JP5707494B2 - 粘性の表現型を変化させた糸状菌 - Google Patents
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（関連出願の相互参照）
本出願は２０１０年８月２５日出願の米国特許仮出願６１／３７７，０３０号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本案件に組み込まれる。
本出願は２０１０年８月２５日出願の米国特許仮出願６１／３７７，０３０号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本案件に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明の菌株及び方法は、糸状菌から、生育特性が変化した変異体を生じさせる、遺伝子変異に関する。このような変異体は、深部培養（例えば、商業的用途のための酵素及び他のタンパク質又は代謝物の大量生産）での生育に非常に好適である。
本発明の菌株及び方法は、糸状菌から、生育特性が変化した変異体を生じさせる、遺伝子変異に関する。このような変異体は、深部培養（例えば、商業的用途のための酵素及び他のタンパク質又は代謝物の大量生産）での生育に非常に好適である。
参考文献
以下の参考文献及び本明細書に引用される追加の参考文献は、これによって参照により組み込まれる。
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Ｃａｒａｃｕｅｌ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １８：１１４０〜４７。
Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ．ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｄ．Ｊ．（２００８）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２９：１２９〜５１。
Ｋａｒｈｉｎｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｔｒａｆｆｉｃ ６：５６２〜７４。
Ｍｏｕｙｎａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５６：１６７５〜８８。
Ｐａｓｓｏｌｕｎｇｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ９：７〜１７。
Ｐｅｎｇ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１５２１〜２８。
Ｒｏｂｅｒｇ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４５：６５９〜７２。
Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５１：９７３〜８４。
Ｔｕｒｃｈｉｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｅｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１１６７〜７１。
糸状菌は、天然及び異種タンパク質を高濃度に発現し得ることから、工業用途で酵素及び他のタンパク質を大規模産生するにあたり非常に好適である。糸状菌は、典型的には、培地（すなわち、ブロス）の中に酸素及び栄養素を導入し分配するのに適合しているバイオリアクター内での深部培養により、菌糸体として生育する。菌糸の形態的特徴は、ブロスのレオロジー特性に影響し、ひいてはバイオリアクターの性能に影響する。
一般に、ブロスの粘性が高くなるほど酸素及び栄養素の分布は均一でなくなり、また培地を撹拌するのに必要とされるエネルギーは大きくなる。場合により、ブロスの粘性は、酸素及び栄養素の溶存に有意に干渉するほど高くなり、これにより真菌の生育に悪影響を与える。加えて、粘稠なブロスを混合及び通気するのに必要とされる電力は、産生コストを有意に押し上げ、モーター及び電力にかかる支出を大きくする恐れがある。
粘性の表現型が変化するような遺伝子変異を有する糸状菌に関する菌株及び方法が記載される。
一態様では、親菌株から誘導された糸状菌の変異菌株であって、この変異株が、変異菌株の細胞の機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を、親菌株の細胞と比較して変化させる、遺伝子変異を含み、変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵中に（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を変更する必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する、変異菌株。
一部の実施形態では、機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量の変化が、量を減少させる変化であり、深部培養における好気性発酵中に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する、変異菌株が提供される。
一部の実施形態では、遺伝子変異は、親菌株内に存在するｓｆｂ３遺伝子の破壊を含む。一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子のすべて又は一部を欠失させた結果得られる。一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部を欠失させた結果得られる。一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子に変異を導入した結果得られる。
一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる。一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる。一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、変異菌株に粘性を低下させる表現型を付与するための主要な遺伝的決定因子になる。
一部の実施形態では、変異菌株は機能性Ｓｆｂ３タンパク質を産生しない。一部の実施形態では、変異菌株はＳｆｂ３タンパク質を産生しない。
一部の実施形態では、変異菌株は、対象のタンパク質をコードする遺伝子を含む。
一部の実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たりに前記親菌株と実質的に同量のタンパク質を産生する。一部の実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たりに前記親菌株と実質的に同量の対象のタンパク質を産生する。
一部の実施形態では、Ｓｆｂ３タンパク質は、アミノ酸配列ＩＱＬＡＲＱＧＸＤＧＸＥＸＸＸＡＲＸＬＸＥＤＲＮＸＥＡＸＳＸＶＤＷＬ（配列番号９、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含む。
一部の実施形態では、糸状菌は、チャワンタケ（Pezizomycotina）種である。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）である。
別の態様では、糸状菌細胞の変異菌株の産生方法であって、遺伝子変異を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程を含み、前記遺伝子変異が前記親菌株の細胞と比較して機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を変化させることで、深部培養における好気性発酵中に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を変更する必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する、変異糸状菌細胞を製造する、方法。
一部の実施形態では、この遺伝子変異は、機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を低下させ又は抑制することで、深部培養における好気性発酵中に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する、変異糸状菌細胞を製造する。
一部の実施形態では、この遺伝子変異は、遺伝子操作を使用して、親糸状菌細胞中のｓｆｂ３遺伝子を破壊することを含む。
一部の実施形態では、この遺伝子変異は、遺伝子操作を使用して、親糸状菌細胞中のｓｆｂ３遺伝子を欠失させることを含む。
一部の実施形態では、この遺伝子変異は、部位特異的遺伝子組み換えを使用して、行われる。一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる。
一部の実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たりに前記親菌株と実質的に同量のタンパク質を産生する。一部の実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たりに前記親菌株と実質的に同量の対象のタンパク質を産生する。
一部の実施形態では、Ｓｆｂ３タンパク質は、アミノ酸配列ＩＱＬＡＲＱＧＸＤＧＸＥＸＸＸＡＲＸＬＸＥＤＲＮＸＥＡＸＳＸＶＤＷＬ（配列番号９、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含む。
一部の実施形態では、糸状菌は、チャワンタケ（Pezizomycotina）種である。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）である。
一部の実施形態では、親菌株は、対象のタンパク質をコードする遺伝子を含む。一部の実施形態では、対象のタンパク質をコードする遺伝子は、機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生を低下させる又は抑制する遺伝子変異を導入する前に、親菌株内に存在する。
別の態様では、前述の変異菌株により産生される対象のタンパク質が提供される。
別の態様では、前述の方法により産生される糸状菌の変異菌株が提供される。
別の態様では、親菌株から誘導される糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、（ａ）（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要があること、並びに／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持すること、をもたらす遺伝子変異と、（ｂ）（ａ）における遺伝子変異の前に対象のタンパク質をコードする遺伝子が前記変異菌株中に存在する、対象のタンパク質をコードする遺伝子と、を含む、変異菌株が提供される。
一部の実施形態では、遺伝子変異は、親菌株内に存在するｓｆｂ３遺伝子の破壊を含む。一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる。
別の態様では、粘性が変更された表現型について変異糸状菌細胞をスクリーニングするための方法であって、（ａ）糸状菌の親菌株の細胞に変異を誘導して変異細胞を製造する工程と、（ｂ）蛍光染色に対する感度の変化について前記変異細胞をスクリーニングする工程と、（ｃ）前記蛍光染色に対し感度の変更された変異菌株を選択する工程と、を含み、前記蛍光染色に対し変更された感度と、前記変異糸状菌細胞が、深部培養における好気性発酵中に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を変更する必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する能力と、が相関する、方法が提供される。
一部の実施形態では、前記変更された感度は増加した感度であり、前記変異糸状菌細胞が、深部培養における好気性発酵中に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要があり、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する。一部の実施形態では、蛍光染色は、カルコフロールホワイト（Calcofluor White）である。
一部の実施形態では、細胞の変異誘導は、遺伝子組み換えにより行われる。一部の実施形態では、細胞の変異誘導は、ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる。
別の態様では、糸状菌のチャワンタケ種におけるＳｆｂ３ポリペプチドを同定するための方法であって、（ａ）糸状菌のチャワンタケ種からアミノ酸配列を得る工程と、（ｂ）隣接アミノ酸配列ＩＱＬＡＲＱＧＸＤＧＸＥＸＸＸＡＲＸＬＸＥＤＲＮＸＥＡＸＳＸＶＤＷＬ（配列番号９、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）の存在について前記アミノ酸配列をスクリーニングする工程と、を含み、（ｃ）前記糸状菌のチャワンタケ種のアミノ酸配列中に配列番号９が存在することで、前記糸状菌のチャワンタケ種のアミノ酸配列がｓｆｂ３ポリペプチドであることを示される、方法が提供される。
別の態様では、前述の方法により同定された単離ｓｆｂ３ポリペプチドが提供される。
また更なる態様では、糸状菌において対象のタンパク質を産生させるための方法であって、親糸状菌細胞に、前記対象のタンパク質をコードする遺伝子と、前記細胞中のＳｆｂ３タンパク質の量又は活性を減少させる遺伝子変異と、を導入することで、深部培養における好気性発酵中に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を変更する必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、変更された溶存酸素量を維持する、対象のタンパク質を含む細胞ブロスを産生する、変異糸状菌細胞を製造することを含み、ここで、対象のタンパク質が親細胞と比較して変異細胞中で実質的に同じ濃度で産生される、方法が提供される。
一部の実施形態では、対象のタンパク質は、対象の１種を超える（又は１種以上の）タンパク質であり、対象の１種を超えるタンパク質の各々は、親細胞と比較して変異細胞中で実質的に同じ相対濃度で産生される。特定の実施形態では、対象の１種を超えるタンパク質の各々は、セルラーゼ及びヘミセルラーゼから選択される。
関連する態様では、このような方法により産生される対象のタンパク質が提供される。更に別の関連する態様では、このような方法により産生される１種を超える対象のタンパク質を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、この組成物は、全セルラーゼ組成物（whole cellulase composition）である。
本発明の菌株及び方法の、これらの及び他の、態様及び実施形態は、添付の図を包含する説明から明らかになる。
Ｉ．概要
本発明の菌株及び方法は、形態及び生育特性に影響する遺伝子改変のなされた変異糸状菌細胞に関する。変異細胞を深部培養で生育した場合、これらは、親菌株の細胞を含む細胞ブロスと比較して、異なるレオロジー特性を有する細胞ブロスを産生する。これらの変異菌株のうち一部ものは、酵素及び他の商業的に重要なタンパク質の大量生産に非常に好適である。
本発明の菌株及び方法は、形態及び生育特性に影響する遺伝子改変のなされた変異糸状菌細胞に関する。変異細胞を深部培養で生育した場合、これらは、親菌株の細胞を含む細胞ブロスと比較して、異なるレオロジー特性を有する細胞ブロスを産生する。これらの変異菌株のうち一部ものは、酵素及び他の商業的に重要なタンパク質の大量生産に非常に好適である。
ＩＩ．定義
本発明の菌株及び方法を詳細に説明するのに先立ち、明確性のために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、関連技術分野で使用される場合にこれらの用語が通常持っている意味に従うものとする。
本発明の菌株及び方法を詳細に説明するのに先立ち、明確性のために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、関連技術分野で使用される場合にこれらの用語が通常持っている意味に従うものとする。
