in Molecular Biology, Actualizacion del 9 de mayo de 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934­ 3647). Preferentemente, la cantidad de polinucleotido expresado se mide por qRT-PCR. Ademas, en contexto con la presente invencion, un microorganismo geneticamente modificado debe considerarse como "sobreexpresion" de un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa si expresa al menos 1,5 veces, mas preferentemente al menos 1,8 veces, mas preferentemente al menos 2,0 veces, y lo mas preferentemente al menos 2,2 veces de dicho polipeptido en comparacion con un microorganismo control no modificado de la misma cepa. En este contexto, el nivel de expresion de un polipeptido puede evaluarse facilmente por el experto en la materia mediante procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, por transferencia Western, ELISA, EIA, RIA o similares (vease, por ejemplo, Sambrook, loc cit; Current Protocols in Molecular Biology, Actualizacion del 9 de mayo de 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647). Preferentemente, la cantidad de polipeptido expresado se mide por transferencia Western.
En general, en contexto con la presente invencion, el polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa puede introducirse en el microorganismo en cualquier forma adecuada, por ejemplo, comprendido en un vector, un plasmido o un acido nucleico desnudo. El polinucleotido introducido en el microorganismo puede ser exogeno (por ejemplo, en un vector o un plasmido) dentro del microorganismo (es decir, fuera del (de los) cromosoma(s) microbiano(s), o puede incorporarse en el(los) cromosoma(s) microbiano(s) mediante, por ejemplo, recombinacion aleatoria (ectopica) u homologa o cualquier otro procedimiento adecuado como se conoce en la tecnica. En contexto con la presente invencion, el polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa que se ha introducido en el microorganismo (es decir, la copia adicional al polinucleotido endogeno natural que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa de una cepa no modificada correspondiente) no necesariamente tiene que tener la misma secuencia de nucleotidos que el polinucleotido endogeno natural que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa de una cepa no modificada correspondiente, siempre que tenga actividad 1,3-p-D-glucano sintasa como se describe en el presente documento.
Los procedimientos para cultivar microorganismos tales como procesos de fermentacion son conocidos en la tecnica y tambien se describen y ejemplifican en el presente documento (Kumari, Bioresource Technol (2008), 99: 1036­ 1043; Reyes, J Natural Studies (2009), 7(2), Enero-Junio). En contexto con la presente invencion, tales procedimientos permiten que el microorganismo respectivo crezca y produzca el p-glucano deseado como se describe y ejemplifica en el presente documento. Los medios adecuados pueden comprender, por ejemplo, agua de coco como se describe en Reyes, loc cit. Ademas, tal como se conoce en la tecnica, hay varios medios particularmente adecuados para microorganismos particulares. Por ejemplo, tambien en contexto con la presente invencion, los medios adecuados para el cultivo de S. commune comprenden medio CYM (25 g de agar (Difco), 20 g de glucosa (Sigma), 2 g de peptona tripticasa (Roth), 2 g de extracto de levadura (Difco), 0,5 g MgSO4 x 7 H2O (Roth), 0,5 g KH2PO4 y 1 g K2HPO4 (ambos de Riedel-de Haen) por litro de H2O) (particularmente util para el cultivo en soporte solido) o un medio que contiene 30 g de glucosa (Sigma), 3 g de extracto de levadura (Difco), 1 g de KH2PO4 (Riedel-de Haen), 0,5 g de MgSO4 x 7 H2O (Roth) por litro de H2O (particularmente util para cultivos lfquidos) como tambien se describe y ejemplifica en el presente documento. Otros medios adecuados para el cultivo de S. rolfsii son conocidos en la tecnica (Survase, Bioresource Technol (2006), 97: 989-993). El p-glucano producido de acuerdo con la presente invencion puede recuperarse mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica y descritos en el presente documento (vease tambien "Recommended Practices for Evaluation of Polymers Used in Enhanced Oil Recovery Operations, API Recommended Practice 63 (RP 63), 1a Ed, American Petoleum Institute, Washington D.C., 1 de Junio de 1990; Kumari, Bioresource Technol (2008), 99: 1036-1043).
En contexto con la presente invencion, la expresion "grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3" puede significar que, en promedio, aproximadamente 3 de las 10 unidades de p-D-(1-3) -glucopiranosilo estan (1-6) unidas a una sola unidad de p-D-glucopiranosilo. En este contexto, el termino "aproximadamente" puede significar que el grado de ramificacion promedio puede estar dentro del intervalo de 0,1 a 0,5, preferentemente de 0,2 a 0,4, mas preferentemente de 0,25 a 0,35, mas preferentemente de 0,25 a 0,33, mas preferentemente de 0,27 a 0,33, y lo mas preferentemente de 0,3 a 0,33. Puede ser tambien 0,3 o 0,33. El esquizofilano, escleroglucano, pendulano, cineriano, laminarina, lentinano y pleurano tienen un grado de ramificacion promedio entre 0,25 y 0,33; por ejemplo, el escleroglucano y el esquizofilano tienen un grado de ramificacion promedio de 0,3 a 0,33 (Survase, loc cit; Novak, loc cit). El grado de ramificacion promedio de un p-glucano se puede determinar por procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, por analisis periodico de oxidacion, analisis de azucar metilado y RMN (Brigand, Industrial Gums, Academic Press, Nueva York/Estados Unidos (1993), 461-472).
El polfmero a producir se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
El microorganismo descrito en el presente documento (en lo sucesivo, tambien denominado "microorganismo en el contexto de la presente invencion") puede ser generalmente un microorganismo per se (es decir, naturalmente, en un estado no modificado en contexto con la presente invencion) capaz de sintetizar polfmeros de p-glucanos, particularmente aquellos polfmeros que consisten en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3. Es decir, tales microorganismos preferentemente poseen per se (es decir, naturalmente, en un estado no modificado en contexto con la presente invencion) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa. Ejemplos no limitantes de microorganismos en el contexto de la presente invencion son Schizophyllum commune, Sclerotium rolfsii, Sclerotium glucanicum, Sclerotium delphinii, Porodisculus pendulus, Botrytis cinerea, especies de Laminaria, Lentinula edoles y Monilinia fructigena. El microorganismo en contexto con la presente invencion es S. commune.
El polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa como se menciona y se empleara en contexto con la presente invencion (en lo sucesivo, tambien denominado "polinucleotido en el contexto de la presente invencion") puede ser un gen de la 1,3-p-D-glucano sintasa. Por ejemplo, el polinucleotido en el contexto de la presente invencion puede comprender o puede consistir en una secuencia de acidos nucleicos que es
al menos el 70 %, preferentemente al menos el 75 %, mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente
al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el 90 %, mas preferentemente al menos el 95 %, mas
preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, mas preferentemente al menos el 98 %,
mas preferentemente al menos el 99 %, mas preferentemente al menos el 99,5 %, y lo mas preferentemente al
menos el 100 % identica a la SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, siempre que el polipeptido codificado por dicho
polinucleotido tenga actividad 1,3-p-D-glucano sintasa como se describe y ejemplifica adicionalmente en el presente
documento a continuacion. SEQ iD NO: 1 representa la secuencia de nucleotidos del gen de la glucano sintasa I de
la cepa Lu15531 de S. commune (obtenida de la coleccion de cepas de la Universidad de Jena (Alemania),
Alemania, Prof. E. Kothe; Jena University internal strain name: W22). SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de
nucleotidos del gen de la glucano sintasa II de la cepa Lu15531 de S. commune. SEQ ID NO: 5 repr secuencia de ADNc de la glucano sintasa I de la cepa Lu15531 de S. commune. SEQ ID NO: 7 repr secuencia de ADNc de la glucano sintasa II de la cepa Lu15531 de S. commune. SEQ ID NO: 9 repr secuencia de nucleotidos del gen de la glucano sintasa I de la cepa Lu15634 de S. commune (coleccion de cepas,
BASF SE; cepa monocariotica que se origina a partir de la cepa S. commune de la coleccion de cepas en la
Universidad Tecnica de Braunschweig (Alemania), Prof. Rau; generada por aislamiento de esporas). SEQ ID NO: 11
representa la secuencia de nucleotidos del gen de la glucano sintasa II de la cepa Lu15634 de S. commune. SEQ ID
NO: 13 representa la secuencia de ADNc de la glucano sintasa I de la cepa Lu15634 de S. commune. SEQ ID NO:
15 representa la secuencia de ADNc de la glucano sintasa II de la cepa Lu15634 de S. commune.
El polipeptido como se refiere y se usa en contexto con la presente invencion y el polipeptido codificado por el
polinucleotido en el contexto de la presente invencion (dichos polipeptidos en lo sucesivo denominados tambien
"polipeptido en el contexto de la presente invencion") tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa. En una realizacion, es
una 1,3-p-D-glucano sintasa. Por ejemplo, el polipeptido en el contexto de la presente invencion puede comprender
o puede consistir en una secuencia de aminoacidos que es al menos el 70 %, preferentemente al menos el 75 %,
mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el
90 %, mas preferentemente al menos el 95 %, mas preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al
menos el 97 %, mas preferentemente al menos el 98 %, mas preferentemente al menos el 99 %, mas
preferentemente al menos el 99,5 %, y lo mas preferentemente al menos el 100 % identica a la SEQ ID NO: 6, 8, 14
o 16, siempre que el polipeptido tenga actividad 1,3-p-D-glucano sintasa. SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de
aminoacidos de la glucano sintasa I de la cepa Lu15531 de S. commune. SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de
aminoacidos de la glucano sintasa II de la cepa Lu15531 de S. commune. SEQ ID NO: 14 representa la secuencia
de aminoacidos de la glucano sintasa I de la cepa Lu15634 de S. commune. SEQ ID NO: 16 representa la secuencia
de aminoacidos de la glucano sintasa II de la cepa Lu15634 de S. commune.
