CN111733169A

CN111733169A - 调控真菌木质纤维素降解酶系表达的元件及其应用

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Publication number: CN111733169A
Application number: CN202010708586.2A
Authority: CN
Inventors: 徐欣欣; 张伟; 刘波; 张宇宏; 范超
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN111733169B

Abstract

本发明公开了调控真菌木质纤维素降解酶系表达的元件及其应用。本发明首次发现转录因子HIKLF12在特异腐质霉木质纤维素降解酶系表达过程中具有重要的全局调控作用，Hiklf12基因的高表达能够明显提高特异腐质霉中多种纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的表达量。由此，将Hiklf12基因在特异腐质霉中高表达能够构建特异腐质霉的纤维素酶高产工程菌株或显著提高特异腐质霉的纤维素酶的工业生产水平，有效降低工业生产成本，在生物质能源开发、酿造工业、纺织工业及高效外源基因表达等领域具有重要的应用前景。

Description

调控真菌木质纤维素降解酶系表达的元件及其应用

技术领域

本发明涉及转录因子HIKLF12的新用途，尤其涉及转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途，属于转录因子HIKLF12的新用途领域。

背景技术

生物质是地球上储量最为丰富的可再生资源，利用廉价的生物质材料生产液体燃料和大宗化工用品，可以有效地缓解能源和环境危机，促进全球经济的可持续发展(Banerjee, G., Scott-Craig, J., and Walton, J. (2010). Improving Enzymes forBiomass Conversion: A Basic Research Perspective. BioEnergy Research 3, 82-92)。

生物质主要由通过木质素结合在一起的纤维素和半纤维素组成，其中含量最高的纤维素是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键链聚化形成的聚合物，其内部结构复杂，具有水不溶性的结晶区，难以降解利用。化学水解法和酶水解法是可将纤维素转化为葡萄糖的两种方法。使用无机酸在苛刻条件下对纤维素进行化学水解的产物中不仅包含可发酵的糖，而且还包含对后续发酵步骤中使用的微生物有毒的糖降解产物，例如糠醛。通常需要附加的解毒步骤从水解产物中去除副产物中的抑制剂（Juturu V, Jin CW (2012) Microbialxylanases: Engineering, production and industrial applications BiotechnologyAdvances 30:1219-1227）。利用微生物产生的纤维素酶分解纤维素因具有条件温和、环境友好以及副产物污染少等优点而更具吸引力，受到世界各国的广泛关注和深入研究（SoniSK, Sharma A, Soni R (2018) Cellulases: Role in Lignocellulosic BiomassUtilization Methods in molecular biology(Clifton,NJ)1796:3-23 doi:10.1007/978-1-4939-7877-9_1）。

丝状真菌具有丰富的木质纤维素酶系，且胞外蛋白的分泌水平相比其他微生物具有很大的优势，所以目前用于工业化生产的纤维素酶大多来自于真菌，其中里氏木霉是目前应用最广泛的纤维素酶系生产菌株(Lynd, L.R., Weimer, P.J., van Zyl, W.H., andPretorius, I.S. (2002). Microbial cellulose utilization: fundamentals andbiotechnology. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 66, 506-577.)。但木霉存在着酶系中β-葡萄糖苷酶酶活低、半纤维素酶种类少，酶蛋白热稳定性不佳、最适pH偏酸性等问题，这极大地限制木霉产纤维素酶类的应用（邹根, 刘睿, 魏勇军,周志华, 严兴 (2014). 木质纤维素酶基因资源挖掘及真菌酶系改造. 生物加工过程,63-71.)。因此，研究开发木霉之外的优良木质纤维素酶生产菌株，具有重要的理论意义与应用价值。

嗜热真菌特异腐质霉（Humicola insolens）因其强大的纤维素利用能力和完善的纤维素降解酶表达分泌能力，在生物质能源、饲料、酿酒和纺织等领域重要重要的应用价值。特异腐质霉可以产生丰富的纤维素、半纤维素酶类，并且具有生长温度高、生长快、分泌能力强、所产酶耐高温偏中性等优点（Xu, X., Li, J., Zhang, W., Huang, H., Shi,P., Luo, H., Liu, B., Zhang, Y., Zhang, Z., Fan, Y., et al. (2015). A NeutralThermostable beta-1,4-Glucanase from Humicola insolens Y1 with Potential forApplications in Various Industries. PloS one 10, e0124925.）。近年，在国际上特异腐质霉因其在生物质能源开发、酿造工业、纺织工业及高效外源基因表达等领域的巨大应用前景而受到人们的广泛重视。但目前特异腐质霉原始菌株的纤维素酶产量仍较低，无法满足工业生产的需求。深入了解、研究其中纤维素酶的表达调控机制，并以此为依据，对生产菌株进行定向遗传改良，是提高纤维素酶的工业生产水平、降低工业生产成本的重要途径。