本明細書で使用するとき、「トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）」は、子嚢菌門チャワンタケ亜門（phylum Ascomycota, subylum Pezizomycotina）の糸状菌を指す。この生物は、かつて、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）として、並びにハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）としても、分類されていた。
本明細書で使用するとき、語句「糸状菌細胞の変異菌株」又は同様の語句は、例えば、遺伝子操作により、チャワンタケに属する親（若しくは参照）菌株から誘導される（すなわち、親若しくは参照菌株から得られる又はこれらの菌株から入手可能である）糸状菌細胞の菌株を指す。
本明細書で使用するとき、用語「対象のタンパク質」は、任意選択で高濃度で並びに商業目的のために、糸状菌において発現させることが所望されるポリペプチドを指す。このようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質（surface-active protein）、構造タンパク質又はこれらに類するものであり得る。
本明細書で使用するとき、語句「実質的に活性を有さない」又は同様の語句は、特定の活性が混和物中で検出不可能であるか又は混和物に意図された目的に干渉しない量で存在するかのいずれかであることを意味する。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指すために互換的に使用される。アミノ酸残基については従来の一文字又は三文字コードが本明細書でも使用される。ポリマーは直鎖であってもよく又は分枝鎖であってもよく、修飾化アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により割り込まれてもよい。これらの用語はまた、天然に又は介入により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、二硫化結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化反応又は任意の他の操作若しくは変性（標識成分との結合など）が挙げられる。例えば、１つ以上のアミノ酸類縁体を含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸など）並びに当該技術分野で既知の他の変更もまた、この定義の中に包含される。
本明細書で使用するとき、機能的に及び／又は構造的に同様のタンパク質は、「関連タンパク質」であると考えられる。このようなタンパク質は、異なる属及び／又は種の生物、あるいは、更には生物の異なる綱（例えば、細菌及び真菌）から誘導され得る。関連タンパク質はまた、一次配列分析により判定される、二次若しくは三次構造分析により判定される、又は、免疫学的交差により判定される、相同体を包含する。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド／タンパク質誘導体」は、Ｎ−末端及びＣ−末端のいずれか若しくは両方に１つ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列中の１つ若しくは多数の異なる部位で１つ以上のアミノ酸を置換することにより、タンパク質のいずれか若しくは両方の末端で又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を欠失させることにより、並びに／あるいは、アミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を挿入することにより、タンパク質から誘導される又は誘導可能であるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、このＤＮＡ配列により好適な宿主を形質転換させ、改変されたＤＮＡ配列を発現させてタンパク質誘導体を形成することにより、達成されてもよい。
関連タンパク質（及び誘導体）は、「変異タンパク質」を含む。変異タンパク質は、少数のアミノ酸残基での置換、欠失及び／又は挿入により参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）と異なる。変異体と親タンパク質との間で異なるアミノ酸残基の個数は１つ以上であり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基が異なり得る。変異タンパク質のアミノ酸配列は、参照タンパク質と比較した場合に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％以上が同一であってよい。変異タンパク質はまた、選択されたモチーフ、ドメイン、エピトープ、及び保存領域などが参照タンパク質と異なっていてもよい。
本明細書で使用するとき、用語「類似配列」は、対象のタンパク質（すなわち、元々の対象のタンパク質）と同様の機能、三次構造及び／又は保存残基を提供するタンパク質を構成する配列を指す。例えば、α−へリックス又はβ−シート構造を含有するエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は、好ましくは、同一の特異的構造を維持する。この用語はまた、ヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列を指す。一部の実施形態では、類似配列は、アミノ酸の置換により生じる変異酵素が、同様の又は改善された機能を示すよう開発される。一部の実施形態では、対象のタンパク質中のアミノ酸の三次構造及び／又は保存領域は、目的とする部分又は断片に若しくはこれらの近傍に位置する。それゆえに、目的とする部分又は断片が例えば、α−へリックス又はβ−シート構造を含有する場合、置換アミノ酸は好ましくはその特異的構造を維持する。
本明細書で使用するとき、用語「相同タンパク質」は、参照タンパク質と同様の活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。相同体は、必ずしも進化的関連があるものと意図されない。それゆえに、この用語は、異なる生物から得られる同じ、同様の又は対応する酵素（すなわち、構造及び機能の点で）を包含することが意図される。一部の実施形態では、参照タンパク質と同様の四次、三次及び／又は一次構造を有する相同体を同定することが望ましい。一部の実施形態では、相同タンパク質は、参照タンパク質と同様の免疫応答を引き起こす。一部の実施形態では、相同タンパク質は、所望の活性を有する酵素を産生するために設計される。
配列間の相同性の程度は、当該技術分野において既知である任意の好適な方法を用いて判定され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧｅｎｅｔｉｃｓソフトパックのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜９５を参照されたい）。
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性の程度を判定するのに有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、累進ペアワイズアライメントを用いて、関連する配列群から複数の配列アライメントを作成する。このアルゴリズムは、アライメントを作成するために使用されるクラスタの関係性を示す、樹形図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進アライメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜６０）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（１９８９）により記載されるものと類似のものである（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜５３）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトのギャップ・ウェイト：３．００、デフォルトのギャップ長・ウェイト：０．１０、及びエンド・ギャップのウェイト化を含む。有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜８７）により記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。１つの具体的に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜８０を参照されたい）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」は、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’４及びストランド両方の比較をデフォルトとして使用する。
本明細書で使用するとき、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈における語句「実質的に同様である」及び「実質的に同一である」は典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は更には少なくとも約９９％の同一性又はそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬなどの既知のプログラムを使用して、判定され得る。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３；及びＨｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７〜２４４を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）により公開されている。また、ＦＡＳＴＡを用いてデータベースを探索してもよい（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜４８）。２つのポリペプチドが実質的に同一であることの１つの指標としては、第１ポリペプチドが、第２ポリペプチドと免疫的に交差反応性であることが挙げられる。通常、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが同類置換によってのみ異なる場合には、第二ポリペプチドに対して実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子が厳密な（例えば、中度〜高度な厳密性）条件下で互いにハイブリッド形成するか否かである。
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、タンパク質又はＲＮＡをコードし、発現を方向づける核酸を指すという点で、用語「対立遺伝子」と同義である。糸状菌の栄養型は一般に半数体であり、したがって、特定の表現型を付与するのに特定の遺伝子の単一コピー（すなわち、単一対立遺伝子）で十分である。
本明細書で使用するとき、「野生型」及び「天然」遺伝子、タンパク質又は菌株は、天然に見出されるものである。
本明細書で使用するとき、「遺伝子の欠失」は、宿主細胞のゲノムから遺伝子が除去されることを指す。遺伝子が、遺伝子のコード配列に直に隣接して位置しない制御因子（例えば、エンハンサー因子）を含む場合、遺伝子の欠失は、コード配列の欠失、並びに、任意選択で隣接したプロモーター及び／又はターミネーター配列の欠失、を指す。
本明細書で使用するとき、「遺伝子の破壊」は、宿主内での例えば、タンパク質といった、機能性遺伝子産物の産生を実質的に抑制する任意の遺伝子操作又は化学操作を広く指す。破壊の代表的方法としては、ポリペプチドをコードする配列、プロモーター、エンハンサー又は他の制御因子を含む遺伝子の任意の部分の完全な又は部分的な欠失、あるいはその変異誘導が挙げられ、変異誘導は、置換、挿入、欠失、転位及びこれらの組み合わせ並びに変形を包含し、これらの変異のうちのいくつかは機能性遺伝子産物の産生を実質的に抑制する。
本明細書で使用するとき、「遺伝子操作」は、予め選択された核酸配列に優先的に作用するマクロ分子（すなわち、酵素及び／又は核酸）を用いて、予め選択された標的核酸配列を変更することを指す。このように遺伝子操作は、予め選択されたわけではない核酸配列を、小分子を用いてランダムに変化させる化学操作とは異なる。
本明細書で使用するとき、「遺伝子変異」は、遺伝子操作により細胞のＤＮＡに生じる変化であり、化学操作により細胞のＤＮＡに生じる変化とは異なる。
本明細書で使用するとき、「好気性発酵」は、酸素の存在下での生育を指す。
本明細書で使用するとき、用語「細胞ブロス」は、総じて、液体／深部培養における培地及び細胞を指す。
本明細書で使用するとき、用語「細胞集団」は、液体／深部培養において存在する細胞成分（無傷及び溶解細胞を包含する）を指す。細胞集団は、乾燥又は湿潤重量で表現され得る。
本明細書で使用するとき、用語「レオロジー」は、物質の変形及び流動に関連する物理学の一分野を指す。
本明細書で使用するとき、「粘性」は、剪断応力又は引張応力などの機械的応力による変形に対する流体の抵抗の尺度である。本明細書の文脈では、粘性は、例えば、ローター／インペラによりもたらされるような機械的応力に対する、糸状菌を含む細胞ブロスの抵抗を指す。細胞ブロスの粘性は直接測定するのが困難であり得るため、予め選択された速度での撹拌した場合の培養ブロスの溶存酸素量、予め選択された溶存酸素量を維持するのに必要とされる撹拌速度、予め選択された溶存酸素量を維持するために細胞ブロスを撹拌するに必要とされる電力量、又は更には固体培地上のコロニー形態といった、粘性の間接的測定を用いてもよい。
本明細書で使用するとき、糸状菌細胞の「粘性が変更された」変異菌株は、親菌株により産生される相当する細胞ブロスと比較して、粘性が低下した又は増加した（すなわち、剪断又は引張応力に対する抵抗が低下した又は増加した）細胞ブロスを産生する変異菌株である。一般に、相当する細胞ブロスは、比較可能な細胞集団を含む。好ましくは、粘性が変更された変異菌株と親菌株との間の差異は、粘性の任意の直接又は間接尺度に関して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は更には少なくとも５０％、又はそれ以上である。糸状菌細胞ブロスの粘性を比較するための方法が本明細書に記載される。一般に、比較可能な（又は相当する）細胞ブロスは、比較可能な細胞集団を含む。
本明細書で使用するとき、糸状菌細胞の「粘性が低下した」変異菌株は、親菌株により産生される相当する細胞ブロスと比較して、粘性が低下した（すなわち、剪断又は引張応力に対する抵抗が低下した）細胞ブロスを産生する変異菌株である。好ましくは、粘性が変更された変異菌株と親菌株との間の差異は、粘性の任意の直接又は間接尺度に関して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は更には少なくとも５０％、又はそれ以上である。
本明細書で使用するとき、「主要な遺伝子的決定因子」は、他の遺伝子又はその遺伝子操作の不在下で、特定の表現型を付与するのに必要及び十分である遺伝子又はその遺伝子操作に関する。
本明細書で使用するとき、「機能性ポリペプチド／タンパク質」は、酵素活性、結合活性、表面活性特性又はこれらに類するものなどの活性を保有するタンパク質であって、変異誘導、切断ないしは別の方法で改変されてその活性を消失又は低下していないタンパク質である。機能性ポリペプチドは、指定に従って、熱安定性又は熱不安定性であり得る。
本明細書で使用するとき、「機能性遺伝子」は、活性な遺伝子産物を、典型的にはタンパク質などを産生するために、細胞成分により使用可能な遺伝子である。機能性遺伝子は、活性な遺伝子産物を産生するために細胞成分により使用することができないよう変性されている、破壊された遺伝子とは正反対のものである。
本明細書で使用するとき、変異細胞（又は変異菌株）は、変異細胞と親細胞の間のタンパク質発現の差異が約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約７％未満、約５％未満、又は更には約３％未満であるならば、親細胞（又は親菌株）と比較して「高レベルのタンパク質発現及び／又は分泌を維持又は保持する」。
