CN106699854B

CN106699854B - 功能蛋白pox04420及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106699854B
Application number: CN201710014034.XA
Authority: CN
Inventors: 冯家勋; 赵帅; 廖陆升; 闫语丝; 何启鹏
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2037-01-09
Also published as: CN106699854A

Abstract

本发明公开了一种功能蛋白POX04420及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自草酸青霉，命名为POX04420蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。编码所述POX04420蛋白的基因(POX04420基因)也属于本发明的保护范围。本发明通过实验证明POX04420在调控草酸青霉的纤维素酶基因和木聚糖酶基因的表达过程中起关键作用，在提高纤维素酶产量中具有应用潜力。

Description

功能蛋白POX04420及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及遗传工程领域，具体涉及一种功能蛋白POX04420及其编码基因与应用。

背景技术

人类的生产生活或多或少地消耗着能量，随着化石燃料如石油、煤炭等非可再生能源的不断消耗以及所带来的一系列严重的社会问题。寻找可替代的、清洁的再生能源已成为研究者们和各国政府关注的焦点(Singh，R.，Krishna，B.B.，Kumar，J.，Bhaskar，T.Opportunities forutilization of non-conventional energy sources for biomasspretreatment[J].Bioresour Technol2016，199：398-407)。以纤维素为主要成分的植物木质纤维素类物质是地球上最丰富的可再生资源，全球每年产生约1800亿吨植物木质纤维素类物质，其中小麦、水稻秸秆和甘蔗渣的量分别为3.54、7.31和1.81亿吨，是极其廉价的可利用的原料(Taha，M.，Foda，M.，Shahsavari，E.，Aburto-Medina，A.，Adetutu，E.，Ball，A.Commercial feasibility of lignocellulose biodegradation：possibilities andchallenges[J].Curr Opin Biotechnol 2016，38：190-197)。中国是个农业大国，拥有极其巨大的植物生物质资源，每年产生约7.3亿吨的农作物秸秆等农业废弃物，相当于12000万亿kJ的能量。此外，中国每年还产生约3700万立方米的森林废弃物，相当于580万亿kJ的能量(Ma，L.，Wang，T.，Liu，Q.，Zhang，X.H.，Ma，W.C.，Zhang，Q.A review of thermal-chemical conversion of lignocellulosic biomass in China[J].Biotechnol Adv2012，30(4)：859-873)。

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中，纤维素含量最多，由成百上千个葡萄糖分子聚合而成，占40％-50％；半纤维素次之，占25％-30％；木质素含量最少，主要由结构复杂的含芳香环的有机分子聚合而成，占15％-20％(Brethauer，S.，Studer，M.H.Biochemical conversion processes of lignocellulosic biomass tofuels and chemicals-a review[J].CHIMIA Int J Chem 2015，69(10)：572-581)。筛选和构建高效的产纤维素酶的微生物菌株，实现天然纤维素的有效生物转化，具有极其重要的现实意义和广阔的发展前景。

生产中，纤维素酶主要来自于丝状真菌，例如，木霉、青霉和曲霉等(Gusakov，AV.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production[J].TrendsBiotechnol 2011，29(9)：419-425；Yao，GS.，Li，ZH.，Gao，LW.，Wu，RM.，Kan，QB.，Liu，GD.，Qu，YB.Redesigining the regulatory pathway to enhance cellulase production inPenicillium oxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71；Florencio，C.，Cunha，F.，Badino，A.，Farinas，C.，Ximenes，E.，Ladisch，M.Secretome analysis of Trichodermareesei and Aspergillus nigercultivated by submerged and sequentialfermentation processes：Enzyme production for sugarcane bagasse hydrolysis[J].Enzyme MicrobTech 2016，90：53-60)。根据作用方式的不同，纤维素酶主要分为三类：内切-1，4-β-D-葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EG，EC3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC3.2.1.21)(Lynd，L..R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，Pretorius，I.S.Microbialcellulose utilization：fundamentals and biotechnology[J].Microbiol MoleculBiol R 2002，66(3)：506-577；Glass，N.L.，Schmoll，M.，Cate，J.H.，Coradetti，S.Plantcell wall deconstruction by ascomycete fungi[J].Annu Rev Microbiol 2013，67：477-498)。EG作用于纤维素链分子内部，随机水解纤维素分子内的β-1，4-糖苷键，产生短的纤维素链或可溶性纤维寡糖，暴露出新的纤维素链末端。CBH沿着纤维素链末端由外向里水解β-1，4-糖苷键，释放纤维二糖。上述酶解反应为固相反应，反应速度慢，是纤维素酶水解的限速步骤。继而是液相反应，反应速度快。在液相反应中，EG和CBH继续水解上述固相反应产生的可溶性纤维寡糖产生纤维二糖，BGL将上述固相反应和液相反应产生的纤维二糖水解成葡萄糖。通过这三种酶的协同作用，纤维素酶将纤维素转化为葡萄糖，葡萄糖可以被微生物利用产生化学品如被酿酒酵母发酵生产燃料酒精(Wang，J.，Quirk，A.，Lipkowski，J.，Dutcher，J.R.and Clarke.A.J.Direct in situ observation of synergism betweencellulolytic enzymes during the biodegradation of crystalline cellulosefibers[J].Langmuir 2013，29(48)：14997-15005；Zhang，Y.H.P.，Himmel，M.E.，Mielenz，J.R.Outlook for cellulase improvement：screening and selection strategies[J].Biotechnol Adv 2006，24(5)：452-481；Dashtban，M.，Schraft，H.，Qin，W.Fungalbioconversion of lignocellulosic residues：opportunity and perspectives[J].IntJ Biol Sci 2009，5(6)：578-595)。