HIKLF12在人和小鼠中的同源蛋白编码了Krueppel-like factor 12，参与了生长发育调控过程（Roth C, Schuierer M, Gunther K, Buettner R (Jul 2000). "Genomicstructure and DNA binding properties of the human zinc finger transcriptionalrepressor AP-2rep (KLF12)". Genomics. 63 (3): 384–90），但未见其参与真菌木质纤维素降解酶系表达调控的研究报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首次发现转录因子HIKLF12在特异腐质霉木质纤维素降解酶系表达过程中具有重要的全局调控作用，将Hiklf12基因在特异腐质霉进行高表达可明显提高特异腐质霉中多种纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的表达量：

本发明首先克隆特异腐质霉Hiklf12基因的完整开放阅读框，利用特异腐质霉翻译延伸因子1基因的组成型强启动子Ptef1和色氨酸合酶基因的终止子，构建Hiklf12基因表达框；将该Hiklf12表达框克隆至M13-PTgpd-neo载体，构建得到Hiklf12基因高表达质粒M13-PTgpd-neo-Hi klf12；将Hiklf12高表达质粒通过原生质体转化转入特异腐质霉构建得到高表达菌株，命名为Hiklf12OE。RT-qPCR鉴定高表达菌株中Hiklf12基因的转录水平较野生型菌株，结果显示，Hiklf12基因的转录水平在高表达菌株中显著高于野生型菌株。

为了鉴定Hiklf12高表达对特异腐质霉纤维素酶表达水平的影响，本发明将Hiklf12高表达菌株和野生型菌株进行纤维素诱导条件下的摇瓶发酵。结果发现，Hiklf12高表达菌株发酵上清中的滤纸酶活力、木聚糖酶活力和漆酶活力较野生型菌株显著升高，qRT-PCR结果显示，多种纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶基因的转录水平显著提高，这表明，HIKLF12在特异腐质霉木质纤维素降解酶系的表达过程中，具有重要的全局性调控作用。

由此，本发明提供了转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途。其中，所述的真菌优选是特异腐质霉（Humicola insolens）。

进一步，本发明提供了一种提高特异腐质霉中多种纤维素酶、半纤维素酶或木质素降解酶的表达量的方法，包括：将Hiklf12基因在特异腐质霉中进行高表达或过表达；譬如：将Hiklf12基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在真菌中表达该基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化真菌，使Hiklf12基因在特异腐质霉中进行高表达或过表达。

该重组表达载体可以由5′端非编码区，Hiklf12基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；优选的，所述的启动子可以是特异腐质霉翻译延伸因子1基因的组成型强启动子Ptef1；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等，优选的，所述的终止子可以是色氨酸合酶基因的终止子。

所述的转化方法可以是原生质体转化的方法。

本发明中所述的Hiklf12基因的氨基核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其推导的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；另外，本领域技术人员还可以将SEQ ID NO.1所示的核苷酸进行优化以增强在真菌中的表达效率。

将Hiklf12基因在特异腐质霉中高表达能够构建特异腐质霉的纤维素酶高产工程菌株或显著提高特异腐质霉的纤维素酶的工业生产水平，有效降低工业生产成本，从而在生物质能源开发、酿造工业、纺织工业及高效外源基因表达等领域具有重要的应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992)；Rossolini等人, Mol Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1 Hiklf12高表达对特异腐质霉木质纤维素降解酶系表达水平的影响；A）Hiklf12高表达菌株发酵上清中滤纸酶活，木聚糖酶活和漆酶活力的变化；B）Hiklf12高表达菌株中木质纤维素降解酶编码基因转录水平的变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1

1实验材料

1.1 菌株及质粒

特异腐质霉Y1野生型菌株由实验室保存；载体pEASY-Blunt-simple（北京全式金生物技术有限公司）；质粒M13-PT_gpd-neo为本实验室构建保存。

