CN105238704A - 一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。所述方法包括在里氏木霉中过表达里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPMO9C基因的步骤。本发明通过对里氏木霉的TrLPMO9C基因进行过表达，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养7天后，其纤维素酶的滤纸酶活0.21U/ml，CMC酶活0.40U/ml，较出发菌株均有一定程度的提高。

Description

一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。

背景技术

植物细胞壁多糖主要包括纤维素和半纤维素，它的来源丰富、可再生，是生产可再生生物燃料的理想原料。将植物细胞壁多糖，尤其是其中的主要成分——纤维素完全降解为可发酵的简单寡糖和单糖如葡萄糖需要复杂的纤维素酶酶系协同作用。里氏木霉是一种丝状真菌，具有强大的分泌纤维素酶的能力。工业上，经改造后的里氏木霉，其产纤维素酶的产量可达到100g/L以上，因此，在降解植物细胞壁多糖以及相关应用上具有重要的应用价值。

里氏木霉的纤维素酶系包括两个外切纤维素酶、五个内切纤维素酶、一个β-葡萄糖苷酶和三个裂解性多糖单加氧酶(lyticpolysaccharidesmonooxygenases,LPMOs，即原GH61家族成员)。对这些纤维素酶的分泌表达的调控非常复杂，涉及到多个阶段，如转录、翻译、转运、蛋白折叠、胞外降解等以及多种关键因子。

里氏木霉的纤维素酶对纤维素的降解，主要采取的是水解的作用方式，具体为：外切纤维素酶从纤维素链的还原端(CBH1)和非还原端(CBH2)进行切割，而内切纤维素酶则从纤维素的无定形区进行切割，释放出来的自由末端可称为外切纤维素酶的底物；β-葡萄糖苷酶将纤维二糖或纤维寡糖降解为葡萄糖。三种类型的纤维素酶协同作用，共同发挥水解纤维素的作用。

里氏木霉的纤维素酶中还包括微量的裂解性多糖单加氧酶，其中TrAA9A和TrAA9B的性质得到了初步的阐明，采取氧化裂解的方式对纤维素发生降解作用。

由于裂解性多糖单加氧酶采取了不同于普通纤维素酶一样的氧化裂解方式对纤维素进行降解，其产生的纤维素链末端可称为外切纤维素酶的作用位点，而裂解性多糖单加氧酶所产生的氧自由基因其分子小，可攻击高度结晶的纤维素分子，对这些位点的裂解可打破高度结晶的纤维素结构，而产生无定形区，作为内切纤维素酶的作用位点。基于酶之间的协同作用，过表达裂解性多糖单加氧酶有可能提高里氏木霉的纤维素酶酶活。

发明内容

本发明的目的是提供过表达TrLPMO9C的技术以快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法。

本发明的再一目的是提供高产纤维素酶酶活的重组里氏木霉。

根据本发明的快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法包括在里氏木霉中过表达里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPMO9C的步骤。

根据本发明的快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法，其中，所述TrLPMO9C基因的序列如SEQIDNo.1所示，以pRS424为模板，通过将cbh1启动子、TrLPMO9C全长基因片段以及cbh1终止子串联拼接而成的TrLPMO9C基因的过表达质粒，cbh1启动子的序列如SEQIDNo.2所示，cbh1终止子的序列如SEQIDNo.3所示。