纤维素酶可应用在食品、饲料、酿造和酿酒、农业、生物炼油、纸浆和造纸、纺织和洗涤等行业(Kuhad，R.C.，Gupta，R.，Singh，A.Microbial cellulases and theirindustrial application[J].Enzyme Res 2011，Article ID 280696)。木霉、曲霉、青霉、粗糙脉胞菌等丝状真菌在诱导物存在的情况下，可迅速启动纤维素酶和半纤维素酶基因的转录、翻译合成纤维素酶和半纤维素酶。真菌细胞内存在多个功能保守的转录因子，调控纤维素酶和半纤维素酶基因的转录水平，例如，里氏木霉中的Crel(Portnoy，T.，Margeot，A.，Linke，R.，Atanasova，L.，Fekete，E.，Sándor，E.，Hartl，L.，Karaffa，L.，Druzhinina，IS.，Seiboth，B.，Le Crom，S.，Kubicek，CP.The CRE1 carbon catabolite repressor of thefungus Trichoderma reesei：a master regulator of carbon assimilation[J].BMCGenomics 2011，12：269)，AceII(Aro，N.，Saloheimo，A.，Ilmen，M.，M.ACEII，anovel transcriptional activator involved in regulation of cellulase andxylanase genes of Trichoderma reesei[J].J Biol Chem 2001，276(26)：24309-24314)，曲霉中的XlnR(Hasper，A.A.，Trindade，L.M.，van der Veen，D.，van Ooyen，A.J.，de Graaff，L.H.Functional analysis of the transcriptional activator XlnR fromAspergillus niger[J].Microbiology 2004，150：1367-1375)，PacC(Kunitake，E.，Hagiwara，D.，Miyamoto，K.，Kanamaru，K.，Kimura，M.，Kobayashi，T.Regulation of genesencoding cellulolytic enzymes by Pal-PacC signaling in Aspergillus nidulans[J].Appl Microbiol Biotechnol 2016，100(8)：3621-3635)，粗糙脉孢菌中的Clrl和Clr2(Craig，J.P.，Coradetti，S.T.，Starr，T.L.，Glass，N.L.Direct target network of theNeurospora crassa plant cell wall deconstruction regulators CLR-1，CLR-2，andXLR-1[J].mBio 2015，6(5)：e1415-e1452)，以及草酸青霉中的ClrB，CreA，XlnR和AmyR(Li，H.，Yao，G.，Wu，R.，Gao，L.，Kan，Q.，Liu，M.，Yang，P.，Liu，G.，Qin，Y.，Song，X.，Zhong，Y.，Fang，X.，Qu，Y.Synergistic and dose-controlled regulation of cellulase geneexpression in Penicillium oxalicum[J].PLoS Genet 2015，11：e1005509)，ClrC(Lei，Y.，Liu，G.，Yao，G.，Li，Z.，Qin，Y.，Qu，Y.A novel bZIP transcription factor ClrCpositively regulates multiple stress responses，conidiation and cellulaseexpression inPenicillium oxalicum[J].Res Microbiol 2016.167(5)：424-435)等。这些转录因子呈现共调控作用。

近年来，研究发现草酸青霉可以产生完整的纤维素酶系及高活力的β-葡萄糖苷酶(Gusakov，A.V.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production[J].Trends Biotechnol2011，29(9)：419-425；Yao，G.S.，Li，Z.H.，Gao，L.W.，Wu，R.M.，Kan，Q.B.，Liu，G.D.，Qu，Y.B.Redesigining the regulatory pathway to enhance cellulaseproduction in Penicillium oxalicum[J].Biotechnol Biofuel 2015，8：71；Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，Feng，J.X.Comparative genomic，transcriptomic and secretomic profiling ofPenicillium oxalicumHP7-1 and its cellulase and xylanase hyper-producingmutant EU2016，and identification of two novel regulatory genes of cellulaseand xylanase gene expression[J].Biotechnol Biofuel 2016，(9)：203)，在工业生产纤维素酶方面具有应用价值。

基于鉴定的真菌调控转录因子，构建的基因工程菌株比野生型菌株明显提高了纤维素酶的产量。例如，在瑞氏木霉中过量表达ace3后纤维素酶的产量比野生型菌株的显著提高(Hakkinen，M.，Valkonen，M.，Westerholm-Parvinen，A.，Aro，N.，Arvas，N.，Vitikainen，M.，Penttila，M.，Saloheimo，M.，Pakula，T.Screening of candidateregulators for cellulase and hemicellulase production in Trichoderma reeseiand identification of a factor essential for cellulase production[J].Biothechnol Biofuel 2014，7∶14)。在草酸青霉中，Yao等遗传改造草酸青霉菌株114-2，通过缺失crel和bgl2，过量表达clrB，构建突变菌株RE-10，检测发现菌株RE-10的纤维素酶产量比野生型的提高了20倍(Yao，G.，Li，Z.，Gao，L.，Wu，R.，Kan，Q.，Liu，G.，Qu，Y.Redesigning the regulatory pathway to enhance cellulase production inPenicillium oxalicum[J].Biotechnol Biofuel2015，8：71)。但是，真菌纤维素酶的产量仍远远不能满足木质纤维素工业规模生物炼制的需求。因此，鉴定丝状真菌纤维素酶基因更多新的调控转录因子，为通过理性设计、遗传改造真菌以提高纤维素酶产量提供理论指导，具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种功能蛋白POX04420及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，获自草酸青霉，命名为POX04420蛋白，是如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

序列1由302个氨基酸残基组成，自N端的第237-290位氨基酸残基为其结合功能域，自N端的第237-259和265-290位氨基酸残基为两个连续的功能域，功能域均为C2H2型，可与DNA结合。

为了使(a1)中的POX04420蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-mvc	10	EQKLISEEDL

上述(a2)中的POX04420蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的POX04420蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述POX04420蛋白的基因(POX04420基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)序列表的序列3所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码所述POX04420蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述POX04420蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

序列表的序列2是POX04420基因的开放阅读框(ORF)序列，由909个碱基组成。

序列表的序列3是POX04420基因的基因组DNA序列，自5′端的第179-259位碱基为POX04420基因的一个内含子。

含有所述POX04420基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述POX04420蛋白或POX04420基因的应用，为如下(b1)-(b14)中的至少一种：

(b1)调控微生物纤维素酶产量；

(b2)调控微生物半纤维素酶产量；

(b3)调控微生物羧甲基纤维素酶产量；

(b4)调控微生物外切纤维素酶产量；

(b5)调控微生物木聚糖酶产量；

(b6)调控微生物β-葡萄糖苷酶产量；

(b7)调控微生物纤维素酶基因的表达量；

(b8)调控微生物半纤维素酶基因的表达量；

(b9)调控微生物内切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因的表达量；

(b10)调控微生物纤维二糖水解酶基因的表达量；

(b11)调控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表达量；

(b12)调控微生物木聚糖酶基因的表达量；

(b13)调控微生物纤维素酶基因的调控转录因子的编码基因的表达量；

(b14)调控微生物木聚糖酶基因的调控转录因子的编码基因的表达量。

所述(b1)-(b5)中，所述调控为正向调控。

所述(b6)中，所述调控为负向调控。

所述纤维素酶基因具体可为POX05587、POX04786、POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983、POX07535、POX06835、POX07963或POX08882。

所述纤维二糖水解酶基因具体可为POX05587或POX04786。

所述内切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因具体可为POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983或POX07535。

所述β-葡萄糖苷酶基因具体可为POX06835、POX07963或POX08882。

所述半纤维素酶基因具体可为POX05916、POX06783或POX08484。

所述木聚糖酶基因具体可为POX05916、POX06783或POX08484。

所述纤维素酶基因的调控转录因子或所述木聚糖酶基因的调控转录因子具体可为PoxBrlA(无性繁殖调控因子)、PoxClrB(纤维素降解调控转录因子)、PoxFlbD(无性繁殖调控因子)、PoxAmyR(淀粉酶基因表达调控转录因子)。

本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力的方法，包括如下步骤：抑制所述微生物中POX04420基因的表达，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力降低的微生物。

本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力的方法，包括如下步骤：降低POX04420蛋白的表达量和/或活性，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力降低的微生物。

所述“抑制所述微生物中POX04420基因的表达”是通过向所述微生物中导入POX04420基因敲除盒实现的。

本发明还保护一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制POX04420基因表达的物质导入出发微生物，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力低于所述出发微生物的重组微生物。