酶类及其他生化试剂

羧甲基纤维素钠、微晶纤维素/Avicel、桦木木聚糖、对硝基苯-葡萄糖苷/纤维二糖苷购自美国Sigma公司；噻孢霉素、G418购自北京索莱宝科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基购自美国BD公司；Whatman 1号试纸购自英国Whatman公司；细胞壁裂解酶购自L1412，美国Sigma公司，NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit购自美国New EnglandBiolabs公司；其它药品均为进口或国产分析纯级别。

培养基

MMN液体培养基：蛋白胨1 g/L，酵母膏20 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6 g/L，Avicel 20 g/L；

PDA固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（BD） 39 g/L，琼脂粉7 g/L；

YPD液体培养基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L；

上层固体再生培养基：蔗糖150.61 g/L，酵母膏3 g/L，蛋白胨6 g/L，0.75%琼脂糖（w/v）；

下层固体再生培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（BD）39 g/L，蔗糖150.61 g/L，琼脂粉5g/L。

实验方法

2.1 质粒构建

以特异腐质霉基因组DNA为模板，利用引物对klf12S/ klf12A扩增klf12基因的完整开放阅读框，利用引物对Ptef1S/ Ptef1A、TtrpCS/TtrpCA分别扩增tef1基因的启动子和trpC基因的终止子片段。将纯化后的片段Ptef1、klf12、TtrpC与载体M13-PT_gpd-neo（XhoI单酶切）进行一步克隆重组，得到klf12过表达质粒M13-PTgpd-neo-Hi klf12。

特异腐质霉原生质体转化

（1）从2-3个预培养的PDA平板收集特异腐质霉孢子，调孢子浓度至107个/mL；

（2）将1 mL孢子悬液接入至250 mL YPD液体培养基中，42℃、200 rpm培养10 h；

（3）将0.1g细胞壁裂解酶溶于20 mL solution A（KH2PO4 0.1 M，山梨醇1.2 M，KOH调pH至5.6），现配现用，过滤除菌。

（4）用细胞筛过滤特异腐质霉菌丝，用200 mL无菌超纯水冲洗菌体，尽量洗掉孢子。再用10 mL Solution A溶液洗涤一次菌体。

（5）将20 mL solution A溶液及洗好的菌丝体加入到100 mL无菌三角瓶中，并将菌丝体进行吹吸重悬。

（6）将三角瓶置于30℃、120 rpm摇床进行菌丝裂解。从1.5 h起取样计数，原生质体数量达到107个/mL以上时停止裂解，最多裂解2 h。

（7）将裂解后的酶解液直接轻轻倒入滤网进行过滤。将过滤后的原生质体悬液加至2 mL无菌离心管中，4℃、3,000 rpm离心5 min收集原生质体，并将离心管置于冰上。

（8）向离心管中加入2 mL预冷的Solution B溶液（CaCl2 50 mM，山梨醇1 M，Tris-HCl（pH 7.5）10 mM），轻轻上下颠倒进行重悬原生质体，4℃、3,000 rpm离心5 min，小心、仔细的直接弃掉上清。重复该步骤一次，用预冷的Solution B溶液共洗涤两次。

（9）加入适量预冷的Solution B溶液，轻轻颠倒离心管底重悬原生质体，并进行镜检，使其浓度为5×107-1×108个/mL，放置冰上待用。

（10）取200 µL原生质体至无菌2 mL离心管中，加入10 µg DNA片段，加入1/10体积的PEG缓冲液（PEG 6000 25%（w/v），山梨醇1 M，CaCl2 50 mM，Tris-HCl（pH 7.5）10 mM），轻轻颠倒混匀，冰浴20min。

