CN105779314B - Gsp亚基蛋白在调控里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用 - Google Patents

Gsp亚基蛋白在调控里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了里氏木霉GSP亚基蛋白过表达在提高里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用。还提供了一种提高里氏木霉胞外蛋白分泌量的方法，所述方法包括构建过表达里氏木霉GSP亚基蛋白的重组里氏木霉的步骤；还进一步提供了一种构建过表达里氏木霉GSP亚基蛋白的重组里氏木霉的方法和由该方法获得的重组里氏木霉。

Description

GSP亚基蛋白在调控里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种里氏木霉GSP亚基蛋白在调控里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用。
背景技术
丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种嗜温的腐生真菌，被广泛应用于生产食品、饲料、纺织、制浆和造纸等行业用纤维素和半纤维素酶。目前已成为研究纤维素降解的重要模式菌株。里氏木霉是FDA认证的安全生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉也是一种非常理想的重组蛋白表达宿主。目前研究表明里氏木霉纤维素酶基因的表达调控是在转录水平进行的，受到转录激活因子的促进和碳代谢抑制蛋白的阻遏，在以往的研究中，人们采用基因克隆、酵母杂交等传统方法分离，仅仅鉴定了3个转录激活因子(Ace2、Hap2/3/5、Xyrl)和2个阻遏蛋白(CreI、Ace I)。同时也有研究表明阻遏蛋白的铗失可以显著提高里氏木霉外分泌蛋白的表达水平。基于里氏木霉纤维素酶表达调控的复杂性，在其转录调控过程中应该还有许多关键的调控因子仍然没被发现。运用蛋白质组学技术，通过对比不同状态下的里氏木霉的磷酸化蛋白质组，分析差异蛋白的功能，研究其在纤维素酶半纤维素酶生物合成中的作用有望从机制本身进一步提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。
磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控修饰形式，由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，发生酯化作用，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力，在许多生物学过程，如信号传导、基因表达、细胞分裂等的调控中起着重要作用，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化；有些蛋白质在原核生物和真核生物中均可被磷酸化，它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。所以我们相信，调控里氏木霉合成和分泌纤维素酶的蛋白中一定有磷酸化蛋白。
随着蛋白质组学的发展，从最开始的双向电泳慢慢发展到现在的质谱分析技术，包括无标记定量法和稳定同位素标记定量法。其中，基于稳定同位素标记的蛋白质组定量方法可以在不同步骤实现样品混合，可以同时实现多重标记及消除色谱-质谱联用分析过程中不稳定性带来的定量误差等优点，成为定量蛋白质组学研究中最常用的方法。根据同位素引入的方式，基于稳定同位素标记的蛋白质组定量方法可以分为代谢标记法、化学标记法和酶解标记法。采用不同方法，标记同位素的样品在不同步骤混合；越早混合，样品预处理步骤引入的误差越小，定量的准确度越高。进行相对定量时，采用代谢标记法则样品在细胞水平混合；采用化学标记法则样品在蛋白质或者肽段水平混合；采用酶解标记法则样品在肽段水平混合。本发明是在现有技术的基础上对里氏木霉GSP蛋白的功能进行研究并获得一种提高里氏木霉胞外蛋白的分泌量的新方法。
发明内容
为了提高里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白的分泌量，其中所述胞外蛋白优选纤维素酶，本发明提供了一种全新的提高里氏木霉胞外蛋白分泌量的方法，所述方法包括构建过表达里氏木霉GSP亚基蛋白的重组里氏木霉的步骤。
本发明的另一方面提供了里氏木霉GSP亚基蛋白在调控里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用，其中所述胞外蛋白优选纤维素酶。本发明进一步地提供了里氏木霉GSP亚基蛋白的过表在提高里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用，其中所述胞外蛋白为纤维素酶。
本发明的另一个方面还提供了一种构建过表达里氏木霉GSP亚基蛋白的重组里氏木霉的方法，包括以下步骤：
(1)合成并扩增GSP亚基基因；
(2)将GSP亚基基因与表达载体Ppdc-Tcbh1可操作地连接，构建重组质粒Ppdc-GSP-Tcbh1，其结构如图1所示；
(3)将重组质粒Ppdc-GSP-Tcbh1与质粒pAN7-1共转化里氏木霉，获得过表达里氏木霉GSP亚基蛋白的重组里氏木霉，从而获得重提高里氏木霉纤维素酶表达量的重组里氏木霉菌株。
本发明的再一个方面是提供了由上述构建方法获得的过表达GSP亚基蛋白的重组里氏木霉菌株。
附图说明
图1是本发明所述表达载体Ppdc-Tcbh1的结构示意图。