SEQIDNo.1：

ATGAAGCTTTGGATCGGCCTCTTGCTTTTGGGCCTCGCCTGCAGGGCAAGTGCCCACACAACTTTCACCACGCTCTTCATCGACAAGAAGAACCAAGGGGATGGGACGTGCGTCCGGATGCCGTACGATGACAAGACGGCAACCAACCCGGTCAAACCCATCACATCTTCAGACATGGCTTGTGGTGAGCATGCTTCTCTTACCAGGGCCGCCCGAATGGCAGTGAAGCTGGTTCGGTATTGACATATATCATCAGGTCGCAACGGTGGCGATCCGGTGCCATTCATTTGTTCGGCAAAGAAAGGATCTTTGCTCACCTTTGAATTTCGCCTCTGGCCCGATGCTCAGCAGCCCGGTAGCATTGATCCTGGCCACCTGGGTCCCTGCGCCGTGTACCTGAAGAAGGTTGACAACATGTTCTCGGACAGCGCCGCCGGTGGCGGCTGGTTCAAGATCTGGGAGGACGGCTACGACTCCAAGACGCAGAAATGGTGCGTCGACCGCCTTGTCAAGAACAATGGCCTGCTCTCCGTGAGGCTTCCCAGGGGACTGCCTGCGGGATACTACATCGTGAGGCCCGAGATCCTCGCGCTGCACTGGGCTGCCCATCGCGACGACCCGCAGTTCTACCTCGGTTGCGCCCAAATCTTCGTCGACAGCGACGTACGTGGTCCGCTGGAGATTCCTCGGAGACAGCAAGCGACTATCCCTGGGTATGTCAACGCCAAGACCCCAGGCCTCACGTTCGACATCTACCAGGACAAGCTGCCTCCGTATCCCATGCCCGGCCCCAAGGTGTATATCCCCCCCGCGAAGGGGAACAAGCCCAATCAGGACCTGAACGCGGGCCGGCTCGTCCAGACTGACGGCCTCATCCCCAAGGACTGCTTGATCAAGAAGGCAAACTGGTGCGGCAGGCCCGTCGAGCCGTACTCGAGCGCACGCATGTGCTGGAGGGCCGTCAACGACTGCTACGCGCAGAGCAAGAAGTGCAGGGAGAGCTCTCCGCCCATAGGGCTGACCAACTGCGACCGCTGGAGCGACCACTGCGGCAAGATGGACGCGCTTTGCGAGCAGGAAAAGTACAAGGGGCCGCCCAAGTTCACCGAGAAGGAGTACGTTGTGCCGGCGCCGGGGAAGCTGCCGGAGATGTGGAACGACATCTTTGAGCGGCTTGAGCAGAACGGAACTTCTACCAAGTTTTTTTGA

SEQIDNo.2(cbh1启动子)：

GGGTTTGGAGCAATGTGGGACTTTGATGGTCATCAAACAAAGAACGAAGACGCCTCTTTTGCAAAGTTTTGTTTCGGCTACGGTGAAGAACTGGATACTTGTTGTGTCTTCTGTGTATTTTTGTGGCAACAAGAGGCCAGAGACAATCTATTCAAACACCAAGCTTGCTCTTTTGAGCTACAAGAACCTGTGGGGTATATATCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT

SEQIDNo.3(cbh1终止子)

AGCTCCGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCACGGCAAAGGTATTTCATGATCGTTCAATGTTGATATTGTTCCCGCCAGTATGGCTCCACCCCCATCTCCGCGAATCTCCTCTTCTCGAACGCGGTAGTGGCGCGCCAATTGGTAATGACCCATAGGGAGACAAACAGCATAATAGCAACAGTGGAAATTAGTGGCGCAATAATTGAGAACACAGTGAGACCATAGCTGGCGGCCTGGAAAGCACTGTTGGAGACCAACTTGTCCGTTGCGAGGCCAACTTGCATTGCTGTCAAGACGATGACAACGTAGCCGAGGACCGTCACAAGGGACGCAAAGTTGTCGCGGATGAGGTCTCCGTAGATGGCATAGCCGGCAATCCGAGAGTAGCCTCTCAACAGGTGGCCTTTTCGAAACCGGTAAACCTTGTTCAGACGTCCTAGCCGCAGCTCACCGTACCAGTATCGAGGATTGACGGCAGAATAGCAGTGGCTCTCCAGGATTTGACTGGACAAAATCTTCCAGTATTCCCAGGTCACAGTGTCTGGCAGAAGTCCCTTCTCGCGTGCGAGTCGAAAGTCGCTATAGTGCGCAATGAGAGCACAGTAGGAGAATAGGAACCCGCGAGCACATTGTTCAATCTCCACATGAATTGGATGACTGCTGGGCAGAATGTGCTGCCTCCAAAATCCTGCGTCCAACAGATACTCTGGCAGGGGCTTCAGATGAATGCCTCTGGGCCCCCAGATAAGATGCAGCTCTGGATTCTCGGTTACGATGATATCGCGAGAGAGCACGAGTTGGTGATGGAGGGGACGAGGAGGCATAGGTCGGCCGCAGGCCCATAACCAGTCTTGCACAGCATTGATCTTCCTCACGAGGAGCTCCTGATGCAGAAACTCCTCCATGTTGCTGATTGGGTTGAGAATTTCATCGCTCCTGGATCGTATGGTTGCTGGCAAGACCCTGCTTAACCGTGCCGTGTCATGGTCATCTCTGGTGGCTTCGTCGCTGGCCTGTCTTTGCAATTCGACAGCAAATGGTGGAGATCTCTCTATCGTGACAGTCATGGTAGCGATAGCTAGGTGTCGTTGCACGCACATAGGCCGAAATGCGAAGTGGAAAGAATTTCCCGGCGCGGAATGAAGTCTCGTCATTTTGTACTCGTACTCGACACCTCCACCGAAGTGTT根据本发明的具体实施方式，设计引物，从里氏木霉TU-6的基因组DNA中扩增cbh1基因启动子片段、TrLPMO9C全长基因片段和cbh1终止子，同时用KpnI、SacI将pRS424质粒载体进行双酶切，电泳回收这四个片段。将这四个片段同时转化酿酒酵母AH109菌株，由于在引物设计时，加入了末端的互补序列，因此pRS424和这三个外源片段可以通过酿酒酵母的体内重组无缝拼接起来。挑取筛选平板上的阳性克隆，通过PCR及质粒测序的方法验证这三个外源片段的插入。经验证这三个外源片段同时且正确拼接的质粒即为受cbh1启动子调控的、能过表达TrLPMO9C的重组质粒。将重组转化子接种于土豆培养基平板上产孢，将1×10⁷孢子接种到100ml以葡萄糖作为唯一碳源的MM-glucose培养基中，并于30℃，180rpm培养3天。将菌丝过滤、无菌水洗涤并转移至100ml以微晶纤维素Avicel做唯一碳源的MM-Avicel培养基中，继续于30℃，180rpm培养7天。

