BRPI0713090A2

BRPI0713090A2 - composições de enzima e métodos para a hidrólise enzimática aperfeiçoada de celulose

Info

Publication number: BRPI0713090A2
Application number: BRPI0713090-2A
Authority: BR
Inventors: Jeffrey S Tolan; Theresa White; John Tomashek
Original assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2012-10-30
Also published as: CA2655640A1; EP2029761A4; AU2007262633A1; US8202709B2; CN101501206A; EP2029761A1; WO2007147263A1; US20100068768A1

Abstract

COMPOSIçõES DE ENZIMA E MéTODOS PARA A HIDRóLISE ENZIMáTICA APERFEIçOADA DE CELULOSE. A presente invenção refere-se a um processo para a hidrólise enzimática de celulose para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose a partir de um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado e enzimas para uso no processo. O processo compreende hidrolisação parcial de uma pasta fluida aquosa de um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado com enzimas celulase, uma ou mais do que uma enzima b glicosidade e um agente de ligação para ligação da b-glicosidade aos sólidos de fibra presentes na pasta fluida aquosa. Os sólidos de fibra separados são, desse modo, obtidos, e, em seguida, ressuspensos em uma solução aquosa para produzir uma pasta fluida ressuspensa. A hidrólise é, em seguida, continuada para produzir o produto de hidrólise compreendendo glicose.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES DE ENZIMA E MÉTODOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA A- PERFEIÇOADA DE CELULOSE".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se às enzimas para a hidrólise de celulose e métodos de uso das mesmas. Mais especificamente, a presente invenção se refere às enzimas celulase e β-glicosidase para hidrólise enzi- mática de celulose para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose a partir de um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado.

Antecedentes da Invenção

O etanol combustível é atualmente produzido de estoques de alimentação tais como amido de milho, cana de açúcar e beterrabas de açú- car. Contudo, o potencial para produção de etanol destas fontes é limitado, visto que muita da gleba de terra cultivada que é adequada para a produção destas colheitas já está em uso como uma fonte de alimento para seres hu- manos. Além disso, a produção de etanol a partir deste estoque de alimen- tação tem um impacto negativo no ambiente porque os combustíveis fósseis usados no processo de conversão produzem dióxido de carbono e outros subprodutos.

A produção de celulose a partir de estoques de alimentação con- tendo celulose, tais como resíduos agrícolas, gramas e resíduos de área florestal, tem recebido muita atenção nos anos recentes. As razões para isto são porque estes estoques de alimentação são amplamente disponíveis e pouco custosos, e seu uso para produção de etanol proporciona uma alter- nativa a queima ou aterro de materiais de resíduo lignocelulósico. Além dis- so, um subproduto de conversão de celulose, lignina, pode ser usado como um combustível para energizar o processo ao invés de combustíveis fósseis. Vários estudos têm concluído que, quando o ciclo de produção total e con- sumo é levado em conta, o uso de etanol produzido de celulose gera perto de zero gases de estufa.

Os estoques de alimentação celulósicos que são os mais pro- missores para produção de etanol incluem (1) resíduos agrícolas tais como forragem de milho, espigas de milho, fibra de milho, palha de trigo, palha de cevada, palha de aveia, cascas de aveia, palha de arroz, cascas de arroz, palha de canola, e forragem de feijão-soja; (2) gramas tais como grama de vara, miscanthus, grama de corda, grama de centeio e grama de canário de cana; (3) biomassa de área florestal tais como fibra de polpa de madeira re- ciclada, madeira dura, madeira macia e serragem; e (4) resíduos de proces- samento de açúcar, tais como bagaço e polpa de beterraba.

A primeira etapa de processo de conversão de estoque de ali- mentação lignocelulósico em etanol envolve quebra do material fibroso para liberar monômeros de açúcar, tais como glicose, a partir do estoque de ali- mentação para conversão em etanol na etapa subsequente de fermentação. Os dois processos primários são hidrólises ácida, que envolve a hidrólise do estoque de alimentação usando-se uma etapa simples de tratamento ácido, e hidrólise enzimática, que envolve um pré-tratamento ácido seguido por hidrólise com enzimas celulase.

No processo de hidrólise ácida, o estoque de alimentação é submetido a vapor e a um ácido forte, tal como ácido sulfúrico, a uma tempe- ratura, concentração ácida e comprimento de tempo que são suficientes pa- ra hidrolisar a celulose em glicose e hemicelulose em xilose e arabinose. No caso quando ácido sulfúrico é usado, o ácido pode ser concentrado (25-80% em p/p) ou diluído (3-8% em p/p), medido como o peso de ácido no peso de solução aquosa acidificada que está presente com o estoque de alimenta- ção. A glicose é, em seguida, fermentada a etanol usando-se levedura, e o etanol é recuperado e purificado por destilação.

No processo de hidrólise enzimática, a temperatura de vapor, concentração ácida e tempo de tratamento são escolhidos para serem mais brandos do que no processo de hidrólise ácida, tal que a área superficial da celulose é grandemente aumentada à medida que o estoque de alimentação fibroso é convertido em uma textura turva, mas existe pouca conversão da celulose em glicose. A celulose pré-tratada é, em seguida, hidrosilada a gli- cose em uma etapa subsequente que usa enzimas celulase, e o va- por/tratamento ácido neste caso é conhecido como pré-tratamento. Antes da adição de enzima, o pH do estoque de alimentação ácido é ajustado a um valor que é adequado para a reação de hídrólise enzimática. Tipicamente, isto envolve a adição de álcali a um pH entre cerca de 4 a cerca de 6, que é a faixa de pH ótima para celulases, embora o pH possa ser mais alto se ce- Iulases alcalofílicas são usadas.