所述抑制POX04420基因表达的物质具体可为POX04420基因敲除盒。

所述抑制POX04420基因表达的物质还可为干扰载体；所述干扰载体为含有POX04420基因敲除盒的重组载体。

以上任一所述POX04420基因敲除盒具体为序列表的序列4所示的DNA分子。

以上任一所述微生物或所述出发微生物可为青霉，具体可为草酸青霉，更具体可为草酸青霉HP7-1。

以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为以草酸青霉HP7-1为出发菌，敲除其Ku70基因得到的重组菌。

以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为草酸青霉Ku70基因敲除突变体ΔPoxKu70。

本发明还保护采用以上任一所述方法制备得到的重组微生物。

所述重组微生物具体可为实施例中的ΔPOX04420-2，又称为草酸青霉(Penicillium oxalicum)ΔPOXO4420，已于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.12967。

本发明通过同源重组的方法敲除草酸青霉突变体ΔPoxKu70中的POX04420基因(将所有敲除POX04420基因的重组菌均命名为突变株ΔPOX04420)。突变株ΔPOX04420具有如下特点：

(1)在葡萄糖培养条件下，突变株ΔPOX04420能够正常生长。

(2)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX04420的滤纸酶活力、羧甲基纤维素酶活力、外切纤维素酶活力、木聚糖酶活力均显著降低。

(3)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX04420的β-葡萄糖苷酶活力显著升高。

(4)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX04420中纤维素酶基因和木聚糖酶基因的转录水平显著降低/升高。

(5)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX04420中已知关键纤维素酶基因和木聚糖酶基因的调控转录因子的编码基因的转录水平显著降低/升高。

本发明提供了一种草酸青霉的功能蛋白POX04420，通过实验证明POX04420在调控纤维素酶和木聚糖酶基因的表达过程中起关键性作用，在提高纤维素酶产量中具有应用潜力。

附图说明

图1为构建POX04420基因敲除盒的PCR产物电泳图。

图2为POX04420基因敲除盒的元件示意图。

图3为突变株ΔPOX04420的PCR验证电泳图。

图4为突变株ΔPOX04420的Southern杂交验证图。

图5为突变株ΔPoxKu70和ΔPOX04420-2在葡萄糖培养条件下的生物量检测结果。

图6为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的滤纸酶产量检测结果。

图7为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的羧甲基纤维素酶产量检测结果。

图8为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的外切纤维素酶产量检测结果。

图9为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的木聚糖酶产量检测结果。

图10为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的β-葡萄糖苷酶产量检测结果。

图11为突变株ΔPOX04420相对ΔPoxKu70在Avicel诱导条件下不同纤维素酶和木聚糖酶基因的RT-PCR检测结果。

图12为突变株ΔPOX04420相对ΔPoxKu70在Avicel诱导条件下已知转录因子PoxFlrD，PoxAmyR，PoxClrB和PoxBrlA编码基因的RT-PCR检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

质粒pCPXG418：参考文献：Chen，M.M.，Jiang M.G.，Shang，J.J.，Lan，X.W.，YangF.，Huang，J.K.，Nuss，D.L.，Chen，B.S.CYP1，a hypovirus-regulated cyclophilin，isrequired for virulence in the chestnut blight fungus[J].Mol Plant Pathol2011，12(3)：239-246；质粒pCPXG418在文献中的名称为“transformation vector pCPXG418”，公众可以从广西大学获得。

DNA纯化试剂盒：天根生化科技有限公司，货号：DP214。

溶菌酶：索莱宝公司，货号：L8120。

蜗牛酶：索莱宝公司，货号：S8280。

裂解酶：Sigma公司，货号：L1412-5G。

PDA培养基：BD公司，货号：5056836。

再生培养基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、琼脂17.0g，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌20分钟。

基本培养基：KH₂PO₄ 4.0g、(NH₄)₂SO₄ 4.0g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、CaCl₂ 0.6g、FeSO₄·7H₂O0.005g、MnSO₄ 0.0016g、ZnCl₂ 0.0017g、CoCl₂ 0.002g、Tween80 1.0g，蒸馏水定容至1L，pH5.5；115℃灭菌20分钟。

葡萄糖液体培养基：在基本培养基中加入葡萄糖，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。

Avicel液体诱导培养基：在基本培养基中加入微晶纤维素(Avicel)，Avicel在培养基中的终浓度为20g/L。

CM培养基：20×硝酸盐50mL、微量元素混合液1mL、葡萄糖10.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、酸水解酪蛋白1.0g，调pH至6.5；115℃灭菌20分钟。

20×硝酸盐：NaNO₃ 120g、KCl 10.4g、MgSO₄.7H₂O 10.4g、KH₂PO₄ 30.4g，蒸馏水定容至1L；高压灭菌后室温保存。

微量元素混合液：ZnSO₄.7H₂O 2.2g、H₃BO₃ 1.1g、MnCl₂.4H₂O 0.5g、FeSO₄.7H₂O0.5g、CoCl₂.6H₂O 0.17g、CuSO₄.5H₂O 0.16g、Na₂MoO₄.2H₂O 0.15g、Na₄EDTA 5.0g，蒸馏水定容至100mL。

酶解液：溶菌酶0.2g、蜗牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mL OM溶液中；28℃，180rpm震荡30分钟后离心，将上清液过滤除菌，得到酶解液。

OM溶液：MgSO₄.7H₂O 73.92g、NaH₂PO₄ 0.3g，溶于400mL去离子水；用1M Na₂HPO₄水溶液调节pH至5.8，蒸馏水定容至500mL。

Trapping buffer溶液：山梨醇36.4g、Tris 6.05g，溶于400mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至7.0，蒸馏水定容至500mL。

STC溶液：山梨醇91g、Tris 6g、CaCl₂ 5.55g，溶于400mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至8.0，蒸馏水定容至500mL。

PTC溶液：聚乙二醇3350 40g、Tris 3g、CaCl₂ 2.25g，溶于200mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至8.0，蒸馏水定容至250mL。

0.1％吐温80溶液：由吐温80和水组成，吐温80的体积百分含量为0.1％。

实施例1、草酸青霉中功能蛋白POX04420及其编码基因的发现

经过对草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株HP7-1的基因组及其在不同培养条件下的转录组进行大量分析和功能验证，发现了一个新蛋白及其编码基因。草酸青霉菌株HP7-1的基因组序列分析的文献如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，Xie S.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，Feng，J.X.Comparative genomic，transcriptomic andsecretomic profiling of Penicillium oxalicum HP7-1 and its cellulase andxylanase hyper-producing mutant EU2106，and identification of two novelregulatory genes of cellulase and xylanase gene expression[J].BiotechnolBiofuel 2016，9：203；草酸青霉菌株HP7-1在文献中的名称为“Penicilliumoxalicumstrain HP7-1”。草酸青霉菌株HP7-1保藏号为：CGMCC 10781，公众也可以从广西大学获得。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为POX04420，由302个氨基酸残基组成。将编码POX04420的基因命名为POX04420基因，POX04420基因的开放阅读框(ORF)如序列表的序列2所示。POX04420基因的基因组DNA如序列表的序列3所示。