图2是本发明所述Ppdc-GSP-Tcbh1重组质粒的结构示意图。
图3是重组菌株和对照菌株中的GSP基因表达量对比图。
图4是重组菌株和对照菌株在诱导培养基中分泌酶的CMC酶活的时间过程。
其中，三角形表示重组菌株T.reesei-GSP，正方形表示对照菌株。
图5重组菌株和对照菌株在诱导培养基中分泌酶的滤纸酶活的时间过程。
其中，三角形表示重组菌株T.reesei-GSP，正方形表示对照菌株。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的全部材料、试剂，质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中所有引物均由英潍捷基公司合成。
菌株T.reesei rut-c30购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)
土豆培养基PDA(1000ml)：20g去皮马铃薯，切碎，加入900mL水，煮沸30min，双层纱布过滤，加入2g葡萄糖和1.8g琼脂粉，用水定容至1000mL，115℃高压蒸气灭菌。
基本培养基(Minimal medium，MM)组成：溶剂为水，每升培养基中溶质及其质量为：0.05g(NH4)2SO4，0.15g KH2PO4，0.006g MgSO4，0.006g CaCl2，0.00005g FeSO47H2O，0.000016g MnSO4.H2O，0.000014g ZnSO4.7H2O，0.00002g CoCl2。
发酵培养基：在MM培养基中加入下列碳源(如2％纤维素、3％乳糖、1％木聚糖、2％葡萄糖、2％甘油，终浓度)之一，pH 4.8±0.1。
A1、含2％葡萄糖的MM液体培养基：在MM中加入葡萄糖至终浓度为2％(质量百分浓度)得到的液体培养基。
A2、含2％微晶纤维素液体培养基：在MM中加入微晶纤维素至终浓度为2％(质量百分浓度)得到的液体培养基。
LB培养基：溶剂是水，每升培养基中溶质及其质量百分含量为：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物。
里氏木霉染色体DNA提取试剂盒：购置上海生工公司。
蛋白提取，酶解，磷酸化富集及标记试剂：蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，pbs，胰蛋白酶，50mM NH4HCO3，8mol尿素，碘代乙酰胺，二硫苏糖醇，10％氨水，甲醛，氘代甲醛，氰基硼氢化钠，Tio2磁珠。
【实施例1】里氏木霉纤维素酶调控表达蛋白的筛选
1、里氏木霉蛋白组的提取及浓度测定
将里氏木霉T.reesei rut-c30接种于PDA培养基上，于28℃恒温培养7天至孢子成熟。制备适量孢子悬液接种于液体种子培养基中，于28℃，250rpm条件下培养2天至菌丝体浓度达到4～5g/L，然后分别转接与诱导培养基中(A2)和阻遏培养基中(A1)，于28℃，250rpm条件下培养4天。采用超速离心法提取里氏木霉全蛋白组，抽滤，研磨然后加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的pbs缓冲液，高速离心取上清并进行蛋白浓度测量，用Bradford法对蛋白进行定量。
2、里氏木霉全蛋白组的酶切
取两只10K超滤管编号，分别加入1mg的诱导组和阻遏组的里氏木霉全蛋白。每管加入800ul 8mol尿素的尿素进行变性，轻微振荡30min后于12000转离心30min，弃去外管溶液然后再重复一次；每管分别加入100ul，100Mmde二硫苏糖醇还原肽段，轻微振荡30min，然后12000转离心20min，弃去外管溶液；加入100ul，50Mm的碘代乙酰胺用以封闭肽段，轻微振荡30min，然后12000转离心30min，弃去外管溶液；再加入250ul，50mM的NH4HCO3，离心20min，弃去外管溶液；再向超滤管内管中加入250ug的胰蛋白酶和250ul，50mM的NH4HCO3 buffer37度酶切过夜；换新的干净无污染的外管，12000转离心20min直至内管溶液全部离出，冻干备用。
3、磷酸化肽段的富集
用lording buffer溶解上述肽段，按1∶1的质量比加入二氧化钛磁珠，振荡10分钟，离心去上清，加入wash buffer1振荡10分钟，离心去上清，重复一次，再加入washbuffer2振荡10分钟离心取上清，重复一次，加入100ul的10％的氨水洗脱，重复一次，冻干，加入lc-ms上样缓冲液，然后进行质谱分析。
所述lording buffer的配方为：2％的三氟乙酸和65％的饱和谷氨酸乙腈溶液。
所述wash buffer1的配方为：0.5％的三氟乙酸和50％的乙腈溶液。
所述wash buffer2的配方为；0.1％的三氟乙酸和50％的乙腈溶液。
4、质谱数据处理
首先利用ProteinPilotTM Software 5.0软件和Trichoderma reesei genomedata base v2.0(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)数据库对lc-ms信号进行解锁。然后再应用skyline软件(https://skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view)对数据进行分析，skyline利用反应监测(SRM)/多反应监测(MRM)和全扫描(MS1和MS/MS)等方法定量和分析结果数据。利用IDA(Information Dependent Acquisition)数据中的二级图谱对多肽进行定性，然后用一级图谱中多肽对应的峰面积进行定量，多肽相加即可代表相应蛋白的面积。