Em um tipo de processo de pré-tratamento, a pressão produzida pelo vapor é trazida para baixo rapidamente com descompressão explosiva, que é conhecida como explosão de vapor. Foody (Patente dos Estados Uni- dos N0 4.461.648) descreve o equipamento e condições usadas no pré- tratamento de explosão de vapor. A explosão de vapor com ácido sulfúrico adicionado para alcançar um pH de 0,4 a 2,0 tem sido o processo de pré- tratamento padrão por duas décadas. Ele produz material pré-tratado que é uniforme, e requer menos enzima celulase para hidrolisar ceiulase do que outros processos de pré-tratamento. As enzimas celulase catalisam a hidrólise da celulose (ligações

β-1, 4-D-glucan) no estoque de alimentação em produtos tais como glicose, celobiose, e outros celooligossacarídeos. A celulase é um termo genérico que denota uma mistura de multienzima compreendendo exo-celobio- hidrolases (CBH), endoglucanases (EG), e β-glicosidases (βΘ) que podem ser produzidas por várias plantas e microorganismos. As enzimas celulase operam sinergisticamente para hidrolisar celulose em glicose. CBHI e CBHII geralmente agem nas extremidades dos polímeros de glicose em microfibri- Ias de celulose que liberam celobiose (Teeri e Koivula, Carbohydr. Europe,1995, 12:28-33), enquanto as endoglucanases agem em localizações aleató- rias na celulose. Juntas, estas enzimas hidrolisam celulose em celooligossa- carídeos, principalmente celobiose. A celobiose é hidrosilada em glicose por β-glicosidase. É conhecido que muitas exo-celobio-hidrolases (CBH) e en- donucleases (EG) se ligam a celulose no estoque de alimentação, via módu- los de ligação de carboidrato (CBMs), tais como domínios de ligação de ce- Iulose (CBDs), enquanto muitas enzimas β-glicosidase, incluindo enzimas β- glicosidase de Trichoderma e Aspergillus, não contêm tais módulos de liga- ção e, desse modo, permanecem em solução. Enzimas celulase podem con- ter uma região Iigante que liga o domínio catalítico ao módulo de ligação de carboidrato. Acredita-se que a região Iigante facilita a atividade do domínio cataliticamente ativo.

Enzimas celulase contendo um CBD foram produzidas por en- genharia genética. Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N0 .5.763.254 (Wóldike et ai) descreve a produção de enzimas de degradação de celulose geneticamente projetadas derivadas de domínios de ligação de carboidrato contendo Humicola, Fusarium e Myceliopthora. O objetivo dos estudos foi produzir enzimas de degradação de celulose ou hemicelulose com novas combinações do domínio cataliticamente ativo, a região Iigante e o CBD, ou para produzir enzimas de degradação de celulose ou hemicelulo- se contendo CBD daquelas que carecem de um CBD. Contudo, a capacida- de destas novas enzimas hidrolisarem estoque de alimentação lignocelulósi- co não foi demonstrada.

Um problema significante com processos de hidrólise enzimática é a grande quantidade de enzima celulase requerida, que aumenta o custo do processo. O custo de celulose monta em mais do que 50% do custo de hidrólise. Existem vários fatores que contribuem para o requerimento de en- zima, mas um de significância particular é a presença de compostos que reduzem a taxa de reação de celulase e/ou microorganismos na fermenta- ção subsequente do açúcar. Por exemplo, glicose liberada durante o proces- so inibe celulases, particularmente β-glicosidase (Alfani et ai, J. Membr. Sci., 1990, 52:339-350). A celobiose produzida durante hidrólise de celulose é um inibidor particularmente potente de celulase (Tolan et ai, em Biorefine- ries - Industrial Processes and Products, Vol. 1 Ed. Kamm et ai., Capítulo 9, página 203). Outros inibidores solúveis são produzidos durante pré- tratamento, incluindo produtos de degradação de açúcar, tais como furfural e hidroxil-metil-furfural, derivados de furan, ácidos orgânicos, tal como ácido acético, e compostos fenólicos solúveis derivados de lignina. Estes compos- tos também inibem levedura, que diminui produção de etanol e, consequen- temente, torna o processo mais custoso. Embora os efeitos de inibidores possam ser reduzidos pela realização de hidrólise em uma concentração mais diluída, isto requer o uso de um reator de hidrólise grande, que se so- ma a despesa do processo.

Sacarificação e Fermentação (SSF) simultâneas é um método de conversão de biomassa lignocelulósica em etanol que minimiza inibição de glicose de celulase (ver, por exemplo, Ghost et ai, Enzyme Microb. Te- chnol., 1982, 4:425-430). Em um sistema de SSF, hidrólise enzimática é efe- tuada concorrentemente com fermentação de levedura de glicose em etanol. Durante SSF, a levedura remove glicose do sistema, fermetando-a em eta- nol, e isto diminui a inibição da celulase. Contudo, uma desvantagem deste processo é que as enzimas celulase são inibidas pelo etanol. Em adição, SSF é tipicamente efetuada em temperaturas de 35-38°C, que é mais baixa do que os 50°C ótimos para celulase, e mais alta do que os 28°C ótimos pa- ra levedura. Esta temperatura intermediária resulta em desempenho abaixo do padrão por ambas enzimas celulase e a levedura. Como um resultado, a hidrólise requer tempos de reação muito longos e vasos de reação muito grandes, ambos os quais são custosos.

Outra abordagem que foi proposta para reduzir a inibição por glicose, celobiose, e outros inibidores solúveis é a remoção de produtos de hidrólise através de toda hidrólise, efetuando-se a reação em um reator de membrana. Um reator de membrana contém uma membrana de ultrafiltração que retém partículas e componentes de alto peso molecular, tal como enzi- ma, enquanto permite que moléculas de peso molecular mais baixo, tais co- mo açúcares, passem através da membrana como peremeado.

