CN109134627B - 功能蛋白tp06128及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种功能蛋白TP06128及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自嗜松蓝状菌，命名为TP06128蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。编码所述TP06128蛋白的基因(TP06128基因)也属于本发明的保护范围。本发明提供了一种嗜松蓝状菌的功能蛋白TP06128，通过实验证明功能蛋白TP06128在调控淀粉酶基因和纤维素酶基因的表达过程中起关键性作用。

Description

功能蛋白TP06128及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及微生物遗传领域，具体涉及一种功能蛋白TP06128及其编码基因与应用。

背景技术

能源是社会经济发展的重要因素，促进经济增长。化石燃料，尤其是石油和天然气，在一定程度上是有限的，并且大量化石燃料的使用对环境、人类的健康造成严重的危害。生物燃料乙醇具有对环境友好，可再生等优点，成为未来能源发展的主流。

丝状真菌可以将木质纤维素类及淀粉类物质转化为微生物可发酵的糖,进一步通过工业发酵生产可增值的生物液体燃料和生物基化学品。木质纤维素类物质是世界上含量最多,分布最广泛的可再生生物资源(Kuhad RC et al.Microorganisms and enzymesinvolved in the degradation of plant fiber cell walls[M].Biotechnology in thepulp and paper industry.Springer Berlin Heidelberg 1997,45-125),一直被认为是最合适的解决能源危机的原料。目前，我国主要通过玉米陈化粮和木薯淀粉为原料生产燃料乙醇，中国是木薯淀粉的生产大国，在木薯淀粉生产燃料乙醇上占有绝对优势。目前，在燃料乙醇生产过程中面临的主要问题是丝状真菌中生物质降解酶的产量低、成本高。基于对淀粉酶及纤维素酶生产的调控机理的研究，通过遗传工程技术提高丝状真菌的生物质降解酶的产量具有重大意义和应用价值。

淀粉酶是降解淀粉的酶的统称，按照对淀粉的降解方式不同分为4类：α-淀粉酶(α-amylase,EC3.2.1.1)、淀粉糖化酶(glucoamylase,EC3.2.1.3)、脱支酶和转移酶。其中α- 淀粉酶和淀粉糖化酶在淀粉水解过程中发挥主要作用。α-淀粉酶随机切断淀粉内部的α-1,4-糖苷键，形成不同长度的寡糖；淀粉糖化酶从淀粉的非还原端开始往里切割，每次切下1个葡萄糖分子(van der Maarel MJEC et al.Properties and applicationsofstarch-converting enzymes of the alpha-amylase family[J].Journal ofBiotechnology 2002,94(2):137-155)。

纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，包括内切葡聚糖酶 (endo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91)，β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)。内切葡聚糖酶在纤维素多糖链内部随机切割，产生长度不等的纤维素多糖链及其还原性末端。外切葡聚糖酶作用于纤维素多糖链的还原性或非还原性末端，产生纤维寡糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维寡糖和纤维二糖，产生葡萄糖。这三种酶通过协同作用将纤维素水解成葡萄糖(Wang JP et al.Direct insitu observation of synergism between cellulolytic enzymes during thebiodegradation ofcrystalline cellulose fibers[J]. Langmuir 2013,29:14997-15005)。

目前，对淀粉酶基因和纤维素酶基因的表达调控研究不多，且主要集中在曲霉、木霉和青霉。因此，鉴定嗜松蓝状菌(Talaromyces pinophilus)中淀粉酶和纤维素酶基因的新的关键调控因子具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种功能蛋白TP06128及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，获自嗜松蓝状菌(Talaromyces pinophilus)，命名为TP06128蛋白，是如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

序列1由658个氨基酸残基组成，自N端的第240-317位氨基酸残基为RFX-DNA结合功能域，该功能域与DNA结合有关。

为了使(a1)中的TP06128蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a2)中的TP06128蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的TP06128蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述TP06128蛋白的基因(TP06128基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)序列表的序列3所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码所述TP06128蛋白的 DNA分子；

(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述TP06128 蛋白的DNA分子。

序列表中序列2是TP06128基因的cDNA序列，由2586个碱基组成。

序列表中序列3是TP06128基因的DNA核苷酸序列，自5′端的第47-102位为TP06128基因的第一个内含子，第796-852位为TP06128基因的第二个内含子，第1172-1227位为TP06128基因的第三个内含子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述TP06128基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述TP06128蛋白或TP06128基因的应用，为如下(b1)-(b13)中的至少一种：

(b1)调控微生物淀粉酶产量；

(b2)调控微生物纤维素酶产量；

(b3)调控微生物羧甲基纤维素酶产量；

(b4)调控微生物外切纤维素酶产量；

(b5)调控微生物β-葡萄糖苷酶产量；

(b6)调控微生物淀粉酶基因的表达量；

(b7)调控微生物α-淀粉酶基因的表达量；

(b8)调控微生物淀粉糖化酶基因的表达量；

(b9)调控微生物α-葡萄糖苷酶基因的表达量；

(b10)调控微生物纤维素酶基因的表达量；

(b11)调控微生物内切-1,4-β-D-葡聚糖酶基因的表达量；

(b12)调控微生物纤维二糖水解酶基因的表达量；

(b13)调控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表达量。

所述(b1)-(b5)中，所述调控为正向调控。

所述淀粉酶基因具体可为TP04013、TP04014、TP09288、TP09267、TP00293、TP01354或TP05120。

所述α-淀粉酶基因具体可为TP04014或TP09288。

所述淀粉糖化酶基因具体可为TP09267。

所述α-葡萄糖苷酶基因具体可为TP00293、TP04013、TP01354或TP05120。

所述纤维素酶基因具体可为TP05820、TP08514或TP09412。

所述纤维二糖水解酶基因具体可为TP09412。

所述内切-1,4-β-D-葡聚糖酶基因具体可为TP08514。

所述β-葡萄糖苷酶基因具体可为TP05820。

本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力的方法，包括如下步骤：抑制所述微生物中TP06128基因的表达，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力降低的微生物。

本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力的方法，包括如下步骤：降低TP06128蛋白的表达量和/或活性，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力降低的微生物。

所述“抑制所述微生物中TP06128基因的表达”是通过向所述微生物中导入TP06128基因敲除盒实现的。

本发明还保护一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制TP06128基因表达的物质导入出发微生物，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力低于所述出发微生物的重组微生物。

所述抑制TP06128基因表达的物质具体可为TP06128基因敲除盒。

所述抑制TP06128基因表达的物质还可为干扰载体；所述干扰载体为含有TP06128基因敲除盒的重组载体。

以上任一所述TP06128基因敲除盒具体为序列表的序列4所示的DNA分子。

以上任一所述微生物或所述出发微生物可为蓝状菌属，具体可为嗜松蓝状菌，更具体可为嗜松蓝状菌1-95。

以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为以嗜松蓝状菌1-95为出发菌，敲除其 TpKu70基因得到的重组菌。

以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70。

本发明还保护采用以上任一所述方法制备得到的重组微生物。

本发明通过同源重组的方法敲除嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70中TP06128基因(将所有敲除TP06128基因的重组菌均命名为突变株ΔTP06128)。突变株ΔTP06128具有如下特点：

(1)在葡萄糖培养条件下，突变株ΔTP06128能够正常生长。

(2)在淀粉诱导培养条件下，突变株ΔTP06128生长受到抑制。

(3)在淀粉诱导培养条件下，相对于出发菌株ΔTpKu70，突变株ΔTP06128的淀粉酶产量显著下降。

(4)在麦麸加Avicel诱导培养条件下，相对于出发菌株ΔTpKu70，突变株ΔTP06128的滤纸酶产量、羧甲基纤维素酶产量、pNPG酶产量和pNPC酶产量均显著下降。