实施例2、POX04420基因敲除盒的构建

1、提取草酸青霉菌株HP7-1的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物POX04420-L-F和引物POX04420-L-R组成的引物对进行PCR扩增，得到POX04420基因ORF上游的1998bpDNA片段(电泳结果见图1的泳道1)，称为POX04420左臂。

POX04420-L-F：5’-GCCAACATCAAAGTCCGATAACA-3’：

POX04420-L-R：5’-GGTAATCCTTCTTTCTAGATGTCGGACTAGATGCTTCGT-3’。

3、以质粒pCPXG418为模板，采用引物G418-F和引物G418-R组成的引物对进行PCR扩增，得到抗生素G418抗性基因的编码序列(1890bp)(电泳结果见图1的泳道2)。

G418-F：5’-TCTAGAAAGAAGGATTACC-3’：

G418-R：5’-GTCGACAGAAGATGATATT-3’。

4、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物POX04420-R-F和引物POX04420-R-R组成的引物对进行PCR扩增，得到POX04420基因ORF下游的2656bpDNA片段(电泳结果见图1的泳道3)，称为POX04420右臂。

POX04420-R-F：5’-AATATCATCTTCTGTCGACGACAACAAAAAACCCCCTTCA-3’；

POX04420-R-R：5’-CGATTCGTGCGTGATGTTGAG-3’。

5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的三个PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化，然后按照摩尔比1∶1∶1混合后，进行融合PCR扩增，得到PCR混合产物。

融合PCR反应条件：预变性98℃3min；98℃30s，58℃15s，72℃3min，一共进行30个循环反应；72℃10min。

6、以步骤5得到的PCR混合产物为模板，采用引物POX04420-N-F和引物POX04420-N-R组成的引物对进行PCR扩增，得到5572bp PCR产物(电泳结果见图1的泳道4)。

POX04420-N-F：5’-ATACAAACCAAACGAGAAAGTGAA-3’：

POX04420-N-R：5’-CGTCCTCGTTCCACTTGCG-3’。

经测序，得到的PCR产物如序列表的序列4所示。将序列表的序列4所示的DNA分子命名为POX04420基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-1533位核苷酸为POX04420左臂区段，第1534-3423位核苷酸为G418抗性基因区段，第3424-5572位核苷酸为POX04420右臂区段。

POX04420基因敲除盒的元件示意图见图2。

实际应用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。

实施例3、草酸青霉POX04420基因缺失突变株ΔPOX04420的构建与验证

1、以草酸青霉菌株HP7-1为出发菌，敲除其Ku70基因，得到草酸青霉突变体ΔPoxKu70。

记载草酸青霉突变体ΔPoxKu70，以及敲除Ku70基因的具体步骤的文献如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，Xie S.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，Feng，J.X.Comparative genomic，transcriptomic and secretomic profiling ofPenicillium oxalicum HP7-1 and its cellulase and xylanase hyper-producingmutant EU2106，and identification of two novel regulatory genes of cellulaseand xylanase gene expression[J].Biotechnol Biofuel 2016，9：203；草酸青霉突变体ΔPoxKu70在文献中的名称为“Penicilliumoxalicum mutantΔPoxKu70”。草酸青霉突变体ΔPoxKu70保藏号为：CGMCC 3.15650，公众也可从广西大学获得。

2、制备草酸青霉突变体ΔPoxKu70的原生质体

(1)将步骤1得到的草酸青霉突变体ΔPoxKu70接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

(2)取2mL步骤(1)的孢子悬浮液，接种至200mLCM培养基中，28℃、180rpm振荡培养8小时。

(3)完成步骤(2)后，4℃、3500rpm离心10min，弃上清，收集菌丝体沉淀，用0.6MMgSO₄·7H₂O水溶液洗涤2次，然后4℃、3500rpm离心15min，弃上清，收集菌丝体沉淀。

(4)取(3)得到的菌丝体，用50mL酶解液重悬，28℃、180rpm振荡反应2-3小时以进行酶解；用显微镜观察到大部分菌丝形成原生质体后，按每管12.5mL分装到50mL离心管中，加入2倍体积的Trapping buffer溶液，4℃、3500rpm离心30分钟，观察到明显的分层现象。

(5)用巴氏吸管小心地吸出步骤(4)中间层的原生质体至新的50mL离心管中，加入2倍体积1M山梨醇水溶液漂洗1次，4℃、3500rpm离心15分钟，再使用20mL STC溶液漂洗2次后离心，弃上清，得到原生质体。

3、草酸青霉突变株ΔPOX04420的构建及验证

(1)将4体积份的STC溶液和1体积份的PTC溶液混合，得到混合液，用混合液重悬步骤2得到的原生质体，得到原生质体溶液(调整浓度为1×10⁷个/mL)。

(2)用实施例2得到的POX04420基因敲除盒DNA转化ΔPoxKu70原生质体(方法参照文献：Churchill，A.C.L.，Ciuffetti，L.M.，Hansen，D.R.，Van Etten，H.D.，Van Alfen，N.K.Transformation of the fungal pathogen Cryphonectria parasitica with avariety of heterologous plasmids[J].CurrGenetics 1990，17：25-31)，具体步骤如下：

①将5μgPOX04420敲除盒DNA和5μL 100mM亚精胺溶液混合后加入到100μL步骤(1)制备的原生质体溶液中，混合均匀，冰上反应30分钟；

②反应结束后向溶液中加入1mLPTC溶液，混合均匀，室温放置25分钟；

③向混合液中加入1mL STC溶液混合均匀，将混合液加入到20mL预热的再生培养基中，混合均匀，将上述混合液倒入到无菌培养皿中(按每个培养皿分别倒入2-5mL)，室温放置1h，加入40mL含有G418(800μg/mL)与潮霉素(250μg/mL)的PDA培养基，覆盖在再生培养基的表面，完全凝固后28℃倒置培养5天。

④将步骤③的转化双层板的孢子用0.1％吐温80溶液冲洗，放入到新的离心管中，用无菌水梯度稀释孢子悬浮液，将每个稀释梯度的孢子悬浮液涂在两个含有G418(800μg/mL)与潮霉素(250μg/mL)的PDA平板上，28℃培养4天，挑选单菌落，随机选取三个候选突变株(Δ2、Δ6和Δ8)，提取各候选突变株基因组DNA，采用引物POX04420-L-F和左交叉验证引物-R、右交叉验证引物-F和引物POX04420-R-R、引物POX04420-F和引物POX04420-R进行PCR验证。