Um exemplo de um processo utilizando um reator de membrana é descrito em Ohlson and Trãgârdh (Biotech. Bioeng., 1984, 26:647-653). Neste processo, a hidrólise enzimática de salgueiro pré-tratado (uma espé- cie de árvore de salgueiro) é realizada em um reator com uma membrana tendo um corte de peso molecular de 10.000. As celulases têm um peso mo- lecular de 50.000 e são, portanto, retidas pela membrana no reator de hidró- lise, enquanto os açúcares são removidos e substituídos com solução tam- pão de um recipiente de alimentação com substrato fresco adicionado inter- mitentemente. A taxa de hidrólise, bem como a produção dos açúcares solú- veis, é aumentada devido à remoção de inibidores. Contudo, uma desvanta- gem de tais reatores é que as membranas requeridas para um sistema de hidrólise comercial são extremamente grandes e caras. As membranas são também propensas a turvamento por sólidos suspensos presentes na mistu- ra de reação.

Vários grupos têm investigado a recuperação e reciclagem de enzimas celulase durante hidrólise enzimática para reduzir a quantidade de enzima necessária durante o processo de conversão. Em alguns casos, isto tem também envolvido a remoção contínua de hidrolisados a partir da mistu- ra de reação para remover compostos inibitórios.

Por exemplo, Ishihara et al (Biotech. Bioeng., 1991, 37:948-954) descrevem a reciclagem de enzimas celulase durante a hidrólise de madeira dura vaporizada e polpa kraft de madeira dura. O processo envolve a remo- ção de uma mistura de reação de celulase a partir do reator, seguido pela remoção de resíduo insolúvel contendo Iignina a partir da mistura por filtra- gem com sucção. As enzimas celulase que estão no filtrado são separadas dos produtos de hidrólise, tais como glicose e celubiose, por ultrafiltração e, em seguida, retornadas para o reator de hidrólise. Conforme citado pelos investigadores, uma vantagem deste sistema é que a etapa extra de remo- ção de sólidos seria não-prática em uma aplicação industrial devido à eleva- ção no custo de matéria-prima. Em adição, muitas das celulases permane- cem ligadas à celulose, e são difíceis de recuperar.

Larry et al (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1986, 25:256-261) des- crevem uma abordagem para reutilização de celulases que envolve realiza- ção da hidrólise em um reator de coluna contendo celulase (Floco Solka). Os açúcares hidrolisados são continuamente removidos por percolação da colu- na com uma corrente constante de tampão. De acordo com os investigado- res, a remoção de produtos de açúcar deve reduzir inibição do produto, e aumentar as eficiências de hidrólise. Contudo, hidrólise inadequada é obtida, visto que enzimas β-glicosidase não-ligada e endoglucanase eluem da colu- na.

Knutsen e Davis (Appl. Biochem. Biotech., 2002, 98-100:1161- .1172) reportam um processo de sedimentação inclinada e ultrafiltração com- binadas para recuperação de enzimas celulase durante a hidrólise de bio- massa lignocelulósica. O objetivo do processo é remover partículas Iignoce- lulósicas grandes de modo que um filtro de membrana usado durante uma etapa subsequente de ultrafiltração não se torne entupido. O processo pri- meiro envolve tratamento de partículas lignocelulósicas com enzimas celula- se e, em seguida, alimentação da mistura resultante no assentador inclina- do. Partículas lignocelulósicas grandes, incluindo enzima ligada às partícu- las, são retidas no assentador inclinado, enquanto partículas menores e en- zima solúvel são transportadas com o transbordamento do assentador. O transbordamento é, em seguida, alimentado para uma unidade de ultrafiltra- ção de fluxo cruzado para recuperar celulases não-ligadas, enquanto permi- te a passagem de açúcares. Após ultrafiltração, as celulases recuperadas são adicionadas ao reator de hidrólise. As partículas lignocelulósicas que permanecem no assentador inclinado, junto com a enzima ligada, são retor- nadas para o reator junto com o fluxo inferior do assentador. Uma desvanta- gem deste sistema é que a operação de tal sistema na escala de um reator de hidrólise comercial, que é, do mesmo modo, para estar cerca de 21,34 m (70 pés) elevado e processa milhares de galões de pasta fluida por hora, seria proibitivamente difícil. Uma segunda desvantagem deste sistema é que a concentração de glicose e celobiose no reator permanecem não-mudadas através de todo o processo de modo que um nível alto de inibição ainda o- correrá. Uma desvantagem adicional do processo é que ele requer uma eta- pa de ultrafiltração custosa para recuperar celulases não-ligadas.

Mores et al (Appl. Biochem. Biotech., 2001, 91-93:297-309) re- porta um processo de sedimentação inclinada e ultrafiltração combinadas similar àquele descrito por Knutsen e Davis (supra). Contudo, o processo de Mores et al envolve uma etapa extra de clareamento envolvendo submeter o transbordamento do assentador à microfiltração antes da ultrafiltração para reduzir turvamento da membrana de ultrafiltração. O processo de Mores et al seria submetido às mesmas limitações conforme aquele descrito por Knut- sen e Davis (supra). A Patente dos Estados Unidos N0 3.972.775 (Wilke et a!) des- creve um processo para reciclagem de celulase em que os produtos de hi- drólise são separados em uma fase contendo açúcar aquosa e uma fase sólida contendo sólidos gastos não-hidrolisados após a hidrólise ser comple- tada. Os sólidos gastos são lavados com água para recuperar enzima ad- sorvida nos mesmos, e a água de lavagem resultante contendo a enzima desorvida é alimentada para a reação de hidrólise. Os sólidos gastos rema- nescentes podem ser usados como uma fonte de combustível para o siste- ma. Contudo, o processo de Wilke et aí incorre no custo da lavagem de água adicional após a hidrólise, que é significante devido à grande quantidade de material sólido e a natureza do particulado fino dos sólidos. Em adição, o processo não resulta na remoção de inibidores de enzimas celulase presen- tes durante a reação de hidrólise, visto que a separação de hidrolisados é efetuada após completação da reação de hidrólise.