(5)在淀粉诱导培养条件下，相对于出发菌株ΔTpKu70，突变株ΔTP06128中淀粉酶基因的转录水平显著降低/升高。

(6)在麦麸加Avicel诱导培养条件下，相对于出发菌株ΔTpKu70，突变株ΔTP06128中纤维素酶基因的转录水平显著降低/升高。

本发明提供了一种嗜松蓝状菌的功能蛋白TP06128，通过实验证明功能蛋白TP06128在调控淀粉酶基因和纤维素酶基因的表达过程中起关键性作用，在提高淀粉酶产量和纤维素酶产量中具有应用潜力。

附图说明

图1为构建TP06128基因敲除盒的PCR产物电泳图。

图2为TP06128基因敲除盒的元件示意图。

图3为突变株ΔTP06128的PCR验证电泳图。

图4为突变株ΔTP06128的Southern杂交验证图。

图5为基因TP06128回补表达盒的元件示意图。

图6为回补株CTP06128的PCR验证电泳图。

图7为突变株ΔTpKu70和ΔTP06128在葡萄糖培养条件下的生物量检测结果。

图8为突变株ΔTpKu70和ΔTP06128在可溶性玉米淀粉培养条件下的生物量检测结果。

图9为突变株ΔTpKu70,ΔTP06128和CTP06128的淀粉酶产量检测结果。

图10为突变株ΔTpKu70,ΔTP06128和CTP06128的滤纸酶产量检测结果。

图11为突变株ΔTpKu70,ΔTP06128和CTP06128的羧甲基纤维素酶活力检测结果。

图12为突变株ΔTpKu70,ΔTP06128和CTP06128的外切葡聚糖酶活力检测结果。

图13为突变株ΔTpKu70,ΔTP06128和CTP06128的β-葡萄糖苷酶活力检测结果。

图14为ΔTP06128相对ΔTpKu70在淀粉诱导条件下淀粉酶基因的RT-qPCR检测结果。

图15为ΔTP06128相对ΔTpKu70在麦麸加Avicel诱导条件下纤维素酶基因的RT-qPCR检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

嗜松蓝状菌(Talaromyces pinophilus)菌株1-95：参考文献：Xian L,etal.Purification and characterization of a highly efficient calcium-independentα-amylase from Talaromyces pinophilus 1-95[J].Plos One,2015,10(3):e0121531.；公众可以从广西大学获得。

质粒pLPMBn：参考文献:Zhang T,Zhao S,Liao L S,et al.Deletion ofTpKu70facilitates gene targeting in Talaromyces pinophilus and identificationof TpAmyR involvement in amylase production[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2017,33(9):171.公众可以从广西大学获得。

质粒pPICZ.A：Invitrogen,http://www.biofeng.com/zaiti/jiaomu/pPICZA.html。

DNA纯化试剂盒：天根生化科技有限公司，货号：DP214。

溶菌酶：索莱宝公司，货号：L8120。

蜗牛酶：索莱宝公司，货号：S8280。

裂解酶：Sigma公司，货号：L1412-5G。

PDA培养基：BD公司，货号：5056836。

再生培养基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、琼脂17.0g，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌20分钟。

基本培养基：KH₂PO₄4.0g、(NH₄)₂SO₄4.0g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、CaCl₂0.6g、FeSO₄·7H₂O 0.005g、MnSO₄0.0016g、ZnCl₂0.0017g、CoCl₂0.002g、Tween801.0g，蒸馏水定容至1L，pH5.5； 115℃灭菌20分钟。

葡萄糖液体培养基：在基本培养基中加入葡萄糖，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。

可溶性淀粉液体培养基：5g蛋白胨、3g KH₂PO₄、2.5g(NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.13g CaCl₂、0.0255g FeSO₄·7H₂O、玉米可溶性淀粉10g，蒸馏水定容至1L，pH5.0。

麦麸加Avicel液体诱导培养基：5g蛋白胨、3g KH₂PO₄、2.5g(NH₄)₂SO₄、0.2gMgSO₄·7H₂O、0.13g CaCl₂、0.0255g FeSO₄·7H₂O、麦麸10g、Avicel 10g，蒸馏水定容至 1L，pH 5.0。

CM培养基：20×硝酸盐50mL、微量元素混合液1mL、葡萄糖10.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、酸水解酪蛋白1.0g，调pH至6.5；115℃灭菌20分钟。

20×硝酸盐：NaNO₃120g、KCl 10.4g、MgSO₄·7H₂O 10.4g、KH₂PO₄30.4g，蒸馏水定容至1L；高压灭菌后室温保存。

微量元素混合液：ZnSO₄·7H₂O 2.2g、H₃BO₃1.1g、MnCl₂·4H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O0.5g、 CoCl₂·6H₂O 0.17g、CuSO₄·5H₂O 0.16g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.15g、Na₄EDTA5.0g，蒸馏水定容至 100mL。

酶解液：溶菌酶0.2g、蜗牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mL OM溶液中；28℃，180rpm震荡30分钟后离心，将上清液过滤除菌，得到酶解液。

OM溶液：MgSO₄·7H₂O 73.92g、NaH₂PO₄0.3g，溶于400mL去离子水；用1M Na₂HPO₄水溶液调节pH至5.8，蒸馏水定容至500mL。

Trapping buffer溶液:山梨醇36.4g、Tris 6.05g，溶于400mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至7.0，蒸馏水定容至500mL。

STC溶液：山梨醇91g、Tris 6g、CaCl₂5.55g，溶于400mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至8.0，蒸馏水定容至500mL。

PTC溶液：聚乙二醇335040g、Tris 3g、CaCl₂2.25g，溶于200mL去离子水中，用稀HCl 溶液调节pH至8.0，蒸馏水定容至250mL。

0.1％吐温80溶液:由吐温80和水组成，吐温80的体积百分含量为0.1％。

蛋白提取液：10mLPBS缓冲液中含有5mM EDTA和5mM PMSF、1个cOmplete ULTRAprotease inhibitor cocktail tablet(Roche,Cat.No.05892791001),pH 7.4。

Southern杂交验证使用罗氏(Roche)公司的DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II试剂盒，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。所使用的试剂配置方法如下：

脱嘌呤液：取11～15mL浓盐酸加ddH₂O定容至1L(0.125M HCl)。

变性液：称取NaOH 20g，NaCl 87.66g，定容至1L。

中和液：称取Tris-base 60.5g，NaCl 87.66g，加ddH₂O至900mL，再用6M HCl调pH至7.5，补水至1L。

柠檬酸钠缓冲液20×SSC：称量NaCl 175.32g，C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 88.23g，加ddH₂O至900 mL，再用浓盐酸调pH至7～8之间，定容至1L。

20％SDS：20g SDS，定容至100mL。

10M NaOH：20gNaOH，定容至50mL。

洗膜液I：取10mL 20×SSC，0.5mL 20％SDS，定容至100mL，现配现用，常温放置。

洗膜液II：取2.5mL 20×SSC，0.5mL 20％SDS，定容至100mL，现配现用，需放在杂交炉中预热30min以上。

马来酸缓冲液：称量NaCl 8.775g，C₄H₄O₄11.607g，定容至900mL，再用10M NaOH 调pH至7.5，补水至1L。

洗脱缓冲液(Washingbuffer)：在马来酸缓冲液中加入终浓度为0.3％吐温-20。

封闭缓冲液(Blocking buffer)：使用马来酸缓冲液将10×封闭缓冲液母液稀释成1×封闭缓冲液工作液。

抗体溶液(Antibody solution)：20mL封闭缓冲液加1.5μL的抗体4-Anti-Digoxigenin-Ap。

检测缓冲液(Detection buffer)：称量NaCl 0.585g，Tris-base 1.21g，定容至90mL，再用稀盐酸调pH至9.5，补水至100mL。