左交叉验证引物-R：5’-GCCCTGGGTTCGCAAAGATA-3’；

右交叉验证引物-F：5’-AATAATGTCCTCGTTCCTGTCTGC-3’。

POX04420-F：5’-TGCCCAAGTCATACAGTGAAACA-3’；

POX04420-R：5’-CGGAGAATGCCTTGCCACA-3’。

结果如图3所示。图3中，泳道M为1 kb DNA Marker，泳道1为Δ2的鉴定结果，泳道2为Δ6的鉴定结果，泳道3为Δ8的鉴定结果，泳道4为突变体ΔPoxKu70对照，泳道5为ddH₂O阴性对照。图3A为用引物POX04420-F和引物POX04420-R扩增得到的扩增产物；图3B为用引物POX04420-L-F和左交叉验证引物-R扩增得到的扩增产物；图3C为用右交叉验证引物-F和引物POX04420-R-R扩增得到的扩增产物。结果表明，Δ2、Δ6和Δ8不能扩增出POX04420基因片段，而突变体ΔPoxKu70可以扩增出876bp的POX04420基因片段(图3A)。同时，Δ2、Δ6和Δ8都扩增出2226bp的左臂DNA片段(图3B)和2862bp的右臂DNA片段(图3C)，而突变体ΔPoxKu70没有G418抗性基因的存在，不能扩增出左臂和右臂基因片段(图3B、图3C)。上述结果表明菌株Δ2、Δ6和Δ8中POX04420基因已被敲除。

⑤提取三个候选突变株(Δ2、Δ6和Δ8)和突变体ΔPoxKu70的基因组DNA，将基因组DNA用BamHI酶切后进行Southern杂交分析，结果如图4所示。图4中，泳道M为1 kb DNAMarker，泳道1为突变体ΔPoxKu70的对照，泳道2为Δ2的鉴定结果，泳道3为Δ6的鉴定结果，泳道4为Δ8的鉴定结果。结果表明，Δ2、Δ6和Δ8均得到大小为4886bp的杂交带，突变体ΔPoxKu70得到5765bp的杂交带，与预计结果一致，表明Δ2、Δ6和Δ8中POX04420基因已被敲除。

以上结果表明，将POX04420基因敲除盒导入草酸青霉突变体ΔPoxKu70得到的三个转化子(Δ2、Δ6和Δ8)均为POX04420基因被敲除的突变菌株，分别命名为ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8。将敲除POX04420基因的该3个突变菌株均命名为突变株ΔPOX04420。

实施例4、草酸青霉突变株ΔPOX04420在葡萄糖液体培养基中生物量的测定

待测菌株为：ΔPOX04420-2和ΔPoxKu70。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。

分别于培养的第12小时、第24小时、第36小时、第48小时、第60小时、第72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重，测定生物量(菌丝体干重)。

结果如图5所示。结果表明，ΔPOX04420-2在葡萄糖液体培养基中的生物量与ΔPoxKu70菌株的生物量无显著差异，表明菌株ΔPoxKu70中POX04420基因的敲除不影响草酸青霉的基本代谢，ΔPOX04420-2能利用葡萄糖正常生长。

实施例5、草酸青霉突变株ΔPOX04420纤维素酶和木聚糖酶活力的测定

待测菌株为：ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌体，用无菌水洗涤2-3次。

4、取步骤3得到的菌体(湿重为1g)，转接到100mL Avicel液体诱导培养基中，28℃、180rpm振荡培养4天。

分别于培养的第2天、第3天和第4天取样，8000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。

5、检测步骤4得到的粗酶液的如下各项酶活：滤纸酶活力、羧甲基纤维素酶活力(CMC酶活力)、外切纤维素酶活力(pNPC酶活力)、β-葡萄糖苷酶活力(pNPG酶活力)和木聚糖酶活力。检测方法参照文献：Ghose，T.K.Measurement of cellulase activities[J].Pureand Applied Chemistry 1959，(59)：257-268；Gokhale，D.V.，Puntambekar，U.S.，Deobagkar，D.N.，Peberby，J.F.Production of cellulolytic enzymes by mutants ofAspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme Microbial Technol 1988，10：442-445。

6.提取步骤4得到的菌体中的胞内蛋白。方法参照以下步骤：

①将步骤4得到菌体放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末。

②将步骤①得到的粉末转移到50mL离心管中，加入15mL蛋白提取液，再加入5g直径为0.25mm以及1g直径为3mm的玻璃珠。

③将步骤②的混合液在旋涡振荡器上振荡1min，再放置冰上30s。重复8-10次。

④将步骤③得到的混合液在7000rpm，4℃，离心20min，收集上清液，即为菌体胞内蛋白。胞内蛋白浓度检测方法参照文献：Zor，T.，Selinger，Z.Linearization of theBradford protein assay increase its sensitivity：theoretical andexperimentalstudies[J].Anal Biochem 1996，236：302-308。

草酸青霉菌株酶产量(U/g胞内蛋白)＝酶活力(U)/胞内蛋白(g)。

结果如图6-图10所示。与ΔPoxKu70相比，三株突变株(ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8)的滤纸酶产量、羧甲基纤维素酶产量、外切纤维素酶产量和木聚糖酶产量均显著降低(图6-图9)，说明POX04420为菌株生产滤纸酶、羧甲基纤维素酶、外切纤维素酶和木聚糖酶的正调控蛋白；相反，与ΔPoxKu70相比，三株突变株β-葡萄糖苷酶产量显著升高(图10)，说明POX04420为菌株生产β-葡萄糖苷酶的负调控蛋白。

实施例6、POX04420基因的缺失对草酸青霉纤维素酶基因和其它已知调控转录因子的编码基因转录水平的影响

待测菌株为：ΔPOX04420-2和ΔPoxKu70。

1、将待测菌株接种于无菌PDA培养基上，28℃恒温培养6天。

2、用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到1×10⁸个/mL。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将菌丝体转接至100mL Avicel液体诱导培养基，28℃、180rpm培养。分别收集、提取诱导培养第4小时、第12小时、第24小时、第48小时的待测菌株总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行定量RT-PCR检测，检测关键纤维素酶基因(2个CBH基因：POX05587和POX04786；7个EG基因：POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983和POX07535；3个BGL基因：POX06835、POX07963和POX08882)和木聚糖酶基因(3个XYN基因：POX05916、POX06783和POX08484)的表达情况。采用actin基因作为内参基因。