本明細書で使用するとき、宿主細胞は、これらが、野生型Ｓｆｂ３タンパク質に特徴的な活性、特に菌糸の伸張を促進するないしは別の方法で液体培地において糸状菌の粘性を増加させる活性、を呈する機能性Ｓｆｂ３ポリペプチドの産生を抑制するように遺伝子的又は化学的に変更されているならば、「Ｓｆｂ３の産生を抑制するように改変」されている。このような改変としては、限定するものではないが、ｓｆｂ３遺伝子の欠失、ｓｆｂ３遺伝子の破壊、コードされるポリペプチドが上記活性を失うようなｓｆｂ３遺伝子の変更、翻訳後のプロセシング又は安定性に影響を与えるｓｆｂ３遺伝子の変更、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用するとき、「対象のタンパク質」は、糸状菌細胞の深部培養において産生されることが所望されるタンパク質である。一般に、対象のタンパク質は、工業又は製薬用途に関し商業的に重要なものであり、よって大量生産されることが望ましい。対象のタンパク質は、糸状菌により発現される多種多様な他のタンパク質とは区別されるものであり、こうした他のタンパク質は一般に製品としての関心の対象とはならず、主にバックグラウンドのタンパク質混入物と見なされる。
本明細書で使用するとき、変異細胞（又は変異菌株）は、変異細胞により産生されるタンパク質量の低下が親細胞により産生されるタンパク質量と比較して２０％以下、１５％以下、１０％以下、更には５％以下であるならば、バイオマス単位量当たりに親細胞（又は親菌株）と「実質的に同量」のタンパク質を産生することになり、ここで、タンパク質量は、タンパク質産生が測定される細胞の生物集団の合計量に対して標準化され、生物集団は湿潤（例えば、細胞ペレットの）又は乾燥重量のいずれかで表現され得る。
本明細書で使用するとき、変異細胞及び親細胞により発現される対象のタンパク質の量は、変異細胞と親細胞の間の発現の差異が約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は更には約１％未満であるならば、「実質的に同様」である。
本明細書で使用するとき、「蛍光色素」は、蛍光染料である。好ましい蛍光色素は、真菌の細胞壁中のセルロース及び／又はキチンに結合する。
本明細書で使用するとき、単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容的に明らかに示されていない限り、複数の対象物も包含する。本明細書に引用される参考文献はすべて、その全体が参照により本案件に組み込まれる。以下の略称／頭辞語は、特に指定されない限り、以下の意味を有する。
これまでに、粘性を低下させたトリコデルマ・リーゼイ菌株を開発する際には、化学的な変異誘導を行う工程と、それに続き得られた変異体をカルコフロールホワイト（真菌の細胞壁中に含まれるセルロース及びキチンに結合する蛍光染色）に対する感度についてスクリーニングする工程が包含された。カルコフロールホワイトに対する感度は、酵母形態の変化と関連しているが、糸状菌におけるカルコフロールホワイト感度の有意性は従来知られていなかった。上記の方法で、親トリコデルマ・リーゼイ菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒｇｌａＡ（２９−９）に化学的に変異誘導した結果、得られた１つの菌株（すなわち、７０Ｈ２）が、寒天プレート上でのコロニーの増殖性の低下、胞子形成の低下、形態の変化及び液体培地における粘性の低下を呈する一方で、高レベルのタンパク質発現及び分泌を維持することが判明した。比較ゲノム配列分析は、親２９−９菌株と比較して７０Ｈ２菌株中の複数の遺伝子に変異があることを明らかにした。
７０Ｈ２菌株は、「粘性が低下した」表現型を示したが、ゲノムは完全には画定されておらず、粘性を低下させる表現型に関与する遺伝子（１つ又は複数）は未知であった。その上、７０Ｈ２は、外因性遺伝子を高発現レベルで導入するための宿主菌株として使用できたのに対し、他の菌株には粘性を低下させる表現型に関与する遺伝子（１つ又は複数）を導入することができなかった。
ＩＶ．Ｓｆｂ３産生における変更は、糸状菌の細胞粘性に影響を与える
今回、Ｓｆｂ３産生量を変更させると意図状菌の細胞粘性に影響が生じることが発見された。この発見は、商業的に重要なタンパク質の発現に対する糸状菌の使用について重要な示唆を有する。
今回、Ｓｆｂ３産生量を変更させると意図状菌の細胞粘性に影響が生じることが発見された。この発見は、商業的に重要なタンパク質の発現に対する糸状菌の使用について重要な示唆を有する。
Ｓｆｂ３遺伝子（Ｌｓｔ１としても知られる）は、かつては、出芽酵母（すなわち、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae））においてのみ特徴付けれていたが、この遺伝子は、小胞体からゴルジ体へタンパク質を運搬する輸送小胞を囲むＣＯＰＩＩタンパク質に関連するタンパク質をコードする。Ｓｆｂ３並びにＳｆｂ２は、Ｓｅｃ２４の相同体であり、これらの遺伝子はすべて、小胞の中に特定の積荷タンパク質をパッケージングすることと関連する。
Ｓｅｃ２４が酵母において本質的な遺伝子であるのに対して、Ｓｆｂ３及びＳｆｂ２は本質的な遺伝子ではないが、酵母におけるＳｆｂ３の欠失は、原形質膜輸送タンパク質（Ｐｍａ１ｐ）の輸送と、細胞壁合成に関連するグルカノシルトランスフェラーゼ（Ｇａｓ１ｐ）と、に影響することが知られている。
問い合わせ配列としてＳ．セレヴィシエＳｅｃ２４ｐ、Ｓｆｂ３ｐ又はＳｆｂ２ｐアミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴを使用して、トリコエデルマ・リーゼイの公的に入手可能なゲノム配列を検索すると、Ｔ．リーゼイが、酵母Ｓｅｃ２４に対して最も相同に近い単一遺伝子と、酵母Ｓｆｂ３に対して最も相同に近い単一遺伝子と、を有することが明らかになる。他の相同体は同定されておらず、Ｔ．リーゼイがＳｆｂ２に相当する遺伝子を有さないことを示唆している。
問い合わせ配列としてＴ．リーゼイＳｆｂ３アミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴを使用して、チャワンタケ種の公的に入手可能なゲノム配列を検索すると、一般的なパターンが示される。すなわち、各真菌は、Ｓｆｂ３及びＳｅｃ２４の各々の明確な相同体を有するが、酵母Ｓｆｂ２に他よりも密接に関連する追加の相同体はこれらの糸状子嚢菌（filamentous ascomycetes）のゲノム内には存在しない。
Ｓｆｂ３タンパク質の相同体は、糸状菌（例えば、トリコデルマ・リーゼイ及びアスペルギルス・オリザエ）に見出されるが、これらのタンパク質の機能はこれまで知られていなかった。Ｓ．セレヴィシエ（配列番号１）、Ｔ．リーゼイ（配列番号２）、Ａ．オリザエ（配列番号３）、Ａ．ニガー（配列番号４）、Ｐ．フニクロスム（P.funiculosum）（配列番号５）、Ｐ．クリゾゲナム（P.chrysogenum）（配列番号６）、Ｎ．クラッサ（N.Crassa）（配列番号７）及びＦ．オキシスポラム（F.oxysporum）（配列番号８）のＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列は、以下に例として示される：配列番号４〜８は公的にアクセス可能な真菌ゲノムデータベースから入手したが、これらはアクセス番号は有してない。
サッカロマイセス・セレヴィシエＳｆｂ３のアミノ酸配列（配列番号１）：
ＭＳＱＱＮＩＬＡＡＳＶＳＡＬＳＬＤＥＳＴＶＨＴＧＧＡＳＳＫＫＳＲＲＰＨＲＡＹＨＮＦＳＳＧＴＶＰＴＬＧＮＳＰＹＴＴＰＱＬＮＱＱＤＧＦＱＱＰＱＡＦＴＰＫＱＦＧＧＦＮＮＧＳＧＳＶＭＳＴＰＶＭＶＳＱＥＲＦＧＡＳＥＡＳＳＰＹＧＱＳＭＬＤＭＴＡＰＱＰＴＳＨＩＶＰＴＱＲＦＥＤＱＡＱＹＬＱＲＳＦＥＴＣＲＤＳＶＰＰＬＰＴＴＱＦＹＣＶＤＱＧＳＣＤＰＨＬＭＳＬＳＭＹＮＩＰＥＳＥＨＬＲＡＡＴＫＬＰＬＧＬＴＩＱＰＦＳＴＬＴＰＮＤＡＥＶＰＴＩＰＬＰＭＤＧＴＰＬＲＣＲＲＣＲＡＹＡＮＰＫＦＱＦＴＹＤＳＳＶＩＣＮＩＣＲＶＫＭＱＶＰＧＥＨＦＡＰＭＧＰＮＧＱＲＳＤＬＮＥＫＳＥＬＬＨＧＴＶＤＦＬＶＰＳＩＹＮＡＩＱＥＫＥＬＬＰＬＨＹＶＦＬＩＤＶＳＬＬＡＮＥＮＧＳＳＬＡＭＶＥＧＶＲＳＣＩＥＹＩＳＤＦＱＰＮＣＥＶＡＩＩＶＹＤＮＫＬＲＦＦＮＬＲＰＤＬＤＮＡＱＥＹＩＶＳＥＬＤＤＶＦＬＰＦＹＮＧＬＦＶＫＰＧＮＳＭＫＩＩＮＤＴＬＩＫＩＳＧＹＩＳＴＤＫＹＳＨＶＰＱＶＣＹＧＳＡＬＱＡＡＫＬＡＬＤＴＶＴＧＧＱＧＧＫＩＩＣＳＬＮＳＬＰＴＩＧＮＧＮＬＳＬＫＲＤＮＡＨＩＡＨＶＫＣＤＮＧＦＹＫＫＬＡＳＤＦＬＫＳＹＩＳＬＤＬＹＶＴＮＡＧＦＩＤＭＡＴＶＧＨＰＶＥＭＴＳＧＩＬＫＹＹＰＨＦＱＱＥＴＤＡＦＴＬＶＮＤＭＶＴＮＶＳＮＩＶＧＹＱＡＬＬＫＶＲＣＳＴＧＬＳＶＥＱＹＹＣＤＳＳＤＮＴＤＨＤＰＩＩＰＶＬＴＲＤＴＴＬＤＶＬＬＫＹＤＳＫＩＫＴＧＴＤＶＨＦＱＴＡＬＬＹＴＤＩＤＧＶＲＫＶＲＳＩＮＴＳＧＡＶＳＮＮＩＲＥＩＦＫＦＩＮＱＮＰＶＭＲＩＭＩＫＤＶＩＫＴＬＧＤＣＤＦＶＫＩＲＲＬＩＤＤＫＭＶＥＩＬＴＱＹＲＧＬＶＳＳＮＳＳＴＱＬＩＬＰＤＳＩＫＴＬＰＡＹＭＬＡＦＥＫＳＥＬＭＫＰＮＡＱＳＴＲＧＮＥＲＩＹＤＬＬＫＹＤＳＬＮＳＡＱＬＣＹＫＬＹＰＱＩＶＰＦＨＶＬＬＥＥＴＤＬＴＦＹＤＡＮＤＫＬＬＱＩＮＳＳＳＩＮＮＬＳＶＲＡＳＨＳＮＦＩＮＧＧＣＹＬＩＦＱＧＤＴＩＹＬＷＦＮＥＮＴＮＲＭＬＬＱＤＬＬＳＶＤＥＳＬＰＶＳＱＩＳＬＦＳＧＴＬＰＥＴＧＴＳＩＮＱＫＡＳＮＶＩＫＮＷＱＱＶＶＮＫＳＳＬＰＬＶＬＬＲＰＮＶＤＱＹＹＳＮＶＭＳＱＬＬＣＥＤＫＴＶＮＲＩＥＳＹＤＮＹＬＶＩＭＨＫＫＩＱＥＫＬＱＫＤＤＦＩＫＶＳＴＡＡＴＨＥＮＩＨＱＫＦＶＱＦ
トリコデルマ・リーゼイＳｆｂ３のアミノ酸配列（配列番号２）：
ＭＤＹＴＱＹＨＡＬＧＨＧＥＶＬＤＰＮＤＰＮＫＴＳＡＰＡＡＰＱＦＱＰＰＳＳＰＹＶＰＰＧＳＰＹＧＡＰＰＹＨＧＧＨＱＡＰＰＭＡＭＰＰＰＳＴＰＧＹＧＰＰＱＧＱＳＦＰＧＳＰＭＰＳＱＤＡＧＬＡＡＱＦＧＧＭＳＬＧＡＤＡＧＧＡＡＡＲＫＫＫＫＤＲＨＡＹＨＳＶＥＰＴＧＳＳＱＡＦＮＧＬＰＰＧＴＰＡＥＱＦＬＮＶＮＮＰＱＧＩＰＡＬＧＧＱＦＧＳＰＬＡＳＰＭＧＴＰＨＭＡＮＰＧＱＦＰＡＰＴＳＰＦＴＰＳＡＰＶＳＰＡＥＦＡＳＲＦＧＳＰＤＡＡＴＳＩＧＳＡＧＰＳＱＶＳＰＤＤＭＰＳＩＰＡＳＲＤＡＩＱＥＨＦＦＫＮＶＹＰＴＦＥＲＨＶＰＰＰＡＴＶＳＦＶＡＦＤＱＧＮＡＳＰＫＦＴＲＬＴＬＮＮＩＰＴＴＡＥＧＬＨＡＴＧＬＰＬＧＭＬＩＱＰＬＡＰＬＱＡＧＥＡＥＩＰＶＬＤＦＧＤＡＧＰＰＲＣＲＲＣＲＡＹＩＮＰＦＭＭＦＲＳＧＧＮＫＦＶＣＮＬＣＳＹＰＮＥＴＰＰＥＹＦＣＡＶＳＰＱＧＶＲＬＤＲＤＱＲＰＥＬＨＲＧＴＶＥＦＶＶＰＫＥＹＷＴＲＥＰＶＧＬＲＷＬＦＶＩＤＶＴＱＥＳＹＮＫＧＦＭＥＴＦＣＥＧＩＬＡＡＬＹＧＧＮＤＥＥＮＤＥＤＧＥＰＫＲＲＩＰＫＧＡＫＶＧＦＩＴＹＤＫＤＩＨＦＹＮＩＮＰＨＬＤＱＡＨＭＭＩＭＰＤＬＥＤＰＦＬＰＬＧＥＧＬＦＶＤＰＹＥＳＫＡＩＩＴＳＬＬＴＲＬＰＥＭＦＳＴＩＫＮＰＥＰＡＬＬＡＴＬＮＡＡＶＡＡＬＥＡＴＧＧＫＶＶＣＳＣＳＴＬＰＴＷＧＰＧＲＬＦＭＲＤＤＧＮＨＰＧＧＥＬＤＫＫＬＹＴＴＥＨＰＡＷＫＫＶＳＥＫＭＡＳＳＧＩＧＶＤＦＦＬＡＡＰＳＧＧＹＬＤＩＡＴＩＧＨＶＡＡＴＴＧＧＥＴＦＹＹＰＮＦＩＡＰＲＤＧＡＲＬＳＭＥＩＴＨＡＩＴＲＥＴＧＦＱＡＬＭＫＶＲＣＳＴＧＬＱＶＡＡＹＨＧＮＦＶＱＨＴＦＧＡＤＬＥＩＧＶＩＤＡＤＫＡＬＧＶＳＦＳＨＤＧＫＬＤＰＫＬＤＡＨＦＱＴＡＬＬＹＴＴＡＳＧＱＲＲＶＲＣＳＮＶＩＡＳＶＳＤＴＳＫＥＳＮＴＫＥＬＡＩＲＱＣＬＫＦＶＤＱＤＡＶＶＧＩＦＡＫＥＡＳＴＫＬＡＴＴＳＡＮＬＱＤＶＲＮＷＬＴＥＲＴＩＤＩＭＡＹＹＫＫＨＳＡＮＱＦＰＰＳＱＬＶＭＰＥＲＬＫＥＦＣＭＹＭＬＧＭＬＫＣＲＡＦＫＧＧＩＥＮＳＤＲＲＶＨＥＬＲＭＶＲＳＭＧＰＬＥＬＳＬＹＬＹＰＲＭＩＡＬＨＮＬＱＰＥＥＧＦＡＤＰＥＴＧＨＬＫＭＰＰＳＶＲＴＳＦＳＲＶＥＰＧＧＶＹＬＶＤＮＧＱＱＣＬＬＷＦＨＡＱＴＳＰＮＬＩＴＤＬＦＧＥＧＨＤＳＬＫＧＬＤＰＹＴＳＴＬＰＶＬＥＴＨＬＳＡＱＶＲＮＩＩＥＦＬＫＳＭＲＧＳＫＧＭＴＩＱＬＡＲＱＧＩＤＧＡＥＹＥＦＡＲＭＬＶＥＤＲＮＮＥＡＫＳＹＶＤＷＬＶＨＩＨＲＧＶＱＬＥＬＳＧＱＲＫＫＥＧＤＧＥＡＴＡＶＭＡＮＦＡＧＬＲＰＡＹＷ
アスペルギルス・オリザエＲＩＢ４０のＳｆｂ３アミノ酸配列（ＧＩ：８３７６６０７４；配列番号３）：
ＭＡＤＱＳＭＹＮＴＬＧＱＧＴＳＰＡＥＤＰＳＮＰＮＲＭＡＨＱＶＰＰＱＳＱＰＡＡＧＦＰＰＧＰＹＰＰＱＰＧＡＹＹＧＮＰＰＰＮＱＹＤＡＰＡＡＡＰＰＴＱＱＬＱＳＰＰＰＲＧＬＡＰＳＰＱＬＡＹＧＴＥＴＱＴＨＭＧＡＰＡＤＰＭＡＧＬＡＳＱＭＳＧＬＧＩＭＧＤＳＧＡＲＰＧＫＫＫＨＲＨＡＨＨＥＩＧＧＡＴＡＳＡＰＱＱＦＡＧＭＰＱＡＧＭＱＰＳＳＱＦＬＮＴＧＬＮＱＡＰＲＰＩＳＰＡＡＧＶＰＰＡＧＩＶＰＱＰＧＶＰＡＰＧＳＧＳＶＰＴＱＧＫＩＤＰＥＱＩＰＳＩＰＱＳＲＤＩＰＴＭＹＹＦＤＨＩＹＰＴＭＥＲＨＬＰＰＰＡＡＶＰＦＶＡＨＤＱＧＮＳＳＰＫＨＡＲＬＴＬＮＮＩＰＴＴＳＤＦＬＳＳＴＡＬＰＬＧＭＶＬＱＰＬＡＲＬＤＰＧＥＰＥＶＰＶＬＤＦＧＥＭＧＰＰＲＣＲＲＣＲＡＹＩＮＰＦＭＴＦＲＳＧＧＮＫＦＶＣＮＭＣＴＦＰＮＤＶＡＰＥＹＦＡＰＬＤＭＳＧＡＲＶＤＲＬＱＲＰＥＬＭＩＧＴＶＥＦＭＶＰＫＥＹＷＮＫＥＰＶＧＬＱＲＬＦＬＩＤＶＳＱＥＳＶＮＲＧＦＬＫＧＶＣＫＧＩＴＥＡＬＹＧＡＰＤＡＳＥＥＤＡＡＡＲＲＶＰＥＧＳＫＩＧＩＶＴＹＤＲＥＶＨＦＹＮＬＳＡＱＬＤＱＡＱＭＭＶＭＴＤＬＥＥＰＦＶＰＬＳＥＧＬＦＶＤＰＹＥＳＫＤＩＩＴＳＬＬＨＲＩＰＫＩＦＳＨＩＫＫＰＥＰＡＬＬＰＡＬＮＡＡＭＳＡＬＱＡＴＧＧＫＩＦＡＳＩＣＳＬＰＴＷＧＰＧＡＬＨＭＲＤＤＰＫＶＨＧＴＤＡＥＲＫＬＦＴＴＤＮＱＡＷＲＴＴＡＧＫＭＡＥＨＧＩＧＶＤＭＦＶＡＡＰＧＧＴＹＶＤＶＡＴＩＧＨＶＡＥＶＳＧＧＥＴＦＦＹＰＮＦＨＡＰＲＤＩＬＫＬＳＱＥＦＡＨＡＶＴＲＥＴＧＹＱＡＭＭＫＶＲＣＳＮＧＬＱＶＳＡＹＨＧＮＦＩＱＨＡＬＧＡＤＬＥＩＧＳＩＤＡＤＫＡＩＧＶＭＦＳＹＤＧＫＬＤＰＫＬＤＡＨＦＱＡＡＬＬＹＴＴＡＥＧＱＲＲＶＲＣＩＮＶＶＡＡＶＮＥＧＧＬＥＴＭＫＦＩＤＱＤＣＶＶＳＩＭＡＫＥＡＡＡＫＴＶＤＫＳＬＫＤＩＲＡＳＩＴＥＫＴＶＤＩＦＳＧＹＲＫＶＦＳＧＳＨＰＰＧＱＬＶＬＰＥＮＬＫＥＦＳＭＹＭＬＡＬＩＫＳＲＡＦＫＧＧＱＥＡＳＤＲＲＩＨＤＭＲＭＬＲＳＩＧＡＴＥＬＡＬＹＬＹＰＲＶＩＰＩＨＮＭＱＰＥＤＧＦＰＮＥＱＧＱＬＱＶＰＰＳＬＲＡＳＦＳＫＩＥＥＧＧＡＹＬＶＤＮＧＱＩＣＬＬＷＬＨＳＲＶＳＰＮＬＬＥＤＬＬＧＰＧＱＳＳＬＱＧＬＮＰＱＴＳＳＬＰＶＬＥＴＨＬＮＡＱＶＲＮＬＬＱＹＦＳＴＭＲＧＳＫＳＶＡＩＱＬＡＲＱＧＬＤＧＡＥＹＥＦＡＲＬＬＶＥＤＲＮＮＥＡＱＳＹＶＤＷＬＶＨＩＨＲＱＩＮＬＥＬＡＧＨＲＫＲＥＤＴＳＡＥＧＳＬＴＳＬＡＧＬＲＡＰＹＷ
アスペルギルス・ニガーのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号４）
ＭＡＤＰＮＭＹＨＴＹＧＱＡＰＶＰＧＥＮＰＳＤＰＮＱＭＡＹＱＶＰＰＱＧＹＰＡＡＧＩＰＰＧＰＳＰＰＱＰＧＡＡＹＧＶＰＡＰＮＱＱＷＰＡＹＧＳＰＰＰＡＱＱＰＬＱＱＰＰＳＱＦＡＨＱＡＤＰＱＡＡＭＧＡＰＶＤＰＧＭＡＧＬＡＳＱＭＳＧＬＧＩＭＧＧＥＧＧＡＡＲＳＳＫＫＫＨＲＨＡＨＨＥＩＡＧＡＳＡＳＶＡＱＰＦＡＡＡＰＱＤＰＭＱＰＴＳＱＦＬＮＴＧＬＮＱＡＰＲＰＩＳＰＡＡＳＩＰＡＰＶＮＰＡＦＧＧＧＡＧＡＶＰＴＱＧＫＶＤＰＥＱＩＰＳＩＰＲＳＲＤＬＰＡＱＹＹＦＮＨＶＹＰＴＭＥＲＨＬＰＰＰＡＡＶＰＦＶＡＨＤＱＧＮＳＳＰＫＹＡＲＬＴＬＮＮＩＰＳＴＳＤＦＬＳＳＴＧＬＰＬＧＭＶＬＱＰＬＡＲＬＤＧＥＱＰＩＰＶＬＤＦＧＤＡＧＰＰＲＣＲＲＣＲＡＹＩＮＰＦＭＳＦＲＳＧＧＮＫＦＶＣＮＭＣＴＦＰＮＤＶＰＰＥＹＦＡＰＬＤＰＳＧＳＲＩＤＲＭＱＲＰＥＬＭＭＧＴＶＥＦＬＶＰＫＤＹＷＮＫＥＰＶＧＬＱＷＬＬＬＩＤＶＳＱＥＳＶＮＫＧＦＬＫＧＶＣＫＧＩＭＥＡＬＹＳＥＥＴＥＮＰＥＤＥＡＰＡＲＲＩＰＥＧＡＫＩＧＩＶＴＹＤＫＥＶＨＦＹＮＬＳＡＱＬＤＱＡＱＭＭＶＭＴＤＬＥＥＰＦＶＰＬＳＥＧＬＦＶＤＰＹＥＳＫＤＶＩＴＳＬＬＱＲＩＰＳＩＦＳＨＶＫＮＰＱＰＡＬＬＰＡＬＮＡＡＬＳＡＬＲＰＴＧＧＫＩＶＧＴＩＡＳＬＰＴＷＧＰＧＡＬＳＬＲＤＤＰＫＶＨＧＴＤＡＥＲＫＬＦＴＴＥＨＡＧＷＲＥＴＡＧＨＬＡＥＡＧＩＧＬＤＭＦＩＡＡＰＳＧＴＹＭＤＶＡＴＩＧＨＩＰＥＶＴＧＧＥＴＦＦＹＰＮＦＨＡＰＲＤＩＲＫＬＳＫＥＬＡＨＡＩＴＲＥＴＧＹＱＡＬＭＫＶＲＣＳＮＧＬＱＶＳＧＹＨＧＮＦＶＱＨＴＦＧＡＤＬＥＩＧＡＩＤＡＤＫＡＩＧＶＶＦＳＹＤＧＫＬＤＰＫＬＤＡＨＦＱＡＡＬＬＹＴＳＡＮＧＱＲＲＶＲＣＩＮＴＶＡＡＶＮＥＧＧＭＥＴＭＫＦＶＤＱＤＡＶＶＡＭＶＡＫＤＡＡＳＫＴＬＤＫＳＬＫＤＩＲＡＧＶＳＥＫＴＶＤＩＦＳＧＹＲＫＩＦＳＧＳＨＰＰＧＱＬＶＬＰＥＮＬＫＥＦＳＭＹＭＬＳＬＩＫＳＲＡＩＫＧＧＱＥＡＳＤＲＲＩＨＤＭＲＭＬＲＳＩＧＣＴＥＬＳＬＹＬＹＰＲＩＩＰＩＨＮＭＱＰＴＤＧＦＰＮＥＱＧＱＬＱＶＰＰＳＬＲＡＳＦＳＫＩＥＥＧＧＡＹＬＶＤＮＧＱＱＣＬＬＷＬＨＳＨＶＳＰＮＬＬＥＤＬＦＧＥＧＱＴＳＬＱＧＬＳＰＱＩＳＴＩＰＶＬＥＴＨＬＮＡＱＶＲＮＬＬＱＹＦＳＴＩＲＧＳＫＡＶＴＩＱＬＡＲＱＧＬＤＧＡＥＹＥＦＡＲＭＬＶＥＤＲＮＮＥＡＱＳＳＶＤＷＬＶＨＩＨＲＱＩＮＬＥＬＡＧＨＲＫＲＥＤＴＡＧＥＧＧＬＴＳＬＡＧＬＲＡＰＹＷ