实施例1、嗜松蓝状菌功能蛋白TP06128及其编码基因的发现

通过对嗜松蓝状菌(Talaromyces pinophilus)1-95的基因组及其在不同碳源培养条件下的转录组进行大量的分析和功能验证，发现了一个新蛋白TP06128及其编码基因。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为TP06128，由861个氨基酸残基组成。将编码TP06128的基因命名为TP06128基因，TP06128基因的开放阅读框(ORF)如序列表的序列 2所示。TP06128基因的基因组DNA如序列表的序列3所示。

实施例2、嗜松蓝状菌TP06128基因敲除盒的构建

1.提取嗜松蓝状菌1-95的基因组DNA。

2.以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物TP06128_left-arm-F和引物TP06128_left-arm-R组成的引物对进行PCR扩增，得到TP06128基因ORF上游的1956bp片段(电泳结果见图1的泳道3)，称为TP06128左臂。

TP06128_left-arm-F：5’-TCGTGTCATCTTCCAGGGTT-3’；

TP06128_left-arm-R：5’-GTCCCTGGAAAATCAACTACTCCATTCCAGAGGTCGAGTG AGTA-3’。

3.以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物TP06128_right-arm-F和引物TP06128_right-arm-R组成的引物对进行PCR扩增，得到TP06128基因ORF下游的2661bp 片段(电泳结果见图1的泳道1)，称为TP06128右臂。

TP06128_right-arm-F：5’-GATCCCCCGGGGATCCACAACTATCTGTTTGAATATTT GAG-3’；

TP06128_right-arm-R：5’-CCAAGAAGCGAAACAGC-3’。

4.以含有苯菌灵抗性基因的质粒pLPMBn为模板，采用引物对benA-F/benA-R进行PCR 扩增，得到苯菌灵抗性基因benA的编码序列(2828bp)(电泳结果见图1的泳道2)。

benA-F：5’-GGAGTAGTTGATTTTCCAGGGAC-3’；

benA-R：5’-GGATCCCCGGGGGATC-3’。

5.将步骤2、步骤3和步骤4得到的TP06128左臂、TP06128右臂和benA抗性基因片段经DNA纯化试剂盒纯化，按照摩尔比1:1:2混合后，进行融合PCR扩增，得到PCR融合产物。

融合PCR反应条件：预变性98℃3min；98℃15s，58℃15s，72℃3min，进行20个循环反应；72℃10min。

6.以步骤5得到的PCR产物为模板，采用引物TP06128_Nest-F和引物TP06128_Nest-R 组成的引物对进行PCR扩增，得到5190bp的PCR产物(电泳结果见图1中泳道4)。

TP06128_Nest-F：5’-TCACTGGTAAACAGGGAACG-3’；

TP06128_Nest-R：5’-TGGCGAACAGAACAAACAG-3’。

经测序，得到的PCR产物如序列表的序列4所示。将序列表的序列4所示的DNA分子命名为TP06128基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-1937位核苷酸为TP06128左臂区段，第1938-4765位核苷酸为苯菌灵抗性基因benA区段，第4766-7110位核苷酸为TP06128右臂区段。

TP06128基因敲除盒的元件示意图见图2。

实际应用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。

实施例3、嗜松蓝状菌TP06128基因缺失突变株ΔTP06128的构建与验证

1、以嗜松蓝状菌1-95为出发菌，敲除其TpKu70基因，得到嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70。

记载嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70，以及敲除TpKu70基因具体步骤的文献如下：Zhang T，et al.Deletion of TpKu70facilitates gene targeting in Talaromycespinophilus and identification of TpAmyR involvement in amylase production[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology, 2017,33(9):171。嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70在文献中的名称为“Talaromycespinophilus mutant ΔTpKu70”。

2、嗜松蓝状菌突变株ΔTpKu70的原生质体的制备

(1)将步骤1得到的嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

(2)取2mL步骤(1)的孢子悬浮液，接种至200mLCM培养基中，28℃、180rpm振荡培养10-12小时。

(3)完成步骤(2)后，4℃、3500rpm离心10min，弃上清，收集菌丝体沉淀，用灭菌水溶液洗涤2次，然后4℃、3500rpm离心15min，弃上清，收集菌丝体沉淀。

(4)取(3)得到的菌丝体，用酶解液重悬，28℃、180rpm振荡反应2-3小时以进行酶解；用显微镜观察到大部分菌丝形成原生质体后，按每管12.5mL分装到50mL离心管中,加入2倍体积的Trapping buffer溶液，4℃、3500rpm离心30分钟，观察到明显的分层现象。

(5)用巴氏吸管小心地吸出步骤(4)中间层的原生质体至新的50mL离心管中，加入2 倍体积1M山梨醇水溶液漂洗2次，4℃、3500rpm离心15分钟，再使用20mL STC溶液漂洗2次后离心，弃上清，得到原生质体,放入-80℃冰箱中保存备用。

3、嗜松蓝状菌突变株ΔTP06128的构建及验证

(1)将4体积份的STC溶液和1体积份的PTC溶液混合，得到混合液，用混合液重悬步骤2得到的原生质体，得到原生质体溶液(调整浓度为1×10⁷个/mL)。

(2)用实施例2得到的TP06128基因敲除盒DNA转化ΔTpKu70原生质体(方法参照文献：Churchill ACL et al.Transformation of the fungal pathogen Cryphonectriaparasitica with a variety of heterologous plasmids[J].Current Genetics 1990,17:25-31)，具体步骤如下：

①将5μg TP06128敲除盒DNA和3μL 100mM亚精胺溶液混合后加入到100μL步骤(1)制备的原生质体溶液中，混合均匀，冰上反应30分钟；

②反应结束后向溶液中加入1mLPTC溶液，混合均匀，室温放置25min；

③向混合液中加入2mL STC溶液混合均匀，将混合液加入到30mL预热的再生培养基中，混合均匀，将上述混合液倒入到无菌培养皿中(按每个培养皿分别倒入2-5mL)；待完全凝固后，室温放置30分钟，加入40mL含有G418(800μg/mL)与潮霉素(250μg/mL)的PDA 培养基，覆盖在再生培养基的表面，完全凝固后28℃倒置培养6天。

④将步骤③的转化双层板的孢子用0.1％吐温80溶液冲洗，放入到新离心管中，用无菌水梯度稀释孢子悬浮液，将每个稀释梯度的孢子悬浮液涂在含有苯菌灵抗生素(20μg/mL) 的PDA平板上，28℃培养4-5天，挑选单菌落，随机选取三个候选突变株(ΔTP06128-2、ΔTP06128-3和ΔTP06128-4)，提取各候选突变株基因组DNA，用引物对TP06128-F/TP06128-R、引物对TP06128_left-arm-F/benA交叉验证下游引物、引物对benA交叉验证上游引物 /TP06128_right-arm-R进行PCR验证。