qRT-PCR检测引物如下所示(5’→3’)：

actin-F：CTCCATCCAGGCCGTTCTG；

actin-R：CATGAGGTAGTCGGTCAAGTCAC；

POX05587-F:GTACTTGCGATCCTGATGGG；

POX05587-R:CCACGGTGAAGGGAGACTTG；

POX04786-F:TACTACGCTTCCGAGGTTCAGAG；

POX04786-R:GTGTCCAGCCAAACGAAGG；

POX01166-F:CGATACTACGGCAACATCATCAC；

POX01166-R:AGGCACCAGTCCACGAGTTT；

POX07535-F:CGACTACTTGACCCAGCACCA；

POX07535-R:CTAGTACACGCTCGCAGACCA；

POX06983-F:GATCAACCACCAGGGTCTCAA；

POX06983-R:CAAACAACAGCCACGGAGTAAG；

POX06147-F:CACAATTACGCTCGCTGGAA；

POX06147-R:GGCTCGTTCATCACACCAAA；

POX02740-F:GTTCAGTTCCTGATGGAAAGATTG；

POX02740-R:CATAACCGCCTGCTTGAGTG；

POX04137-F:CGGCACTCTCGGCAAGGATTA；

POX04137-R:CATCAGGAAGGGGACACGGAA；

POX05571-F:AACCTGGAAGAACGGCACC；

POX05571-R:CCTTGTCACAGTCATCGGAGC；

POX06835-F:GTGCTGGATGGGAACAGGA；

POX06835-R:TACGAACGCCGAGAGGAGA；

POX07963-F:ATCTTTTATGTGCTCCTACAACCAG；

POX07963-R:GCCAGTCACTCATCACGAACC；

POX08882-F:TCCAGGAAGCCGAGAAGAACC；

POX08882-R:AGCACCGATGACACGAACGC；

POX08484-F:ACAAGCACACGCAGGTCAA；

POX08484-R:CGCTGAAGTGGTTGGCAGT；

POX06783-F:TGAGCCCAGGACCATCAACTT；

POX06783-R:TACCCTTGCTTTTGCCGCC；

POX05916-F:ATCGAGAATCAGGGCACAAAG；

POX05916-R:ATCCGCCAACGAAGGTGT。

结果如图11所示，其中差异表达量表示的是突变株ΔPOX04420-2中纤维素酶基因或木聚糖酶基因的转录水平减去ΔPoxKu70中同样基因的转录水平。结果表明，在Avicel诱导第4小时时，ΔPOX04420-2中1个EG基因(POX06983)和1个BGL基因(POX08882)的转录水平分别相对于ΔPoxKu70中该基因的转录水平显著上调82.22％和133.23％，2个XYN基因(POX08484和POX06783)和1个BGL基因(POX07963)的转录水平相对于ΔPoxKu70中这些基因的转录水平无显著差异，其它大部分纤维素酶基因显著下调，下调程度介于19.86％-96.69％之间。在Avicel诱导培养第12小时、第24小时和第48小时时，ΔPOX04420-2中除了2个BGL基因(POX07963和POX08882)的转录水平明显上调外，几乎所有纤维素酶基因与木聚糖酶基因均显著下调，下调程度介于21.99％-99.31％之间。

进一步继续检测调控转录因子PoxFlrD(无性繁殖调控因子)、PoxBrlA(无性繁殖调控因子)、PoxAmyR(淀粉酶基因转录调控因子)和PoxClrB(纤维素酶基因调控转录因子)的编码基因的相对表达水平。采用actin基因作为内参基因。

qRT-PCR检测引物如下所示(5’→3’)：

PoxFlrD-F:AACACATGCACTATCGCTCTCC；

PoxFlrD-R:CTTGCCCATCTCATTCACCA；

PoxBrlA-F:CCAGTTGCCTGTTTCGTCAG；

PoxBrlA-R:GGTAAGGGAATGTCGGGTGTT；

PoxAmyR-F:CATCGTGGAGGAGGTGAGTG；

PoxAmyR-R:CTGGCTTGGCTTGTTGGAG；

PoxClrB-F:CTTCCAGGCGTCTCTCGTTC；

PoxClrB-R:CGCTTGCTTCGTAAA。

结果如图12所示，其中差异表达量表示的是突变株ΔPOX04420-2中纤维素酶基因或木聚糖酶基因的转录水平减去ΔPoxKu70中同样基因的转录水平。结果表明，在Avicel为诱导碳源的培养条件下，相比ΔPoxKu70，ΔPOX04420-2中，PoxAmyR在诱导第24小时和第48小时时转录水平分别下调37.05％和69.50％，在诱导第4小时时，其转录水平均上调107.23％。此外，在Avicel为诱导第24小时和第48小时时，PoxClrB的转录水平和ΔPoxKu70相比分别下调32.87％和83.47％，PoxFlrD和PoxBrlA的转录水平均显著上调，上调程度介于40.26％-2796.18％之间。

以上结果表明，POX04420在Avicel诱导培养条件下，对草酸青霉关键纤维素酶基因与木聚糖酶基因的表达，以及已知重要的纤维素酶基因和木聚糖酶基因的调控转录因子的编码基因的表达起关键调控作用。

将上述实施例中的ΔPOX04420-2，又称为草酸青霉(Penicillium oxalicum)ΔPOXO4420，于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.12967。

<110> 广西大学

<120> 功能蛋白POX04420及其编码基因与应用

<160> 4

<210> 1

<211> 302

<212> PRT

<213> 草酸青霉

<400> 1

Met Asp Leu Ala Ser Leu Ile His Gly Ala Ala Pro Val Pro Lys Ser

1 5 10 15

Tyr Ser Glu Thr Tyr Gly Lys Arg Ser Arg Gln Ala Pro Leu Ser Pro

20 25 30

Pro Ala Glu Glu Arg Pro Lys Cys Ala Leu Pro Ser Ile Ser Ser Leu

35 40 45

Leu Glu Gly Ala Asn Glu Ala Gln His Ser Ala Lys Arg Gln Arg Leu

50 55 60

Ser Ser Pro Ile Ser Lys Arg Asp Ala Arg Tyr Asp Thr Ile Cys Leu

65 70 75 80

Pro Pro Thr Pro Pro Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg His

85 90 95

Gly Ser Ala Val His Ser Pro Val Glu Met Ser Ser Pro Arg His Pro

100 105 110

Ser Pro His Ala His Arg Ser Ser Val Ser Ser Asn Gly Ser Ser Ile

115 120 125

Gly Ser Gln Ser His His Ala Leu Pro Gln Asn Tyr Ser His Gly Pro

130 135 140

Tyr Ala Ser Pro Ala Pro Ser Val Ser Ser Thr Ser Ser His Ser Ser

145 150 155 160

Tyr Thr Ser Pro Val Glu Ala Thr His Pro Ser Thr Ser Pro Leu Tyr

165 170 175

Tyr Ser Arg Pro Pro Pro Val Ile Asn Thr Asn Thr Pro Ala Ser Thr

180 185 190

Pro Pro Ala His Pro Val Ser Ala Gln Asn Ala Ser Gly Leu Ile Ser

195 200 205

Pro Val Thr Pro Ala Trp Pro His Gln His His His Tyr Phe Pro Pro

210 215 220

Thr Ser Ala Ala Pro Tyr Gln Gln Asn His Asp Arg Tyr Ile Cys Arg

225 230 235 240

Thr Cys His Lys Ala Phe Ser Arg Pro Ser Ser Leu Arg Ile His Ser

245 250 255

His Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Phe His Cys Thr His Pro Gly Cys