ペニシリウム・フニクロスムのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号５）
ＭＡＤＹＳＴＹＨＳＳＧＹＡＧＡＰＧＥＤＰＮＲＱＱＰＡＶＰＡＰＹＨＳＰＮＡＰＰＧＱＡＩＱＱＰＧＩＴＰＹＧＡＡＱＰＰＱＦＰＧＱＰＧＶＧＹＧＶＡＰＶＰＳＰＰＱＡＬＧＧＰＤＶＧＤＬＡＴＲＩＧＧＬＧＩＩＳＤＡＧＴＲＳＨＫＫＫＨＲＨＡＹＨＤＩＧＧＰＮＡＱＧＬＮＴＦＰＳＱＴＮＬＱＳＱＦＬＮＴＧＬＮＱＰＥＱＱＰＡＡＰＡＡＦＰＧＡＰＶＧＱＶＰＡＮＶＡＰＧＡＡＰＥＶＧＧＶＧＳＶＰＴＱＧＫＩＤＰＥＱＩＰＳＶＰＲＳＲＤＬＰＡＱＹＹＦＮＮＶＹＰＴＭＥＲＨＶＰＰＰＡＳＩＰＦＩＡＨＤＱＧＮＳＳＰＫＶＡＲＬＴＬＮＮＩＰＳＳＳＤＦＬＱＳＴＧＬＰＬＧＭＩＬＱＰＬＡＫＬＤＡＧＥＱＰＶＰＶＩＤＦＧＤＩＧＰＰＲＣＲＲＣＲＴＹＩＮＰＦＭＴＦＲＳＧＧＮＫＦＶＣＮＭＣＴＦＰＮＤＶＰＰＥＹＦＡＰＶＤＰＳＧＶＲＶＤＲＬＱＲＰＥＬＭＬＧＴＶＥＦＴＶＰＫＥＹＷＶＫＥＰＡＧＬＨＱＬＦＬＩＤＶＳＱＥＳＶＮＲＧＦＬＫＧＶＣＤＧＩＩＮＡＬＹＧＥＥＥＰＶＥＧＡＥＰＥＴＲＫＶＰＥＧＳＫＩＧＩＶＴＦＤＲＥＩＨＦＹＮＬＬＰＲＬＤＫＡＱＭＭＶＭＴＤＬＥＥＰＦＶＰＬＳＥＧＬＦＶＤＰＹＥＳＫＤＶＩＴＳＬＬＥＱＬＰＳＬＦＡＲＶＫＳＰＥＳＴＬＬＰＴＩＫＡＡＩＳＡＬＱＡＴＧＧＫＩＩＣＣＬＴＳＬＰＴＹＧＰＧＫＬＶＭＫＤＫＳＱＡＰＤＧＥＮＫＬＦＡＩＤＮＰＤＹＫＡＡＡＴＫＬＴＥＡＧＶＧＩＤＦＦＶＡＡＰＧＧＳＦＭＤＬＴＴＩＧＹＴＡＡＩＳＧＧＥＣＦＦＹＰＮＦＨＳＰＲＤＳＬＫＬＡＱＥＩＳＨＴＶＴＲＥＴＧＹＱＡＬＭＫＶＲＣＳＮＧＬＱＶＳＡＹＹＧＮＦＬＱＨＴＦＧＡＤＬＥＩＧＴＩＤＡＤＫＡＬＧＶＬＦＳＹＤＧＫＬＤＰＫＬＤＡＨＦＱＡＡＬＬＹＴＡＡＮＧＱＲＲＶＲＣＩＮＩＶＡＧＶＮＥＧＧＩＥＴＭＫＣＩＤＱＤＡＶＶＡＩＩＡＫＥＡＡＳＫＡＧＤＫＴＬＫＤＩＲＡＳＩＴＥＫＴＶＤＩＦＳＧＹＲＫＮＦＳＧＳＨＰＰＧＱＬＶＬＰＥＮＬＫＥＦＳＭＹＭＬＧＬＬＫＳＲＡＦＫＧＧＳＥＴＡＤＲＲＶＨＤＬＲＭＬＲＳＩＧＣＬＥＬＳＬＹＬＹＰＲＩＩＰＩＨＮＭＳＡＥＤＧＦＡＮＥＱＧＱＬＱＶＰＰＡＬＲＡＳＦＳＲＶＥＥＧＧＡＹＬＩＤＮＧＱＧＩＬＬＷＩＨＳＦＶＳＰＮＬＬＥＤＬＦＧＰＧＩＴＳＬＱＡＬＤＰＮＴＳＳＬＰＶＬＥＴＨＬＮＡＱＶＲＮＬＬＱＹＬＳＴＶＲＧＳＫＡＶＴＩＱＬＡＲＱＧＩＤＧＡＥＹＥＦＡＲＳＬＶＥＤＲＮＮＥＡＱＳＹＶＤＷＬＶＨＩＨＲＱＩＮＬＥＬＡＧＨＲＫＫＥＤＳＡＴＳＳＧＥＧＡＬＳＳＬＡＧＩＲＡＰＹＷ
ペニシリウム・クリゾゲナムのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号６）
ＭＡＤＳＳＭＹＮＴＭＧＱＧＳＳＥＤＰＳＮＰＱＹＭＡＱＶＰＰＱＱＹＰＡＧＹＰＰＴＡＡＰＬＱＰＧＡＰＹＡＮＰＡＰＮＱＷＰＡＹＧＳＰＱＱＰＧＭＡＳＰＧＩＡＹＮＡＰＱＱＰＭＧＡＡＶＤＰＧＭＡＧＬＡＳＱＭＧＧＬＤＩＡＡＤＡＧＡＲＴＨＲＫＫＨＲＨＡＨＨＤＩＧＧＧＡＡＰＰＡＱＧＦＮＴＧＭＤＱＧＧＬＱＱＰＱＰＱＱＱＳＱＦＬＮＴＧＬＮＱＨＡＤＲＰＶＳＰＡＶＧＬＶＳＧＱＳＶＡＡＩＰＧＩＱＳＧＡＧＳＶＰＴＳＧＲＩＤＰＥＨＩＰＳＩＰＲＳＲＤＬＰＡＱＹＹＦＮＨＶＹＰＴＭＤＱＨＬＰＰＰＡＡＩＰＦＶＡＱＤＱＧＮＳＳＰＫＹＡＲＬＴＬＮＮＩＰＳＡＳＤＦＬＴＳＴＧＬＰＬＧＭＩＬＱＰＬＡＰＬＤＰＧＥＱＰＩＰＶＬＤＦＧＤＶＧＰＰＲＣＲＲＣＲＴＹＩＮＰＦＭＳＦＲＳＧＧＳＫＦＶＣＮＭＣＴＦＰＮＤＴＰＰＥＹＦＡＰＬＤＰＳＧＡＲＶＤＲＭＱＲＰＥＬＬＭＧＴＶＥＦＴＶＰＫＥＹＷＮＫＥＰＶＧＬＱＴＬＦＬＩＤＶＳＲＥＳＶＨＲＧＦＬＫＧＶＣＡＧＩＫＤＡＬＹＧＤＤＤＫＡＳＥＧＴＥＧＤＧＳＳＲＫＬＰＶＧＡＫＶＧＩＶＴＹＤＫＥＶＨＦＹＮＬＡＡＡＬＤＱＡＱＭＭＶＭＴＤＬＤＥＰＦＶＰＬＳＥＧＬＦＶＤＰＹＥＳＫＳＶＩＴＳＬＬＳＲＩＰＫＩＦＳＳＩＫＮＰＥＳＡＬＬＰＴＬＮＳＡＬＳＡＬＱＡＴＧＧＫＩＶＣＡＶＡＳＬＰＴＣＧＰＧＨＬＡＩＲＥＤＰＫＶＨＧＴＤＡＥＲＫＬＦＴＴＥＮＰＡＷＫＫＴＡＳＫＬＡＥＡＧＶＧＬＤＬＦＭＡＡＰＧＧＴＹＬＤＶＡＴＩＧＨＶＳＳＬＴＧＧＥＴＦＦＹＰＮＦＨＡＰＲＤＬＬＫＬＲＫＥＩＡＨＡＶＴＲＥＴＧＹＱＴＬＭＫＶＲＣＳＮＧＬＱＶＳＡＹＨＧＮＦＶＱＨＴＬＧＡＤＬＥＩＡＧＶＤＡＤＫＡＶＧＶＬＦＳＹＤＧＫＬＤＰＫＬＤＡＨＦＱＡＡＬＬＹＴＳＡＤＧＱＲＲＶＲＣＩＮＶＶＡＡＶＮＥＧＧＬＥＴＭＫＦＶＤＱＤＡＶＶＳＶＩＡＫＥＡＡＳＫＴＬＤＫＮＬＫＤＩＲＡＳＩＳＥＫＴＶＤＩＦＳＧＹＲＫＩＦＳＧＳＨＰＰＧＱＬＶＬＰＥＮＬＫＥＦＳＭＹＭＬＳＬＶＫＳＲＡＦＫＡＧＰＥＳＳＤＲＲＩＨＤＭＲＬＩＲＳＭＧＣＴＥＭＡＬＹＬＹＰＲＩＩＰＶＨＮＭＱＰＥＤＧＦＡＮＥＨＧＱＬＱＩＰＰＴＭＲＡＳＹＳＲＩＥＤＧＧＶＹＩＶＤＮＧＱＡＩＬＬＷＩＨＡＱＶＳＰＮＬＬＥＤＬＦＧＰＧＨＮＳＬＱＧＬＮＰＮＴＳＳＬＰＶＬＥＴＨＬＮＡＱＶＲＮＬＬＱＹＬＳＴＶＲＧＳＫＳＶＴＩＱＬＡＲＱＧＬＤＧＡＥＹＥＦＡＲＬＬＬＥＤＲＮＮＥＡＱＳＹＶＤＷＬＶＨＩＨＲＱＩＮＬＥＬＡＧＨＲＫＫＥＥＧＧＥＧＡＬＡＳＬＳＡＭＲＴＰＹＷ
ネウロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号７）
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フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）Ｓｆｂ３アミノ酸配列（配列番号８）
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図１３は、Ｓ．セレヴィシエ（配列番号１）及びＴ．リーゼイ（配列番号２）から得られるＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。これらの配列は、およそ３０％のアミノ酸配列同一性を有する。対照的に、Ｔ．リーゼイ及びＡ．オリザエから得られるＳｆｂ３タンパク質は、およそ５８％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｓ．セレヴィシエ（配列番号１）、Ｔ．リーゼイ（配列番号２）及びＡ．オリザエ（配列番号３）から得られるＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを、図１４に示す。
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トリコデルマ・リーゼイＳｆｂ３のアミノ酸配列（配列番号２）：
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アスペルギルス・オリザエＲＩＢ４０のＳｆｂ３アミノ酸配列（ＧＩ：８３７６６０７４；配列番号３）：
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アスペルギルス・ニガーのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号４）
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ペニシリウム・フニクロスムのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号５）
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ペニシリウム・クリゾゲナムのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号６）
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ネウロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号７）
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フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）Ｓｆｂ３アミノ酸配列（配列番号８）
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図１３は、Ｓ．セレヴィシエ（配列番号１）及びＴ．リーゼイ（配列番号２）から得られるＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。これらの配列は、およそ３０％のアミノ酸配列同一性を有する。対照的に、Ｔ．リーゼイ及びＡ．オリザエから得られるＳｆｂ３タンパク質は、およそ５８％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｓ．セレヴィシエ（配列番号１）、Ｔ．リーゼイ（配列番号２）及びＡ．オリザエ（配列番号３）から得られるＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを、図１４に示す。
およそ４０のチャワンタケ種のＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントは、特定のアミノ酸配列、すなわち、ＩＱＬＡＲＱＧＸＤＧＸＥＸＸＸＡＲＸＬＸＥＤＲＮＸＥＡＸＳＸＶＤＷＬ（配列番号９、ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列である）がＳｆｂ３タンパク質のＣ末端に近接し、かつこれはＳｅｃ２４タンパク質内には見出されないことを明らかにした。このコンセンサス配列は、チャワンタケの他のメンバーからＳｆｂ３タンパク質を識別するために使用することができる。
他の研究からは、ｇａｓ１遺伝子（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）において知られるようにｇｅｌ１遺伝子）が、細胞壁構造に影響し、形態変化、並びに、カルコフロールホワイト、コンゴレッド及びドデシル硫酸ナトリウムに対する超感度を引き起こすことを明らかにした。
理論に制限されるものではないが、糸状菌におけるＳｆｂ３発現及び／又は活性の変化が細胞壁合成に関連するタンパク質の輸送に干渉することで、細胞壁構造が変更され、菌糸がより短く及びより酵母に似た外観を持つことを特徴とする、よりコンパクトな形態の細胞を産生すると考えられる。細胞壁合成に関連するタンパク質としての同様の候補は、Ｇａｓ１／Ｇｅｌ１である。
液体培地において粘性が変更された表現型を呈する変異糸状菌株は、商業的に重要なタンパク質の大量生産に非常に適し得る。本発明の菌株及び方法は、糸状菌Ｔ．リーゼイを用いて例示されているが、チャワンタケに属するのであればＳｆｂ３タンパク質の機能は保存されているものと予測される。したがって、本発明の菌株及び方法は、Ｔ．リーゼイに限定されるものではない。
Ｖ．Ｓｆｂ３タンパク質産生量が変更された糸状菌株
一態様では、親菌株から誘導された糸状菌の変異菌株であって前記変異菌株の細胞の機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を、前記親菌株の細胞と比較して変化させる、遺伝子変異を含む、変異菌株が提供される。変異菌株の細胞は続いて、深部培養における好気性発酵中に前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を変更する必要がある、又は前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する。
一態様では、親菌株から誘導された糸状菌の変異菌株であって前記変異菌株の細胞の機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を、前記親菌株の細胞と比較して変化させる、遺伝子変異を含む、変異菌株が提供される。変異菌株の細胞は続いて、深部培養における好気性発酵中に前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を変更する必要がある、又は前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する。
場合により、この遺伝子変異は、変異菌株の細胞の機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を、親菌株の細胞と比較して低下させ、得られた細胞ブロスは、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために撹拌速度を低下させる必要があり、又は、予め選択された速度での撹拌下でより高い溶存酸素量を維持する。このような場合には、この変異菌株の細胞集団は、親菌株の細胞集団と比較して粘性の低下を呈するものと考えられ、このことは、溶存酸素量及び撹拌に関する観察を説明する。
機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量の低下は、親菌株中に存在するｓｆｂ３遺伝子を破壊することで生じ得る。ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、粘性を低下させる表現型を変異菌株に対して付与する主要な遺伝子的決定因子であるため、このような変異菌株は、ｓｆｂ３遺伝子が破壊されてさえいればよく、その一方で他のすべての遺伝子が無傷のままであってもよい。場合により、変異菌株は任意選択で、これらが誘導される元の親菌株と比較して、追加の遺伝子変異を含み得る。このような追加の遺伝子変異は、必ずしも粘性の低下を付与するものではないが、他の利点を菌株に付与し得る。
Ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、機能性ｓｆｂ３遺伝子産物、すなわち、Ｓｆｂ３タンパク質、の発現を実質的に抑制する任意の好適な方法を用いて、行うことができる。代表的な破壊方法としては、ｓｆｂ３遺伝子の完全な又は部分的な欠失が挙げられ、そのような欠失としては、例えば、Ｓｆｂ３−コード配列、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー又は別の制御因子の、完全な又は部分的な欠失が挙げられる。ｓｆｂ３遺伝子の破壊はまた、ｓｆｂ３遺伝子の任意の部分を含む染色体の一部を完全に又は部分的に欠失させることで、行うことができる。ｓｆｂ３遺伝子を破壊する特定の方法としては、ｓｆｂ３遺伝子の任意の部分−例えば、Ｓｆｂ３−コード配列、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー又は別の制御因子−におけるヌクレオチドの置換又は挿入が挙げられる。好ましくは、欠失、挿入及び／又は置換（総じて変異と称される）は、一般に特異的核酸配列を標的としない化学的変異誘導とは対照的な配列特異的分子生物学技術を用いる遺伝子操作により導入される。
ｓｆｂ３遺伝子における変異は、ｓｆｂ３プロモーターの有効性を低下させ、ｓｆｂ３エンハンサーの有効性を低下させ、ｓｆｂ３ ｍＲＮＡのスプライシング又は編集に干渉し、ｓｆｂ３ ｍＲＮＡの翻訳に干渉し、Ｓｆｂ３コード配列に終止コドンを導入して完全長のＳｆｂ３タンパク質のコード配列を変化させてより活性の弱い若しくは不活性のタンパク質を産生し又は他の細胞壁成分とのＳｆｂ３の相互作用を低下させ、Ｓｆｂ３タンパク質のコード配列を、より不安定なタンパク質を産生させるために変化させ又はＳｆｂ３タンパク質を破壊するための標的にし、Ｓｆｂ３タンパク質に誤った折り畳みを行わせ又は誤った修飾をさせ（例えば、グリコシル化によるなど）、あるいは、Ｓｆｂ３タンパク質の細胞輸送に干渉し得る。
一般に、これら及び他の遺伝子操作の目的は、機能性Ｓｆｂ３タンパク質の発現を低下させ若しくは抑制し、あるいは、Ｓｆｂ３タンパク質の正常な生物活性を低下させ又は抑制することで、粘性を低下させる表現型を生じる形態変化を生み出すことである。
他の場合には、遺伝子変異は、機能性Ｓｆｂ３タンパク質の発現を増加させ若しくは回復させ、あるいは、Ｓｆｂ３タンパク質の通常の生物活性を増加させ、これにより、粘性が増加又は回復する表現型を生じる形態変化を生み出す。Ｓｆｂ３機能を増加又は回復させる代表的な遺伝子変異は、ｓｆｂ３遺伝子の追加の複製を細胞の中に導入する、ｓｆｂ３プロモーター、エンハンサー又は他の制御因子の有効性を増加させる、Ｓｆｂ３タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を増加させる、Ｓｆｂ３タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性を増加させる、Ｓｆｂ３タンパク質の活性又は安定性を増加させる変化をｓｆｂ３遺伝子に導入する、他のタンパク質若しくは細胞壁成分及びこれらに類するものとの相互作用を調節する変化をｓｆｂ３遺伝子に導入するものである。Ｓｆｂ３機能を増加又は回復させる他の遺伝子変異は、機能性Ｓｆｂ３タンパク質の発現を低下させる又は抑制する遺伝子変異の効果を逆転するものである。