TP06128-F：5’-CTGATGCTTCCTGCCGTTAT-3’；

TP06128-R：5’-CAAGCGTCAAGCGGTGTA-3’；

benA交叉验证上游引物：5’-TCATTCCACTCAACATTCAGGC-3’；

benA交叉验证下游引物：5’-ACACACAGGAAAACATTGACCG-3’。

结果如图3所示。图3中，泳道M为1kb DNAMarker，泳道1为ΔTpKu70的阳性对照，泳道2为ddH₂O阴性对照，泳道3为ΔTP06128-2的鉴定结果，泳道4为ΔTP06128-2的鉴定结果，泳道5为ΔTP06128-4的鉴定结果。图3A为用引物对TP06128-F/TP06128-R检测TP06128 基因是否被敲除；图3B为用引物对TP06128_left-arm-F/benA交叉验证下游引物的PCR产物；图3C为用引物对benA交叉验证上游引物/TP06128_right-arm-R的PCR产物。结果表明，ΔTP06128-2、ΔTP06128-3和ΔTP06128-4不能扩增出TP06128基因片段，而突变体ΔTpKu70可以扩增出TP06128基因片段(图3A)。同时，ΔTP06128-2、ΔTP06128-3和ΔTP06128-4都扩增出左臂DNA片段(图3B)和右臂DNA片段(图3C)，而突变体ΔTpKu70没有抗性基因benA存在，不能扩增出左臂和右臂基因片段(图3B-C)。这些结果表明菌株ΔTP06128-2、ΔTP06128-3和ΔTP06128-4中TP06128基因已被敲除。

⑤提取三个候选突变株(ΔTP06128-2、ΔTP06128-3和ΔTP06128-4)和突变体ΔTpKu70 的基因组DNA，将基因组DNA采用SacⅠ酶切后进行Southern杂交分析，结果如图4所示。图4中，泳道M为1kb DNA Marker，泳道1为突变体ΔTpKu70作为对照，泳道2为ΔTP06128-2 的鉴定结果，泳道3为ΔTP06128-3的鉴定结果，泳道4为ΔTP06128-4的鉴定结果。结果表明，ΔTP06128-2、ΔTP06128-3和ΔTP06128-4均得到大小为2315bp的杂交带，突变体ΔTpKu70 得到4348bp的杂交带，与预计结果一致。

以上结果表明，将TP06128基因敲除盒导入嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70得到的三个转化子(ΔTP06128-2、ΔTP06128-3和ΔTP06128-4)均为TP06128基因被敲除的突变菌株。将敲除TP06128基因的突变株ΔTP06128-4命名为突变株ΔTP06128并对其做进一步实验和检测。

实施例4、嗜松蓝状菌缺失突变株ΔTP06128的回补菌株CTP06128的构建

1、以嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70的总DNA为模板，使用引物对 CTP06128-L-F/CTP06128-R进行PCR扩增得到TP06128左臂和TP06128编码框片段；用引物对TP06064ter-F/TP06064ter-R扩增得到TP06064终止子片段。所用引物序列如下：

CTP06128-L-F：5’-TCAAATCAAAGCGTCCAAC-3’；

CTP06128-R：5’-CGACCGTTATATAGTCAAGCAATCAGGCGACAACAACCACG-3’；

TP06064ter-F：5’-TTGCTTGACTATATAACGGTCG-3’；

TP06064ter-R：5’-CGTCGTAGAAGCGGTGGT-3’。

2、以嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70的总DNA为模板，用引物对 CTP06128-R-F/CTP06128-R-R扩增得到TP06128右臂序列。所用引物序列如下：

CTP06128-R-F：5’-AAGGCTTTAATTTGCAAGCTACAACTATCTGTTTGAAT ATTTGAG-3’；

CTP06128-R-R：5’-CACCACGTCACCCTGATC-3’。

3、以含有博莱霉素抗性基因(Ble)的质粒pPICZ.A为模板，用引物对Ble-F/Ble-R扩增出Ble序列。所用引物序列如下：

Ble-F：5’-ACCACCGCTTCTACGACGCCCACACACCATAGCTTCA-3’；

Ble-R：5’-AGCTTGCAAATTAAAGCCTT-3’。

4、将步骤2和步骤4得到的TP06064终止子片段和Ble序列纯化后按照摩尔比1:1混合后，进行融合PCR扩增，得到PCR融合产物。融合PCR反应条件：预变性98℃3min；98℃ 15s，58℃15s，72℃3min，进行20个循环反应；72℃10min。

5、以步骤4得到的PCR融合产物为模板，用引物对TP06064ter-F/Ble-R扩增得到TP06064终止子加Ble的融合片段。

6、将步骤1、步骤2和步骤5得到的TP06128左臂和TP06128编码框片段、TP06064终止子片段加Ble融合序列和TP06128右臂序列经DNA纯化试剂盒纯化，按照摩尔比1：2：1 混合后，进行融合PCR扩增，得到PCR融合产物。

融合PCR反应条件：预变性98℃3min；98℃15s，58℃15s，72℃3min，进行20个循环反应；72℃10min。

7、以步骤6得到的PCR融合产物为模板，用引物对CTP06128-NF/CTP06128-NR扩增得到TP06128回补盒。所用引物序列如下：

CTP06128-NF：5’-GGTTTCACTGGTAAACAGGGA-3’；

CTP06128-NR：5’-GAGGCGCAAACTAGATTCTGA-3’。

经测序，TP06128回补盒如序列表的序列5所示。序列5中，自5’端第1-1941位核苷酸为TP06128左臂区段，第1942-4696位核苷酸为TP06128编码框片段，第4697-5531位核苷酸为TP06064终止子片段，第5532-6704位核苷酸为Ble序列，第6705-8643位核苷酸为TP06128右臂序列。

TP06128回补盒的元件示意图见图5。

实际应用中，也可以直接人工合成序列5所示DNA分子。

6、采用实施例3中制备的ΔTP06128-4替代嗜松蓝状菌突变株ΔTpKu70，按照实施例3 的步骤2制备原生质体，然后将步骤4制备的TP06128回补盒按照实施例3的步骤3中的(1) 和(2)中的①-④转化到ΔTP06128-4突变株的原生质体中，将其中的含有苯菌灵抗生素 (20μg/mL)的PDA平板替换为含250μg/ml的博莱霉素的PDA平板。将PCR验证引物替换为引物对TP06128-F/TP06128-R、引物对CTP06128-L-F/TP06064ter-R和引物对 TP06064ter-F/CTP06128-R-R。

PCR验证结果见图6。图6中，泳道M为1kb DNA Marker，泳道1-3为回补菌株3个转化子的鉴定结果，泳道4为ΔTpKu70的阳性对照，泳道5为ddH₂O阴性对照。使用引物对TP06128-F/TP06128-R验证TP06128目的基因，结果三个转化子均有目的基因条带出现(图6-A)；用引物对CTP06128-L-F/TP06064ter-R做左交叉PCR验证，用引物对 TP06064ter-F/CTP06128-R-R做右交叉PCR验证，结果三个转化子均含有与理论大小一致的条带(图6-B和C)。表明ΔTP06128回补菌株(CTP06128)构建成功。所用引物序列如下：

TP06128-F：5’-CTGATGCTTCCTGCCGTTAT-3’；

TP06128-R：5’-CAAGCGTCAAGCGGTGTA-3’；

CTP06128-L-F：5’-TCAAATCAAAGCGTCCAAC-3’；

TP06064ter-R：5’-CGTCGTAGAAGCGGTGGT-3’；

TP06064ter-F：5’-TTGCTTGACTATATAACGGTCG-3’；

CTP06128-R-R：5’-CACCACGTCACCCTGATC-3’。

实施例5、嗜松蓝状菌缺失突变株ΔTP06128在葡萄糖液体培养基中生物量的测定

待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70和突变株ΔTP06128。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。

分别于培养的第24小时、36小时、48小时、60小时和72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)。

结果如图7所示。结果表明，突变株ΔTP06128在葡萄糖液体培养基中生物量与ΔTpKu70 的生物量无显著差异，表明基因TP06128的敲除在葡萄糖存在下不影响嗜松蓝状菌的正常生长。