Ramos et aí (Enzyme Microb. Technol., 1993, 15:19-25) descre- vem um processo em que aparas de eucalipto explodidas por vapor são hi- drolisadas usando-se celulase com remoção de açúcares solúveis, e a reci- clagem de enzima. O processo envolve cessamento da reação em tempos de incubação selecionados, e coleta do resíduo contendo enzima não- hidrolisada em um filtro de vidro sinterizado. O resíduo contendo enzima é lavado com tampão de hidrólise para remover açúcares solúveis. O resíduo lavado é, em seguida, ressuspenso em enzima β-glicosidase fresca conten- do tampão de hidrólise fresco, e incubado a 45°C para hidrólise subsequen- te. Um problema com este processo é que a adição repetida de β- glicosidase fresca após ressuspensão aumentaria significantemente o custo do processo.

Lee et al (Biotech. Bioeng., 1994, 45:328-336) examinam a reci- clagem de enzimas celulase em um procedimento envolvendo mais de cinco etapas sucessivas de hidrólise. O processo envolve adição de enzimas celu- lase e β-glicosidase (Novozym® 188) a vidoeiro tratado com peróxido, e re- cuperação do substrato residual por filtragem após 12 horas de hidrólise. O substrato fresco é, em seguida, adicionado ao substrato residual recuperado para alcançar uma concentração de substrato total de 2%, e a mistura resul- tante é ressuspensa em β-glicosidase contendo tampão, e a hidrólise é per- mitida continuar. A reciclagem de celulase seguida por hidrólise é subse- qüentemente repetida três vezes. Também descrito é um procedimento para reciclagem de celulases presentes na mistura de reação completa ambos antes e após toda a celulose ser hidrolisada. Similar a Ramos et ai, uma limitação deste processo é que a β-glicosidase deve ser adicionada à reação a cada etapa de reciclagem.

A Patente dos Estados Unidos N0 5.962.289 (Kilburn et a!) des- creve uma hidrólise enzimática de três fases. A primeira etapa do processo envolve adição de ambas endoglucanase e exoglucanase a um material Iig- nocelulósico a ser hidrolisado a celobiose. A segunda etapa envolve adição deste material a uma coluna Avicel® para adsorver a endoglucanase e exo- glucanase. Em uma terceira etapa, o eluente contendo celobiose é, em se- guida, aplicado a uma segunda coluna Avicel® contendo β-glicosidase imo- bilizada via um CBD. A β-glicosidase imobilizada hidrolisa a celobiose em glicose. Uma limitação deste método é que a produção de glicose é efetuada em três etapas de processo distintas, o que é altamente complexo e custoso. Uma segunda limitação é que o envio da pasta fluida de material lignoceluló- sico parcialmente hidrolisado através da coluna de Avicel® em uma taxa de fluxo alta de um processo de hidrólise comercial é muito difícil. Em adição, os efeitos altamente inibitórios de celobiose estão presentes durante a hidró- lise de celulose.

Atualmente, existe muita dificuldade na técnica para operar uma hidrólise enzimática de celulose eficiente. Um obstáculo chave é superar os efeitos inibitórios de glicose e, especialmente, celobiose em celulase. O de- senvolvimento de tal sistema permanece um requerimento crítico para um processo converter celulose em glicose. Sumário da Invenção A presente invenção se refere a enzimas para a hidrólise de ce-

lulose e métodos de uso das mesmas. Mais especificamente, a presente invenção se refere a enzimas celulase e β-glicosidase para a hidrólise enzi- máíica de celulose para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose de um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado.

É um objetivo da invenção proporcionar um método aperfeiçoa- do para o tratamento de estoques de alimentação lignocelulósicos.

De acordo com a presente invenção, é provida uma composição

de enzima para a hidrólise enzimática de celulose para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose a partir de um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, a composição de enzima compreendendo enzi- mas celulase, uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase e um agente

de ligação para ligação da enzima β-glicosidase ao estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, no qual a hidrólise é efetuada por:

(i) hidrolisação parcial de uma pasta fluida aquosa do estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado com a composição de enzima para produzir uma pasta fluida hidrosilada compreendendo glicose, oligômeros de

glicose, ou uma combinação destes, e sólidos de fibra não-hidrosilados compreendendo celulose e lignina;

(ii) separação dos sólidos de fibra não-hidrosilados a partir da pasta fluida hidrosilada para produzir sólidos de fibra separados, em que as enzimas xelulase e a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase se Ii-

gam aos sólidos de fibra separados;

(iii) ressuspensão dos sólidos de fibra separados em uma solu- ção aquosa para produzir uma pasta fluida ressuspensa; e

(iv) continuação da hidrólise da pasta fluida ressuspensa para produzir o produto de hidrólise compreendendo glicose.

O agente de ligação pode ser um módulo de ligação de carboi-

drato operavelmente ligado a uma ou mais do que uma enzima β- glicosidase. Preferivelmente, o módulo de ligação de carboidrato é um domí- nio de ligação de celulose.

A presente invenção também pertence à composição de enzima

conforme descrita acima, na qual as enzimas celulase são produzidas por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combi- nação destas. Preferivelmente, as enzimas celulase são produzidas por Tri- choderma.