本发明通过对里氏木霉的TrLPMO9C基因进行过表达，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养7天后，其纤维素酶的滤纸酶活0.21U/ml，CMC酶活0.40U/ml，较出发菌株均有一定程度的提高。

附图说明

图1为pLPMO9C质粒构建及其作用示意图。

图2显示TrLPMO9C在里氏木霉RUT-C30基因组的整合及表达鉴定，A：PCR检测TrLPMO表达盒在里氏木霉基因组中的插入，1，DNA分子量标准；2，水对照；3，RUT-C30出发菌株；4-13，转化子1-10。B：SDS-PAGE电泳检测重组TrLPMO的表达。1，蛋白质分子量标准；2，RUT-C30出发菌株；3-7：转化子1-5。

图3显示RUT-C30和转化子(Transformant-1)的纤维素酶酶活比较.A：滤纸酶酶活；B：外切酶CBHI酶活；C：CMC酶活；D：葡萄糖苷酶酶活。

具体实施方式

实施例1TrLPMO9C基因进行过表达的重组质粒pLPMO9C的构建

通过构建pLPMO9C重组质粒，转入里氏木霉中，在cbh1启动子的驱动下转录并合成LPMO9C蛋白分泌至胞外。pCre1-i的质粒构建示意图如图1所示。

cbh1启动子的扩增

以里氏木霉Tu-6的基因组DNA为模板，以Pcbh1pF1(5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCGGCCGCGGGTTTGGAGCAATGTGGGAC-3')和Pcbh1pR1(5'-CGGAGCTGGATCCGAATTCGTCGACCTCGAGGGTACCAGCACGAGCTGTGGCCAAGAAG-3')为引物对cbh1基因启动子进行扩增。PCR反应条件为：95℃×5分钟->94℃×0.5分钟，55℃×0.5分钟，,72℃×2分钟，35个循环->72℃×10分钟->结束反应。在1％琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DNA。

TrLPMO9C全长基因片段的扩增

以里氏木霉Tu-6的基因组DNA为模板，以PLPMO9CF1(5'-CGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCACACAACTTTCACCACGCTCTTC-3')和PLPMO9CR1(5'-ATCTACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCCACGGAGCTTCAAAAAAACTTGGTAGAAGTTCCG-3')为引物对反向的TrLPMO9C全长基因进行扩增。PCR反应条件为：95℃×5分钟->94℃×0.5分钟，55℃×0.5分钟，,72℃×1.5分钟，35个循环->72℃×10分钟->结束反应。在1％琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DNA。

cbh1终止子片段的扩增

以里氏木霉Tu-6的基因组DNA为模板，以Pcbh1tF1(5'-TCGTGCTGGTACCCTCGAGGTCGACGAATTCGGATCCAGCTCCGTGGCGAAAGCCTGAC-3')和Pcbh1tR1(5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCGGCCGCAACACTTCGGTGGAGGTGTCG-3')为引物对正向的cbh1终止子进行扩增。PCR反应条件为：95℃×5分钟->94℃×0.5分钟，55℃×0.5分钟，,72℃×1分钟，35个循环->72℃×10分钟->结束反应。在1％琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DNA。