En contexto con la presente invencion, la expresion "actividad 1,3-p-D-glucano sintasa" significa que el polipeptido
respectivo es capaz de catalizar la elongacion de la cadena de 1,3-p-D-glucano (la cadena puede ser lineal o
ramificada) usando UDP-glucosa como sustrato (vease Inoue, Eur J Biochem (1995), 231: 845-854). Por ejemplo, en
contexto con la presente invencion, se puede considerar que un polinucleotido codifica un polipeptido que tiene
actividad 1,3-p-D-glucano sintasa si una celula de S. commune que se transforma con dicho polinucleotido y que
expresa dicho polinucleotido de forma constitutiva es capaz de producir al menos el 50 %, mas preferentemente al
menos el 75%, mas preferentemente al menos el 100%, mas preferentemente al menos el 120%, mas
preferentemente al menos el 150 %, mas preferentemente al menos el 200 %, y mas preferentemente al menos el
220 % mas de esquizofilano en comparacion con una celula de S. commune que no se esta transformando con
dicho polinucleotido, en el que se pueden aplicar las siguientes condiciones. Los cultivos de S. commune respectivos
con celulas transformadas y no transformadas, respectivamente, pueden cultivarse como sigue. Para los cultivos
lfquidos, se puede usar el siguiente medio (en adelante denominado "Medio Convencional"): 30 g de glucosa
(Sigma), 3 g de extracto de levadura (Difco), 1 g de KH2PO4 (Riedel-de Haen), 0,5 g de MgSO4 x 7 H2O (Roth) por
litro de H2O. Para ambos, pre cultivos y para el cultivo principal, se pueden usar matraces agitadores de 250 ml
llenos con 30 ml de medio convencional. El cultivo se puede realizar a 27 °C y 225 rpm. Antes de cada inoculacion,
la biomasa se puede homogeneizar durante 1 minuto a 13500 rpm utilizando T 25 digital ULTRA-TURRAX® (IKA). El
primer pre cultivo puede inocularse con 50 mg de biomasa humeda. Los cultivos se pueden incubar, a continuacion,
durante 72 horas. Despues de 72 horas, se puede iniciar el segundo pre cultivo. La concentracion de la biomasa
humeda homogeneizada del primer pre cultivo utilizado para la inoculacion puede ser de 250 mg. El tiempo de
cultivo puede ser de 45 horas. Despues de 45 horas, el cultivo principal puede inocularse con 500 mg de biomasa
humeda homogeneizada del segundo pre cultivo y cultivarse durante otras 45 horas. Posteriormente, los cultivos se
pueden tratar de la siguiente manera. Se pueden mezclar 10 ml del cultivo, 20 ml de H2O y 90 pl de Acticide BW20.
La muestra se puede digerir durante 24 horas a 40 °C con p-glucanasa (0,3 ml) (Erbsloh).
Despues de la incubacion, la muestra se puede centrifugar (por ejemplo, 30 minutos a 3400 g) y el sobrenadante se
puede analizar para determinar el contenido de glucosa usando un intercambiador de cationes HPLC (Aminex HPX-87-H, BIO-RAD) con H2SO40,5 M (Roth) como eluyente y velocidad de flujo de 0,5 ml/min a 30 °C. La estructura de
esquizofilano tfpica como se describe en el presente documento puede confirmarse mediante enfoques analtticos
adicionales como se describe en el Ejemplo a continuacion en el presente documento (por ejemplo, mediante RMN y
DRX). La misma evaluacion se puede realizar mutatis mutandis para evaluar si un polipeptido dado tiene actividad
1,3-p-D-glucano sintasa en el contexto de la presente invencion. En este caso, un polinucleotido correspondiente
que codifica dicho polipeptido a evaluar se evalua mutatis mutandis como se describe anteriormente. Si la expresion de un polinucleotido de este tipo que codifica dicho polipeptido a evaluar se considera que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa como se describe anteriormente, se considera que el propio polipeptido tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa.
El nivel de identidad entre dos o mas secuencias (por ejemplo, secuencias de acidos nucleicos o secuencias de aminoacidos) se puede determinar facilmente mediante procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante analisis BLAST. En general, en contexto con la presente invencion, si las dos secuencias que se comparan (por ejemplo, secuencias de polinucleotidos o secuencias de aminoacidos) por, por ejemplo, comparaciones de secuencias difieren en identidad, entonces el termino "identidad" puede referirse a la secuencia mas corta y la parte de la secuencia mas larga que coincide con dicha secuencia mas corta. Por lo tanto, cuando las secuencias que se comparan no tienen la misma longitud, el grado de identidad puede referirse preferentemente al porcentaje de restos de nucleotidos en la secuencia mas corta que son identicos a los restos de nucleotidos en la secuencia mas larga o al porcentaje de nucleotidos en la secuencia mas larga secuencia que son identicos a la secuencia de nucleotidos en la secuencia mas corta. En este contexto, el experto en la materia esta en condiciones de determinar esa parte de una secuencia mas larga que coincide con la secuencia mas corta. Ademas, como se usa en el presente documento, los niveles de identidad de las secuencias de acido nucleico o las secuencias de aminoacidos pueden referirse a la longitud total de la secuencia respectiva y se evaluan preferentemente por pares, en los que cada hueco se cuenta como una falta de coincidencia. Estas definiciones para comparaciones de secuencias (por ejemplo, el establecimiento de valores de "identidad") deben aplicarse a todas las secuencias descritas y desveladas en el presente documento.
Ademas, el termino "identidad" como se usa en el presente documento significa que hay una equivalencia funcional y/o estructural entre las secuencias correspondientes. Las secuencias de acidos nucleicos/aminoacidos que tienen los niveles de identidad dados a las secuencias de acidos nucleicos/aminoacidos particulares descritas en el presente documento pueden representar derivados/variantes de estas secuencias que, preferentemente, tienen la misma funcion biologica. Pueden ser variaciones de origen natural, por ejemplo, secuencias de otras variedades, especies, etc., o mutaciones, y dichas mutaciones pueden haberse formado naturalmente o pueden haber sido producidas por mutagenesis deliberada. Ademas, las variaciones pueden ser secuencias producidas sinteticamente. Las variantes pueden ser variantes de origen natural o variantes producidas sinteticamente o variantes producidas por tecnicas de ADN recombinante. Se pueden haber producido desviaciones de las secuencias de acidos nucleicos descritas anteriormente, por ejemplo, por delecion, sustitucion, adicion, insercion y/o recombinacion. El termino "adicion" se refiere a la adicion de al menos un resto de acido nucleico/aminoacido al final de la secuencia dada, mientras que la "insercion" se refiere a la insercion de al menos un resto de acido nucleico/aminoacido dentro de una secuencia dada. El termino "delecion" se refiere a la delecion o eliminacion de al menos un resto de acido nucleico o resto de aminoacido en una secuencia dada. El termino "adicion" se refiere al reemplazamiento de al menos un resto de acido nucleico/resto de aminoacido en una secuencia dada. De nuevo, estas definiciones, como se usan aqm, se aplican, mutatis mutandis, para todas las secuencias proporcionadas y descritas en el presente documento.
En general, como se usa en el presente documento, las expresiones "polinucleotido" y "acido nucleico" o "molecula de acido nucleico" deben interpretarse como sinonimos. En general, las moleculas de acidos nucleicos pueden comprender, inter alia, moleculas de ADN, moleculas de ARN, tiofosfatos de oligonucleotidos, ribo oligonucleotidos sustituidos o moleculas de ANP. Ademas, la expresion "molecula de acido nucleico" puede referirse a ADN o ARN o sus tnbridos o cualquier modificacion de la misma que sea conocida en la tecnica (vease, por ejemplo, los documentos US 5525711, US 471 1955, US 5792608 o EP 302175 para ejemplos de modificaciones). La secuencia de polinucleotidos puede ser de cadena sencilla o doble, lineal o circular, natural o sintetica y sin ninguna limitacion de tamano. Por ejemplo, la secuencia de polinucleotidos puede ser ADN genomico, ADNc, ADN mitocondrial, ARNm, ARN antisentido, ARN ribosomico un ADN que codifica tales ARN o quimeroplastos (Gamper, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332 - 4339). Dicha secuencia de polinucleotidos puede estar en forma de un vector, plasmido o de ADN o ARN viral. En el presente documento tambien se describen moleculas de acidos nucleicos que son complementarias a las moleculas de acidos nucleicos descritas anteriormente y moleculas de acidos nucleicos que pueden hibridar con moleculas de acidos nucleicos descritas en el presente documento. Una molecula de acido nucleico descrita en el presente documento tambien puede ser un fragmento de las moleculas de acidos nucleicos en el contexto de la presente invencion. Particularmente, dicho fragmento es un fragmento funcional. Ejemplos de tales fragmentos funcionales son moleculas de acidos nucleicos que pueden servir como cebadores.