实施例6、嗜松蓝状菌缺失突变株ΔTP06128在可溶性淀粉液体培养基中生物量的测定

待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70和突变株ΔTP06128。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL可溶性淀粉液体培养基中，28℃、180 rpm振荡培养72小时。

分别于培养的第24小时、36小时、48小时、60小时和72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)。

结果如图8所示。结果表明，ΔTP06128在可溶性淀粉液体培养基中生物量比ΔTpKu70 的生物量显著降低，表明基因TP06128的敲除在可溶性淀粉诱导下降低嗜松蓝状菌的生长。

实施例7、嗜松蓝状菌缺失突变株ΔTP06128淀粉酶产量的测定

待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70、突变株ΔTP06128和回补菌株CTP06128。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌体，用无菌水洗涤2-3次。

4、取步骤3得到的菌体(湿重为0.5g)，转接到100mL可溶性淀粉液体培养基中，28℃、 180rpm振荡培养5天。

分别于培养第3天、第4天、第5天收集培养体系，12000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液；收集固体菌丝体，提取胞内蛋白。

5.检测步骤4得到粗酶液的淀粉酶产量，检测方法参考文献：Zhang T,etal.Deletion of TpKu70facilitates gene targeting in Talaromyces pinophilus andidentification of TpAmyR involvement in amylase production[J].World Journalof Microbiology&Biotechnology,2017, 33(9):171.6.

6、提取步骤4得到菌丝体中的胞内蛋白。方法参照以下步骤：

①将步骤4得到固体菌丝体放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末。

②将步骤①得到的粉末转移到50mL离心管中，加入10mL蛋白提取液，再加入5g直径为0.25mm以及1g直径为3mm的玻璃珠。

③将步骤②的混合液在旋涡振荡器上振荡1min，再放置冰上30s。重复8-10次。

④将步骤③得到的混合液在7000rpm，4℃，离心20min，收集上清液，即为菌体胞内蛋白。胞内蛋白浓度检测方法参照文献：Zor T,et al.Linearization oftheBradfordprotein assay increase its sensitivity:theoretical and experimentalstudies[J].Analytical Biochemistry 1996, (236):302-308。

嗜松蓝状菌待测菌株的淀粉酶产量(U/g胞内蛋白)＝步骤5(U/L)/步骤4(g/L)。

结果如图9所示。结果表明，与ΔTpKu70相比，突变株ΔTP06128的淀粉酶产量显著降低，而回补菌株的淀粉酶产量恢复到出发菌株水平，说明TP06128为淀粉酶产量的正调控基因。

实施例8、嗜松蓝状菌缺失突变株ΔTP06128纤维素酶活力的测定

待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70、突变株ΔTP06128和回补菌株CTP06128。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌体，用无菌水洗涤2-3次。

4、取步骤3得到的菌体(湿重为0.5g)，转接到100mL麦麸加Avicel液体诱导培养基中，28℃、180rpm振荡培养5天。

分别于培养第3天、第4天、第5天收集反应体系，12000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。

5.检测步骤4得到粗酶液的如下各项酶产量：滤纸酶产量、羧甲基纤维素酶产量(CMCase 产量)、外切纤维素酶产量(pNPCase产量)、β-葡萄糖苷酶产量(pNPGase产量)。检测方法参照文献：Ghose TK.Measurement ofcellulase activities[J].Pure andAppliedChemistry 1959, (59):257-268；Gokhale et al.Production of cellulolytic enzymesby mutants ofAspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme and Microbial Technology1988,(10):442-445。

结果如图10-13所示。结果表明，与ΔTpKu70相比，突变株ΔTP06128的滤纸酶产量(图 10)、羧甲基纤维素酶产量(图11)、外切纤维素酶产量(图12)、β-葡萄糖苷酶产量(图13) 均显著降低，而回补菌株的上述4种酶产量均恢复到出发菌株水平，说明TP06128为纤维素酶的产量的正调控基因。

实施例9、TP06128基因的缺失对嗜松蓝状菌淀粉酶基因转录水平的影响

待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70和突变株ΔTP06128。

1、将待测菌株接种于无菌PDA培养基上，28℃恒温培养6天。

2、用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到 1×10⁸个/mL。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将菌丝体转接至100mL可溶性淀粉液体培养基中，28℃、180rpm培养。

分别收集诱导培养第12小时、第24小时和第48小时的培养体系，灭菌纱布过滤收集菌丝，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行定量RT-PCR检测。

选择了与淀粉降解相关的7个基因，包括2个α-淀粉酶基因TP04014和TP09288，1个淀粉糖化酶基因TP09267，以及4个α-葡萄糖苷酶基因TP00293、TP04013、TP01354和TP05120。

所用RT-qPCR引物序列如下：

RT-TP05120-F 5’-AGTTCTGGTTACGCAAGGGC-3’

RT-TP05120-R 5’-ATCTGGGAAGTCTGACGGCT-3’

RT-TP00293-F 5’-TGCCACAAGCACGGAATG-3’

RT-TP00293-R 5’-CGCCAGAAATACCAATCGC-3’

RT-TP01354-F 5’-ACCATTCGTCTTGACTCGCA-3’

RT-TP01354-R 5’-CCACCAATGTCGTGTCCGT-3’

RT-TP04013-F 5’-AATGTTCAGACAGGGCACGA-3’

RT-TP04013-R 5’-GACCGATAATAAATGGACGCTT-3’

RT-TP09288-F 5’-CTTGTCGGACGGTATCCCCATT-3’

RT-TP09288-R 5’-CCAAACGGCTTCACGGTTATTA-3’

RT-TP04014-F 5’-GGACAGATTTGCCCGAACAG-3’

RT-TP04014-R 5’-TCCAAACAGCAGTGAATCCCA-3’

RT-TP09267-F 5’-GTGTCGTTATTGCCAGTCCCA-3’

RT-TP09267-R 5’-CTCAGCAAGACCCAAACCACTC-3’

RT-TPactin-F 5’-TCGCTCTTCCTCACGCTATTT-3’

RT-TPactin-R 5’-GATGTCACGGACGATTTCACG-3’

结果如图14所示。结果表明，在淀粉诱导12小时时，3个基因TP09288、TP09267和TP00293分别显著上调149.0％、278.0％和44.4％；2个基因TP01354和TP05120分别显著下调64.0％和81.4％；其余2个基因TP04014和TP04013无显著变化。在淀粉诱导24小时时， 7个基因均上调，上调幅度在35.0％–469.1％之间。在淀粉诱导48小时时，除了基因TP01354外，其余基因均显著下调，下调幅度在62.6％–93.7％之间。

以上结果表明,调控基因TP06128在淀粉诱导条件下,对嗜松蓝状菌关键淀粉酶基因的表达起关键调控作用。

实施例10、TP06128基因的缺失对嗜松蓝状菌纤维素酶基因转录水平的影响

待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体ΔTpKu70和突变株ΔTP06128。

1、将待测菌株接种于无菌PDA培养基上，28℃恒温培养6天。

2、用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到 1×10⁸个/mL。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将菌丝体转接至100mL麦麸加Avicel诱导培养基，28℃、180rpm培养。

分别收集诱导培养第12小时、第24小时、第48小时的培养体系，灭菌纱布过滤收集菌丝，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行定量RT-PCR检测。

测定了三个关键的纤维素酶基因TP09412、TP08514和TP05820，其中TP09412为外切纤维素酶基因cbh1，TP08514为内切1,4-β-葡聚糖酶基因eg1，TP05820为β-葡萄糖苷酶基因 bgl1。

所用引物序列如下：

RT-TPactin-F 5’-TCGCTCTTCCTCACGCTATTT-3’