pLPMO9C质粒的构建

将pRS424质粒用KpnI、SacI双酶切，电泳、回收线性化质粒载体。将其和cbh1启动子、LPMO9C基因、cbh1终止子DNA片段按1:3:3:3的摩尔比用氯化锂法共同转化酿酒酵母AH109的感受态细胞，涂布在SD-Trp培养基上，30℃静置培养48h。对酵母菌落做菌落PCR，以鉴定三个片段是否已经连接到pRS424上。将PCR鉴定为阳性的酵母菌落挑取并接种于3mlYPD培养基上，30℃、180rpm振摇培养过夜，提取质粒。将重组质粒转化大肠杆菌TransI-T1感受态细胞，涂布于含100μg/ml氨苄的LB琼脂平板上，37℃静置培养16h。挑取单克隆菌落，接种于3mlLB培养基(含100μg/ml氨苄)中，37℃、180rpm振摇培养过夜，提取质粒，备用于转化。

实施例2pLPMO9C转化入里氏木霉

含潮霉素抗性基因hph的pRLMex30质粒的准备

pRLMex30质粒含有潮霉素抗性基因hph，该抗性基因可在里氏木霉的pki组成型启动子和cbh1终止子的调控下进行组成型的表达。将pRLMex30质粒转化大肠杆菌TransI-T1感受态细胞，涂布于含100μg/ml氨苄的LB琼脂平板上，37℃静置培养16h。挑取单克隆菌落，接种于3mlLB培养基(含100μg/ml氨苄)中，37℃、180rpm振摇培养过夜，提取质粒，备用于转化。

里氏木霉RUT-C30的转化

将里氏木霉RUT-C30接种于土豆培养基(PDA)平板上，30℃静置培养7d待其产孢，将孢子刮下并接种于100mlPDB培养基中，30℃、180rpm振摇培养过夜。在12层纱布上过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的Lysingenzymes(购自Sigma公司)，在30℃消化1-2小时。收集原生质体，将pLPMO9C质粒和pRLMex30质粒DNA(各5μg)混合，以PEG介导的原生质体转化法将两种DNA同时转入里氏木霉RUT-C30菌株。

实施例3重组转化子的筛选

转化子在含1M山梨醇和300μg/ml的MM-glucose琼脂培养基上生长、选择。挑取单个克隆于MM-glucose琼脂培养基上生长。提取基因组DNA，通过PCR验证pLPMO9C质粒已经成功转化进入里氏木霉细胞。PCR所用引物为：PLPMO9CD_f(5’-GCTCTCCCCATCTACTCATCAACTC-3’)和PLPMO9CD_r(5’-GCTGCTGAGCATCGGGCCAGAGGCG-3’)。

在1％琼脂糖胶上电泳，有10个转化子出现和预期一致大小的DNA条带(如图2所示)。因此，这些转化子是有pLPMO9C质粒转入的阳性转化子。将这些转化子接种于PDA培养基上，30℃静置培养7d产孢，收集孢子备用。

实施例4.转化子的诱导培养和纤维素酶活测定

转化子的诱导培养

经预实验证明，第1号转化子(Transformant-1)的纤维素酶酶活提高最为显著。因此，将出发菌株RUT-C30的孢子和转化子Transformant-1的孢子，分别接种1×10⁷于100mlMM-glucose培养基中。30℃、180rpm振摇培养3d。将菌丝用12层纱布过滤，收集菌丝并用大量无菌水冲洗，以去除残余的葡萄糖。

称取等量(200mg)的菌丝，接种于100mlMM-Avicel液体培养基中，出发菌株和每个转化子均做3个平行。30℃、180rpm振摇培养7d以诱导纤维素酶的生产。从第3d开始，每12小时收集发酵液，储存于4℃冰箱备用。

纤维素酶活测定

对出发菌株RUT-C30和转化子Transformant-1，分别测定每个时间点取出的发酵液中总体纤维素酶酶活(滤纸酶酶活)及各分解酶酶活包括内切纤维素酶酶活(CMC酶活)、外切纤维素酶酶活(CBH酶活)以及β-葡萄糖苷酶酶活(BG酶活)。