上記のように操作及び使用するための糸状菌細胞は一般に、子嚢菌門チャワンタケ亜門からのものであり、特に栄養菌糸状態を有しｓｆｂ３遺伝子の相同体を含む真菌である。このような生物としては商業的に重要な工業及び製薬タンパク質の産生に使用される真菌が挙げられ、限定するものではないが、トリコデルマｓｐｐ．、アスペルギルスｓｐｐ．、フザリウムｓｐｐ．、スケドスポリウム（Scedosporium）ｓｐｐ．、ペニシリウムｓｐｐ．、クリソスポリウム（Chrysosporium）ｓｐｐ．、セファロスポリウム（Cephalosporium）ｓｐｐ．、タラロマイセス（Talaromyces）ｓｐｐ．、ゲオスミチア（Geosmithia）ｓｐｐ．、ミセリオフトラ（Myceliophthora）ｓｐｐ．及びニューロスポーラ（Neurospora）ｓｐｐ．が挙げられる。具体的な生物としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（かつてはトリコデルマ・ロンギブラキアタム及びハイポクレア・ジェコリーナとして分類）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・イタコニカス（Aspergillus itaconicus）、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Scedosporium prolificans）、ネウロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・フニクロスム、ペニシリウム・クリゾゲナム、タラロマイセス（ゲオスミチア）・エマーソニイ（Talaromyces（Geosmithia）emersonii）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）が挙げられる。
例えば、糸状菌がＴ．リーゼイであるといった、一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。他の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％同一であるなど、アミノ酸全体が配列番号２のアミノ酸配列と特定の割合で同一であるタンパク質をコードする。
例えば、糸状菌がＡ．オリザエである一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。他の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一であるなど、アミノ酸全体が配列番号３のアミノ酸配列と特定の割合で同一であるタンパク質をコードする。
例えば、糸状菌がＴ．リーゼイである一部の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子は、以下に示される配列番号１０のヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％同一であるなど、アミノ酸全体が配列番号１０のアミノ酸配列と特定の割合で同一であるタンパク質をコードする。
トリコデルマ・リーゼイのｓｆｂ３ ＤＮＡ配列（配列番号１０、２つのイントロンに下線が引いてある）：
別の態様では、糸状菌細胞の形態を変化させるための方法が提供される。変異糸状菌細胞は、固体培地上で生育形態の変化を呈し、深部培養において生育させた場合には複数の異なる粘性を有する細胞集団を産生する。
場合により、この方法は、好適な遺伝学的又は化学的方法を用いて親菌株においてｓｆｂ３遺伝子を破壊することを含み、ここで、好気性発酵中に変異菌株は、深部培養における好気性発酵中に、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要があり、又は、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する。このような方法を用いて、上記及び別の箇所に記載の任意の方法でｓｆｂ３遺伝子を破壊してもよい。好ましくは、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、一般に特定の核酸配列を標的としない化学的変異誘導とは対照的な配列特異的分子生物学技術を用いる遺伝子操作により行われる。
一部の実施形態では、粘性を低下させる表現型を導入される親菌株は、高レベルで発現させることが意図される対象の遺伝子を既に含んでいる。この方法によると、本発明の方法は、予め粘性を低下させた菌株に、対象のタンパク質を産生させるために遺伝子を導入する必要がなくなる。それゆえに、本発明の方法は、対象の遺伝子を既に含む親菌株から粘性が低下した糸状菌細胞の変異菌株を産生するために使用することができる。
別の態様では、粘性の変化した表現型について糸状菌細胞をスクリーニングするための方法も提供される。この方法は、蛍光染色に対する感度の変化について糸状菌細胞（例えば、変異誘導細胞又は野性分離株）のパネルをスクリーニングすることを包含し、ここで、蛍光染色に対する感度の変化は、変異細胞が、深部培養における好気性発酵中に、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するためにより多くの若しくはより少ない撹拌を必要とする、並びに／又は、予め選択された速度での撹拌下で増加若しくは低下した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生することを示唆する。この方法によると、蛍光染色に対する感度は、感度の表現型が変化した変異糸状菌細胞を同定するために使用することができる。場合により、この方法は、蛍光染色に対する感度の上昇について糸状菌細胞（例えば、変異誘導細胞又は野性分離株）のパネルをスクリーニングすることを包含し、ここで、蛍光染色に対する感度の上昇は、変異細胞が、深部培養における好気性発酵中に、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要があり、並びに／又は、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生することを示唆する。この方法によると、蛍光染色に対する感度は、感度が低下する表現型を有する変異糸状菌細胞を同定するために使用することができる。
代表的な蛍光色素は、糸状菌の細胞壁中のセルロース及び／又はキチンに結合するものであり、限定するものではないが、カルコフロールホワイト（ＣＡＳ Ｎｏ．４１９３−５５−９）、コンゴレッド（ＣＡＳ Ｎｏ．５７３−５８−０）、ソロフェニルフラビン（Solophenyl Flavine）（ＣＡＳ Ｎｏ．６１７２５−０８−４）、ポンタミンファストスカーレット（Pontamine Fast Scarlet）（ＣＡＳ Ｎｏ．７９７７０−２９−９）及びプリムリン（ＣＡＳ Ｎｏ．３０１１３−３７−２）などが挙げられる。
糸状菌の親菌株においてｓｆｂ３遺伝子を破壊するために使用する具体的な遺伝学的技術は、一般に、その技術が配列特異的な方法でｓｆｂ３遺伝子を標的とするものであるならば、どのような技術を用いようとそれは本方法にとって決定的なものではない。代表的方法は、部位特異的組み換え、標的遺伝子挿入、転位因子の使用、ウィルスによる形質導入及びＲＮＡによる遺伝子サイレンシングである（Ｒａｐｏｎｉ Ｍ．ａｎｄ Ａｒｎｄｔ，Ｇ．Ｍ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：４４８１〜８９ｌ；Ｎａｋａｙａｓｈｉｋｉ Ｈ．ａｎｄ Ｎｇｕｙｅｎ，Ｑ．Ｂ．（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１：４９４〜５０２；Ｋｕｃｋ，Ｕ．ａｎｄ Ｈｏｆｆ，Ｂ．（２０１０）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８６：５１〜６２）。
所望される場合には、ｓｆｂ３遺伝子の破壊は、例えば、選択マーカー、蛍光若しくは他の識別可能なマーカー、クローニング部位若しくはクロニーングカセット、以降の菌株の同定を可能にする配列フィンガープリント、又は、菌株に識別性若しくは機能性を付加するための他の遺伝子修飾を、同時に又は連続して挿入することを伴う。場合により、粘性が低下した菌株において高レベルで発現されることが意図される対象の遺伝子を、ｓｆｂ３遺伝子の破壊部位に導入することが望ましいことがある。このような場合には、粘性を低下させる表現型を導入することと対象の遺伝子を導入することは、同時に行われ得る。
ＶＩＩ．有用性
粘性が低下した糸状菌株を使用した場合、深部培養時の酸素及び栄養素の分布が改善し、深部培養培地を撹拌するのに必要とされるエネルギー量が低下し、培地中に存在する細胞集団を増加させ、タンパク質産生を増加させることが知られている。しかしながら、本発明の糸状菌の変異菌株は、かつて述べられてきた粘性が低下した菌株よりも有意な利点を提供する。
粘性が低下した糸状菌株を使用した場合、深部培養時の酸素及び栄養素の分布が改善し、深部培養培地を撹拌するのに必要とされるエネルギー量が低下し、培地中に存在する細胞集団を増加させ、タンパク質産生を増加させることが知られている。しかしながら、本発明の糸状菌の変異菌株は、かつて述べられてきた粘性が低下した菌株よりも有意な利点を提供する。
第一に、本発明の菌株は、完全に定義されたゲノムを有するため、後続の遺伝子操作、相補的操作、マッチング及びこれらに類する操作に非常に適する。第二に、本発明の菌株は、分泌タンパク質の産生に悪影響を与えない。第三に、粘性が低下した菌株は、高レベルに発現させることを意図したタンパク質（すなわち、対象のタンパク質）を既に産生している、選択マーカーを既にコードしている、又は産生宿主において望ましい他の特徴を既に含んでいる、親菌株を含む本質的に任意の親菌株から産生することができる。それゆえに、本発明の菌株及び方法は、対象のタンパク質をコードする遺伝子を、粘性が低下している既存の産生菌株の中に輸送する必要がない。
本発明の菌株及び方法は、糸状菌の深部培養における商業的に重要なタンパク質の産生への使用を見出される。商業的に重要なタンパク質としては、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、ヒドロホビン、及び他の酵素、並びに、糸状菌において発現可能な非酵素タンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、工業又は製薬用途を目的としたものであり得る。
本発明の菌株及び方法の、これらの及び他の、態様及び実施形態は、本説明を見た当業者にとっては、明白であろう。以下の実施例は、菌株及び方法を更に例示することを意図するものであり、限定することを意図したものではない。
以下の例の読解を補助するために、慣用名、ジェネンコア菌株コレクション番号（Genencor strain collection numbers）（ＧＩＣＣ＃）及び開始糸状菌株に選択された特徴を表１に列挙する。生成した糸状菌菌株についての同様の情報を表２に列挙する。実施例において使用した核酸プライマーを表３に列挙する。小文字表記した配列は、ＰＣＲにより増幅させた断片の直接的な消化を可能にするよう付加したヌクレオチドである。イタリック体表記した配列は、制限酵素認識部位である。太字表記した配列は、ｌｏｘＰ部位である。下線を付したＣＡＣＣ配列には、増幅させたＤＮＡ断片をＧＡＴＥＷＡＹエントリーベクター中に組み込むことができるよう適切なプライマーを付加した。
１．１．Δｓｆｂ３欠失カセットの作製
Ｔ．リーゼイｓｆｂ３遺伝子の５’末端に隣接するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ８８／ＡＶＧ８９で増幅した。このプライマー対による断片の増幅により、断片の５’末端にＳａｌＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入した。平行なｌｏｘＰ部位に隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ｈｐｈ−ｌｏｘＰ＃４（図１）からプライマー対ＡＶＧ９０／ＡＶＧ９１で増幅し、断片の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＮｏｔＩ部位を導入した。ｓｆｂ３の３’末端に隣接するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ９２／ＡＶＧ９３で増幅し、断片の５’末端にＮｏｔＩ部位を、並びに、３’末端にＸｂａｌ部位を導入した。
上記３つの断片を連続して、ベクターｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））の中にライゲーションし、得られたプラスミドをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ ８８９０９２（図２）と命名した。テンプレートとしてＭｏｒｐｈ ＴｒｇｌａＡ（２９−９）ゲノムＤＮＡを用いて、ｓｆｂ３遺伝子の５’及び３’末端のＤＮＡ配列を増幅した。５’ｓｆｂ３隣接部位を含有するΔｓｆｂ３欠失カセット、各端部にてｌｏｘＰにより囲まれたハイグロマイシンＢ耐性カセット、及び３’ｓｆｂ３隣接部位をプラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ ８８９０９２からプライマー対ＡＶＧ１０４／ＡＶＧ１０５で増幅した。複数のＰＣＲ反応物をプールし、ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、エタノール沈殿させて、増幅したＤＮＡ断片を濃縮した。このようにして調製したＤＮＡを、次の工程で使用した。
１．２．ｓｆｂ３遺伝子を欠損している菌株２９−９ Δｓｆｂ３及びＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３の作製
ＰＥＧ法による形質転換を用い、Δｓｆｂ３欠失カセットにより菌株Ｍｏｒｐｈ及び２９−９を形質転換し、ハイグロマイシンＢとソルビトールとを含有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。トリコデルマの形質転換は、例えば、米国特許第５，２４６，８５３号に記載されている。ハイグロマイシンＢを含有するアカパンカビ用最少培地に候補株（２９−９＋Δｓｆｂ３については６８４及びＭｏｒｐｈ＋Δｓｆｂ３については３４８）を移植し、ハイグロマイシンＢ耐性候補株を選択した。コンゴレッドを含有するアカパンカビ最少培地又はＰＤＡにハイグロマイシンＢ耐性形質転換体を移植し、コンゴレッド感度を評価した。ＰＣＲ分析は、相同組み換えによりΔｓｆｂ３欠失カセットがｓｆｂ３座に組み込まれた各形質転換体のうち、１株がコンゴレッド感応性候補株であることを明らかにした（図３）。２９−９ Δｓｆｂ３及びＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３の両方におけるｓｆｂ３遺伝子座へのΔｓｆｂ３欠失カセットの相同組み込みは、プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１０９、ＡＶＧ１１０／ＡＶＧ１１１及びＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１１１を用いて、期待されたサイズのＤＮＡ断片を増幅することにより、確認された。プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１０９は、ＡＶＧ８８／ＡＶＧ８９欠失カセット領域の５’末端の外側から開始してハイグロマイシンＢ耐性カセット内で終止するＤＮＡ断片を増幅する。プライマー対ＡＶＧ１１０／ＡＶＧ１１１は、ハイグロマイシンＢ耐性カセット内で開始してＡＶＧ９２／ＡＶＧ９３欠失カセット領域の３’末端の外側で終止するＤＮＡ断片を増幅する。プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１１０は、ｓｆｂ３遺伝子座に組み込まれた欠失カセット全体を増幅する。欠失カセットの相同組み込みが確認された生成菌株はそれぞれ２９−９ Δｓｆｂ３及びＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３と命名した。