260 265 270

Gly Lys Ala Phe Ser Val Arg Ser Asn Met Lys Arg His Glu Arg Gly

275 280 285

Cys His Ser Gly Arg Pro Ala Ala Leu Gln Ala Met Val Ser

290 295 300

<210> 2

<211> 909

<212> DNA

<213> 草酸青霉

<400> 2

atggatttgg ccagcctgat tcacggtgcc gctccggtgc ccaagtcata cagtgaaaca 60

tatggcaagc gatcacgaca agcacctctt tcaccacctg ccgaggaacg tccgaaatgc 120

gccttgccct ccatctcatc attgctcgaa ggagccaacg aagctcagca ctcagccaaa 180

cggcaacgcc tgagctcccc gatctcaaag cgtgatgctc gctacgatac catctgtctg 240

cctcccactc cacctctccg gcctggttca ggctcgggct ctcgccatgg tagtgcggtc 300

cactcgcccg tggagatgag ctctcccaga catccttcac cacatgcgca ccgctcgtcg 360

gtctccagca acggcagctc gatcggctct caatcacacc atgctctccc tcaaaattac 420

tcgcatggtc cctacgcatc tcccgctccc agcgtctctt ccacctcttc tcactcctcc 480

tacacctcgc ctgtagaagc cacccaccct tccacctcgc cactttacta ctcgcgtcct 540

ccacctgtca tcaacacgaa tactcccgcc tccacaccac ccgctcaccc cgtcagcgcc 600

cagaatgctt cgggcttgat ctcccccgtg actcctgcgt ggcctcatca acatcaccac 660

tacttccctc ccaccagtgc tgcgccttat cagcagaatc atgaccgata tatctgccgc 720

acctgtcaca aggccttctc tcggccttcc agcctgcgca tccactccca ctcccacacc 780

ggcgagaagc cattccactg cacacatccc ggctgtggca aggcattctc cgtgcgcagc 840

aacatgaaac gccatgagcg aggctgccac tcgggacgcc ctgcagctct gcaggccatg 900

gtctcttaa 909

<210> 3

<211> 990

<212> DNA

<213> 草酸青霉

<400> 3

atggatttgg ccagcctgat tcacggtgcc gctccggtgc ccaagtcata cagtgaaaca 60

tatggcaagc gatcacgaca agcacctctt tcaccacctg ccgaggaacg tccgaaatgc 120

gccttgccct ccatctcatc attgctcgaa ggagccaacg aagctcagca ctcagccagt 180

gagtcctcct tgttacacac tctctacccc ctcccattct cacctcgact tgagttctga 240

tcactgacca ttcaaccaga acggcaacgc ctgagctccc cgatctcaaa gcgtgatgct 300

cgctacgata ccatctgtct gcctcccact ccacctctcc ggcctggttc aggctcgggc 360

tctcgccatg gtagtgcggt ccactcgccc gtggagatga gctctcccag acatccttca 420

ccacatgcgc accgctcgtc ggtctccagc aacggcagct cgatcggctc tcaatcacac 480

catgctctcc ctcaaaatta ctcgcatggt ccctacgcat ctcccgctcc cagcgtctct 540

tccacctctt ctcactcctc ctacacctcg cctgtagaag ccacccaccc ttccacctcg 600

ccactttact actcgcgtcc tccacctgtc atcaacacga atactcccgc ctccacacca 660

cccgctcacc ccgtcagcgc ccagaatgct tcgggcttga tctcccccgt gactcctgcg 720

tggcctcatc aacatcacca ctacttccct cccaccagtg ctgcgcctta tcagcagaat 780

catgaccgat atatctgccg cacctgtcac aaggccttct ctcggccttc cagcctgcgc 840

atccactccc actcccacac cggcgagaag ccattccact gcacacatcc cggctgtggc 900

aaggcattct ccgtgcgcag caacatgaaa cgccatgagc gaggctgcca ctcgggacgc 960

cctgcagctc tgcaggccat ggtctcttaa 990

<210> 4

<211> 5572

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atacaaacca aacgagaaag tgaaataaaa ggaaaatacc caatgtggcc caccacccga 60