El termino "hibridacion" o "hibrida" como se usa en el presente documento en el contexto de moleculas de acidos nucleicos/secuencias de ADN puede relacionarse con hibridaciones en condiciones rigurosas o no rigurosas. Si no se especifica adicionalmente, las condiciones son preferentemente no rigurosas. Dichas condiciones de hibridacion pueden establecerse de acuerdo con los protocolos convencionales descritos, por ejemplo, en Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001); Current Protocols in Molecular Biology, Actualizacion del 9 de mayo de 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647; Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989), o Higgins y Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). El establecimiento de condiciones esta bien dentro de la habilidad del experto y puede determinarse de acuerdo con los protocolos descritos en la tecnica. Por tanto, la deteccion de solo secuencias de hibridacion espedfica generalmente requerira condiciones de hibridacion y lavado rigurosas como 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C. Las condiciones de hibridacion no rigurosas para la deteccion de secuencias homologas o no exactamente complementarias se pueden establecer en 6 x SSC, SDS al 1 % a 65 °C. Como es bien conocido, la longitud de la sonda y la composicion del acido nucleico a determinar constituyen parametros adicionales de las condiciones de hibridacion. Las variaciones en las condiciones anteriores se pueden lograr mediante la inclusion y/o sustitucion de reactivos de bloqueo alternativos utilizados para suprimir el fondo en experimented de hibridacion. Los reactivos de bloqueo tfpicos incluyen el reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmon desnaturalizado y formulaciones patentadas disponibles comercialmente. La inclusion de reactivos de bloqueo espedficos puede requerir la modificacion de las condiciones de hibridacion descritas anteriormente, debido a problemas de compatibilidad. De acuerdo con la invencion descrita en el presente documento, las condiciones de hibridacion rigurosas bajas para la deteccion de secuencias homologas o no exactamente complementarias se pueden establecer, por ejemplo, en 6 x SSC, por ejemplo, SDS al 1 % a 65 °C. Como es bien conocido, la longitud de la sonda y la composicion del acido nucleico a determinar constituyen parametros adicionales de las condiciones de hibridacion.
Las moleculas de acido nucleico que hibridan tambien comprenden fragmentos de las moleculas descritas anteriormente. Dichos fragmentos pueden representar moleculas de acidos nucleicos que codifican una 1,3-p-D-glucano sintasa funcional como se describe en el presente documento o un fragmento funcional de la misma que puede servir como cebador. Ademas, las moleculas de acido nucleico que hibridan con cualquiera de las moleculas de acidos nucleicos mencionadas anteriormente tambien incluyen fragmentos complementarios, derivados y variantes de estas moleculas. De manera adicional, un complejo de hibridacion se refiere a un complejo entre dos secuencias de acidos nucleicos en virtud de la formacion de enlaces de hidrogeno entre bases complementarias de G y C y entre bases complementarias de A y T; estos enlaces de hidrogeno pueden estabilizarse adicionalmente por las interacciones de apilamiento de bases. Las dos secuencias de acidos nucleicos complementarias se enlazan con hidrogeno en una configuracion antiparalela. Se puede formar un complejo de hibridacion en solucion (por ejemplo, analisis Cot o Rot) o entre una secuencia de acido nucleico presente en solucion y otra secuencia de acido nucleico inmovilizada en un soporte solido (por ejemplo, membranas, filtros, chips, alfileres o portaobjetos de vidrio en los cuales, por ejemplo, se han fijado las celulas). Los terminos complementarios o complementariedad se refieren a la union natural de polinucleotidos en condiciones de sal y temperatura permisivas por emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" se une a la secuencia complementaria "T-C-A". La complementariedad entre dos moleculas de cadena sencilla puede ser "parcial", en la que solo algunos de los acidos nucleicos se unen, o puede ser completa cuando existe una complementariedad total entre las moleculas de cadena sencilla. El grado de complementariedad entre las cadenas de acido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficacia y la resistencia de la hibridacion entre las cadenas de acidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificacion, que dependen de la union entre las cadenas de acidos nucleicos. La expresion "secuencias de hibridacion" se refiere preferentemente a secuencias que muestran una identidad de secuencia de al menos el 45 %, mas preferentemente al menos el 50 %, mas preferentemente al menos el 55 %, mas preferentemente al menos el 60 %, mas preferentemente al menos el 65 %, mas preferentemente al menos el 70 %, mas preferentemente al menos el 75 %, mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el 90 %, mas preferentemente al menos el 95 %, mas preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, mas preferentemente al menos el 98 %, mas preferentemente al menos el 99 %, mas preferentemente al menos el 99,5 %, y lo mas preferentemente el 100 % de identidad con una secuencia de acido nucleico como se describe en el presente documento que codifica una 1,3-p-D-glucano sintasa.
En el presente documento tambien se describen vectores que contienen un polinucleotido en el contexto de la presente invencion. La presente invencion se refiere tambien a un vector que comprende el polinucleotido en el contexto de la presente invencion. El termino "vector" tal como se usa en el presente documento se refiere particularmente a plasmidos, cosmidos, virus, bacteriofagos y otros vectores usados comunmente en ingeniena genetica. En una realizacion preferida, los vectores son adecuados para la transformacion, transduccion y/o transfeccion de microorganismos como se describe en el presente documento, por ejemplo, celulas de hongos, celulas procariotas (por ejemplo, bacterias), levaduras y similares. Ejemplos espedficos de microorganismos en contexto con la presente invencion son Schizophyllum commune, Sclerotium rolfsii, Sclerotium glucanicum, Sclerotium delphinii, Porodisculus pendulus, Botrytis cinerea, especies de Laminaria, Lentinula edoles y Monilinia fructigena. En una realizacion particularmente preferida, dichos vectores son adecuados para la transformacion estable del microorganismo, por ejemplo para expresar el polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa como se describe en el presente documento. En consecuencia, en un aspecto de la invencion, el vector que se proporciona es un vector de expresion. En general, los vectores de expresion han sido ampliamente descritos en las referencias. Como norma, pueden no solo contener un gen marcador de seleccion y un origen de replicacion que asegure la replicacion en el hospedador seleccionado, sino tambien un promotor y en la mayona de los casos una senal de terminacion para la transcripcion. Entre el promotor y la senal de terminacion, hay preferentemente al menos un sitio de restriccion o un poliligador que permite la insercion de una secuencia/molecula de acido nucleico que se desea expresar.
Debe entenderse que cuando el vector proporcionado en el presente documento se genera aprovechando un vector de expresion conocido en la tecnica anterior que ya comprende un promotor adecuado para ser empleado en el contexto de la presente invencion, por ejemplo, la expresion de un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa como se describe en el presente documento, la construccion de acido nucleico se inserta preferentemente en ese vector de una manera que el vector resultante comprende solo un promotor adecuado para ser empleado en el contexto de la presente invencion. El experto sabe como se puede poner en practica dicha insercion. Por ejemplo, el promotor se puede escindir ya sea de la construccion de acido nucleico o del vector de expresion antes de la union. Un ejemplo no limitante del vector de la presente invencion es pBluescript II que comprende el polinucleotido en el contexto de la presente invencion. Otros ejemplos de vectores adecuados para comprender el polinucleotido en el contexto de la presente invencion para formar los descritos en el presente documento son conocidos en la tecnica y comprenden, por ejemplo, pDrive, pTOPO, pUC19 y pUC21.
En general, la presente invencion se refiere a todas las realizaciones descritas en el presente documento asf como a todas las permutaciones y combinaciones de las mismas. Los siguientes aspectos particulares de la presente invencion no deben interpretarse como limitantes del ambito de la presente invencion en tales aspectos.
En un aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En un aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En un aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune. En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SeQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir esquizofilano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir esquizofilano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune. En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un poUmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0. 3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune. En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un
microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el
70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o
16, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que
tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena
principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona
del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum
commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de
producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen
una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal
con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo
geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que
tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado
correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir un polfmero que
consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de
ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en
esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de
producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen
una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal
con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo
geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un
microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el
70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o
16, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de
producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen
una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal
con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo
geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que
tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado
correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir esquizofilano, en el
que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de
producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen
una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal
con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo
geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un
microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el
70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o
16, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de
producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen
una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal
con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo
geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que
tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado
correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SeQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir escleroglucano, en el
que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de
producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un
polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene
actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir esquizofilano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir esquizofilano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SeQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir esquizofilano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado de la especie Schizoyphyllum commune, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SeQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad de p-D-glucopiranosilo (1-6) unidas a una unidad de p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir esquizofilano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o 100% identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir escleroglucano, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado contiene al menos una copia mas de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16, para producir escleroglucano, en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir esquizofilano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un promotor fuerte (por ejemplo, constitutivo o inducible) cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, aumentando, de este modo, la expresion de dicho polinucleotido, o un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo es capaz de sintetizar esquizofilano;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca esquizofilano; y
(c) opcionalmente recuperar esquizofilano del medio,
en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir escleroglucano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un promotor fuerte (por ejemplo, constitutivo o inducible) cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, aumentando, de este modo, la expresion de dicho polinucleotido, o un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo es capaz de sintetizar escleroglucano;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca escleroglucano; y
(c) opcionalmente recuperar escleroglucano del medio,
en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D- (1-3)-glucopiranosilo que tiene una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un promotor fuerte (por ejemplo, constitutivo o inducible) cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, lo que aumenta la expresion de dicho polinucleotido, o un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo de la especie Schizophyllum commune capaz de sintetizar dicho polfmero;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio,
en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D- (1-3)-glucopiranosilo que tiene una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo capaz de sintetizar dicho poUmero, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio,
en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D- (1-3)-glucopiranosilo que tiene una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo capaz de sintetizar dicho polfmero, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio,
en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir esquizofilano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo capaz de sintetizar esquizofilano, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca esquizofilano; y
(c) opcionalmente recuperar esquizofilano del medio,
en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir escleroglucano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo capaz de sintetizar escleroglucano, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca escleroglucano; y
(c) opcionalmente recuperar escleroglucano del medio,
en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir esquizofilano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo capaz de sintetizar esquizofilano, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca esquizofilano; y
(c) opcionalmente recuperar esquizofilano del medio,
en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir escleroglucano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo capaz de sintetizar escleroglucano, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16; (b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca escleroglucano; y
(c) opcionalmente recuperar escleroglucano del medio,
en el que el microorganismo es Schizophyllum commune.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D- (1-3)-glucopiranosilo que tiene una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo de la especie Schizophyllum commune que es capaz de sintetizar dicho polfmero, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio,
en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D- (1-3)-glucopiranosilo que tiene una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo de la especie Schizophyllum commune que es capaz de sintetizar dicho polfmero, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio,
en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir esquizofilano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo de la especie Schizophyllum commune que es capaz de sintetizar dicho polfmero, en el que dicho polinucleotido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir esquizofilano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa en un microorganismo de la especie Schizophyllum commune que es capaz de sintetizar dicho polfmero, en el que dicho polipeptido es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % identico a la SEQ ID NO: 6, 8, 14 o 16;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio.