ＰＥＧ法による形質転換を用い、Δｓｆｂ３欠失カセットにより菌株Ｍｏｒｐｈ及び２９−９を形質転換し、ハイグロマイシンＢとソルビトールとを含有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。トリコデルマの形質転換は、例えば、米国特許第５，２４６，８５３号に記載されている。ハイグロマイシンＢを含有するアカパンカビ用最少培地に候補株（２９−９＋Δｓｆｂ３については６８４及びＭｏｒｐｈ＋Δｓｆｂ３については３４８）を移植し、ハイグロマイシンＢ耐性候補株を選択した。コンゴレッドを含有するアカパンカビ最少培地又はＰＤＡにハイグロマイシンＢ耐性形質転換体を移植し、コンゴレッド感度を評価した。ＰＣＲ分析は、相同組み換えによりΔｓｆｂ３欠失カセットがｓｆｂ３座に組み込まれた各形質転換体のうち、１株がコンゴレッド感応性候補株であることを明らかにした（図３）。２９−９ Δｓｆｂ３及びＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３の両方におけるｓｆｂ３遺伝子座へのΔｓｆｂ３欠失カセットの相同組み込みは、プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１０９、ＡＶＧ１１０／ＡＶＧ１１１及びＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１１１を用いて、期待されたサイズのＤＮＡ断片を増幅することにより、確認された。プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１０９は、ＡＶＧ８８／ＡＶＧ８９欠失カセット領域の５’末端の外側から開始してハイグロマイシンＢ耐性カセット内で終止するＤＮＡ断片を増幅する。プライマー対ＡＶＧ１１０／ＡＶＧ１１１は、ハイグロマイシンＢ耐性カセット内で開始してＡＶＧ９２／ＡＶＧ９３欠失カセット領域の３’末端の外側で終止するＤＮＡ断片を増幅する。プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１１０は、ｓｆｂ３遺伝子座に組み込まれた欠失カセット全体を増幅する。欠失カセットの相同組み込みが確認された生成菌株はそれぞれ２９−９ Δｓｆｂ３及びＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３と命名した。
１．３．深部培養での菌株２９−９、７０Ｈ２及び２９−９ Δｓｆｂ３の生育
菌株２９−９、７０Ｈ２及び２９−９ Δｓｆｂ３を深部（液体）培養にて同等条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。
菌株２９−９、７０Ｈ２及び２９−９ Δｓｆｂ３を深部（液体）培養にて同等条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。
簡潔には、両面及び底部バッフルを有する３Ｌフラスコ内の５００ｍＬの培地に、各菌株の胞子を別々に添加した。使用した培地は、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１４．４ｇ／Ｌのクエン酸を含有しているものであり、５％のＮａＯＨによりｐＨ ５．５に調整していた。そして３０分間オートクレーブ処理した後、無菌６０％グルコースを添加して最終濃度を２７．５ｇ／Ｌにし、これと共に、２．５ｍＬ／Ｌの微量元素溶液を添加させて培地を使用した。この微量元素溶液には、１７５ｇ／Ｌのクエン酸、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ及び０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３が含有されていた。培養物を４８時間にわたって３４℃にてインキュベーター内で振盪させながら生育させた。
４８時間後、４．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｍＬ／Ｌの同様の微量元素溶液を含有する９．５Ｌの培地を含有する１５Ｌ発酵器に各フラスコの内容物を別々に加えた。これらの成分を一緒に１２１℃にて３０分にわたって熱滅菌した。６０％のグルコースと０．４８％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの溶液を別々にオートクレーブ処理し、冷却し、発酵器に添加して最終濃度を７５ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏにした。この培地を２８％のＮＨ３でｐＨ ３．５に調整し、生育期間全体にわたって温度を３４℃に維持した。
ヘッドスペースへの圧力の印加がなかった場合、溶存酸素（ＤＯ）プローブを１００％に較正した（すなわち、０ｂａｒ（０ｋＰａ）のゲージ圧、１ｂａｒ（１００ｋＰａ）の絶対圧）。ヘッドスペース内の圧力を次に０．７ｂａｒ（７０ｋＰａ）（ゲージ圧）に設定した。その後、播種培地を添加する前に酸素プローブは１７０％の読み取り値を示した。この発酵器は、５００ｒｐｍに初期設定された可変速度モーターにより混合を行う４枚ブレードタービンを２つ備えた。
培養物が生育するにつれて、糸状菌の増殖に起因してブロスの粘性が上昇したことに少なくともある程度は起因して、ＤＯ濃度は低下した。ＤＯが４０％以下に低下した場合には、撹拌速度を増加させて、溶存酸素を４０％に維持した。ＤＯが４０％以下に低下しない場合には、発酵工程中の撹拌速度を増加させる必要はなく、開始撹拌速度は必要とされている速度よりも速いことになる。グルコースが完全に消費された時点で各発酵器で産生されたバイオマスの量を測定したところ、３つの菌株すべてについて産生量がほぼ同じであったことが判明した。
所与の撹拌速度における各発酵器のＤＯ濃度、並びに、所与のＤＯレベルを維持するために必要とされる撹拌速度は、複数の異なる菌株生育表現型により、複数の異なるブロスから得られる粘性の間接的測定値である。一方の変数（すなわち、ＤＯ又は撹拌）のみを変更してもう一方を測定するのが理想であるが、各発酵器において十分なバイオマスの産生を確保するためにＤＯが４０％以下に低下するのを防止して、これにより、異なる菌株の生育のより有意な比較を可能にすることが望ましい。
一般に、対象とするＤＯ濃度を維持するには、撹拌速度を上昇させる必要があるが、撹拌速度は、ブロスの粘性に相関する基準を提供する発酵器タービンを駆動するモーターに供給される電力の量により推定することができる。
具体的には、懸濁した培地を撹拌するのに必要とされる割増電力は、撹拌速度の三乗に比例する。表４は、増殖期の最後にて、溶存酸素を４０％に維持するのに必要とされる最高撹拌速度を示す。
１．４．Ｍｏｒｐｈ Δｓｆｂ３からのｌｏｘＰが隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットの除去
ｌｏｘＰ部位間の組み換えを誘導したｃｒｅ遺伝子を一過性発現することにより、菌株Ｍｏｒｐｈ Δｓｆｂ３からｌｏｘＰに隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットを除去した。Ｍｏｒｐｈ Δｓｆｂ３菌株を、ｃｒｅ含有テロメアプラスミドｐＴｒｅｘ−Ｔｅｌ−ｐｙｒＧ１３／ｐＤＯＮＲ２２１／０９２７８５３ｃｒｅ（図４）で形質転換して、ｌｏｘＰ間の組み換えを誘導し、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを除去した。このベクターは、アセトアミドを含有する培地での生育を可能にするａｍｄＳマーカーカセットを含有する。形質転換体は、いったんアセドアミド含有培地に移植し、次いで、３つをＰＤＡ培地に移植し、ｃｒｅ含有テロメアプラスミドを消失させた。これらの形質転換体を次に平行して、ハイグロマイシンＢカセットが消失したかどうかを評価するためのハイグロマイシンＢ含有アカパンカビ用培地、並びに、ｃｒｅ含有プラスミドが消失したかどうかを評価するためのアセトアミド含有培地に移した（図５；ＰＤＡ＝ポテトデキストロース寒天、ＶＭＨ＝ハイグロマイシンＢを有するアカパンカビ用最少培地、ａｍｄＳ＝アセトアミドを有する最少培地、ｈｐｈ−＝ハイグロマイシンＢに対する感度、ｃｒｅ−＝培地中のアセトアミドの存在に対する感度）。９１．８％の形質転換体がハイグロマイシンＢカセットを消失し、９２．５％の形質転換体がｃｒｅ含有プラスミドを消失した。これは、組み込まれたΔｓｆｂ３欠失カセットからハイグロマイシンＢを除去することが可能であることを実証した。
ｌｏｘＰ部位間の組み換えを誘導したｃｒｅ遺伝子を一過性発現することにより、菌株Ｍｏｒｐｈ Δｓｆｂ３からｌｏｘＰに隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットを除去した。Ｍｏｒｐｈ Δｓｆｂ３菌株を、ｃｒｅ含有テロメアプラスミドｐＴｒｅｘ−Ｔｅｌ−ｐｙｒＧ１３／ｐＤＯＮＲ２２１／０９２７８５３ｃｒｅ（図４）で形質転換して、ｌｏｘＰ間の組み換えを誘導し、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを除去した。このベクターは、アセトアミドを含有する培地での生育を可能にするａｍｄＳマーカーカセットを含有する。形質転換体は、いったんアセドアミド含有培地に移植し、次いで、３つをＰＤＡ培地に移植し、ｃｒｅ含有テロメアプラスミドを消失させた。これらの形質転換体を次に平行して、ハイグロマイシンＢカセットが消失したかどうかを評価するためのハイグロマイシンＢ含有アカパンカビ用培地、並びに、ｃｒｅ含有プラスミドが消失したかどうかを評価するためのアセトアミド含有培地に移した（図５；ＰＤＡ＝ポテトデキストロース寒天、ＶＭＨ＝ハイグロマイシンＢを有するアカパンカビ用最少培地、ａｍｄＳ＝アセトアミドを有する最少培地、ｈｐｈ−＝ハイグロマイシンＢに対する感度、ｃｒｅ−＝培地中のアセトアミドの存在に対する感度）。９１．８％の形質転換体がハイグロマイシンＢカセットを消失し、９２．５％の形質転換体がｃｒｅ含有プラスミドを消失した。これは、組み込まれたΔｓｆｂ３欠失カセットからハイグロマイシンＢを除去することが可能であることを実証した。
１．５．ｓｆｂ３遺伝子を破壊させても対象の遺伝子の発現は損なわれない
グルコアミラーゼ酵素をコードする発現カセットは、目的とする代表的な遺伝子として機能し、並びに、変異糸状菌株から分泌されるタンパク質の量を測定するための便利な方法が得られた。ａｍｄＳマーカーカセットに融合させた、ｃｂｈＩプロモーター、Ｔ．リーゼイ・グルコアミラーゼ遺伝子ＴｒｇｌａＡ及びｃｂｈＩターミネーターを含有するグルコアミラーゼ発現カセット（すなわち、ＴｒｇｌａＡ発現カセット）をプラスミドｐＮＳＰ２３（図６）からプライマー対ＳＫ７４５／ＳＫ７４６を用いてＰＣＲ増幅した。複数のＰＣＲ反応物をプールし、ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、エタノール沈殿させて、増幅したＤＮＡ断片を濃縮した。ＰＥＧ法による形質転換を用い、ＴｒｇｌａＡ発現カセットによりＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３菌株を形質転換し、その後、ソルビトールを含有するアセトアミド最小培地上に蒔いた。好適な候補株をアセトアミド最小培地上で選択し、マイクロタイターフォーマット内の誘導培地に移した。これらの菌株をマイクロタイタープレートで生育させ、基質としてＰＮＰＧを用い、上清の持つグルコアミラーゼ活性をアッセイした。
グルコアミラーゼ酵素をコードする発現カセットは、目的とする代表的な遺伝子として機能し、並びに、変異糸状菌株から分泌されるタンパク質の量を測定するための便利な方法が得られた。ａｍｄＳマーカーカセットに融合させた、ｃｂｈＩプロモーター、Ｔ．リーゼイ・グルコアミラーゼ遺伝子ＴｒｇｌａＡ及びｃｂｈＩターミネーターを含有するグルコアミラーゼ発現カセット（すなわち、ＴｒｇｌａＡ発現カセット）をプラスミドｐＮＳＰ２３（図６）からプライマー対ＳＫ７４５／ＳＫ７４６を用いてＰＣＲ増幅した。複数のＰＣＲ反応物をプールし、ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、エタノール沈殿させて、増幅したＤＮＡ断片を濃縮した。ＰＥＧ法による形質転換を用い、ＴｒｇｌａＡ発現カセットによりＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３菌株を形質転換し、その後、ソルビトールを含有するアセトアミド最小培地上に蒔いた。好適な候補株をアセトアミド最小培地上で選択し、マイクロタイターフォーマット内の誘導培地に移した。これらの菌株をマイクロタイタープレートで生育させ、基質としてＰＮＰＧを用い、上清の持つグルコアミラーゼ活性をアッセイした。
最良のＭｏｒｐｈ Δｓｆｂ３＋ＴｒｇｌａＡ候補株は、２９−９菌株（これもＴｒｇｌａＡ発現カセットを含む）よりも高いグルコアミラーゼ活性を有した。一番の候補株の上清のもつグルコアミラーゼ活性を振盪フラスコ培養法による生育後に検証し、マイクロタイタープレートで得られた結果を確認した。この結果は、ｓｆｂ３の欠失が対象のタンパク質の発現又は分泌を損なわないことを示す。
実施例２．野生型ｓｆｂ３遺伝子による７０Ｈ２菌株の相補性試験
２．１．ｓｆｂ３遺伝子を含有するコンストラクトの作製
ｓｆｂ３遺伝子を含有する４種のコンストラクトを作製した。プライマー対ＡＶＧ８２／ＡＶＧ８３を用いて、２９−９ゲノムＤＮＡから野生型ｓｆｂ３遺伝子をその天然のプロモーター及びターミネーターで増幅し、７０Ｈ２ゲノムＤＮＡから変異ｓｆｂ３遺伝子をその天然のプロモーター及びターミネーターで増幅した。プライマー対ＡＶＧ８４／ＡＶＧ８５を用いて、２９−９ゲノムＤＮＡを使用して野生型ｓｆｂ３遺伝子を開始コドンから終止コドンまで増幅し、７０Ｈ２ゲノムＤＮＡを使用して変異ｓｆｂ３遺伝子を開始コドンから終止コドンまで増幅した。その結果、天然のｓｆｂ３プロモーター及びターミネーターを有する又は有さない、野生型又は変異ｓｆｂ３遺伝子を含有する４種のＰＣＲ増幅断片が得られた。これらの４種の断片を、独立してｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））の中にクローニングした。
２．１．ｓｆｂ３遺伝子を含有するコンストラクトの作製
ｓｆｂ３遺伝子を含有する４種のコンストラクトを作製した。プライマー対ＡＶＧ８２／ＡＶＧ８３を用いて、２９−９ゲノムＤＮＡから野生型ｓｆｂ３遺伝子をその天然のプロモーター及びターミネーターで増幅し、７０Ｈ２ゲノムＤＮＡから変異ｓｆｂ３遺伝子をその天然のプロモーター及びターミネーターで増幅した。プライマー対ＡＶＧ８４／ＡＶＧ８５を用いて、２９−９ゲノムＤＮＡを使用して野生型ｓｆｂ３遺伝子を開始コドンから終止コドンまで増幅し、７０Ｈ２ゲノムＤＮＡを使用して変異ｓｆｂ３遺伝子を開始コドンから終止コドンまで増幅した。その結果、天然のｓｆｂ３プロモーター及びターミネーターを有する又は有さない、野生型又は変異ｓｆｂ３遺伝子を含有する４種のＰＣＲ増幅断片が得られた。これらの４種の断片を、独立してｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））の中にクローニングした。
次の工程で、４種のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯコンストラクトを、ＬＲクロナーゼ反応を用いて、デスティネーションベクターｐＴｒｅｘ２ｇ／ＨｙｇＢに移した。大腸菌により４種のコンストラクトを各々増幅させ、各コンストラクトについて得られたミニプレップ産物を減圧乾燥し濃縮した。このように調製したＤＮＡを後続の工程で使用した。代表的なデスティネーションコンストラクトを、図７に示す。
２．２．ｓｆｂ３遺伝子による７０Ｈ２表現型の相補性試験
ＰＥＧ法による形質転換を用い、４種のデスティネーションベクターコンストラクトの各々により７０Ｈ２を別個に形質転換させ、その後、ハイグロマイシンＢを有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。４種の形質転換体の各々から得た３０の候補株を、ハイグロマイシンＢを含むＰＤＡに移し、これらの表現型を、ｐＴｒｅｘ２ｇ／ＨｙｇＢベクター単独で形質転換した７０Ｈ２及び２９−９（対照として）の表現型と比較した。野生型ｓｆｂ３遺伝子で形質転換されたすべての候補株は、ハイグロマイシンＢを含むＰＤＡ培地上で２９−９と同様の野生型表現型を有した。変異ｓｆｂ３遺伝子で形質転換した結果７０Ｈ２から誘導されたすべての候補株は、７０Ｈ２表現型を保持していた（図８）。これらの結果は、２９−９から誘導された野生型ｓｆｂ３遺伝子は７０Ｈ２菌株に野生型表現型を付与することができたが、７０Ｈ２から誘導された変異ｓｆｂ３遺伝子は付与できなかったことを示した。