RT-TPactin-R 5’-GATGTCACGGACGATTTCACG-3’

RT-TP08514-F 5’-CGGGGCTCTTTATCTCTCTGA-3’

RT-TP08514-R 5’-GTTGCCTCGCCATTTGCT-3’

RT-TP09412-F 5’-ATAACACCCACTACCAAATCTTCG-3’

RT-TP09412-R 5’-GCACCGTTCAAACCGCAA-3’

RT-TP05820-F 5’-TACGCAATGTCCTCAAACTCG-3’

RT-TP05820-R 5’-CAATAGACTCAGCAGCGGCAC-3’

结果见图15。结果表明，与出发菌株ΔTpKu70相比，缺失突变株ΔTP06128中，在诱导 12小时时，基因TP09412和TP08514分别显著下调80.3％和96.5％；TP05820显著上调267.2％。在诱导24小时时，3个基因均显著下调，下调幅度在73.6％–90.5％之间。在诱导48小时时， 3个基因在缺失突变株ΔTP06128中的转录水平和在出发菌株ΔTpKu70中的转录水平接近。

以上结果表明,调控基因TP06128在麦麸加Avicel诱导条件下,对嗜松蓝状菌关键纤维素酶基因的表达起关键调控作用。

序列表

<110> 广西大学

<120> 功能蛋白TP06128及其编码基因与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 861

<212> PRT

<213> 嗜松蓝状菌(Talaromyces pinophilus)

<400> 1

Met Pro Pro Glu Val Gly Asp His Trp Glu Pro His Phe Pro Met Asn

1 5 10 15

Arg Ala His Ser Gln Gly Ser Met Met Ser His Thr Gln Pro Leu Ser

20 25 30

Arg Pro Gly Thr Ala Asp Pro Leu Arg Ser Arg Ser Asn Thr Ala Ile

35 40 45

Ser Arg Ala His Arg Arg Pro Arg Ser Arg Gly Ser Thr Ala Ser Ile

50 55 60

His Ser Ser Thr Thr Gln Gln Thr Gln Asp Gln His Met Gly Asp Gly

65 70 75 80

Phe Ser Pro Phe Met Pro Ser Gln Gln Ala Pro Pro His Gly Val Phe

85 90 95

Asn Pro Asn Pro Glu Glu Met Met Met Arg Phe Asn Gln Gln Met Ala

100 105 110

His Ser Asn Ser Gln Gly Ser Leu Asp Val Ser Met His Glu Ala His

115 120 125

Gly Ala Val Met Gln Arg Pro Glu Asp Phe His Gly Leu Pro Asn Ser

130 135 140

Met Ser Asp Met Val Pro Ala His Gly Ile Pro Ser Ile Pro Val Ser

145 150 155 160

His Tyr Gly His Ile Tyr Asp Gly Ser Gly Met Asp Pro Gln Met Pro

165 170 175

Asp Arg Thr Gly Asp Asp Asn Asp Asn Ser Glu Ala Gly Gly Arg Lys

180 185 190

Lys Arg Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ala Asn Asp Asn Glu Leu Arg Lys

195 200 205

Leu Leu Arg Gln Tyr Glu Gly Tyr Thr Leu Lys Gln Met Ala Thr Glu

210 215 220

Val Gln Lys His Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ser Glu Lys Val Lys Gln

225 230 235 240

Val Phe Ala Met Val Trp Leu Lys Glu Asn Cys Arg Lys Ser Ser Gly

245 250 255

Ser Val Arg Arg Asp Arg Val Tyr Cys Cys Tyr Ala Glu Arg Cys Gly

260 265 270

Ser Glu His Val Ser Val Leu Asn Pro Ala Ser Phe Gly Lys Leu Val

275 280 285

Arg Ile Ile Phe Pro Asn Val Gln Thr Arg Arg Leu Gly Val Arg Gly

290 295 300

Glu Ser Lys Tyr His Tyr Val Asp Leu Thr Val Ile Glu Glu Lys His

305 310 315 320

Gln Gln Ser Ile Gly Gln Ser Ser Gln Asp Gln Asn Thr Ala Asn Glu

325 330 335

Ser Phe Asn Thr Asp Gly Lys Gly Leu Asn Ser Ser Ile Arg Pro Arg

340 345 350

Ser Ile Ser Ile Ser Gln Pro Pro Ile Asp Thr Ala Val Phe Pro Ser

355 360 365

Pro Thr Thr Ser Phe Thr Pro Lys Phe Ser Leu Ala Pro Asn Gly Asn

370 375 380

Gly Cys Thr Cys Asp Ser Gln Thr Arg Pro Lys Ile Asp His Thr Ile

385 390 395 400

Thr Leu Glu Asn Ile Ser Thr Gln Ser Gly Arg Met Ile Arg Gln Met

405 410 415

Leu Ala Phe Pro Asp Ser Thr Ser Gly His Val Asp Lys Glu Ser Leu

420 425 430

Asn Ile Pro Asp Ile Ser Ser Phe Leu Pro Ala Asn Thr Asp Thr Lys

435 440 445

Val Ala Asp Ala Leu Ala Ala Leu Tyr Arg Thr His Cys Ile Ser Val

450 455 460

Ile Asp Ser Phe Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Asn Leu Phe Arg His Phe

465 470 475 480

Ser Ala Phe His Gly Thr Leu Thr Val Pro Val Gln Lys Leu Leu Ile

485 490 495

His Pro Asn Leu Ala Pro Trp Ile Lys Glu Cys Asp Trp Arg Met Tyr

500 505 510

Gln Lys Met Ile Glu Phe Val Ala Pro Leu Thr Thr Gln Leu Val Pro

515 520 525

Gln Ala Val Leu Asp Ser Phe Gly Ser Ile Ser Arg Arg Leu Thr Gly

530 535 540

His Ile Ser Glu Thr Phe Lys Ser His Pro Thr His Val Ser Leu Ser

545 550 555 560

Arg Leu Ala Pro Ala His Ile Phe Cys Asn Leu Leu Lys His Met Leu

565 570 575

Asp Val Asn Gln Ala Ala Asn Ala Ala Ala Ala Trp Leu Cys His Pro

580 585 590

Asp Asn Arg Lys Gln Met Trp Ile Asp Phe Ala Ser Phe Val Asp Pro

595 600 605

Lys Glu Met Leu Phe Lys Ala His Ile Pro Ala Cys Ser Glu Lys Ala

610 615 620

Ala Glu Gln Ile Leu Lys His Asp Val Arg Ala Leu Leu Thr Pro Leu

625 630 635 640

Glu Asn Pro Thr Ser Pro Glu Ile Leu Pro Phe Tyr Gln Gln Thr Gly

645 650 655

Asp Asn Thr Gln Asp Gln Lys Ser Thr Val Glu Val Ser Thr Gly Asp

660 665 670

Glu Tyr Asn Phe Gly Asp Lys Trp Leu Ser Phe Ile Leu Ser Leu Pro

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Ser Leu Phe Pro Asn His Pro Val Gln Cys Ile Val Asp Lys Val Asp

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Lys Leu Trp Asp Cys Ile Leu His Arg Leu Thr Leu Ala Gly Ala Pro

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Ser Phe Ser Ala Trp Trp Met Thr Lys Val Phe Phe His Glu Met Leu

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Leu Trp Gln Val Glu Gln Gly Gly Phe Lys Lys His Ser Pro Ser Ser

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Ile Gln Ser Ser Ala Ala Gln Ser Gln Leu Glu Asn Ser Gln Ala Arg

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Val Ser Arg Gln Gly Ser Phe Ala Val Pro Val Lys Asn Glu Pro Phe