（11）加2 mL PEG缓冲液，轻轻颠倒混匀，室温静置20 min。

（12）将转化反应液转移至无菌的50 mL离心管中，加入4 mL液体再生培养基，轻柔混匀。

（13）每1.5 mL转化反应液与5 mL溶化好的含相应抗生素的固体再生培养基轻轻混匀，覆盖至底层培养基。

（14）为保证较高的转化子纯合度，将转化物放置于37℃培养2-5 d，至有转化子长出。

（15）挑取菌落边缘少量菌丝至PDA/YPD培养基（含对应抗生素）上，42℃进行传代培养。

特异腐质霉摇瓶发酵

将特异腐质霉菌株接种至PDA固体培养基，42℃培养5-7 d后加入适量无菌水，用无菌棉棒轻轻刮取菌体表面，将刮取液分别经过八层纱布、四层擦镜纸过滤，收集孢子，并测定浓度。在YPD液体培养基中接种相同孢子量的孢子液（终浓度10⁵个/mL）， 42℃、200 rpm培养24 h。将YPD液体培养基培养的菌体室温、12,000 rpm离心10 min，收集菌体并用无菌水洗涤1次。取相同量（湿重0.5 g）最后收集的菌丝体接种到40 mL MMN液体发酵培养基中（8层纱布封口），42℃、200 rpm培养6 d，每隔24 h取样1次。样品室温、12,000 rpm离心10min，发酵上清（酶液）用于测定酶活，沉淀物用于测定生物量。

纤维素酶和木聚糖酶活力测定

纤维素酶滤纸（FPase）酶活测定：该酶活的测定使用DNS法测定(MILLER, 1959)。将Whatman 1号试纸剪成6 cm×1 cm长条状并折成M型，放至试管底部，加入1.96 mL的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（0.1 M，pH 6.0）浸没试纸。取50 µL酶液用柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液进行适当稀释，取40 µL加入试管中并振荡混匀（对照组先不加）。放至60℃水浴锅中水浴30 min，迅速冷却，加入3 mL DNS试剂（对照组同时加入40 µL酶液）混合均匀，沸水浴5 min，迅速冷却。以去离子水为参照，测定各反应液在540 nm处的吸光度值。在60℃、pH 6.0条件下，每分钟生成1 µM还原糖所需要的酶量定义为一个酶活单位（U）。

内切葡聚糖酶（CMCase）酶活测定：取1 g CMC-Na溶于100 mL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（0.1 M，pH 6.0）中并混匀。1% CMC-Na溶液现用现配，在4℃保存不超过3天。取900 µL 1%CMC-Na溶液加入至各试管底部，放于60℃水浴锅水浴平衡后，依次向各个试管中加入100 µL适当稀释的酶液（每隔10 s加一个样品，对照组先不加），振荡混匀。反应10 min后，向各个试管中依次加入1.5 mL DNA试剂（每隔10 s加一个，对照组同时加入100 µL酶液），混合均匀后沸水浴5 min并迅速冷却。以去离子水为参照，测定各反应液在540 nm处的吸光度值。在60℃、pH 6.0条件下，每分钟生成1 µM还原糖所需要的酶量定义为一个酶活单位（U）。

木聚糖酶（Xylanase）酶活测定：取1 g桦木木聚糖溶于90 mL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（0.1 M，pH 6.0）中，沸水浴5 min，期间摇晃混匀。12,000 rpm离心10 min后，取上清液用缓冲液定容至100 mL。1% 木聚糖溶液现用现配，在4℃保存不超过3天。其测定方法同内切葡聚糖酶酶活测定方法一致。在60℃、pH 6.0条件下，每分钟生成1 µM还原糖所需要的酶量定义为一个酶活单位（U）。

β-1，4葡萄糖苷酶（pNPGase）酶活测定：用去离子水配制4 mM的pNPG（p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside，对硝基苯-葡萄糖苷）溶液，加入等体积的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（0.1 M，pH 6.0）混合配制2 mM的pNPG溶液。该溶液在4℃保存不超过3天。向试管底部加入250 µL 2 mM的pNPG溶液，60℃水浴锅水浴平衡。依次向各个试管中加入250µL适当稀释的酶液（每隔10 s加一个，对照组先不加），振荡混匀。反应10 min后，向各个试管中依次加入1.5 mL 1 M Na₂CO₃终止反应（每隔10 s加一个，对照组同时加入250 µL酶液），混合均匀，迅速冷却。以去离子水为参照，测定各反应液在420 nm处的吸光度值。在60℃、pH 6.0条件下，每分钟生成1 µM对硝基苯所需要的酶量定义为一个酶活单位（U）。

纤维二糖水解酶（pNPCase）酶活：底物换为pNPC（p-nitrophenyl-β-d-cellobioside，对硝基苯-纤维二糖苷）。底物浓度、测定方法同β-1，4葡萄糖苷酶酶活。在60℃、pH 6.0条件下，每分钟生成1 µM对硝基苯所需要的酶量定义为一个酶活单位（U）。