5、差异蛋白定量方法
扫描PeptideSummary的峰面积数据，将所有相同前体离子的峰面积相加；然后将三个样本(包括实验重复)列在同一矩阵中，样本之间鉴定存在差别的前体离子赋予极小值(如0或0.0001)，对矩阵进行quantile normalization及log2转换；不同前体离子(多肽)对应同一蛋白时，取中位数；再用线性模型及贝叶斯估算方法对表达矩阵2-3进行统计学检验，筛选出可信结果；最后为了控制假阳性率(FDR)，利用Holm-Bonferroni方法对得到的p值进行调整，选取调整后p小于0.05的结果。
6、差异蛋白的分析
通过上述步骤，共获得了32个差异蛋白，其中上调24个，下调8个。对这些差异蛋白进行生物信息学分析发现，大多数蛋白都是未知蛋白或是假设蛋白，功能并不是很清楚，为了进一步的了解这些蛋白功能，对这些蛋白进行blast对比，氨基酸序列分析等方法，大致预测出各种差异蛋白所具有的功能。通过对这些差异蛋白的功能分析，以及是否可能在调控纤维素酶的分泌过程产生作用等条件下，我们选择了GSP亚基蛋白作为研究对象进行后续实验，因为通过分析发现其具有介导信号转导的功能，说明可能会介导纤维素酶的分泌。
【实施例2】里氏木霉GSP亚基基因的克隆和重组里氏木霉的构建
在Trichoderma reesei genome database v2.0(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)上检索里氏木霉GSP亚基蛋白的基因序列全长。核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的GSP亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。以提取的里氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物F1和下游引物R1进行特异的PCR扩增分离GSP基因。
所用到的引物序列如下：
GSP-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中含有Pst I的酶切位点；
GSP-R：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其中含有BamH I的酶切位点；
以里氏木霉基因组为模板，使用TaKaRa公司的高保真DNA聚合酶PrimeStar HSDNA Pioymerase，用引物Ppdc-F/R扩增得到丙酮酸脱羧酶的启动子Ppdc，同时引入酶切位点HindIII和Pst I，经过双酶切回收后，插入到经过同样双酶切的载体PUC19中，得到PUC-Ppdc。再用引物Tcbh1-F/R从里氏木霉基因组中扩增出纤维二糖水解酶I的终止子Tcbh1，并引入酶切位点BamHI和EcoRI，双酶切回收后，插入到经过同样双酶切的载体PUC-Ppdc中，得到了载体Ppdc-Tcbh1，其结构如图1所示。将上述所获得的GSP亚基基因经Pst I和BamH I酶切后与经同样双酶切的表达载体Ppdc-Tcbh1连接，经转化大肠杆菌、筛选，获得含表达盒Ppdc-GSP-Tcbh1的重组质粒菌株，其质粒图谱如图2所示。总的大小约为5585bp。将重组质粒中的表达盒进行DNA测序分析，结果表明表达盒中各元素包括启动子、目的基因以及终止序列的结构正确。
Ppdc-F：5’-CCCAAGCTTAGGACTTCCAGGGCTACTTG-3’(SEQ ID NO：5)
Ppdc-R：5’-ACGGTCGACGATTGTGCTGTAGCTGCGCT-3’(SEQ ID NO：6)
Tcbh1-F：5’-CGCGGATCCAGCTCCGTGGCGAAAGCCT-3’(SEQ ID NO：7)
Tcbh1-R：5’-CCGGAATTCGAGGCTACTCTCGGATTGC-3’(SEQ ID NO：8)
Pdc启动子：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示
Tcbh1终止子：其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示
将上述表达盒Ppdc-GSP-Tcbh1和质粒pAN7-1(购于Biovectoer公司，GenBankno.z32698)共转化里氏木霉原生质体，转化后的原生质体在原生质体液体再生培养基中进行再生，培养24h后球状原生质体再生并长出芽管，呈短丝状，有些则凝集在一起。上述液体再生培养基的成分为里氏木霉液体种子培养基+STC(1.2M山梨醇-10mM pH7.5的Tris·Cl-50mM CaCl2)。将液体再生的原生质体均匀涂布在含100ug/ml潮霉素B的筛选平板上，28℃培养2天后得到具有潮霉素抗性的转化子10株，转化效率为2株/ug DNA。在对照实验中，未转化质粒的T.reesei原生质体在100ug/ml潮霉素B的筛选平板上不生长。取一株重组菌株进行基因型鉴定。以重组菌株的基因组DNA为模板，用引物PT-1F和PT-1R可以扩增出906bp左右的片段，对应于表达盒Ppdc-GSP-Tcbh1的大小，该重组菌株命名为T.reesei-GSP，用于后续的实验。
PT-1F：其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示
PT-1R：其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示