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Ile Thr Asn Glu Asn Gly Ser Ile Ile Glu Ser Ala Pro Thr Ala Asn

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Pro Gly Asn Asp Arg Thr Met Ser Glu Lys Thr Ser Ala Val Glu Ser

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Asp Asp Asp Ser Met Leu Met Ser Val Gly Lys Tyr Asp Ile Met Thr

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Asp Thr Thr Asp Ala Glu Gly Asp Val Val Val Val Ala

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<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 嗜松蓝状菌(Talaromyces pinophilus)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggtttcactg gtaaacaggg aacgtgagta tctgagatct tagcatagga gtttgcactg 60

acgagattgg tactggctag tttccatgcc gagcaagcta tcgcatacgg taattccgag 120

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gtcggcccta actgtcccgg tatcattgct ccggtacgtt acttaccttc tacaatacaa 660

tcttataggg gtttattcga cgatgggata tgtgattaat gtggaacttg tttagggtca 720

atgcaaaatc ggtatcatgc ctggtttcat ccacaagcgt ggtcgcattg gtatcgtctc 780

tcgttccggt actctcacct acgaagccgt caaccagact acccaagctg gtttgggcca 840

gtccctcgtc gtcggtatcg gcggtgaccc cttctccgga acaaacttca ttgactgctt 900

gaaggtcttc ctcgaagacg aggagacgga tggtattatc atgattggtg aaattggtgg 960

tagcgctgag gaggatgccg cagagttctt gaagaccgag aacaagaaga acaagcccac 1020

tgtgagcttc attgctggta tcagtgctcc ccccggtcga cgaatgggcc acgccggtgc 1080

tattgttagc ggtggtaagg gtggtgccga ctctaagatc tctgctctcg aggctgccgg 1140

tgttattgtt gagcgaagcc ctgcttctct tggtaagact ctgcgcgacg agttcgtgcg 1200

acgcgatctt ctttaaaggg gtgggctggt atagggacgt tctttcatcc ttctcgtcta 1260

caattgttac aagtagctgc aggagtcaga tgtcctagta gatacgagga gtggctgtac 1320

tttgttcatt tgtgtgttga tacttgatag tttcatatcc cgatagatgt gtgtttactt 1380

aatgagacgt tggtctgtgt attgtcagac agtttacttt gtcctcgaca gagtgacttt 1440

ccggacatta ttaggctctc taataacttt tcggacaata tatatattat acactaggcc 1500

tcgtagcatt gttgtcgcga gcagcgcgtg ctgtgattgg ctcgtcagcg agcgctcacg 1560

tgacgccagc cacccaagca aaacacagca gacgaaccaa aacaataggg ctaactcggt 1620

tgtctgagtg acggccgatt ctgtttatcc tcccttcata ttccaataac ccagcaccac 1680

ctcgagccac ctcgaacgtg acgacgacac catccagcct agtctggctt cgataattag 1740

tattacgact cggtttattc gacgccacgc ttcttctcca cgccaggttt gtatgctttt 1800

tattattcag ccattgatga ctcccgccat cgtgtgttga tgtggatgtg acgattcaca 1860

acattccacc aaatcgccct caccacccgc gctcattgcg ctaaggaaac tcctttttaa 1920

tactcactcg acctctggaa tatgcctcct gaagtaggcg accactggga gcctcatttc 1980

ccgatgagta cgtgactgat gcttcctgcc gttatgtggc tcctgctaac tgtgactcgt 2040

tagatcgagc acactctcaa ggctcgatga tgtcgcatac acaaccgctt agtcgacccg 2100

gtacagcgga tccattgcgg tctcgatcaa acacggctat atccagagct catcgtcgcc 2160

ctcgatcaag agggtctact gctagtattc attcgagcac gacacaacaa acccaggacc 2220

agcacatggg cgatggattc tctcccttta tgccctctca acaagcaccg ccgcatggcg 2280

tgtttaaccc aaaccccgag gagatgatga tgcggttcaa tcaacaaatg gcacattcga 2340

atagccaggg ttccctcgat gtctcaatgc acgaagctca cggagctgtc atgcaacgac 2400

cggaggactt tcacggcctt ccaaactcga tgtctgatat ggttcctgct catgggatcc 2460

caagcatacc tgtcagccat tacggacaca tttacgacgg gagcggaatg gaccctcaga 2520

tgccggaccg taccggtgat gacaacgata actcggaggc tggtggtcga aagaaacgag 2580

gttccagctc tactattgct aatgacaatg aattgagaaa actgttacgt caatatgaag 2640

gttacacgct caagcagatg gctactgagg tccagaagca tgaaggcgcg ggcgggaagt 2700

ctgaaaaggt gaagcaggtt tttgccatgg tgtggtaagt tgtcacgtcg aaacgcgtct 2760

tctttacagc tactgaagta tttgtgtata ggttgaaaga gaattgtcgg aaaagcagcg 2820

gctctgttcg tcgggatcgc gtatactgct gctatgcaga gagatgtgga agtgaacacg 2880

tctcagttct aaacccagcc tccttcggca aacttgtgcg aattattttc ccgaatgtgc 2940

agacacgtcg tcttggtgtc agaggcgaat cgaaatatca ttatgttgat cttactgtca 3000

tagaggaaaa acatcaacaa tcgatcggcc aaagctcaca ggatcaaaac acggcaaacg 3060

aatcatttaa tacagatgga aaaggactga actcgtctat acgacctcgc aggtaactta 3120

tgctgctctt ctacacgatc ttacagttga gtactgataa ctttatagta taagcatatc 3180

tcaaccacca atcgataccg ccgtctttcc ctcgcctaca acttctttta cgcccaagtt 3240

ctcacttgct ccgaacggca atggatgcac ttgtgactct caaacacggc ctaagataga 3300

ccacacgatt acattggaaa acatatcaac acaaagtgga aggatgatac gtcagatgct 3360

cgcctttcct gactcgactt caggacatgt cgacaaagag tctctgaata ttcccgatat 3420

ctcctccttt cttccggcga atacagatac caaagttgca gatgccttgg cagctttata 3480

cagaacgcat tgcatttctg tcattgacag cttccggtat tgcaaagaac ggaacttgtt 3540

tcgacacttt tctgcatttc atgggacatt gactgttcct gtacagaaac tgcttattca 3600

cccaaacctt gcaccctgga tcaaggaatg tgattggcgg atgtaccaaa aaatgattga 3660

attcgtggcg cctttgacca cccagcttgt accacaagca gttcttgatt cctttggctc 3720

aatttcccga cgtctgacag gacacatatc cgagacgttc aagtctcatc ctacacatgt 3780

atccttgtcg agattagcac cggcacatat tttctgcaat ctcttgaaac atatgctcga 3840

tgtgaaccaa gccgccaatg ccgccgcagc ctggctttgc catccggata accgcaaaca 3900

aatgtggatt gattttgcta gttttgtgga tccgaaagaa atgctgttca aagctcatat 3960

tccggcttgt tcggagaaag cagccgagca aatattgaaa cacgacgtgc gtgctctttt 4020

gacgccattg gagaacccca cgtcacctga aatcctgcca ttctaccagc aaacaggaga 4080

caatacgcag gaccaaaaaa gcaccgtgga ggtctcaaca ggcgatgaat acaatttcgg 4140

cgataaatgg ctctctttca tactcagtct accgtcgctt ttccccaacc acccggtaca 4200

gtgcatagtc gacaaggtcg ataaattatg ggactgtata ttacaccgct tgacgcttgc 4260

tggtgctcct agcttcagtg catggtggat gaccaaagtg ttctttcatg aaatgttatt 4320

atggcaagtg gaacaaggtg gttttaagaa gcattcgcct agctctatac agagttctgc 4380

agcccaatcg caacttgaga actcacaggc ccgtgtttct agacaaggga gttttgccgt 4440

cccagtcaag aacgagcctt ttatcaccaa cgagaatggc tccatcatcg agtctgcgcc 4500

aacagcaaat ccgggaaacg accgcacaat gagtgagaag acctcagctg tggagagttt 4560

ccctggtgct caagcaccta accatgatga cagcggcatc ggccttgatg acgattctat 4620

gctcatgtcc gttggcaaat atgatataat gacagataca acagatgccg aaggcgacgt 4680