A presente invenção também pertence à composição de enzima conforme descrita acima, no qual as enzimas celulase compreendem uma enzima celobio-hidrolase (CBH) selecionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase CBHI e CBHII1 e combinações destas, e uma enzima endoglucanase (EG) selecionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase EGI, EGII1 EGIV, EGV e EGVI, e combinações destas.

A presente invenção também pertence à composição de enzima conforme descrita acima, na qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), cerca de 75% a cerca de 100% (p/p) das enzimas celulase totais presen- tes na composição de enzima se ligam aos sólidos de fibra presentes na pasta fluida aquosa.

A presente invenção também pertence à composição de enzima conforme descrita acima, na qual a uma ou mais do que uma enzima β- glicosidase é produzida por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destas. Preferivelmente, a enzima β- glicosidase é produzida por Trichoderma ou Aspergillus. A enzima β- glicosidase pode estar ocorrendo naturalmente, ou ser uma proteína de fu- são geneticamente modificada.

A presente invenção também pertence à composição de enzima conforme descrita acima, na qual cerca de 75% a cerca de 100% (p/p), ou cerca de 90% a cerca de 100% (p/p) da enzima β-glicosidase total presentes na composição de enzima compreendem um domínio de ligação de celulose. O domínio de ligação de celulose pode ser um domínio de ligação de celulo- se de Família I. Além disso, o domínio de ligação de celulose pode ser um domínio de ligação de celulose bacteriana ou fúngica. Opcionalmente, a en- zima β-glicosidase compreende um ligante, que liga operavelmente o domí- nio de ligação de celulose a enzima β-glicosidase.

De acordo com a presente invenção, é também provido um uso de uma composição de enzima para a hidrólise enzimática de celulose para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose a partir de um es- toque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, a composição de enzima compreendendo enzimas celulase, uma ou mais do que uma enzima β- glicosidase, e um agente de ligação para ligação da enzima β-glicosidase ao estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, no qual o uso da com- posição de enzima compreende:

(i) hidrolisação parcial de uma pasta fluida aquosa do estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado com a composição de enzima para produzir uma pasta fluida hidrosilada compreendendo glicose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes, e sólidos de fibra não-hidrosilados compreendendo celulose e lígnina;

(ii) separação dos sólidos de fibra não-hidrosilados a partir da pasta fluida hidrosilada para produzir sólidos de fibra separados, nos quais as enzimas celulase e a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase se ligam aos sólidos de fibra separados;

O agente de ligação é um módulo de ligação de carboidrato ope- ravelmente ligado a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase. Preferi-

velmente, o módulo de ligação de carboidrato é um domínio de ligação de celulose.

A presente invenção também pertence ao uso da composição de enzima conforme descrito acima, no qual as enzimas celulase são produzi- das por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida1 ou uma combinação destas. Preferivelmente, as enzimas celulase são produzidas por Trichoderma.

A presente invenção também pertence ao uso da composição de enzima conforme descrito acima, no qual as enzimas celulase compreendem uma celobio-hidrolase (CBH) selecionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase CBHI e CBHII, e combinações destas, e uma endogluca- nase (EG) selecionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase EGI, EGII, EGIV1 EGV, e combinações destas. A presente invenção também pertence ao uso da composição de enzima conforme descrito acima, na qual, cerca de 75% e cerca de 100% (p/p) das enzimas celulase totais presentes na composição de enzima se ligam aos sólidos de fibra presentes na pasta fluida aquosa.

A presente invenção também pertence ao uso da composição de

enzima conforme descrito acima, na qual a enzima β-glicosidase é produzida por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillusl Thermobifida, ou uma combinação destas. Preferivelmente, a enzima β-glicosidase é produzida por Trichoderma ou Aspergillus. A enzima β-glicosidase pode estar ocorrendo naturalmente, ou ser uma proteína de fusão geneticamente modificada. A enzima β-glicosidase pode ser nativa ao hospedeiro, ou ser nativa a outro gênero ou espécie, e inserida no hospedeiro a ser expresso.

A presente invenção também pertence ao uso da composição de enzima conforme descrito acima, na qual cerca de 75% a cerca de 100% (p/p), preferivelmente cerca de 90% a cerca de 100% (p/p) da enzima β- glicosidase total presentes na composição de enzima compreendem um do- mínio de ligação de celulose. O domínio de ligação de celulose pode ser um domínio de ligação de celulose de Família I. Além disso, o domínio de liga- ção de celulose pode ser um domínio de ligação de celulose bacteriana ou fúngica. Opcionalmente, a enzima β-glicosidase compreende um ligante.

De acordo com a presente invenção, é também provido um pro- cesso para a hidrólise enzimática de celulose com uma composição de en- zima compreendendo enzimas celulase, uma ou mais do que uma enzima β- glicosidase e um agente de ligação para ligação da enzima β-glicosidase ao estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, para produzir um produ- to de hidrólise compreendendo glicose de um estoque de alimentação ligno- celulósico pré-tratado, o processo compreendendo:

(i) hidrolisação parcial de uma pasta fluida aquosa do estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado com a composição de enzima para produzir uma pasta fluida hidrosilada compreendendo glicose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes, e sólidos de fibra não-hidrosilados compreendendo celulose e lignina; (ii) separação dos sólidos de fibra não-hidrosilados a partir da pasta fluida hidrosilada para produzir sólidos de fibra separados, no qual as enzimas celulase e a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase se li- gam aos sólidos de fibra separados;

O agente de ligação pode ser um módulo de ligação de carboi- drato operavelmente ligado a uma ou mais do que uma enzima β- glicosidase. Preferivelmente1 o módulo de ligação de carboidrato é um domí- nio de ligação de celulose.

O estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado pode ser obtido de palha de trigo, palha de aveia, palha de cevada, palha de milho, palha de forragem, palha de feijão-soja, palha de canola, palha de arroz, ca- na de açúcar, bagaço, palha de vara, grama de capim de corda, grama de corda, ou miscanthus.

A presente invenção também pertence ao processo conforme descrito acima, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a pasta fluida aquosa tem um teor de sólidos suspensos ou não-dissolvidos de cerca de 3% a cerca de 30% (p/p). Esta pasta fluida aquosa pode ser concentrada antes da etapa de hidrolisação parcial (etapa(i)). Preferivelmente, a pasta fluida aquosa é preparada em água.

A presente invenção também pertence ao processo conforme descrito acima, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), o pH da pasta fluida aquosa é de cerca de 4,5 a cerca de 5,5, ou entre cerca de 4,5 a -5,0. A temperatura da pasta fluida aquosa pode ser entre cerca de 45°C a cerca de 55°C.

A presente invenção também pertence ao processo conforme descrito acima, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), as enzi- mas celulase são adicionadas a uma dosagem de cerca de 1,0 a cerca de -40,0 IU por grama de celulose. As enzimas celulase podem ser produzidas por Aspergillus, Humicola, Tríchoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destas. Preferivelmente, entre cerca de 75% a 100% (p/p) das enzimas celulase totais presentes se ligam aos sólidos de fibra presentes na pasta fluida aquosa.

A presente invenção também pertence à composição, uso da composição, ou processo, conforme descritos acima, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a uma ou mais do que uma β-glicosidase é adicionada a uma dosagem de cerca de 35 a cerca de 200 IU por grama de celulose. As enzimas β-glicosidase podem ser produzidas por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destas. Preferivelmente, a enzima β-glicosidase é produzida por Aspergillus ou Tri- choderma. A enzima β-glicosidase pode ser nativa ao hospedeiro, ou ser nativa a outro gênero ou espécie, e inserida no hospedeiro a ser expresso.

A presente invenção também pertence ao processo conforme descrito acima, no qual os sólidos não-hidrosilados são separados por microfiltração, centrifugação, filtração a vácuo, ou filtração por pressão. Pre- ferivelmente, os sólidos não-hidrosilados são separados por microfiltração.

A etapa de continuação da hidrólise da pasta fluida ressuspensa pode ser efetuada por cerca de 12 a cerca de 200 horas. Preferivelmente, uma corrente compreendendo glicose produzida na etapa (i) é combinada com uma corrente compreendendo glicose produzida na etapa (iv) para pro- duzir uma corrente combinada de açúcar.

Preferivelmente, cerca de 70% a cerca de 100% de celulose na pasta fluida aquosa é convertida em glicose.

Durante a etapa de ressuspensão (etapa (iii)), a solução aquosa pode ser água de processo.

A presente invenção também pertence ao processo conforme descrito acima, no qual o processo é efetuado em um sistema de hidrólise que compreende um reator de hidrólise selecionado a partir do grupo consis- tindo em um tanque agitado, um tanque não-misturado, uma torre agitada, e uma torre não-misturada. A torre agitada ou torre não-misturada pode ser ou uma torre de fluxo descendente, ou uma torre de fluxo ascendente. O processo pode ser um processo em batelada, ou um processo contínuo.

A presente invenção supera várias desvantagens da técnica an- terior levando-se em conta as dificuldades encontradas nas etapas efetua- das durante a conversão de estoque de alimentação lignocelulósico em gli- cose. Pela separação dos sólidos hidrolisados da fase aquosa, e ressuspen- são dos sólidos separados com uma solução aquosa, glicose, celobiose, e outros compostos presentes na fase aquosa que inibem as enzimas celulase são removidos, ou suas concentrações são reduzidas. Na ausência de glico- se ou celobiose, ou pela diminuição de sua concentração, a hidrólise pode proceder com eficiência aumentada. Pela realização de uma hidrólise da pasta fluida de estoque de alimentação aquoso com enzimas celulase e en- zima β-glicosidase que se ligam ao estoque de alimentação pré-tratado, a enzima β-glicosidase é transportada através da pasta fluida ressuspensa em vez de ser removida com a fase aquosa. Desde que a enzima β-glicosidase esteja presente na pasta fluida ressuspensa, quando a hidrólise é permitida continuar, qualquer celobiose que permanece no estoque de alimentação é eficientemente convertida em glicose. Além disso, a atividade de celulase estará presente quando a hidrólise é continuada, visto que as enzimas celu- lase também se ligam ao estoque de alimentação pré-tratado, e são trans- portadas através da pasta fluida ressuspensa. Uma outra vantagem da in- venção é que a enzima β-glicosidase não necessita de ser adicionada du- rante hidrólise continuada da pasta fluida ressuspensa conforme requerido se a enzima permanecesse na fase aquosa, tornando, desse modo, o pro- cesso menos custoso.

Este sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção. Breve Descrição dos Desenhos

Estas e outras características da invenção tornar-se-ão mais a- parentes a partir da seguinte descrição na qual referência é feita aos dese- nhos em anexo, no qual:

A figura 1A mostra um fluxograma de processo ilustrando as e- tapas de processamento de um estoque de alimentação lignocelulósico de acordo com as concretizações da invenção. FIGURA 1B mostra um fluxo- grama de processo ilustrando as etapas de processamento de um estoque de alimentação lignocelulósico usando reatores de hidrólise de fluxo ascen- dente.

As FIGURAS 2A e 2B mostram a hidrólise de 5% de celulose de palha de trigo pré-tratada por Trichoderma celulase contendo β-glicosidase com um CBD com e sem ressuspensão. A hidrólise com ressuspensão foi filtrada e ressuspensa em 24 horas, enquanto a hidrólise sem ressuspensão foi operada sem interrupção. Na FIGURA 2A, a dosagem de celulase é 16 mg/g, e na FIGURA 2B, a dosagem de celulase é 24 mg/g.