特异腐质霉RNA提取及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

1）特异腐质霉的RNA提取

将特异腐质霉Y1野生型及纤维素酶高产突变株T4接种MMN发酵培养基，42℃、200 rpm进行培养，培养方法见2.2.2。分别在培养第4 h、24 h、48 h取样，收集菌丝后提取其RNA（每个样品两个平行）。

特异腐质霉菌株 RNA提取方法如下：

收集菌体，尽量用滤纸吸干并迅速放入用液氮预冷的研钵中研磨至粉末状（及时补加液氮，保证样品一直处于液氮中）；将菌体粉末装入预冷的1.5 mL离心管中（约100 µL刻度线处），迅速加入1 mL TRIzol试剂并吹吸混匀，室温静置5 min后，4℃、12,000 rpm离心10min；将上清转移至新离心管并加入各200 µL氯仿及酸酚进行剧烈震荡混匀，4℃、12,000rpm离心10 min；小心的取上清再次加入各200 µL氯仿及酸酚混匀并离心，直至无中间层；取上清加入200 µL氯仿剧烈混匀并离心，直至无中间层；将上清取至新离心管，加入等体积异丙醇混匀，-20℃放置20 min，4℃、12,000 rpm离心10 min，弃上清；用800 µL预冷的70%乙醇洗涤白色沉淀两次，超净台吹干后加入50 µL灭菌超纯水溶解，分装后-80℃保存。

在提取过程中，各器材需要121℃高压灭菌1 h；70%乙醇现用现配；白色沉淀不能完全吹干，完全吹干会降低RNA得率。

各取5 μg RNA进行转录组测序（RNA-Seq），测序由北京博艾生物科技有限公司完成。

2）RNA样品中基因组DNA的去除

取1 µL提取的RNA进行核酸电泳检测合格后，进行基因组DNA去除反应。

反应体系：

上述轻柔混合后，于37℃反应1 h。

之后用异丙醇沉淀法纯化回收RNA，溶解于50 µL灭菌超纯水中（同3.2.6.2）。

可取2 µL 处理的RNA做模板，用相应的引物进行PCR检测（30个循环），确保DNA已被彻底去除（RNA作对照）。

3）qRT-PCR

取去除基因组DNA的RNA为模板进行反转录合成cDNA，反应体系如下：

加入体系后轻轻吹吸混匀，轻甩。反应条件如下：25℃预变性5 min；50℃反转录15min；85℃灭活2 min；25℃保温1 min。

取反转录的cDNA为模板进行qRT-PCR，反应体系如下：

反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸20 s，40个循环；72℃延伸20 s。

采用2^−ΔΔCt法对qRT-PCR数据进行分析。

实验结果

特异腐质霉HiKLF12序列分析

特异腐质霉来源的Hiklf12基因全长1,888 bp，包含2个内含子，推测编码含501个氨基酸的蛋白HIKLF12。HIKLF12是含有Cys₂His₂保守结构域（412–437位）的锌指蛋白。

HIKLF12在人和小鼠中的同源蛋白编码了Krueppel-like factor 12，参与了生长发育调控过程（Roth C et al, 2000），但未见其参与真菌木质纤维素降解酶系表达调控的研究报道。

特异腐质霉高表达菌株的构建

克隆特异腐质霉Hiklf12基因的完整开放阅读框，利用特异腐质霉翻译延伸因子1基因的组成型强启动子Ptef1和色氨酸合酶基因的终止子，构建Hiklf12基因表达框。将Hiklf12表达框克隆至M13-PTgpd-neo载体，构建得到Hiklf12基因高表达质粒M13-PTgpd-neo-Hiklf12。分别用NotI、BamHI/NdeI进行酶切验证，并进一步进行测序验证。

将Hiklf12高表达质粒通过原生质体转化转入特异腐质霉，构建得到高表达菌株，命名为Hiklf12OE。RT-qPCR鉴定高表达菌株中Hiklf12基因的转录水平较野生型菌株。结果显示，Hiklf12基因的转录水平在高表达菌株中显著高于野生型菌株。

在特异腐质霉木质纤维素降解酶系表达中的重要调控作用

为了鉴定Hiklf12高表达对特异腐质霉纤维素酶表达水平的影响，将Hiklf12高表达菌株和野生型菌株进行纤维素诱导条件下的摇瓶发酵。Hiklf12高表达菌株发酵上清中的滤纸酶活力、木聚糖酶活力和漆酶活力较野生型菌株显著升高，qRT-PCR结果显示，多种纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶基因的转录水平显著提高（图1）。这表明，HIKLF12在特异腐质霉木质纤维素降解酶系的表达过程中，具有重要的全局性调控作用。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 调控真菌木质纤维素降解酶系表达的元件及其应用