Las figuras muestran:
Figura 1 Espectro XRD de la muestra de Esquizofilano. La triple helice podria verse como una difraccion intensiva a 5° 20 y la region amorfa del material proporciona una difraccion amplia en el intervalo de 20­ 25° 20
Figura 2 1H-RMN de esquizofilano (50 mg de gel) en [D6] -DMSO medido a 50 °C (16 exploraciones, 600 MHz).
El patron de sustitucion de esquizofilano puede asignarse a partir de las integraciones del CH2OH a 3,7 ppm y CH2O (eter) a las senales de 4,1 ppm, se determino que la proporcion era de 3,3:1 indicando la unidad de repeticion correcta.
Figura 3 13C-NMR de esquizofilano (50 mg de gel) en [D6] -DMSO medido a 50 °C (10,000 exploraciones, 600 MHz). Asignacion de las senales, 5 (ppm): 60 y 61 (C-6), 68 (C6-C p( 1 -6)), 68 ( C 4 - o H glucosa lateral), 70 (C-2 cadena principal), 72 (C-2 ), 76 (C-5), 76,7 (C-3 glucosa lateral), 86 (c-§ cadena principal), 103 (C-1 ).
Figura 4 Imagen esquematica de la unidad de repeticion de esquizofilano.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invencion. Sin embargo, la presente invencion no debe interpretarse como limitada por los siguientes Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Clonacion del plasmido de expresion de p-1,3-glucano sintasa (pGS 1) y transformacion en S. commune
En el genoma de Schizophyllum commune, se identificaron dos genes que codifican la p-1,3-glucano sintasa mediante el analisis BLAST (genes de consulta: secuencia de 1,3-p-glucano sintasa de Mycosphaerellagraminicola, Saccharomyces cerevisiae, Cryptococcus neoformans, Schizosaccharomyces pombe); cf. Ullman, Biochem J (1997), 326: 929-942. En el ambito de la presente invencion, se comprobo que la sobreexpresion de cualquiera de estas p-1,3-glucano sintasas en S. commune produce un aumento de los rendimientos de la produccion de esquizofilano. Se generaron dos plasmidos de expresion (pGS_1)] y (pGS_2) (que tienen pBluescript II como cadena principal) con casete de marcadores de seleccion (ampR, ura1), promotor constitutivo fuerte (promotor Tef1), la secuencia del gen de la sintasa (secuencia genomica) y secuencia del terminador ( terminador Tef1).
Todas las secuencias de polinucleotidos descritas en el presente documento se originan de Schizopyllum commune. Los polinucleotidos representados por las SEQ ID NO 1 y 3 (genes p-1,3-glucano sintasas I y II de Lu15531, respectivamente) se sintetizaron por Eurofins MWG GmbH/Alemania (http://www.eurofinsdna.com/de) de acuerdo con los datos de secuencia originales obtenidos de la base de datos JGI (http://www.jgi.doe.gov/Scommune; gene position: scaffold 2, 1194740-1200474 and gene position: scaffold 6, 1391067-1396555). Las secuencias se administraron en plasmidos pMK (pMK_GS_1) y (pMK_GS_2) (plasmidos Eurofins que contienen kanR, origen ColE1 y secuencia genomica de las respectivas p-1,3-glucano sintasas). Los polinucleotidos se usaron adicionalmente para la clonacion del plasmido de expresion completo. El plasmido (pMK_GS_1) contema un polinucleotido representado por la SEQ ID NO: 1 flanqueado por los sitios de restriccion SpeI 5' y SalI 3'. El plasmido (pMK_GS_2) contema un polinucleotido representado por la SEQ ID NO: 3 flanqueado por los sitios de restriccion de SpeI 5' y EcoRV 3', respectivamente.
Los elementos individuales (SEQ ID NO: 17, 18 y 33 (promotor Tef1, terminador Tef1 y ura-i ) se aislaron del ADN genomico de Schizophyllum commune utilizando tecnologfa de PCR preparada por protocolos microbiologicos establecidos (Sambrook, loc cit; Current Protocols in Molecular Biology, Actualizacion del 9 de mayo de 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647).
Todos los aislamientos de plasmidos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el kit HiSpeed Maxi (Qiagen/Alemania). Para este fin, se cultivaron celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene) que contienen el plasmido de expresion final o uno de los plasmidos interinos en medio Luria-Bertoni (LB) (Sigma-Aldrich) que contiene 50 mg/ml de ampicilina (Sigma-Aldrich).
Para el aislamiento de la secuencia del promotor tef1 (SEQ ID NO: 17), 50 pl de la reaccion de PCR contema 1,25 U de PfuUltra Hotstart Mastermix (Stratagene) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 pl de H2O, 22,1 pmol de cebador directo TefP_forw (Xbal) (SEQ ID NO: 21) y 100 pmol de cebador inverso TefP_rev (Spel) (SEQ ID N o : 22), y 100 ng de plantilla (ADN genomico de Schizophyllum commune). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa para la amplificacion: la etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 55 °C, etapa de elongacion de 1 minuto a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos.
Para la amplificacion del gen sintetico de la p-1,3-glucano sintasa (SEC ID NO: 1), 50 pl de la reaccion de PCR contema 1,25 U de PfuUltra Hotstart Mastermix (Stratagene) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 pl de H2O, 100 pmol de cebador directo GS1_forw (Spel) (SEQ ID N o : 27) y 22 pmol de cebador inverso GS1_rev (Sall) (SEQ ID NO: 28), 100 ng de plantilla (pMK_GS_1). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa para la amplificacion: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 55 °C, etapa de elongacion de 8 minutos a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos.
En la siguiente etapa de reaccion de la PCR, se llevo a cabo la fusion de los dos primeros productos de la PCR (promotor tef1 ( S e Q ID NO: 17) con el gen de la p-1,3-glucano sintasa (SEQ ID NO: 1). 50 pl de la reaccion de PCR contema 1,25 U de Pwo Hotstart Mastermix (Roche) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 |jl de H2O, 22,1 pmol de cada cebador: Fusion TefP_GS1_forw (Xbal) (SEQ ID NO: 29) y Fusion TefP_GS1_rev (Sail) (SEQ ID NO: 30) y 100 ng ambas plantillas. La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa para la fusion de ambas secuencias: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 55 °C, etapa de elongacion de 8 minutos a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos.
El producto de la PCR de fusion se trato con enzimas de restriccion Sail y Xbal (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el vector (pBluescript 2KSP, Stratagene Cloning Systems) se hizo lineal utilizando las mismas enzimas de restriccion y posteriormente se trato con fosfatasa alcalina (Roche) de acuerdo con las Instrucciones del fabricante. Ambos, el producto de la PCR digerido y el vector pBluescript 2KSP linealizado, se ligaron utilizando ADN Ligasa deT4 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA/USA) y se transformaron en celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para el aislamiento de la secuencia del terminador tefl (SEQ ID NO: 18) se realizo la siguiente reaccion de PCR: 50 j l de la reaccion de PCR contema 1,25 U de Pwo Hotstart Mastermix (Roche) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 j l de H2O, 24 pmol de cebador directo TefP_forw (Sail) (SEQ ID NO: 23) y 21 pmol de cebador inverso TefP_rev (Sail) (SEQ ID NO: 24), y 100 ng de plantilla (ADN genomico de Schizophyllum commune). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 60 °C, etapa de elongacion de 1 minuto a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos. El producto de la PCR se trato con la enzima de restriccion SalI (Roche) y se unio con el plasmido que contiene el promotor tef1 y la p-1,3-glucano sintasa, que se linealizo antes con la enzima de restriccion SalI (Roche) y se trato con fosfatasa alcalina (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de la union, la construccion de ADN se transformo en celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para permitir la seleccion de cepas de Schizophyllum commune despues de la transformacion con la expresion de p-1,3-glucano sintasa, se introdujo un marcador de seleccion de plasmido (ural; SEQ ID NO: 33) en el plasmido. Para ese fin, el gen ura1 se aislo del ADN genomico de Schizophyllum commune. La reaccion de PCR contema 2,5 U de Pwo Hotstart Mastermix (Roche), 22 j l de H2O, 21 pmol de cebador directo Ura_forw (Notl) (SEQ ID NO: 19) y 38 pmol de cebador inverso Ura_rev (XbaI) (SEQ ID NO: 20) y 100 ng de la plantilla (ADN genomico de Schizophyllum commune). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 60 °C, etapa de elongacion de 2 minutos a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos. El producto de la PCR se digirio con las enzimas de restriccion XbaI y NotI (Roche) y se unio en el sitio XbaI/NotI del plasmido de expresion de p-1,3-glucano sintasa (pGS_1) utilizando la ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Inc., Bev- erly,MA/USA). El plasmido resultante que codifica la p-1,3-glucano sintasa con el promotor y terminador tef1, y que contiene un marcador de seleccion ura1 se transformo en celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la transformacion de Schizophyllum commune con el plasmido de expresion de p-1,3-glucano sintasa (pGS_1), la preparacion del plasmido se llevo a cabo de la siguiente manera. Las celulas XL10 de Escherichia coli que contienen el plasmido de expresion de p-1,3-glucano sintasa se cultivaron en medio Luria-Bertoni (LB) (Sigma-Aldrich) que contema 50 mg/ml de ampicilina (Sigma-Aldrich) y el aislamiento del plasmido se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit HiSpeed Maxi (Quiagen).