ＰＥＧ法による形質転換を用い、４種のデスティネーションベクターコンストラクトの各々により７０Ｈ２を別個に形質転換させ、その後、ハイグロマイシンＢを有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。４種の形質転換体の各々から得た３０の候補株を、ハイグロマイシンＢを含むＰＤＡに移し、これらの表現型を、ｐＴｒｅｘ２ｇ／ＨｙｇＢベクター単独で形質転換した７０Ｈ２及び２９−９（対照として）の表現型と比較した。野生型ｓｆｂ３遺伝子で形質転換されたすべての候補株は、ハイグロマイシンＢを含むＰＤＡ培地上で２９−９と同様の野生型表現型を有した。変異ｓｆｂ３遺伝子で形質転換した結果７０Ｈ２から誘導されたすべての候補株は、７０Ｈ２表現型を保持していた（図８）。これらの結果は、２９−９から誘導された野生型ｓｆｂ３遺伝子は７０Ｈ２菌株に野生型表現型を付与することができたが、７０Ｈ２から誘導された変異ｓｆｂ３遺伝子は付与できなかったことを示した。
表現型復帰が、染色体ＤＮＡにおける変化によるのではなく、野生型ｓｆｂ３遺伝子の存在により生じたことを確認するために、複数の候補株をＰＤＡ培地（非選択的条件）上に四回移植し、ベクターを消失した候補株を探し、次に、ハイグロマイシンＢを有する選択的培地に戻した。不安定でかつプラスミドを消失していた（ハイグロマイシンＢ耐性の消失に基づく）すべての候補株について、プラスミドの消失は、７０Ｈ２表現型の再出現と相関した。これらの結果は、７０Ｈ２の野生型表現型の回復に野生型ｓｆｂ３が関与していたことを裏付ける。
２．３．野生型ｓｆｂ３遺伝子を含有するｓｆｂ３遺伝子置換カセットの作製
野生型ｓｆｂ３遺伝子の３’末端の約２／３を含有するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ９４／ＡＶＧ９５で増幅させ、これは、断片の５’末端にてＳｐｅＩ部位を、並びに、断片の３’末端にてＢｇｌＩＩ部位を導入した。ｌｏｘＰ部位に隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ｈｐｈ−ｌｏｘＰ＃４（図１）からプライマー対ＡＶＧ９０／ＡＶＧ９１で増幅し、断片の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＮｏｔＩ部位を導入した。ｓｆｂ３ターミネーター領域の３’ＤＮＡ配列下流を含有するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ９６／ＡＶＧ９７で増幅し、断片の５’末端にＮｏｔＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＸｂａＩ部位を導入した。
野生型ｓｆｂ３遺伝子の３’末端の約２／３を含有するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ９４／ＡＶＧ９５で増幅させ、これは、断片の５’末端にてＳｐｅＩ部位を、並びに、断片の３’末端にてＢｇｌＩＩ部位を導入した。ｌｏｘＰ部位に隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ｈｐｈ−ｌｏｘＰ＃４（図１）からプライマー対ＡＶＧ９０／ＡＶＧ９１で増幅し、断片の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＮｏｔＩ部位を導入した。ｓｆｂ３ターミネーター領域の３’ＤＮＡ配列下流を含有するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ９６／ＡＶＧ９７で増幅し、断片の５’末端にＮｏｔＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＸｂａＩ部位を導入した。
これら３つの断片を連続して、ベクターｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））の中にライゲーションし、得られたプラスミドをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ ９４９０９６（図９）と命名した。テンプレートとして２９−９ゲノムＤＮＡを用いて、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを囲む２つのＤＮＡ配列を増幅した。ｓｆｂ３遺伝子の一部と、各端部にてｌｏｘＰにより囲まれたハイグロマイシンＢ耐性カセットと、ｓｆｂ３の３’配列下流とを含有する、ｓｆｂ３遺伝子置換カセットをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ ８８９０９２からプライマー対ＡＶＧ１０２／ＡＶＧ１０３で増幅した。複数のＰＣＲ反応物をプールし、ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、エタノール沈殿させて、増幅したＤＮＡ断片を濃縮した。このように調製したＤＮＡを後続の工程で使用した。
２．４．天然ｓｆｂ３遺伝子座からのｓｆｂ３野生型遺伝子の発現による７０Ｈ２表現型の相補性試験
ＰＥＧ法による形質転換を用い、ｓｆｂ３遺伝子置換カセット（セクション２．３に記載）により菌株７０Ｈ２を形質転換し、次に、ハイグロマイシンＢとソルビトールを含有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。野生型コロニー表現型を有する１５の候補株を、ハイグロマイシンＢを含有するアカパンカビ用最少培地に移植し、野生型コロニー表現型を有するハイグロマイシンＢ耐性候補株を選択した。好適なハイグロマイシンＢ耐性候補株を、ハイグロマイシンＢを含有する最小培地上で選択し、野生型コロニー表現型について評価した（図１０）。
ＰＥＧ法による形質転換を用い、ｓｆｂ３遺伝子置換カセット（セクション２．３に記載）により菌株７０Ｈ２を形質転換し、次に、ハイグロマイシンＢとソルビトールを含有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。野生型コロニー表現型を有する１５の候補株を、ハイグロマイシンＢを含有するアカパンカビ用最少培地に移植し、野生型コロニー表現型を有するハイグロマイシンＢ耐性候補株を選択した。好適なハイグロマイシンＢ耐性候補株を、ハイグロマイシンＢを含有する最小培地上で選択し、野生型コロニー表現型について評価した（図１０）。
７０Ｈ２のｓｆｂ３遺伝子座でのｓｆｂ３遺伝子置換カセットの相同組み込みは、プライマー対ＡＶＧ１１２／ＡＶＧ１１３及びＡＶＧ１１４／ＡＶＧ１１５を用いて、期待されたサイズのＤＮＡ断片を増幅することにより、確認された。プライマー対ＡＶＧ１１２／ＡＶＧ１１３は、ＡＶＧ９４／ＡＶＧ９５ ｓｆｂ３遺伝子置換カセット領域の５’末端の外側から開始してハイグロマイシンＢ耐性カセット内で終止するＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対ＡＶＧ１１４／ＡＶＧ１１５は、ハイグロマイシンＢ耐性カセット内で開始してＡＶＧ９６／ＡＶＧ９７ ｓｆｂ３遺伝子置換カセット領域の３’末端の外側で終止するＤＮＡ断片を増幅した。
生じた、ｓｆｂ３遺伝子置換カセットの相同組み込みが確認された菌株は、７０Ｈ２＋野生型ｓｆｂ３と命名した。この菌株は、２９−９と同様の表現型を有した。それゆえに、７０Ｈ２内の変異ｓｆｂ３遺伝子の、野生型ｓｆｂ３遺伝子による天然ｓｆｂ３遺伝子座における置換により、７０Ｈ２の野生型表現型が回復し、ｓｆｂ３遺伝子の破壊が７０Ｈ２において粘性を低下させる表現型をもたらす更なる根拠をもたらした。
実施例３．深部培養での菌株２９−９、７０Ｈ２及び２９−９ Δｓｆｂ３の生育
菌株２９−９、７０Ｈ２及び２９−９ Δｓｆｂ３を深部（液体）培養にて同等条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。簡潔には、両面及び底部バッフルを有する３Ｌフラスコ内の５００ｍＬの培地に、各菌株の胞子を別々に添加した。使用した培地は、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１４．４ｇ／Ｌのクエン酸を含有しているものであり、５％のＮａＯＨによりｐＨ ５．５に調整していた。そして３０分間オートクレーブ処理した後、無菌６０％グルコースを添加して最終濃度を２７．５ｇ／Ｌにし、これと共に、２．５ｍＬ／Ｌの微量元素溶液を添加させて培地を使用した。この微量元素溶液には、１７５ｇ／Ｌのクエン酸、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ及び０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３が含有されていた。培養物を４８時間にわたって３４℃にてインキュベーター内で振盪させながら生育させた。
菌株２９−９、７０Ｈ２及び２９−９ Δｓｆｂ３を深部（液体）培養にて同等条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。簡潔には、両面及び底部バッフルを有する３Ｌフラスコ内の５００ｍＬの培地に、各菌株の胞子を別々に添加した。使用した培地は、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１４．４ｇ／Ｌのクエン酸を含有しているものであり、５％のＮａＯＨによりｐＨ ５．５に調整していた。そして３０分間オートクレーブ処理した後、無菌６０％グルコースを添加して最終濃度を２７．５ｇ／Ｌにし、これと共に、２．５ｍＬ／Ｌの微量元素溶液を添加させて培地を使用した。この微量元素溶液には、１７５ｇ／Ｌのクエン酸、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ及び０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３が含有されていた。培養物を４８時間にわたって３４℃にてインキュベーター内で振盪させながら生育させた。
４８時間後、４．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｍＬ／Ｌの同様の微量元素溶液を含有する９．５Ｌの培地を含有する１５Ｌ発酵器に各フラスコの内容物を別々に加えた。これらの成分を一緒に１２１℃にて３０分にわたって熱滅菌した。６０％のグルコースと０．４８％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの溶液を別々にオートクレーブ処理し、冷却し、発酵器に添加して最終濃度を７５ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏにした。この培地を２８％のＮＨ３でｐＨ ３．５に調整し、生育期間全体にわたって温度を３４℃に維持した。
ヘッドスペースへの圧力の印加がなかった場合、溶存酸素（ＤＯ）プローブを１００％に較正した（すなわち、０ｂａｒ（０ｋＰａ）のゲージ圧、１ｂａｒ（１００ｋＰａ）の絶対圧）。ヘッドスペース内の圧力を次に０．７ｂａｒ（７０ｋＰａ）（ゲージ圧）に設定した。その後、播種培地を添加する前に酸素プローブは１７０％の読み取り値を示した。この発酵器は、５００ｒｐｍに初期設定された可変速度モーターにより混合を行う４枚ブレードタービンを２つ備えた。
培養物が生育するにつれて、糸状菌の増殖に起因してブロスの粘性が上昇したことに少なくともある程度は起因して、ＤＯ濃度は低下した。ＤＯが４０％以下に低下した場合には、撹拌速度を増加させて、溶存酸素を４０％に維持した。ＤＯが４０％以下に低下しない場合には、発酵工程中の撹拌速度を増加させる必要はなく、開始撹拌速度は必要とされている速度よりも速いことになる。グルコースが完全に消費された時点で各発酵器で産生されたバイオマスの量を測定したところ、３つの菌株すべてについて産生量がほぼ同じであったことが判明した。
所与の撹拌速度における各発酵器のＤＯ濃度、並びに、所与のＤＯレベルを維持するために必要とされる撹拌速度は、複数の異なる菌株生育表現型により、複数の異なるブロスから得られる粘性の間接的測定値である。一方の変数（すなわち、ＤＯ又は撹拌）のみを変更してもう一方を測定するのが理想であるが、各発酵器において十分なバイオマスの産生を確保するためにＤＯが４０％以下に低下するのを防止して、これにより、異なる菌株の生育のより有意な比較を可能にすることが望ましい。
一般に、対象とするＤＯ濃度を維持するには、撹拌速度を上昇させる必要があるが、撹拌速度は、ブロスの粘性に相関する基準を提供する発酵器タービンを駆動するモーターに供給される電力の量により推定することができる。
具体的には、懸濁した培地を撹拌するのに必要とされる割増電力は、撹拌速度の三乗に比例する。表４は、増殖期の最後にて、溶存酸素を４０％に維持するのに必要とされる最高撹拌速度を示す。
実施例４．全セルラーゼ組成物を産生するためのΔｓｆｂ３ Ｈ３Ａ菌株の作製
４．１ Δｓｆｂ３欠失カセットの作製
Ｔ．リーゼイｓｆｂ３遺伝子の５’末端に隣接するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ８８／ＡＶＧ８９で増幅した。このプライマー対による断片の増幅により、断片の５’末端にＳａｌＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入した。平行なｌｏｘＰ部位に隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ｈｐｈ−ｌｏｘＰ＃４（図１）からプライマー対ＡＶＧ９０／ＡＶＧ９１で増幅し、断片の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＮｏｔＩ部位を導入した。ｓｆｂ３の３’末端に隣接するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ９２／ＡＶＧ９３で増幅し、断片の５’末端にＮｏｔＩ部位を、並びに、３’末端にＸｂａｌ部位を導入した。
４．１ Δｓｆｂ３欠失カセットの作製
Ｔ．リーゼイｓｆｂ３遺伝子の５’末端に隣接するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ８８／ＡＶＧ８９で増幅した。このプライマー対による断片の増幅により、断片の５’末端にＳａｌＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入した。平行なｌｏｘＰ部位に隣接するハイグロマイシンＢ耐性カセットをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ｈｐｈ−ｌｏｘＰ＃４（図１）からプライマー対ＡＶＧ９０／ＡＶＧ９１で増幅し、断片の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を、並びに、断片の３’末端にＮｏｔＩ部位を導入した。ｓｆｂ３の３’末端に隣接するＤＮＡ配列をプライマー対ＡＶＧ９２／ＡＶＧ９３で増幅し、断片の５’末端にＮｏｔＩ部位を、並びに、３’末端にＸｂａｌ部位を導入した。
上記３つの断片を連続して、ベクターｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））の中にライゲーションし、得られたプラスミドをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ ８８９０９２（図２）と命名した。テンプレートとしてＭｏｒｐｈ ＴｒｇｌａＡ（２９−９）ゲノムＤＮＡを用いて、ｓｆｂ３遺伝子の５’及び３’末端のＤＮＡ配列を増幅した。５’ｓｆｂ３隣接部位を含有するΔｓｆｂ３欠失カセット、各端部にてｌｏｘＰにより囲まれたハイグロマイシンＢ耐性カセット、及び３’ｓｆｂ３隣接部位をプラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ ８８９０９２からプライマー対ＡＶＧ１０４／ＡＶＧ１０５で増幅した。複数のＰＣＲ反応物をプールし、ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、エタノール沈殿させて、増幅したＤＮＡ断片を濃縮した。このようにして調製したＤＮＡを、次の工程で使用した。
４．２ ｓｆｂ３遺伝子を欠く菌株Ｈ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９の作製