<130> BJ-2002-200601A-L

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1888

<212> DNA

<213> Humicola insolens

<400> 1

atgggagcca cggccgttgg gccccagaga ccactcccgt ttccggaccc tcaaagtacg 60

cggtattatt ccagctactc tcctgaaatc atgtcctcta tcacgagcga tggccgcctt 120

ggagcccggc caggctctcc cttaacagta gccgccgctc ttccgcggcc gcaagcaccg 180

gggctagctt ctggcctccc ttcccattct ctctcctccg actcggtatc cgcacgagac 240

gagcgtgccc caaggtccag cgttctgacc gcctcaggag cagtctcgga ccccttttct 300

ccgccggcag gcgcccacgc cagcagccct aatccttctc aacccggacc atcatcactt 360

tactacgccg gccacatgac cggatcgtgg cccacgccag ggctatcaca accctcggcg 420

tacacgtacg gcggttccag ctcgacgggt ccggcttcgg gcccgctcgc tcctccgcca 480

tacggtcgag cagccgcggc cggcggccca tcatacgcat ctaccgctcc atcgccgtct 540

caacagcatt tccccggccg cggtgcgtca tccgcgtcta actcagacag ccatgccgcg 600

tcacaacctc caacgccata tcaagagcag cagggcttcg ctagtccgct gggtgtcggc 660

ggagcagcag ccggcacggg cgcaacagga ctggggtctc ccctcaacgc tcccggaagc 720

aaccagtcct cgggtctgag ccatcccctt ctcgcagctg cgaaccaggc cgctcgccag 780

gcggcatcaa ctcaaaccac gaccggccca ggtcaagggc cagcgccgaa tgcaacagcg 840

ccagaatcct cggcctaccg tccaccacca ccacctgggg gaccatcaag ctactacccg 900

cagacctcct ctccccaaca acaacagcaa caacaacaaa cttccttccc cggctacccc 960

tcctccgccc ctcctccgcc acaatccctc gcaccagtaa catcctcagc tccgtcaggc 1020

ctctcgcggc cgtcaggctc catccccgcg ctcgccgcag ccggaaccgt ccccaaccct 1080

tctcccttag gctactccac ggccaccggc cctcgcgccg cagctatggc ggcgagtcct 1140

tacagcccgt accccacggc cggtccaatc ctcagcaaca tccaccatcc cggcggcgcg 1200

ctgaccatgg tgggcgggcc ggcggggccg gctggaccga gtagcggagc cgccgcgctg 1260

tcgagctaca gccatcacca ccacccgggc caccatcctc cgggacacca tccgccgccg 1320

ccgttgggac accatcccgg ccaccatcat ccgcatcact cgctgtacct gcaccacccg 1380

gcgccgccgc ccacgccgcc cgctgagagg ccgttcaagt gcaccgagaa cgggtgcatg 1440

caggcgttta atcggaatca tgatttgaag cggcatcaga ggattcattt ggcggtgaag 1500

ccgtttgcgt gtgaggattg cgagaagagg ttttcgagga aggatgcgtt gaaggtttgt 1560

ttttgcttgt tttctcttcc ttttctcgca ttacattctg ggcgatgtgt atagggggtt 1620

gtttggtgtt tgattccttt gaacccttat tttgtttgcc tggttgcctc ggtagtgttt 1680

agatgtacta acagtcacgc catcacagcg tcatcgcctt gtcaaggggt gcgggagcaa 1740

cattcacgcc tcatcgaact tgaacaacaa tacgacatca acaaaaactg agccgggcgc 1800

caccgcgtcg acagcagcga acaccgactc caacgccggt aacaacatcg tcccgggtgg 1860

ttcgtcagcg tcagtgaagg aggcttga 1888

<210> 2

<211> 480

<212> PRT

<213> Humicola insolens

<400> 2

Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Pro Gln Arg Pro Leu Pro Phe Pro Asp