gagactgact cgaagtataa taacgctcat ggttgaaacc ttccactccc cagtagacca 120

ctaatcaaaa taagctttgg gccggactgt ctcacctcag agttgagagc acattgcaag 180

tcaagtacgc tcccgggcaa gcagtcatcg atgtgaatgc cctttctttt tttttttgtt 240

actttttttt tttttcgatt tccgtttcat tttgggagaa gattatgccc ttttgcttga 300

tttcagcctt tgggaccctt gtagaattga cgccggatgg atcgctcgat cgaatgattg 360

aggtctggat gcactgctgg acacccagct catcagccgg actggttctg agcctcgact 420

aggcagagat gggggaacca ctcaattttt gaaaaacgct cgacccaagg tgtgcgagtt 480

gggagttggc ccaagacgta tgtgctcttc ctgtgagctg cgcagaaaag accgcaatca 540

tgaccggtgt ctcgaactat cacggagaca tgtttgcaca cagaatgttt cacgatccac 600

acaatgggac tgctcggtac cgtcctggat tcaacctacc ggcaaagcga agagaaaagg 660

gaaagatgag cgcgaaaggc atgaatcaaa ggagtcgagt gggggagaaa taaaaaaaag 720

aaatccagaa tccccaaatc agctctcctt cctataccag ggctttgtcg aaaagcggag 780

gggggcttaa ccggcatcgc ccgcgggcga tcatccacgc gaaaacccag ccatctgggc 840

atggacgagg gagggcaatg gtgcagtttg gaacggtgac atggggtgga ggggggggga 900

ggactaacca agctgtgagc acagagccct gactatcgta tcaataatca tttaatcatc 960

aaatggaatt gggggcgata ctttggaaaa tgatcaaaaa ggataaaaaa tcaaaatatt 1020

ctgtcctttt tttttcgttg agataggggt gggggggggg gaagaggagg aaatgggtat 1080

agaaaaaatc gaattaatgg aaattccgga aagaatcatt atgaaataat accacaagac 1140

tggaagaagt ggatcacgga ggtggacgtg gacgtggacg tggatgtggt ggaagtggat 1200

acgctggtgg ccactgatgc tcggcgggtg ggttgtccct ggttctggga ccgaccgtag 1260

tcgcctcaga tcgtctggag tcgcttccac tctggcgcct cccccggtgg acgatgaaga 1320

atgtataaac cccctcgtgt ctccccctca tgtgcgttca tgtggaaatt cgtcgatttc 1380

aaactccttt tcatcccacc ttccacctct cacaactctc cccttcccac accttatcgg 1440

tcgtgactaa atctcacgtc ccaattgtat cactcgacga cactgattcc acacaattca 1500

acgatcccaa cggacgaagc atctagtccg acatctagaa agaaggatta cctctaaaca 1560

agtgtacctg tgcattctgg gtaaacgact cataggagag ttgtaaaaaa gtttcggccg 1620

gcgtattggg tgttacggag cattcactag gcaaccatgg ttactattgt ataccatctt 1680

agtaggaatg atttcgaggt ttatacctac gatgaatgtg tgtcctgtag gcttgagagt 1740

tcaaggaaga aacatgcaat tatctttgcg aacccagggc tggtgacgga attttcatag 1800

tcaagctatc agagtaaaga agaggagcat gtcaaagtac aattagagac aaatatatag 1860

tcgcgtggag ccaagagcgg attcctcagt ctcgtaggtc tcttgacgac cgttgatctg 1920

cttgatctcg tctcccgaaa atgaaaatag ctctgctaag ctattcttct cttcgccgga 1980

gcctgaaggc gttactaggt tgcagtcaat gcattaatgc attgcagatg agctgtatct 2040

ggaagaggta aacccgaaaa cgcgttttat tcttgttgac atggagctat taaatcacta 2100

gaaggcactc tttgctgctt ggacaaatga acgtatctta tcgagatcct gaacaccatt 2160

tgtctcaact ccggagctga catcgacacc aacgatctta tatccagatt cgtcaagctg 2220

tttgatgatt tcagtaacgt taagtggatg gatccatcta ctctagaaga actcgtcaag 2280

aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa 2340

gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc 2400

ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt 2460

ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc 2520

gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc 2580

gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg 2640

atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat 2700

tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg 2760

ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac 2820

agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag 2880

ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga 2940

cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa 3000

tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatatc 3060

gatgcttcgg tagaataggt aagtcagatt gaatctgaaa taaagggagg aagggcgaac 3120

ttaagaaggt atgaccgggt cgttcactta ccttgcttga caaacgcaca agttatcgtg 3180

caccaagcag cagatgataa taatgtcctc gttcctgtct gctaataaga gtcacacttc 3240

gagcgccgcc gctactgctt acaagtgggc tgatctgacc agttgcctaa atgaaccatc 3300

ttgtcaaacg acacaaattt tgtgatccgc ctggacgact aaaccaaaat agcattgatg 3360

tgttgacctc cactagctcc agccaagccc aaaaatgctc cttcaatatc atcttctgtc 3420

gacgacaaca aaaaaccccc ttcaaaaaaa aacacaaacc attctcatca caggaaatgt 3480

tatgtattga acggatctct tttgtcatct ttttcctttt ttttcccttt ctcctttttc 3540

tggtcagacc tgggcttgct ttgccaactc ggtggatgct gatggcattt tggttacctt 3600

gataccctga atatgtacga ttttttgtgg ctttgcactt tcttttgttc attattatgc 3660

ctttcccccc catgccgggg gaacctggcg gtggatatat ttagatcggc cgtgcaagcc 3720

acgcaaagag acttgaatat aacgaaataa cggactctga tcaatttttt ttcttcacca 3780

gtaattaact aaatagatca ttaacctttt gcactgtatg tctgatgggt ccatcctatt 3840

cagccagttt atgatgcccc ttccaggtga gtggtcccgc cccagtcgcc atcacctatg 3900

atatcgtcga ccatatcact gctctgttta actgttctgg agaatcccat cgatctctcg 3960

aggagtacaa ggttttgaat tgaattcaat cggtctctgg gtgaagacaa aaaaggagcc 4020

agaaccttgg atccagacgg tcgtcgactg gataagctaa attccgcctt cagcatacct 4080

ggctcgccct cagttcaatc ttcgcgaatc aacaaatgta cgaattgatt tttcattccc 4140

tagatttttg ggggaaaaaa attgggtgta ccgacacccg catcatctcg atagattcga 4200

agatcaaaaa aaagtcaagt gtcttttgac tttctctcga gcgaagcgaa acttgaaacg 4260

ttttgtctac cgatatttga ctttacccgt accaacatcg actcctgtgg atcgaaacca 4320

cgatccgcga gcttgcctat gggaaccttc gtgaagattc ccaaagataa gtcttgagca 4380

tgccccgacc acaacagaga gccaggcgta tgttttgttt ttctgaaggg gggccttttg 4440

acttggaaaa attgtcgagt cgccggcatc tttctccata ttacgatgtc gtttgtacag 4500

cgcccatgct tattccaaga atcatcaaag agctccatac tcgattaagt tcccaatgtc 4560

ttaaaaagaa ccacacacac acacactctc tctctcggaa aaatctcgga aaaattgcaa 4620

tctctctgaa ctcctcctgt cgctccaaaa ctggagggat caggtctaac caagttacta 4680

gatttggaag ctggtgatct atcgatgaaa ttgctacagt gcagcacacg tacattgatg 4740

atcctgtgtt tcaatggacg tgctgtatgt caggtgcccg tcccacttca gacaagttcg 4800

agttcgagcc cgagacccag ttctccgagg aggggagatc acacgggttc cacactccgt 4860

tctttttttt aggggggggg ggttcctttt ctttttgtgg gggcttgaga aaatcacttg 4920

tatgggattg gggcttgaga gaatcacttg tatgggattg gggctgatca aatcaagatg 4980

gatgggacac agggcgcgcg atctgcaaaa ttgatgtgca cacacaaccg agtcgatgat 5040

agatggaata tagaattgat tgtaggtgta atatttgaac ttcatctcag tatatgtatg 5100

gagttcataa gtacccgaat acaaggttgg aagtatgtac cgccctctaa aagtcggagg 5160

aggcggcttg gaacggaagc accttctatt ttcgtattga catcaacgat ccctgcgttg 5220

gcttacaacg gggagctttg gaattaaatt tggatgagaa cgacatagat gtgctcctgc 5280

tccacatcag agttcgtctc ggttcaagct acctgtacat gaattcagta gaatggctct 5340

tgtatcgtac acgcagtgtg cacggtttgt acgtatttat ctggggtgtt acagtgtaca 5400

gtgtgctcaa gttggattgc cgaggcaatt tgattgatgg agaaataaaa aatgggctga 5460

cgcttgacga tcttccagtt tggtaaatcc tggtctccac atgaagattc gaaacgaacc 5520

actgtgacaa tgttttcaac gggagagttt catcgcaagt ggaacgagga cg 5572

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（1）或（2）所述的DNA分子：

（1）编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）序列表的序列3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因的应用，为如下（b1）-（b14）中的至少一种：

（b1）调控微生物纤维素酶产量；

（b2）调控微生物半纤维素酶产量；

（b3）调控微生物羧甲基纤维素酶产量；

（b4）调控微生物外切纤维素酶产量；

（b5）调控微生物木聚糖酶产量；

（b6）调控微生物β-葡萄糖苷酶产量；

（b7）调控微生物纤维素酶基因的表达量；

（b8）调控微生物半纤维素酶基因的表达量；

（b9）调控微生物内切-1,4-β-D-葡聚糖酶基因的表达量；

（b10）调控微生物纤维二糖水解酶基因的表达量；

（b11）调控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表达量；

（b12）调控微生物木聚糖酶基因的表达量；

（b13）调控微生物纤维素酶基因的调控转录因子编码基因的表达量；

（b14）调控微生物木聚糖酶基因的调控转录因子编码基因的表达量。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述（b1）-（b5）中，所述调控为正向调控；所述（b6）中，所述调控为负向调控。

7.一种抑制微生物生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力的方法，包括如下步骤：抑制所述微生物中权利要求2或3所述基因的表达，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力降低的微生物。

8.一种抑制微生物生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力的方法，包括如下步骤：降低权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力降低的微生物。

9.一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制权利要求2或3所述基因表达的物质导入出发微生物，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力低于所述出发微生物的重组微生物。

10.采用权利要求9所述的方法制备得到的重组微生物。