纤维素酶滤纸酶活的测定：纤维素酶的滤纸酶活(FPaseactivity)采用Whatman一号滤纸，参照IUPAC标准方法进行测定。将Whatman1号滤纸制成1.5cm长、1cm宽的形状(10mg左右)，折成4折，成M型。将滤纸条置于试管底部，加入醋酸—醋酸钠缓冲液(0.2M、pH5.0)350μl，抗坏血酸(200mM)5μl，铜离子(12.5mM)20μl。50℃水浴平衡后，加入酶液125μl(空白先不加)，混合均匀，使管内溶液浸没滤纸。50℃水浴保温1小时。向各试管中加入750μlDNS试剂，再向空白中补加酶液125μl，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。1ml液体酶，在50℃、pH5.0的条件下，从葡萄糖标准曲线求得葡萄糖含量，计算酶活力单位。以每分钟产生相当于1μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位(U)。酶活测定结果见图3A。

外切纤维素酶活的测定：用4-methylumbelliferyl-D-cellobioside(MUC,Sigma)作底物，称取30mgMUC，溶于3mlDMSO(Sigma)，再将其转移到27ml柠檬酸缓冲液(pH5.0，50mM)中。将25μl酶液和200μlMUC、25ul葡萄糖(1M)混合，此为不加纤维二糖实验组。在混合溶液中，葡萄糖会抑制BG降解MUC，因此，测得的活性实际为CBH1和EG的活性。同时设加纤维二糖实验组：25μl酶液、200μlMUC、25ul葡萄糖(1M)和纤维二糖(50mM)于50℃反应30min。加入纤维二糖会抑制CBH的活性，因此测得的是EG的活性。加入250μlNa₂CO₃(1M)。吸取200μl于370nm测定吸光度。将不加纤维二糖实验组OD值减去加纤维二糖实验组，即为外切纤维素酶较为特异的活性。一单位的外切纤维素酶酶活定义为每秒催化1nmolMUC水解所需要的酶量。酶活测定结果见图3B。

内切纤维素酶酶活测定：采用羧甲基纤维素钠(CMC)作为底物进行测定。取1g羧甲基纤维素钠，双蒸水定容至50ml，得到2％的羧甲基纤维素钠溶液。在2mlEP管中加入2％的羧甲基纤维素钠溶液30μl、醋酸—醋酸钠缓冲液(0.2M、pH5.0)35μl、抗坏血酸(40mM)5μl，Cu²⁺(5mM)10μl，50℃水浴平衡后，加入酶液20μl(空白先不加)，振荡混合均匀。50℃水浴保温1小时。向各EP管中加入,150μlDNS试剂，再向空白中加酶液20μl，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。在50℃、pH5.0的条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠，产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。酶活测定结果见图3C。

β-葡萄糖苷酶酶活的测定：采用pNPG为底物进行测定。称取4.8mgpNPG溶于4mlddH2O中，即为4mM底物。在2mlEP管中加入4mMpNPG25μl，醋酸—醋酸钠缓冲液(0.2M、pH5.0)40μl、抗坏血酸(40mM)5μl，Cu²⁺(5mM)10μl。50℃水浴平衡后，加入酶液20μl(空白先不加)，振荡混合均匀。50℃水浴保温2小时。向各EP中加入300μlNa₂CO₃(1M)，再向空白中加酶液20μl，混合均匀。吸取200μl于370nm测定吸光度。在50℃、pH5.0的条件下，每分钟水解pNPG，产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。酶活测定结果见图3D。

通过对里氏木霉的ΤρΛΠΜΟ9Χ基因进行过表达，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在中培养7天后，其纤维素酶的滤纸酶活0.21Y/μλ，ΧΜΧ酶活0.40Y/μλ，较出发菌株均有一定程度的提高。

Claims (4)

1.一种快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法，其特征在于，所述方法包括在里氏木霉中过表达里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPMO9C基因的步骤。

2.根据权利要求1所述的快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法，其特征在于，以pRS424为骨架质粒，依次连接核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的cbh1启动子、核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的TrLPMO9C基因和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的cbh1终止子的片段，构建TrLPMO9C基因的过表达质粒。

3.高产纤维素酶酶活的重组里氏木霉，其特征在于，在里氏木霉中过表达里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPMO9C基因。

4.根据权利要求3所述的高产纤维素酶酶活的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉包含里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPMO9C基因的过表达质粒，以pRS424为骨架质粒，依次连接核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的cbh1启动子、核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的TrLPMO9C基因和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的cbh1终止子的片段，构建TrLPMO9C基因的过表达质粒。