ggttgttgtc gcctgattgc ttgactatat aacggtcgaa gagagtttca tatcgcggag 4740

cccctttgtg attgaaatct catgaagttg ttggaatatg ggctcatgtt caagatgaac 4800

taaggaagga accttgctta tctgaagcca atagtctatc agactatctc tgcatctatc 4860

ttgacgaaga ttcttgtgaa tagaataaaa taacgttgac taaccgaaga tcatgatgtc 4920

tgtcgagtat ctgtagagtg ggtcatagtt gcggcctcag gcagctactc cttaatttcc 4980

gacagaaaat caaaaatgga cgaagctggc cagagcttca aagcacttct atcaatcaaa 5040

caacatcaac ataattcttg atagattcgc aattcattcc attttataac cctagcatgt 5100

cactagtgag gtaattggcc tcacggttgc ccacattggc ccaatttttt ctgcgggccg 5160

caagagcccc gcgtcgctct ctcattcatc aatttcaaaa acttcaaatt tcatcctcgc 5220

gtctttggtc tgcaacgaat acaaccactc ttccgcgaat tcctctagct cctagtcgac 5280

ttgcagtaca tcgaaatcgg acgccgttta tcttcactag caacatggct actgcagcgc 5340

tccccgagag ctctcttctc tctttgcttt atcgttccta ccccaccgcc atctcacctg 5400

atgccactga gctcgacctc gctcaagcca cgcccaagat cttttcgcac tacacctaca 5460

ccgacgcaga gaaggcagct atcaaacaat ggctagctac gatacacggt ctgaccaccg 5520

cttctacgac gcccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca 5580

gattttctcg gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta 5640

aattttccct ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa 5700

gaaaaaagag accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc 5760

acgtttcttt ttcttgaaat tttttttttt agtttttttc tctttcagtg acctccattg 5820

atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct 5880

attacaactt tttttacttc ttgttcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaaggg 5940

gcggtgttga caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac gacaaggtga 6000

ggaactaaac catggccaag ttgaccagtg ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg 6060

ccggagcggt cgagttctgg accgaccggc tcgggttctc ccgggacttc gtggaggacg 6120

acttcgccgg tgtggtccgg gacgacgtga ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg 6180

tggtgccgga caacaccctg gcctgggtgt gggtgcgcgg cctggacgag ctgtacgccg 6240

agtggtcgga ggtcgtgtcc acgaacttcc gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga 6300

tcggcgagca gccgtggggg cgggagttcg ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc 6360

acttcgtggc cgaggagcag gactgacacg tccgacggcg gcccacgggt cccaggcctc 6420

ggagatccgt cccccttttc ctttgtcgat atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat 6480

tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc 6540

taggtcccta tttatttttt tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa 6600

atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg 6660

cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct ttaatttgca agctacaact atctgtttga 6720

atatttgagg acatttgtcc tgcactttct tggtggtggt attcgttctg cattgcttac 6780

gtgatttcac ttcaaacaaa aagatatgtt atacagtgtt gaatgtggct ttggctttgc 6840

tattcacttc ttgtccttct cggatttgat attgccttca tgccctttga ttaattcttt 6900

atcgtttttc tttggagcct ttggcgaatt ggatttttca aaaatatccc ccctttcttt 6960

ttgctatttt gccattttct tctcttttga ttaacctgta cttttgcccc tcacaaattc 7020

ttcgacaagc gatgatgacc gtacgagcat taatgtctga accagcgaga gaacttcctc 7080

tctgctattt tctgcttctt ttggattgcc ttatcttacc cctttccgcc tacacttact 7140

attgccattt tgtcttgagt atttacctca tgaacccttt ttgtatatag taccattcga 7200

tactttactt tttggaagag tagtatccca tactttgtgt tggaatagat atgggatttt 7260

tgaacgatta cttctcattc ataaccttgc tgtctgtgtt cgacatatac tgagttaatc 7320

atacaatcat gttgcttcct aagacgaaat atatctcaca aatagatgcc tatcatatac 7380

gtcaaagcct tcgcaaaaag ggccttcacc cgaacacaat caccgtgtat caagcgctgg 7440

gaaatagcga gtaccggcaa agccatggac catgatactc tcgatatcga tgtttccgcc 7500

gctgtaagga ctccacagtt tgattaggat gtatcggccg gacctgttgt ccaatgttaa 7560

caagggtttc gcacatcgga agagctaaag aaaagcaccg gggaacatac acaggaggat 7620

cgaaattgat gctaaccata ctcttttccc gctcaatgaa gaaccgtgca tgtggtttca 7680

tgatattcga tatcccattc atgtctccgc tcacgccatg tgcagctccc gctgaaaagc 7740

gggctggctc aattagactt ggagagttga ggcgattatt acttccgaga ccgtagagac 7800

tgttgcgggg accgcggtca cggcgtcgtg agtcgagacg gccgcggtta ttgaattcga 7860

ctgtgtcgcc gccgtcgctg tcgtcttcgt cgacggggca gaatagttcg ctgtcttcac 7920

cactatccaa aaggtcaacg tcgttggcgg atgggaaatc gtcgtcgtca tgttgtctac 7980

tgtctgggtt gccgtcgtgc tctgtagtta ctctgaactg gggctcggcg tatgtaggat 8040

cgaaaagtga acgacgagac catgttgact cgtttgcttg tgcgtcgagg tctccgctag 8100

aagcaccggc gccccctgcc tcggtgcctt gggtacgaga tctataggtg ttgaagtact 8160

ccctggatgg gttgctgtaa tgtcgcctgg attcgtggca gcgccgactc cgtgatggat 8220

aatggatctg atactgagcc gtccgctcta gtagttcatc agatgacatc gaaacaaaga 8280

tcatgccttc ctggatcctg aagaacggtc agttgtagtt caccgtttgc tgggtatcag 8340

acttacgcag catcaaaccc tttcttcggt gaacgaatca caatcttctt gagagagaat 8400

ggtgtctcgc cacgatgatt cagtatcata ttgcaccggc tcttctttgt gcagtagacc 8460

gaggtgtcgt caagcaggac attccccggc cacgagctct cgccgttgtc ttcatcatag 8520

taatttccgc catcacagct attgatttcc atctttaata aaccaggtac aacttggcca 8580

taatgtccgt aactgaatcc accaagtcct tctctattgt cgtcagaatc tagtttgcgc 8640

ctc 8643

Claims (6)

1.一种抑制微生物生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力的方法，包括如下步骤：抑制所述微生物中序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因的表达，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力降低的微生物；

所述微生物为嗜松蓝状菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)序列表的序列3所示的DNA分子。

3.一种抑制微生物生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力的方法，包括如下步骤：降低序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的表达量，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力降低的微生物；

所述微生物为嗜松蓝状菌。

4.一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因表达的物质导入出发微生物，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力低于所述出发微生物的重组微生物；

所述微生物为嗜松蓝状菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)序列表的序列3所示的DNA分子。

6.采用权利要求4或5所述的方法制备得到的重组微生物。

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