Schizophyllum commune (Lu15527; obtenido de la coleccion de cepas de la Universidad de Jena (Alemania), Prof. E. Kothe, Jena University internal strain name: 12-43) se transformo basandose en el procedimiento descrito por van Peer y col. (van Peer, loc cit) como base. El procedimiento se modifico de acuerdo a la descripcion a continuacion. Para la preparacion de protoplastos de S. commune, se inoculo cultivo fresco en una placa que contema medio complejo (CYM). Para la incubacion a 26 °C durante 2-3 dfas, las placas se sellaron con parafilm.
Para la inoculacion de pre cultivo lfquido (50 ml de volumen de trabajo), la biomasa de la placa se macero durante 1 minuto a 13500 rpm utilizando T25 digital ULTRA-TURRAX® (IKA), se inoculo en un matraz de agitacion que contema medio lfquido CYM y se incubo a 30 °C, 220 rpm durante 3 dfas mas. El cultivo principal se inoculo con 15 ml del pre cultivo en 200 ml de medio CYM y se incubo durante 3 dfas mas a 30 °C a 220 rpm. Despues de terminar el crecimiento del cultivo, el cultivo principal se dividio en cuatro muestras de 50 ml y se centrifugo (4000 rpm, 15 min). El sedimento obtenido se lavo dos veces con MgSO41 M (50 ml) (Roth). Despues del lavado, se unieron cuatro muestras y se disolvieron en 50 ml de MgSO41M.
Para permitir la lisis de la pared celular, se disolvieron 100 mg de Caylase (Cayla, Toulouse, Francia) en 1 ml de MgSO41 M y se agregaron a la suspension de sedimento. La muestra se incubo durante la noche a 30 °C con agitacion ligera (70 rpm). Posteriormente, se anadio agua destilada a la muestra (en una proporcion de 1:1), que a continuacion se incubo con agitacion ligera (70 rpm) durante 5 minutes mas. Despues de esta etapa, las celulas se incubaron sin agitacion durante 10 minutes y posteriormente se centrifugaron (1100 rpm, 20 min, 4 °C). Despues de filtrar el sobrenadante con Miracloth-Membrane, se anadio un volumen de sorbitol 1 M frte y la muestra se dejo equilibrar durante 10 min. Posteriormente, se centrifugo la muestra (2000 rpm, 20 min, 2 °C). El sedimento se lavo resuspendiendo cuidadosamente en sorbitol 1 M y se repitio la etapa de centrifugacion. Finalmente, los protoplastos se resuspendieron en sorbitol 1 M y CaCl250 mM a una concentracion de 108 protoplastos por ml.
El ADN utilizado para la transformacion fue un plasmido circular (pGS_1) y la integracion en el genoma de S. commune fue ectopica. Para transformar los protoplastos con el ADN, se mezclaron suavemente 100 pl de protoplastos y 10 pl de ADN (5-10 pg) y se incubaron durante 60 minutos en hielo. Posteriormente, se anadio un volumen de PEG 4000 (40 %) y la muestra se incubo durante 5 a 10 minutos en hielo. Despues de agregar 2,5 ml de medio de regeneracion (medio completo que contiene 0,1 pg/ml de fleomicina y MgSO40,5 M), la muestra se incubo a 30 °C, 70 rpm durante la noche.
Despues de la transformacion mediada por PEG, los protoplastos regenerados se extendieron en placas de Petri que conteman 40 ml de medio mmimo solidificado: 2 g de acido aspartico (Roth), 20 g de glucosa (Sigma), 0,5 g de MgSO4 (Roth), 0,5 g de KH2PO4, 1 g de KH2PO4 (ambos de Riedel-de Haen), 120 pg de clorhidrato de tiamina (Roth) por litro, pH 6,3 que contiene 1 % de agarosa de bajo punto de fusion (Sigma). Las placas de seleccion se incubaron 5 dfas a 30 °C.
Ejemplo 2
Clonacion del plasmido de expresion de B-1,3-glucano sintasa teGS 21 y transformacion en S. commune
El plasmido de expresion para la segunda p-1,3-glucano sintasa (SEQ ID NO: 3) (pGS_2) se preparo de manera analoga a la preparacion de (pGS_1) como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
Como fuente de la secuencia de promotor tef1 (SEC ID NO: 17); se uso el mismo producto de PCR que en el Ejemplo 1.
El polinucleotido representado por la SEQ ID NO: 3 se amplifico a partir del plasmido (pMK_GS_2) despues de la reaccion de PCR: 50 pl de la reaccion de PCR contema 1,25 U de PfuUltra Hotstart Mastermix (Stratagene) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 pl de H2O, 23 pmol de cada cebador: GS2_forw (Spel) /SEQ ID NO: 31) y GS2_rev (EcoRV)(SEQ iD NO: 32), 100 ng de plantilla (pMK_GS_2). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa para la amplificacion: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 53 °C, etapa de elongacion de 8 minutos a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos.
Para el aislamiento de la secuencia del terminador tefl (SEQ ID NO: 18) y la introduccion de los sitios EcoRV (5 ') y Apal (3'), se llevo a cabo la siguiente reaccion de PCR: 50 pl de la reaccion de PCR contema 1,25 U de Pwo Hotstart Mastermix (Roche) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 pl de H2O, 37 pmol de cebador directo TefP_forw (EcoRV) (SEQ ID No : 25) y 25 pmol de cebador inverso TefP_rev (Apal) (SEQ ID NO: 26), y 100 ng de plantilla (ADN genomico de Schizophyllum commune). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 58 °C, etapa de elongacion de 1 minuto a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos. El producto de la PCR se trato con la enzima de restriccion EcoRV y Apal (Roche) y se unio con el vector (pBluescript 2KSP, Stratagene Cloning Systems), que se digirio antes con las mismas enzimas de restriccion. Despues de la union, la construccion de ADN se transformo en celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Posteriormente, el promotor tef1 se clono en el plasmido. Para este fin, el producto de PCR se digirio con Xbal y Spel (Roche) y se unio con el plasmido descrito anteriormente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que contema el terminador tef1 que se linealizo utilizando Xbal y Spel. La union se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 1 en el presente documento. Despues de la union, la construccion de ADN se transformo en celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Posteriormente, se clono ura1 en el plasmido. Se uso el mismo producto de PCR que en el Ejemplo 1. Despues de la digestion del producto de PCR con Notl y Xbal, el fragmento se clono en el plasmido que lleva el polinucleotido representado por la SEQ ID NO: 7, el promotor tef1 y las secuencias de terminacion. Antes de la union, el plasmido se linealizo por Notl y Xbal. La transformacion se llevo a cabo como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Finalmente, la p-1,3-glucano sintasa (SEQ ID NO: 3) se unio en el plasmido. Para este fin, El producto de PCR se trato con Spel y EcoRV y se unio en el plasmido de expresion diana como se describe anteriormente. La transformacion se llevo a cabo como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
La transformacion de Schizophyllum commune con (pGS_2) siguio como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Verificacion de la funcionalidad de las cepas disenadas de S. commune
Las cepas de S. commune modificadas geneticamente generadas como se describe anteriormente se probaron en matraces de agitacion para aumentar la produccion de esquizofilano. Para asegurar la reproducibilidad de los resultados, se aplico un cultivo de tres etapas, que consiste en dos pre cultivos y un cultivo principal como se describe mas adelante en el presente documento.
Para el cultivo de las cepas de Schizophyllum commune modificadas geneticamente, se utilizaron dos medios diferentes. Para el cultivo en medios solidos, se utilizo medio CYM (25 g de agar (Difco), 20 g de glucosa (Sigma), 2 g de peptona tripticasa (Roth), 2 g de extracto de levadura (Difco), 0,5 g MgSO4 x 7 H2O (Roth), 0,5 g de KH2PO4 y 1 g de K2HPO4 (ambos de Riedel-de Haen) por litro de H2O). Las cepas se inocularon en placas de agar que conteman medio CYM cubierto con celofan (para evitar el crecimiento de micelio en el agar) y se incubaron durante tres a cuatro dfas a 26 °C.
Para los cultivos lfquidos, se uso el siguiente medio (en adelante denominado "Medio Convencional"): 30 g de glucosa (Sigma), 3 g de extracto de levadura (Difco), 1 g de KH2PO4 (Riedel-de Haen), 0,5 g de MgSO4 x 7H2O (Roth) por litro de H2O.
Tanto para pre cultivos como para el cultivo principal, se usaron matraces agitadores de 250 ml llenos con 30 ml de medio convencional. El cultivo se realizo a 27 °C y 225 rpm. Antes de cada inoculacion, la biomasa se homogeneizo durante 1 minuto a 13500 rpm utilizando T 25 digital ULTRA-TURRAX® (IKA).
El primer pre cultivo se inoculo con 50 mg de biomasa humeda. Los cultivos se incubaron, a continuacion, durante 72 horas. Despues de 72 horas, se inicio el segundo pre cultivo. La concentracion de la biomasa humeda homogeneizada del primer pre cultivo utilizado para la inoculacion fue de 250 mg. El tiempo de cultivo fue de 45 horas. Despues de 45 horas, el cultivo principal se inoculo con 500 mg de biomasa humeda homogeneizada del segundo pre cultivo y cultivo durante otras 45 horas.
Una vez finalizado el cultivo, se aplicaron los procedimientos analtticos convencionales descritos a continuacion en el presente documento para definir la concentracion de biomasa, la concentracion de esquizofilano, la concentracion de etanol y la glucosa residual en el medio. Se estabilizaron alfcuotas de 50 ml de los cultivos con 3 g/l de Acticide BW20 (Thor).
La concentracion de etanol y glucosa se estimo utilizando el procedimiento por HPLC. Para este fin se centrifugaron 14 ml del cultivo (30 min, 8500 rpm). El sobrenadante se filtro de forma esteril y se inyecto 1 ml del filtrado para el analisis por HPLC (intercambiador de cationes de HPLC: Aminex HPX-87-H, BIO-RAD con H2SO40,5 M, Roth, como eluyente y caudal de 0,5 ml/min a 30 °C).