1 5 10 15

Pro Gln Ile Ser Asp Pro Phe Ser Pro Pro Ala Gly Ala His Ala Ser

20 25 30

Ser Pro Asn Pro Ser Gln Pro Gly Pro Ser Ser Leu Tyr Tyr Ala Gly

35 40 45

His Met Thr Gly Ser Trp Pro Thr Pro Gly Leu Ser Gln Pro Ser Ala

50 55 60

Tyr Thr Tyr Gly Gly Ser Ser Ser Thr Gly Pro Ala Ser Gly Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Ser Tyr

85 90 95

Ala Ser Thr Ala Pro Ser Pro Ser Gln Gln His Phe Pro Gly Arg Gly

100 105 110

Ala Ser Ser Ala Ser Asn Ser Asp Ser His Ala Ala Ser Gln Pro Pro

115 120 125

Thr Pro Tyr Gln Glu Gln Gln Gly Phe Ala Ser Pro Leu Gly Val Gly

130 135 140

Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Ser Pro Leu Asn

145 150 155 160

Ala Pro Gly Ser Asn Gln Ser Ser Gly Leu Ser His Pro Leu Leu Ala

165 170 175

Ala Ala Asn Gln Ala Ala Arg Gln Ala Ala Ser Thr Gln Thr Thr Thr

180 185 190

Gly Pro Gly Gln Gly Pro Ala Pro Asn Ala Thr Ala Pro Glu Ser Ser

195 200 205

Ala Tyr Arg Pro Pro Pro Pro Pro Gly Gly Pro Ser Ser Tyr Tyr Pro

210 215 220

Gln Thr Ser Ser Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Thr Ser Phe

225 230 235 240

Pro Gly Tyr Pro Ser Ser Ala Pro Pro Pro Pro Gln Ser Leu Ala Pro

245 250 255

Val Thr Ser Ser Ala Pro Ser Gly Leu Ser Arg Pro Ser Gly Ser Ile

260 265 270

Pro Ala Leu Ala Ala Ala Gly Thr Val Pro Asn Pro Ser Pro Leu Gly

275 280 285

Tyr Ser Thr Ala Thr Gly Pro Arg Ala Ala Ala Met Ala Ala Ser Pro

290 295 300

Tyr Ser Pro Tyr Pro Thr Ala Gly Pro Ile Leu Ser Asn Ile His His

305 310 315 320

Pro Gly Gly Ala Leu Thr Met Val Gly Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly

325 330 335

Pro Ser Ser Gly Ala Ala Ala Leu Ser Ser Tyr Ser His His His His

340 345 350

Pro Gly His His Pro Pro Gly His His Pro Pro Pro Pro Leu Gly His

355 360 365

His Pro Gly His His His Pro His His Ser Leu Tyr Leu His His Pro

370 375 380

Ala Pro Pro Pro Thr Pro Pro Ala Glu Arg Pro Phe Lys Cys Thr Glu

385 390 395 400

Asn Gly Cys Met Gln Ala Phe Asn Arg Asn His Asp Leu Lys Arg His

405 410 415

Gln Arg Ile His Leu Ala Val Lys Pro Phe Ala Cys Glu Asp Cys Glu

420 425 430

Lys Arg Phe Ser Arg Lys Asp Ala Leu Lys Arg His Arg Leu Val Lys

435 440 445

Gly Cys Gly Ser Asn Ile His Ala Ser Ser Asn Leu Asn Asn Asn Thr

450 455 460

Thr Ser Thr Lys Thr Glu Pro Gly Ala Thr Ala Ser Thr Ala Ala Asn

465 470 475 480

Claims

1.转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途。

2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调控真菌木质纤维素降解酶系表达是将转录因子HIKLF12编码基因在真菌中高表达提高纤维素酶、半纤维素酶或木质素降解酶的表达量。

3.按照权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的真菌是特异腐质霉（Humicola insolens）。

4.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，将Hiklf12基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在真菌中表达该基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化真菌，使Hiklf12基因在真菌中进行高表达或过表达。

5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于，所述重组表达载体由5′端非编码区，Hiklf12基因和3′非编码区组成。

6.按照权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的5′端非编码区包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的3′非编码区包含终止子序列、mRNA切割序列。

7.权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的启动子是特异腐质霉翻译延伸因子1基因的组成型强启动子Ptef1。

8.按照权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的终止子是色氨酸合酶基因的终止子。

9.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转录因子HIKLF12的氨基酸序列为SEQID No.2所示。

10.按照权利要求1或9所述的用途，其特征在于，所述转录因子HIKLF12的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。