Ｈ３Ａ組み込みトリコデルマ・リーゼイ発現菌株を、国際公開第２０１１／０３８０１９号として公開されているＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４９８４９の記載に従って、調製した。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法による形質転換を用い、菌株Ｈ３ＡをΔｓｆｂ３欠失カセットにより、形質転換し、ハイグロマイシンＢとソルビトールを含有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。ＰＥＧ法によるトリコデルマの形質転換は、例えば、米国特許第５，２４６，８５３号に先行して記載されている。
Ｈ３Ａ組み込みトリコデルマ・リーゼイ発現菌株を、国際公開第２０１１／０３８０１９号として公開されているＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４９８４９の記載に従って、調製した。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法による形質転換を用い、菌株Ｈ３ＡをΔｓｆｂ３欠失カセットにより、形質転換し、ハイグロマイシンＢとソルビトールを含有するアカパンカビ用最少培地上に蒔いた。ＰＥＧ法によるトリコデルマの形質転換は、例えば、米国特許第５，２４６，８５３号に先行して記載されている。
１０２０の候補株を、ハイグロマイシンＢを含有するアカパンカビ用最少培地プレートに移植して、ハイグロマイシンＢ耐性を選択した。ハイグロマイシンＢ耐性候補株を次に、コンゴレッドを含有するアカパンカビ用最少培地又はＰＤＡ培地に移植し、コンゴレッド感度を評価した。
コンゴレッドに対して弱い感度を示す４３の安定な候補株のＰＣＲ分析を行ったところ、１つの候補株＃１００９が、天然ｓｆｂ３遺伝子を脱離させかつＨ３Ａゲノム中にｓｆｂ３欠失カセットを相同組み込みした場合と一致する特性を示した。Ｈ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９におけるｓｆｂ３遺伝子座でのΔｓｆｂ３欠失カセットの相同組み込みは、プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１０９、ＡＶＧ１１０／ＡＶＧ１１１及びＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１１１を用いて、期待されたサイズのＤＮＡ断片を増幅することにより、確認された。具体的には、プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１０９は、ＡＶＧ８８／ＡＶＧ８９欠失カセット領域の５’末端の外側から開始してハイグロマイシンＢ耐性カセット内で終止するＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対ＡＶＧ１１０／ＡＶＧ１１１は、ハイグロマイシンＢ耐性カセット内で開始してＡＶＧ９２／ＡＶＧ９３欠失カセット領域の３’末端の外側で終止するＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対ＡＶＧ１０８／ＡＶＧ１１１は、ｓｆｂ３遺伝子座に組み込まれた欠失カセット全体を増幅した。ｓｆｂ３遺伝子の不在は、内部ｓｆｂ３断片を増幅するように設計されたプライマー対ＡＶＧ１６０／ＡＶＧ１６１を用いたときの、ＰＣＲ産物の不在により確認された。
Ｈ３Ａ宿主菌株と比較したときに、Ｈ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９菌株は、コンゴレッド含有培地上でより制限されたコロニー形態と、ＰＤＡ上でよりゆっくりとした生育速度を示し、ハイグロマイシンＢを含有する培地上で生育できない（図１１）。菌株Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９の液体培養もまた比較した。両方の菌株の振盪フラスコ培地を５０ｍＬのＹＥＧ又はグリシン最少培地において２８℃及び２２０ｒｐｍにてそれぞれ１又は６日間にわたって生育した。両方のＹＥＧ及びグリシン最小培地菌株Ｈ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９は、一般に、より長さの短い菌糸を有した（図１２）が、これは粘性特性の改善を示唆する。
４．３ Ｈ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９における全セルラーゼ組成物の効率的産生
一方はＨ３Ａを用いて、もう一方はＨ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９を用いて、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４９８４９に記載のような標準的発酵条件下で、２つの発酵工程を並行して行った。５００ｒｐｍの撹拌速度を各発酵槽で使用した。Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｏｒ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＵＳＡ，Ｒｅｎｏ ＮＶ））を用いて、溶存酸素を増殖期の最後に測定した。ＤＯ濃度の比較を、以下の表５に示す。
一方はＨ３Ａを用いて、もう一方はＨ３Ａ Δｓｆｂ３ ＃１００９を用いて、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４９８４９に記載のような標準的発酵条件下で、２つの発酵工程を並行して行った。５００ｒｐｍの撹拌速度を各発酵槽で使用した。Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｏｒ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＵＳＡ，Ｒｅｎｏ ＮＶ））を用いて、溶存酸素を増殖期の最後に測定した。ＤＯ濃度の比較を、以下の表５に示す。
上記の組成物及び方法は、理解を明瞭にする目的で例示及び実施例により幾分詳細に記載されてきたが、特定の変化及び修正がなされ得ることは当業者には明白であろう。したがって、本説明は、添付の特許請求の範囲により詳述される本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
本明細書に引用されたすべての公刊物、特許及び特許明細書は、これによって、あらゆる目的のためにこれらの全体が参照により組み込まれ、各個別の公刊物、特許又は特許明細書が特定的に及び個々に示されている場合には参照により同程度そのように組み込まれる。
Claims (37)
- 親菌株から誘導された糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株は、前記変異菌株の細胞の機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を、前記親菌株の細胞と比較して減少させる、遺伝子変異を含み、前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵中に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する、変異菌株。
- 前記遺伝子変異が、前記親菌株中に存在するｓｆｂ３遺伝子の破壊を含む、請求項１に記載の変異菌株。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、前記ｓｆｂ３遺伝子のすべて又は一部を欠失させた結果得られる、請求項２に記載の変異菌株。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、前記ｓｆｂ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部を欠失させた結果得られる、請求項２に記載の変異菌株。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、前記ｓｆｂ３遺伝子に変異を導入した結果得られる、請求項２に記載の変異菌株。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、部位特異的組み換えを用いて行われる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、前記ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、前記変異菌株に粘性を低下させる表現型を付与するための主要な遺伝的決定因子になる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株が機能性Ｓｆｂ３タンパク質を産生しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株がＳｆｂ３タンパク質を産生しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株が、対象のタンパク質をコードする遺伝子を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株が、バイオマス単位量当たりに前記親菌株と実質的に同量のタンパク質を産生する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記Ｓｆｂ３タンパク質が、アミノ酸配列ＩＱＬＡＲＱＧＸＤＧＸＥＸＸＸＡＲＸＬＸＥＤＲＮＸＥＡＸＳＸＶＤＷＬ（配列番号９、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記糸状菌がチャワンタケ（Pezizomycotina）種である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 糸状菌細胞の変異菌株の産生方法であって、遺伝子変異を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程を含み、前記遺伝子変異が前記親菌株の細胞と比較して機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を低下させ又は抑制することで、深部培養における好気性発酵中に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する、変異糸状菌細胞を製造する、方法。
- 前記遺伝子変異が、遺伝子操作を使用して親糸状菌細胞のｓｆｂ３遺伝子を破壊することを含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記遺伝子変異が、遺伝子操作を使用して親糸状菌細胞のｓｆｂ３遺伝子を欠失させることを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
- 前記遺伝子変異が、部位特異的遺伝子組み換えを用いて行われる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、前記ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異菌株が、バイオマス単位量当たりに前記親菌株と実質的に同量のタンパク質を産生する、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｓｆｂ３タンパク質が、アミノ酸配列ＩＱＬＡＲＱＧＸＤＧＸＥＸＸＸＡＲＸＬＸＥＤＲＮＸＥＡＸＳＸＶＤＷＬ（配列番号９、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状菌がチャワンタケ（Pezizomycotina）種である、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親菌株が、対象のタンパク質をコードする遺伝子を更に含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象のタンパク質をコードする遺伝子が、機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生を低下させる又は抑制する遺伝子変異を導入する前に、前記親菌株内に存在する、請求項２５に記載の方法。
- 請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法により産生される、糸状菌の変異菌株。
- 親菌株から誘導される糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、
（ａ）前記変異菌株の細胞の機能性Ｓｆｂ３タンパク質の産生量を、前記親菌株の細胞と比較して減少させる遺伝子変異であって、（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要があること、並びに／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持すること、をもたらす遺伝子変異と、
（ｂ）（ａ）における遺伝子変異の前に対象のタンパク質をコードする遺伝子が前記変異菌株中に存在する、対象のタンパク質をコードする遺伝子と、
を含む、変異菌株。 - 前記遺伝子変異が、前記親菌株中に存在するｓｆｂ３遺伝子の破壊を含む、請求項２８に記載の変異菌株。
- 前記ｓｆｂ３遺伝子の破壊が、前記ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる、請求項２９に記載の変異菌株。
- 粘性の表現型が変更された変異糸状菌細胞をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）糸状菌の親菌株の細胞に変異を誘導して変異細胞を製造する工程であって、前記細胞の変異誘導が、前記ｓｆｂ３遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと組み合わせて行われる工程と、
（ｂ）蛍光染色に対する感度の変化について前記変異細胞をスクリーニングする工程と、
（ｃ）前記蛍光染色に対し感度の変更された変異菌株を選択する工程と、を含み、
前記蛍光染色に対し変更された感度と、前記変異糸状菌細胞が、深部培養における好気性発酵中に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を変更する必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する能力と、が相関する、方法。 - 前記変更された感度が増加した感度であり、前記変異糸状菌細胞が、深部培養における好気性発酵中に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要があり、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを産生する、請求項３１に記載の方法。
- 前記蛍光染色がカルコフロールホワイト（Calcofluor White）である、請求項３１又は３２に記載の方法。
- 前記細胞の変異誘導が、遺伝子組み換えにより行われる、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
- 糸状菌において対象のタンパク質を産生させるための方法であって、親糸状菌細胞に、前記対象のタンパク質をコードする遺伝子と、前記細胞中のＳｆｂ３タンパク質の量又は活性を減少させる遺伝子変異と、を導入することで、深部培養における好気性発酵中に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、撹拌速度を減少させる必要がある、並びに／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された速度での撹拌下で、増加した溶存酸素量を維持する、前記対象のタンパク質を含む細胞ブロスを産生する、変異糸状菌細胞を製造することを含み、ここで、前記対象のタンパク質が前記親細胞と比較して前記変異細胞中で実質的に同じ濃度で産生される、方法。
- 前記対象のタンパク質が、対象の１種を超えるタンパク質であり、前記対象の１種を超えるタンパク質の各々は、前記親細胞と比較して前記変異細胞中で実質的に同じ相対濃度で産生される、請求項３５に記載の方法。
- 前記対象の１種を超えるタンパク質が、セルラーゼ及びヘミセルラーゼから選択される、請求項３６に記載の方法。
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