【实施例3】重组菌株T.reesei-GSP表达产物的分析
将在含潮霉素抗性的PDA平板上生长良好的重组菌株T.reesei-GSP和对照菌株接种于里氏木霉液体种子培养基中，培养48h后按5％的接种量转接到重组里氏木霉表达培养基中，培养72h后提取RNA，再进行反转录，得到重组菌株T.reesei-GSP和对照菌株的cDNA文库。然后用SYBR方法对重组菌株和对照菌株中的GSP基因的表达量进行相对定量。结果如图3所示。
上述里氏木霉液体种子的配方为：100ml/L Mandels营养液浓缩液，1.0ml/LMandels微量元素浓缩液，10g/L葡萄糖，1.0g/L蛋白胨，50ml/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5，1mol/L)，1.0～2.0g/L吐温80。
上述重组里氏木霉表达培养基配方为：100ml/L Mandels营养液浓缩液，1.0ml/LMandels微量元素浓缩液，60g/L葡萄糖，5.0g/L蛋白胨，50ml/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5，1mol/L)，1.0～2.0g/L吐温80。
上述Mandels营养液浓缩液、Mandels微量元素浓缩液和柠檬酸缓冲液的配方同上。
上述所用的RNA提取试剂盒，反转录试剂盒和qPCR试剂盒均购置于北京全式金公司。
上述qPCR中GSP基因和管家基因的引物分别如下：
GSP GF1：其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示
GRi：其核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示
管家基因SAR sra1-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示
sra1-R：其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示
【实施例4】重组菌株T.reesei-GSP中酶活的测定
羧甲基纤维素钠酶活测定
以羧甲基纤维素钠为底物，参照IUPAC标准方法进行测定。取发酵上清液100ul，加入到900ul的柠檬酸缓冲液(0.05M、pH 4.8)中，得到稀释10倍的酶液。每个EP管分别加入0.5mL 2％的CMC-Na，加入经过柠檬酸缓冲液(0.05M、pH4.8)稀释的酶液0.5mL.50℃水浴平衡后，加入已经稀释的酶液0.5mL(空白先不加)，混合均匀。50℃水浴保温1小时，迅速冷却。向各试管中加入3mL DNS试剂，再向空白中加酶液0.5mL，混合均匀。在沸水中煮10min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。1mL液体酶，在50℃、pH 4.8的条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠底物，产生1umol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个国际单位滤纸酶活(IU/ml)。CMC酶活如图4所示，最高酶活达到14.306IU/ml。相对于对照菌株酶活最大提高了2.735倍。
滤纸酶活测定
采用Whatman 1号滤纸，参照IUPAC标准方法进行测定。取发酵上清液100ul，加入到10mL柠檬酸缓冲液(0.05M、pH 4.8)中，得到稀释10倍的酶液。将Whatman 1号滤纸制成6cm长、1cm宽的形状(50mg左右)，折成4折，成M型。将滤纸条置于试管底部，加入柠檬酸(0.05M、pH4.8)1.5mL.50℃水浴平衡后，加入已经稀释的酶液0.5mL(空白先不加)，混合均匀，使管内溶液浸没滤纸。50℃水浴保温1小时，迅速冷却。向各试管中加入3mL DNS试剂，再向空白中加酶液0.5mL，混合均匀。在沸水中煮10min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25mL。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。1mL液体酶，在50℃、pH 4.8的条件下，每分钟水解滤纸底物，产生1umol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个国际单位滤纸酶活(IU/ml)。滤纸酶活如图5所示，最高酶活达到10.473IU/ml。相对于对照菌株酶活最大提高了1.82倍。
【实施例5】重组菌株T.reesei-GSP的稳定性实验
将重组菌株T.reesei-GSP在不含潮霉素抗性的PDA平板上连续传代五次，分别测定各次传代的重组菌株在表达培养基中的产酶活性，发现各次传代的重组菌株的产纤维素酶的能力没有显著差异，说明本发明所构建的重组菌株具有遗传稳定性。

Claims (2)

1.里氏木霉GSP亚基蛋白过表达在提高里氏木霉胞外蛋白分泌量中的应用，其中所述里氏木霉胞外蛋白为里氏木霉纤维素酶，所述GSP亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种提高里氏木霉胞外蛋白分泌量的方法，所述方法包括构建过表达里氏木霉GSP亚基蛋白的重组里氏木霉的步骤，其中所述里氏木霉胞外蛋白为里氏木霉纤维素酶，所述GSP亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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