Debido al hecho de que el esquizofilano esta formado unicamente por moleculas de glucosa, la cuantificacion de este polfmero se puede realizar utilizando procedimientos analtticos convencionales para la glucosa. Se mezclaron 10 ml del cultivo, 20 ml de H2O y 90 pl de Acticide BW20. La muestra se digirio durante 24 horas a 40 °C con pglucanasa (0,3 ml) (Erbsloh). Despues de la incubacion, la muestra se centrifugo (30 minutos a 3400 g) y el sobrenadante se analizo para determinar el contenido de glucosa y etanol usando un intercambiador de cationes HPLC (Aminex HPX-87-H, BIO-RAD) con H2SO40,5 M (Roth) como eluyente y 0,5 ml/min de caudal a 30 °C.
Para la determinacion de la biomasa, la biomasa restante en forma de sedimento (despues de que la muestra de digestion con p-glucanasa se centrifugara) se lavo dos veces con 50 ml de H2O, se filtro usando Whatman-Filter (con determinacion del peso del filtro antes de la filtracion), se lavo dos veces con H2O y se seco en escala de secado HB43S de Mettler Toledo. El secado del filtro se llevo a cabo durante 5 a 10 minutos a 180 °C. Posteriormente, se determino el peso del filtro seco.
La evaluacion de los resultados obtenidos en matraces de agitacion mostro un claro efecto de la sobreexpresion de ambas p-1,3-glucano sintasas sobre la produccion de esquizofilano. Debido al hecho de que en el plasmido de expresion se integro ectopicamente en el genoma y el locus de integracion tiene un efecto explfcito en la expresion del gen diana, se probaron 40 clones que llevan el plasmido (pGS_1) y 40 clones que llevan el plasmido (pGS_2) en experimentos de matraz de agitacion. El aumento de la produccion de esquizofilano en las cepas modificadas geneticamente se muestra en la Tabla 1 en comparacion con la cepa control de Schizophyllum commune no modificada. Los resultados mostrados en la Tabla 1 se refieren a la mejor cepa de cada 40 cepas analizadas. Para la clasificacion de las cepas, la cantidad de esquizofilano en la muestra fue decisiva. Se mezclaron 10 ml del cultivo, 20 ml de H2O y 90 pl de Acticide BW20. La muestra se digirio durante 24 horas a 40 °C con 0,3 ml de p-glucanasa (Erbsloh). Despues de la incubacion, la muestra se centrifugo (30 minutos a 3400 g) y el sobrenadante se analizo para determinar el contenido de glucosa y etanol usando un intercambiador de cationes HPLC (Aminex HPX-87-H, BIO-RAD) con H2SO40,5 M (Roth) como eluyente y 0,5 ml/min de caudal a 30 °C.
Ademas del aumento de los rendimientos de la produccion de esquizofilano en las cepas de S. commune modificadas geneticamente, se observo una clara disminucion en la smtesis del etanol derivado. Esto puede ser una indicacion de que la tasa de exceso de glucosa por la actividad de p-1,3-glucano sintasa regulada al alza se metaboliza mas directamente en la ruta del esquizofilano en lugar de usarse en parte para la smtesis de etanol. Tabla 1: Comparacion de la cepa control de Schizophyllum commune con dos cepas de S. commune modificadas geneticamente que llevan el plasmido de expresion de glucano sintasa (pGS_1) o (pGS_2). Cepa Esquizofilano[%] EtOH [% [%]
Cepa control de S. commune 100 100
S. commune (pGS_1) 220 9
S. commune (pGS_2) 215 3,6
Analisis de la estructura y conformacion del producto
Para asegurar que el polfmero sintetizado a traves de cepas de S. commune modificadas geneticamente sea esquizofilano, se aplicaron los procedimientos de XRD y NMR para confirmar la estructura de la molecula de la siguiente manera.
La difraccion de rayos X en polvo (XRD) permite un analisis rapido y no destructivo de materiales que consta de multiples componentes. Ademas, la preparacion de la muestra es sencilla. Los datos de la medicion se presentan como un difractograma en el que la intensidad difractada (I) se muestra en funcion del angulo de dispersion 20. La cristalinidad del material dado se puede ser determinar por esta medida. En general, los materiales cristalinos tienen patrones de reflexion de una serie de picos afilados, mientras que los materiales amorfos dan senales amplias. Muchos polfmeros muestran un comportamiento semicristalino que tambien puede ser detectado por XRD (Hammond, The basics of chrystallography and diffraction, 3a Ed., Oxford University Press 2009).
Preparacion de muestras a partir de solucion acuosa
La solucion acuosa que contema esquizofilano se vertio en etanol para precipitar el esquizofilano. El precipitado se filtro y se seco en un horno de vado. La muestra seca se midio por XRD.
Medicion de la muestra y resultados por XRD
El esquizofilano muestra una estructura helicoidal triple. Esto fue evidente a partir del difractograma de la muestra de esquizofilano precipitada y seca (Figura 2). La triple helice podna verse como una difraccion intensiva a 5 ° 20 y la region amorfa del material proporciona una difraccion amplia en el intervalo de 20-25 ° 20 (Hisamatsu, Carbohydr Res (1997), 298: 117).
Medicion de la muestra y resultados por NMR
Los espectros de NMR se registraron en un sistema Varian VNMRS de 600 MHz equipado con una sonda criogenica mejorada con 13C (configuracion inversa) a temperatura ambiente o a 50 °C usando secuencias de pulso convencionales para 1H y 13C.
Se sabe que el esquizofilano tiene una estructura helicoidal triple formada por tres cadenas de p (1-3) -D-glucano mantenidas juntas por enlaces de hidrogeno en el agua. Esta estructura esta blindada en el campo magnetico debido a la conformacion ngida y ordenada. Esto significa que en el espectro de NMR, no se obtienen desplazamientos qmmicos para el esquizofilano (Rinaudo, Carbohydr Polym (1982), 2: 135; Vlachou, Carbohydr Polym (2001), 46: 349) (2D NMR). Con el fin de investigar la estructura molecular del esquizofilano y no la estructura macromolecular que consiste en helices triples y ademas registrar los espectros de n Mr exitosos con una buena relacion senal-ruido, debe cambiarse la conformacion de la helice triple. Tambien se sabe que la triple helice de esquizofilano puede alterarse para formar una estructura de serpentm mediante la adicion de DMSO. Cuando la concentracion de DMSO supera ciertos valores umbral (es decir, 87 %), se produce el cambio de conformacion; por lo tanto, se uso [D6] -DMSO deuterado como disolvente para las mediciones. Es importante tener en cuenta este aspecto de la conformacion cuando se realizan experimentos de NMR para el esquizofilano. Por lo tanto, la muestra se midio en [D6] -DMSO, se pueden obtener los espectros bien resueltos (Figura 2 y 3).
Sumario
Las estructuras qmmicas de los materiales de S. commune (GS_1) y S. commune (GS_2) se identificaron como las correctas para la de esquizofilano. Ademas, los materiales muestran en las conformaciones de triple helice suspendida en sorbitol 1 M y CaCl250 mM a una concentracion de 108 protoplastos por ml.
El ADN utilizado para la transformacion fue un plasmido circular (pGS_1) y la integracion en el genoma de S. commune fue ectopica. Para transformar los protoplastos con el ADN, se mezclaron suavemente 100 pl de protoplastos y 10 pl de ADN (5-10 pg) y se incubaron durante 60 minutos en hielo. Posteriormente, se anadio un volumen de PEG 4000 (40 %) y la muestra se incubo durante 5 a 10 minutos en hielo. Despues de agregar 2,5 ml de medio de regeneracion (medio completo que contiene 0,1 pg/ml de fleomicina y MgSO40,5 M), la muestra se incubo a 30 °C, 70 rpm durante la noche.
Despues de la transformacion mediada por PEG, los protoplastos regenerados se extendieron en placas de Petri que conteman 40 ml de medio mmimo solidificado: 2 g de acido aspartico (Roth), 20 g de glucosa (Sigma), 0,5 g de MgSO4 (Roth), 0,5 g de KH2PO4, 1 g de KH2PO4 (ambos de Riedel-de Haen), 120 |jg de clorhidrato de tiamina (Roth) por litro, pH 6,3 que contiene 1 % de agarosa de bajo punto de fusion (Sigma). Las placas de seleccion se incubaron 5 dfas a 30 °C.
Ejemplo 2
Clonacion del plasmido de expresion de B-1,3-glucano sintasa TpGS 2 y transformacion en S. commune
El plasmido de expresion para la segunda p-1,3-glucano sintasa (SEQ ID NO: 3) (pGS_2) se preparo de manera analoga a la preparacion de (pGS_1) como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
Como fuente de la secuencia de promotor tef1 (SEC ID NO: 17); se uso el mismo producto de PCR que en el Ejemplo 1.
El polinucleotido representado por la SEQ ID NO: 3 se amplifico a partir del plasmido (pMK_GS_2) despues de la reaccion de PCR: 50 j l de la reaccion de PCR contema 1,25 U de PfuUltra Hotstart Mastermix (Stratagene) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 j l de H2O, 23 pmol de cada cebador: GS2_forw (Spel) /SEQ ID NO: 31) y GS2_rev (EcoRV)(SEQ iD NO: 32), 100 ng de plantilla (pMK_GS_2). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa para la amplificacion: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 53 °C, etapa de elongacion de 8 minutos a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos.