A figura 3 mostra a hidrólise de 5% de celulose de palha de trigo pré-tratada por Trichoderma celulase contendo β-glicosidase nativa que ca- rece de um CBD. As hidrólises foram filtradas e ressuspensas em 24 horas.

As figuras 4A e 4B são géis de SDS-PAGE de β-glicosidase puri- ficada sem um CBD (ββ) e β-glicosidase com um CBD ^G-CDB) após incu- bação na presença (+) ou ausência (-) de palha de trigo pré-tratada. Na FI- GURA 4A, a incubação foi efetuada a 4°C, e na FIGURA 4B, a incubação foi efetuada a 50°C. Após 30 minutos de incubação, as misturas de reação fo- ram centrifugadas, e a fração de sobrenadante separada por SDS-PAGE, e visualizadas por mancha azul de coomassie. Descrição Detalhada

A seguinte descrição é de concretizações preferidas.

A presente invenção se refere a enzimas para a hidrólise aper- feiçoada de celulose. Mais especificamente, a presente invenção se refere a enzimas celulase e enzimas β-glicosidase para a conversão enzimática a- perfeiçoada de estoques de alimentação lignocelulósicos, e métodos de uso das mesmas.

A seguinte descrição é de uma concretização por meio de e- xemplo somente e sem limitação à combinação de características necessá- rias para efetuar a invenção em efeito.

A invenção proporciona uma composição de enzima e processo para a hidrólise de estoques de alimentação lignocelulósicos que aperfeiço- am a economia de hidrólise enzimática pela diminuição da inibição por glico- se e outros compostos. O processo envolve realizar uma hidrólise parcial de uma pasta fluida de estoque de alimentação pré-tratado com celulases e uma ou mais de uma β-glicosidase que se ligam ao estoque de alimentação pré-tratado, via um agente de ligação, e, em seguida, separação dos sólidos de fibra não-hidrolisados, que contêm Iignina e celulose não-hidrolisada, a partir da fase aquosa, que contém glicose, oligômeros de glicose e celobio- se. Os sólidos separados são, em seguida, ressuspensos em uma solução aquosa para produzir uma pasta fluida ressuspensa. A enzima celulases e β- glicosidase são transportadas através da pasta fluida ressuspensa em virtu- de de sua capacidade de se ligar aos sólidos. A hidrólise da pasta fluida res- suspensa é, em seguida, permitida continuar para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose. Pela separação da fase de sólidos e fase aquosa, glicose e outros inibidores solúveis, tal como celobiose, são removi- dos, ou suas concentrações são reduzidas, de modo que a hidrólise pode continuar sem ou com inibição reduzida.

O processo pode ser um processo contínuo, com alimentação contínua de pasta fluida de estoque de alimentação pré-tratado e retirada de produto de hidrólise. Alternativamente, o processo pode ser um processo em batelada.

O processo é efetuado em uma pasta fluida de estoque de ali- mentação de modo que a digestibilidade da celulose no estoque de alimen- tação pelas enzimas celulase é aumentada. As enzimas celulase convertem pelo menos uma porção da celulose no estoque de alimentação em glicose, celobiose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes.

O estoque de alimentação para o processo é um material Iigno- celulósico. Pelo termo "estoque de alimentação lignocelulósico", entende-se qualquer tipo de biomassa de planta, tal como, mas limitada a, biomassa de planta não-arborizada, colheitas cultivadas, tais como, mas não limitadas a, por exemplo, mas não limitadas a, gramas C4, tais como grama de vara, grama de corda, grama de centeio, miscanthus, grama de canário de cana, ou uma combinação destas, resíduos de processamento de açúcar, por e- xemplo, mas não limitados a, bagaço, polpa de beterraba, ou uma combina- ção destas, resíduos agrícolas, por exemplo, mas não limitados a, forragem de feijão-soja, forragem de milho, palha de arroz, cascas de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, cascas de aveia, fibra de milho, ou uma combinação destes, biomassa de área florestal, por exemplo, mas não limitada a, fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, por exemplo madeira de álamo, madeira macia, ou uma combinação destes. Além disso, o estoque de alimentação lignocelulósico pode compreender material de despejo de celulose, ou maté- rias de despejo de áreas florestais, tais como, mas não limitados a, papel para impressão de jornais, papelão e similares. O estoque de alimentação lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra ou, alternativamen- te, o estoque de alimentação lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que se originam de estoques de alimentação lignocelulósicos dife- rentes. Em adição, o estoque de alimentação lignocelulósico pode compre- ender estoques de alimentação lignocelulósicos frescos, estoque de alimen- tação lignocelulósico parcialmente seco, estoque de alimentação lignocelu- lósico totalmente seco, ou uma combinação destes.

Os estoques de alimentação lignocelulósicos compreendem ce- lulose em uma quantidade maior do que cerca de 20%, mais preferível mente maior do que 30%, mais preferivelmente maior do que 40% (p/p). Por exem- plo, o material lignocelulósico pode compreender de cerca de 20% a cerca de 50% (p/p) de celulose, ou mais, ou qualquer quantidade entre estas, por exemplo, mas não limitado a, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,44, 46, 48 e 50% (p/p) de celulose. O estoque de alimentação lignocelulósico também compreende Iignina em uma quantidade maior do que cerca de 10%, mais preferivelmente em uma quantidade maior do que cerca de 15% (p/p). O estoque de alimentação lignocelulósico pode também compreender pequenas quantidades de sacarose, frutose e amido. Exemplos de estoques de alimentação lignocelulósicos preferi- dos incluem (1) despejos agrícolas, tais como forragem de milho, palha de trigo, palha de cevada, palha de canola, palha de aveia, palha de arroz, e forragem de feijão-soja; e (2) gramas, tais como grama de vara, miscanthus, grama de corda e grama de canário de cana.