Para el aislamiento de la secuencia del terminador tefl (SEQ ID NO: 18) y la introduccion de los sitios EcoRV (5 ') y Apal (3'), se llevo a cabo la siguiente reaccion de PCR: 50 j l de la reaccion de PCR contema 1,25 U de Pwo Hotstart Mastermix (Roche) y 1,25 U de Taq PCR Mastermix (Quiagen), 22 j l de H2O, 37 pmol de cebador directo TefP_forw (EcoRV) (SEQ ID NO: 25) y 25 pmol de cebador inverso TefP_rev (Apal) (SEQ ID NO: 26), y 100 ng de plantilla (ADN genomico de Schizophyllum commune). La reaccion se llevo a cabo en el termociclador de Gene Amp® PCR System 9700 de PE Applied Biosystems. Se utilizo el siguiente programa: una etapa de calentamiento inicial hasta 95 °C durante 4 minutos fue seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, etapa de hibridacion de 30 segundos a 58 °C, etapa de elongacion de 1 minuto a 72 °C, seguido de un ciclo a 72 °C durante 10 minutos. El producto de la PCR se trato con la enzima de restriccion EcoRV y Apal (Roche) y se unio con el vector (pBluescript 2KSP, Stratagene Cloning Systems), que se digirio antes con las mismas enzimas de restriccion. Despues de la union, la construccion de ADN se transformo en celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Posteriormente, el promotor tef1 se clono en el plasmido. Para este fin, el producto de PCR se digirio con Xbal y Spel (Roche) y se unio con el plasmido descrito anteriormente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que contiene el terminador tef1 que se linealizo utilizando Xbal y Spel. La union se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 1 en el presente documento. Despues de la union, la construccion de ADN se transformo en celulas XL10 de Escherichia coli (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Posteriormente, se clono ural en el plasmido. Se uso el mismo producto de PCR que en el Ejemplo 1. Despues de la digestion del producto de PCR con Notl y Xbal, el fragmento se clono en el plasmido que lleva el polinucleotido representado por la SEQ ID NO: 7, el promotor tef1 y las secuencias de terminacion. Antes de la union, El plasmido se linealizo por Notl y Xbal. La transformacion se llevo a cabo como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Finalmente, la p-1,3-glucano sintasa (SEQ ID NO: 3) se unio en el plasmido. Para este fin, El producto de PCR se trato con Spel y EcoRV y se unio en el plasmido de expresion diana como se describe anteriormente. La transformacion se llevo a cabo como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
La transformacion de Schizophyllum commune con (pGS_2) siguio como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Verificacion de la funcionalidad de las cepas disenadas de S. commune
Las cepas de S. commune modificadas geneticamente generadas como se describe anteriormente se probaron en matraces de agitacion para aumentar la produccion de esquizofilano. Para asegurar la reproducibilidad de los resultados, se aplico un cultivo de tres etapas, que consiste en dos pre cultivos y un cultivo principal como se describe mas adelante en el presente documento.
Para el cultivo de las cepas de Schizophyllum commune modificadas geneticamente, se utilizaron dos medios diferentes. Para el cultivo en medios solidos, se utilizo medio CYM (25 g de agar (Difco), 20 g de glucosa (Sigma), 2 g de peptona tripticasa (Roth), 2 g de extracto de levadura (Difco), 0,5 g MgSO4 x 7 H2O (Roth), 0,5 g de KH2PO4 y 1 g de K2HPO4 (ambos de Riedel-de Haen) por litro de H2O). Las cepas se inocularon en placas de agar que conteman medio CYM cubierto con celofan (para evitar el crecimiento de micelio en el agar) y se incubaron durante tres a cuatro dfas a 26 °C.
Para los cultivos lfquidos, se uso el siguiente medio (en adelante denominado "Medio Convencional"): 30 g de glucosa (Sigma), 3 g de extracto de levadura (Difco), 1 g de KH2PO4 (Riedel-de Haen), 0,5 g de MgSO4 x 7 H2O (Roth) por litro de H2O.
Tanto para pre cultivos como para el cultivo principal, se usaron matraces agitadores de 250 ml llenos con 30 ml de medio convencional. El cultivo se realizo a 27 °C y 225 rpm.
Antes de cada inoculacion, la biomasa se homogeneizo durante 1 minuto a 13500 rpm utilizando T 25 digital ULTRA-TURRAX® (IKA).
El primer pre cultivo se inoculo con 50 mg de biomasa humeda. Los cultivos se incubaron, a continuacion, durante 72 horas. Despues de 72 horas, se inicio el segundo pre cultivo, La concentracion de la biomasa humeda homogeneizada del primer pre cultivo utilizado para la inoculacion fue de 250 mg. El tiempo de cultivo fue de 45 horas. Despues de 45 horas, el cultivo principal se inoculo con 500 mg de biomasa humeda homogeneizada del segundo pre cultivo y cultivo durante otras 45 horas.
Una vez finalizado el cultivo, se aplicaron los procedimientos analtticos convencionales descritos a continuacion en el presente documento para definir la concentracion de biomasa, la concentracion de esquizofilano, la concentracion de etanol y la glucosa residual en el medio. Se estabilizaron almuotas de 50 ml de los cultivos con 3 g/l de Acticide BW20 (Thor).
La concentracion de etanol y glucosa se estimo utilizando el procedimiento por HPLC. Para este fin se centrifugaron 14 ml del cultivo (30 min, 8500 rpm). El sobrenadante se filtro de forma esteril y se inyecto 1 ml del filtrado para el analisis por HPLC (intercambiador de cationes de HPLC: Aminex HPX-87-H, BIO-RAD con H2SO40,5 M, Roth, como eluyente y caudal de 0,5 ml/min a 30 °C).
Debido al hecho de que el esquizofilano esta formado unicamente por moleculas de glucosa, la cuantificacion de este polfmero se puede realizar utilizando procedimientos analtticos convencionales para la glucosa. Se mezclaron 10 ml del cultivo, 20 ml de H2O y 90 pl de Acticide BW20. La muestra se digirio durante 24 horas a 40 °C con pglucanasa (0,3 ml) (Erbsloh). Despues de la incubacion, la muestra se centrifugo (30 minutos a 3400 g) y el sobrenadante se analizo para determinar el contenido de glucosa y etanol usando un intercambiador de cationes HPLC (Aminex HPX-87-H, BIO-RAD) con H2SO40,5 M (Roth) como eluyente y 0,5 ml/min de caudal a 30 °C.
Para la determinacion de la biomasa, la biomasa restante en forma de sedimento (despues de que la muestra de digestion con p-glucanasa se centrifugara) se lavo dos veces con 50 ml de H2O, se filtro usando Whatman-Filter (con determinacion del peso del filtro antes de la filtracion), se lavo dos veces con H2O y se seco en escala de secado HB43S de Mettler Toledo. El secado del filtro se llevo a cabo durante 5 a 10 minutos a 180 °C. Posteriormente, se determino el peso del filtro seco.
La evaluacion de los resultados obtenidos en matraces de agitacion mostro un claro efecto de la sobreexpresion de ambas p-1,3-glucano sintasas sobre la produccion de esquizofilano. Debido al hecho de que en el plasmido de expresion se integro ectopicamente en el genoma y el locus de integracion tiene un efecto explfcito en la expresion del gen diana, se probaron 40 clones que llevan el plasmido (pGS_1) y 40 clones que llevan el plasmido (pGS_2) en experimentos de matraz de agitacion. El aumento de la produccion de esquizofilano en las cepas modificadas geneticamente se muestra en la Tabla 1 en comparacion con la cepa control de Schizophyllum commune no modificada. Los resultados mostrados en la Tabla 1 se refieren a la mejor cepa de cada 40 cepas analizadas. Para la clasificacion de las cepas, la cantidad de esquizofilano en la muestra fue decisiva. Se mezclaron 10 ml del cultivo, 20 ml de H2O y 90 pl de Acticide BW20. La muestra se digirio durante 24 horas a 40 °C con 0,3 ml de p-glucanasa (Erbsloh). Despues de la incubacion, la muestra se centrifugo (30 minutos a 3400 g) y el sobrenadante se analizo para determinar el contenido de glucosa y etanol usando un intercambiador de cationes HPLC (Aminex HPX-87-H, BIO-RAD) con H2SO40,5 M (Roth) como eluyente y 0,5 ml/min de caudal a 30 °C.
Ademas del aumento de los rendimientos de la produccion de esquizofilano en las cepas de S. commune modificadas geneticamente, se observo una clara disminucion en la smtesis del etanol derivado. Esto puede ser una indicacion de que la tasa de exceso de glucosa por la actividad de p-1,3-glucano sintasa regulada al alza se metaboliza mas directamente en la ruta del esquizofilano en lugar de usarse en parte para la smtesis de etanol. Tabla 1: Comparacion de la cepa control de Schizophyllum commune con dos cepas de S. commune modificadas geneticamente que llevan el plasmido de expresion de glucano sintasa (pGS_1) o (pGS_2).
Cepa Esquizofilano[%] EtOH [% [%]
Cepa control de S. commune 100 100
(continuacion)
Figure imgf000031_0002
Analisis de la estructura y conformacion del producto
Para asegurar que el polfmero sintetizado a traves de cepas de S. commune modificadas geneticamente sea esquizofilano, se aplicaron los procedimientos de XRD y NMR para confirmar la estructura de la molecula de la siguiente manera.
La difraccion de rayos X en polvo (XRD) permite un analisis rapido y no destructivo de materiales que consta de multiples componentes. Ademas, la preparacion de la muestra es sencilla. Los datos de la medicion se presentan como un difractograma en el que la intensidad difractada (I) se muestra en funcion del angulo de dispersion 20. La cristalinidad del material dado se puede ser determinar por esta medida. En general, los materiales cristalinos tienen patrones de reflexion de una serie de picos afilados, mientras que los materiales amorfos dan senales amplias. Muchos polfmeros muestran un comportamiento semicristalino que tambien puede ser detectado por XRD (Hammond, The basics of chrystallography and diffraction, 3a Ed., Oxford University Press 2009).
Preparacion de muestras a partir de solucion acuosa
La solucion acuosa que contema esquizofilano se vertio en etanol para precipitar el esquizofilano. El precipitado se filtro y se seco en un horno de vado. La muestra seca se midio por XRD.
Medicion de la muestra y resultados por XRD
El esquizofilano muestra una estructura helicoidal triple. Esto fue evidente a partir del difractograma de la muestra de esquizofilano precipitada y seca (Figura 2). La triple helice podna verse como una difraccion intensiva a 5 ° 20 y la region amorfa del material proporciona una difraccion amplia en el intervalo de 20-25 ° 20 (Hisamatsu, Carbohydr Res (1997), 298: 117).
Medicion de la muestra y resultados por NMR
Los espectros de NMR se registraron en un sistema Varian VNMRS de 600 MHz equipado con una sonda criogenica mejorada con 13C (configuracion inversa) a temperatura ambiente o a 50 °C usando secuencias de pulso convencionales para 1H y 13C.
Se sabe que el esquizofilano tiene una estructura helicoidal triple formada por tres cadenas de p (1-3) -D-glucano mantenidas juntas por enlaces de hidrogeno en el agua. Esta estructura esta blindada en el campo magnetico debido a la conformacion ngida y ordenada. Esto significa que en el espectro de NMR, no se obtienen desplazamientos qmmicos para el esquizofilano (Rinaudo, Carbohydr Polym (1982), 2: 135; Vlachou, Carbohydr Polym (2001), 46: 349) (2D NMR). Con el fin de investigar la estructura molecular del esquizofilano y no la estructura macromolecular que consiste en helices triples y ademas registrar los espectros de n Mr exitosos con una buena relacion senal-ruido, debe cambiarse la conformacion de la helice triple. Tambien se sabe que la triple helice de esquizofilano puede alterarse para formar una estructura de serpentm mediante la adicion de DMSO. Cuando la concentracion de DMSO supera ciertos valores umbral (es decir, 87 %), se produce el cambio de conformacion; por lo tanto, se uso [D6] -DMSO deuterado como disolvente para las mediciones. Es importante tener en cuenta este aspecto de la conformacion cuando se realizan experimentos de NMR para el esquizofilano. Por lo tanto, la muestra se midio en [D6] -DMSO, se pueden obtener los espectros bien resueltos (Figura 2 y 3).
Sumario
Las estructuras qmmicas de los materiales de S. commune (GS_1) y S. commune (GS_2) se identificaron como las correctas para la de esquizofilano. Ademas, Los materiales muestran las conformaciones de triple helice.
Secuencias referidas en la presente solicitud
Tabla 2: Asignacion de las SEQ ID NO.
Figure imgf000031_0001
(continuacion)
Figure imgf000032_0001
(continuacion)
Figure imgf000033_0002
SEQ ID NO: 1
Secuencia genica 1,3-p-D-glucano sintasa I de la cepa Lu15531 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
SEQ ID NO: 2
Traduccion de la SEQ ID NO: 5
aminoacido
S. commune
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000036_0001
SEQ ID NO: 3
Secuencia genica 1,3-p-D-glucano sintasa II de la cepa Lu15531 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
SEQ ID NO: 4
Traduccion de la SEQ ID NO: 7
aminoacido
S. commune
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
SEQ ID NO: 5
ADNc 1,3-p-D-glucano sintasa I de la cepa Lu15531 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
SEQ ID NO: 6
Secuencia de polipeptido 1,3-p-D-glucano sintasa I de la cepa Lu15531 de S. commune
aminoacido
S. commune
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000042_0001
SEQ ID NO: 7
ADNc 1,3-p-D-glucano sintasa II de la cepa Lu15531 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
SEQ ID NO: 8
secuencia de polipeptido 1,3-p-D-glucano sintasa II de la cepa Lu15531 de S. commune
aminoacido
S. commune
Figure imgf000044_0002
SEQ ID NO: 9
Secuencia genica 1,3-p-D-glucano sintasa I de la cepa Lu15634 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
SEQ ID NO: 10
traduccion de la SEQ ID NO: 13
aminoacido
S. commune
Figure imgf000047_0002
SEQ ID NO: 11
Secuencia genica 1,3-p-D-glucano sintasa II de la cepa Lu15634 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
SEQ ID NO: 12
traduccion de la SEQ ID NO: 15
aminoacido
S. commune
Figure imgf000050_0002
SEQ ID NO: 13
ADNc 1,3-p-D-glucano sintasa I de la cepa Lu15634 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
SEQ ID NO: 14
Secuencia de polipeptido 1,3-p-D-glucano sintasa I de la cepa Lu15634 de S. commune
aminoacido
S. commune
Figure imgf000053_0002
SEQ ID NO: 15
ADNc 1,3-p-D-glucano sintasa II de la cepa Lu15634 de S. commune
ADN
S. commune
Figure imgf000053_0003
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
SEQ ID NO: 16
Secuencia de polipeptido 1,3-p-D-glucano sintasa II de la cepa Lu15634 de S. commune
aminoacido
S. commune
Figure imgf000056_0001
SEQ ID NO: 17
promotor tefl
ADN
S. commune
Figure imgf000056_0002
SEQ ID NO: 18
terminador tefl
ADN
S. commune
Figure imgf000057_0001
SEQ ID NO: 19
cebador Ura_forw (Notl)
ADN
artificial
ATAAGAATGCGGCCGCTCCAGCTCGACCTTGCGCCG
SEQ ID NO: 20
cebador Ura_rev (Xbal)
ADN
artificial
CTAGTCTAGAGGATCCGACGTGGAGGAGCC
SEQ ID NO.: 21
cebador TefP_forw (Xbal)
ADN
artificial
CTAGTCTAGAATCGCCATTGTAAGCCGCAG
SEQ ID NO: 22
cebador TefP_rev (Spel)
ADN
artificial
CTAGACTAGTTTTGATGTTTTCTAGGTGAG
SEQ ID NO: 23
cebador TefT_forw (SalI)
ADN
artificial
ACGCGTCGACCAAGTCCGGTGGCAAGGTCA
SEQ ID NO: 24
cebador TefT_rev (Sail)
ADN
artificial
CCGACGTCGACGGGTTCAGTAGCATCTGGCT
SEQ ID NO: 25
cebador TefT_forw (EcoRV)
ADN
artificial
CATGGTGATATCCAAGTCCGGTGGCAAGGTCA
SEQ ID NO: 26
cebador TefT_rev (Apal)
ADN
artificial
CCGTATGGGCCCGGGTTCAGTAGCATCTGGCT
SEQ ID NO: 27
cebador GS1_forw (Spel)
ADN
artificial CTAGACTAGTCCCGTCCCTCAAGGCCGTTC SEQ ID NO: 28
cebador GS1_rev (Sail)
ADN
artificial AATGGCCGACGTCGACATGGTATATGCAATGCTATG SEQ ID NO: 29
cebador Fusion TefP_GS1_forw (Xbal)
ADN
artificial CTAGTCTAGAATCGCCATTGTAAGCCGCAG SEQ ID NO: 30
cebador Fusion TefP_GS1_rev (Sall)
ADN
artificial AATGGCCGACGTCGACATGGTATATGCAATGCTATG SEQ ID NO: 31
cebador GS2_forw (Spel)
ADN
artificial CTAGACTAGTCTGTCCAAAGAAGAGATCGA SEQ ID NO: 32
cebador GS2_rev (EcoRV)
ADN
artificial TACATGCGATATCTTTTATGCAGACTCTCCCTG SEQ ID NO: 33
gen ura
ADN
S. commune
Figure imgf000059_0001
SEQ ID NO: 34
protema Ura
aminoacido
S. commune
Figure imgf000059_0002

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo geneticamente modificado capaz de producir un poKmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, caracterizado porque dicho microorganismo geneticamente modificado sobreexpresa (i) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, y/o (ii) un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, en comparacion con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
2. Uso del microorganismo geneticamente modificado de acuerdo con la reivindicacion 1 para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D- (1-3)-glucopiranosilo que tiene una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de aproximadamente 0,3, en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y
en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
3. Un procedimiento para producir un polfmero que consiste en una cadena principal lineal de unidades p-D-(1-3)-glucopiranosilo que tienen una sola unidad p-D-glucopiranosilo (1-6) unida a una unidad p-D-glucopiranosilo de la cadena principal lineal con un grado de ramificacion promedio de alrededor de 0,3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) introducir en un microorganismo capaz de sintetizar dicho polfmero
(i) un promotor fuerte cadena arriba de un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa, aumentando de este modo la expresion de dicho polinucleotido, o
(ii) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad 1,3-p-D-glucano sintasa;
(b) cultivar dicho microorganismo de (a) en un medio, permitiendo, de este modo, que dicho microorganismo produzca dicho polfmero; y
(c) opcionalmente recuperar dicho polfmero del medio,
en el que dicho polfmero se selecciona del grupo que consiste en esquizofilano y escleroglucano y
en el que dicho microorganismo es Schizophyllum commune.
4. El microorganismo geneticamente modificado de acuerdo con la reivindicacion 1, el uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o el procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que dicho polinucleotido es un gen de la 1,3-p-D-glucano sintasa.
5. El microorganismo geneticamente modificado de acuerdo con la reivindicacion 1 o 4, el uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o 4 o el procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, en el que dicho polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 70 % identica a la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
6. El microorganismo geneticamente modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 5, el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4 a 5, o el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho polipeptido es una 1,3-p-D-glucano sintasa.
7. El microorganismo geneticamente modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 6, el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4 a 6, o el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicho polinucleotido comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 70 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.
8. El microorganismo geneticamente modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 7, en el que dicho microorganismo modificado es capaz de producir al menos 1,5 veces mas de dicho polfmero en comparacion con dicho microorganismo control no modificado.
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