A presente invenção é praticada com material lignocelulósico que foi pré-tratado. Os métodos de pré-tratamento são pretendidos para dis- tribuírem uma combinação suficiente de ação mecânica e química de modo a romper a estrutura de fibra e aumentar a área superficial de estoque de alimentação acessível a enzimas celulase. A ação mecânica inclui tipica- mente, mas não está limitada a, o uso de pressão, moagem, agitação, desfi- bramento, compressão/expansão, ou outros tipos de ação mecânica. A ação química pode incluir, mas não está limitada a, o uso de calor (freqüentemen- te vapor), ácido, álcali e solventes. Vários métodos de pré-tratamento quími- co e mecânico são bem-conhecidos na técnica.

Antes do pré-tratamento, o estoque de alimentação lignoceluló- sico pode ser lixiviado. Isto pode ser efetuado, por exemplo, conforme des- crito no WO 02/070753 (Griffin et aí., que é incorporado aqui por referência). Contudo, mesmo se Iixiviamento for praticado, uma quantidade substancial de composto de inibição é produzida no processo de pré-tratamento subse- quente.

O pré-tratamento é empregado para aumentar a suscetibilidade da pasta fluida de estoque de alimentação lignocelulósico ser hidrolisada por enzimas celulase. Por exemplo, o pré-tratamento pode ser efetuado para hidrolisar a hemicelulose, ou uma porção desta, que está presente no esto- que de alimentação lignocelulósico, em açúcares monoméricos, por exem- plo, xilose, arabinose, manose, galactose, ou uma combinação destas. Pre- ferivelmente, o pré-tratamento é realizado de modo que a hidrólise quase completa da hemicelulose e uma pequena quantidade de conversão de celu- lose em glicose, ocorra. A celulose é hidrolisada em glicose em uma etapa subsequente que usa enzimas celulase. Durante o pré-tratamento, tipica- mente um ácido diluído, a uma concentração de cerca de 0,02% (p/v) a cer- ca de 2% (p/v), ou qualquer quantidade entre estas (medida como a percen- tagem de peso de ácido puro no peso total de estoque de alimentação seco mais solução aquosa) é usado para o pré-tratamento do estoque de alimen- tação lignocelulósico. Preferivelmente1 o pré-tratamento é efetuado a uma temperatura de cerca de 180°C a cerca de 250°C por um tempo de cerca de 6 segundos a cerca de 120 segundos, e um pH de cerca de 0,8 a cerca de 2,0. O pré-tratamento pode ser efetuado em um estágio simples ou em mais do que um estágio. Preferivelmente, pelo menos um estágio é efetuado na faixa de temperatura, por um período de tempo e a faixa de pH colocados acima.

Uma abordagem ao pré-tratamento do estoque de alimentação é explosão com vapor, usando as condições de processo descritas nas Paten- tes dos Estados Unidos N0 4.461.648 e 4.237.226 (que são aqui incorpora- das por referência). Outro método de pré-tratamento da pasta fluida de esto- que de alimentação envolve pré-tratamento contínuo, significando que o es- toque de alimentação lignocelulósico é bombeado através de um reator con- tinuamente. Pré-tratamento ácido contínuo é familiar àqueles versados na técnica, ver, por exemplo, Patente de Patente dos Estados Unidos N0 5.536.325 (Brink); Pedido dos Estados Unidos co-pendente N0 US 60/687.224 (Foody e Tolan); Patente dos Estados Unidos N0 4.237.226 (Gre- thlein; que são aqui incorporados por referência). Outros métodos que são conhecidos na técnica podem ser usados conforme requerido para a prepa- ração de um estoque de alimentação pré-tratado, por exemplo, mas não limi- tado a, aqueles descritos na Patente dos Estados Unidos N0 4.556.430 (Converse et a/.; que é incorporado aqui por referência).

O estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado pode op- cionalmente ser lavado com água antes da hidrólise enzímática. A etapa de lavagem ou Iixiviamento pode remover alguns dos inibidores de enzimas ce- Iulase e leveduras, tais como açúcares dissolvidos e produtos de degrada- ção de açúcar, Iignina dissolvida e compostos fenólicos, e outros compostos orgânicos no sistema. Contudo, embora lavagem após pré-tratamento caia dentro do escopo da invenção, ela pode não resultar na remoção de todas as impurezas insolúveis presentes, e ela pode aumentar o custo do proces- so.

O material lignocelulósico pré-tratado é fluidificado em uma solu- ção aquosa para produzir uma pasta fluida de estoque de alimentação aquo- sa, ou "pasta fluida aquosa". Por exemplo, mas sem desejar estar limitando, a solução aquosa pode ser água de processo, água fresca, condensado de vapor, ou correntes de reciclo de processo. A concentração de estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado na pasta fluida aquosa depende do tamanho de partícula, retenção de água, capacidade de bomba, e outras propriedades do estoque de alimentação. Tipicamente, a concentração está entre cerca de 3% e 30% (p/p), ou entre cerca de 10% e cerca de 20% (p/p) de sólidos de fibra (também conhecidos como sólidos suspensos ou não- dissolvidos), ou qualquer quantidade entre estas. A pasta fluida aquosa pre- ferivelmente tem uma concentração de sólidos que a capacita a ser bombe- ada. Conforme é bem-conhecido na técnica, a concentração de sólidos sus- pensos ou não-dissolvidos pode ser determinada por filtragem de uma a- mostra de pasta fluida usando-se papel de filtro de microfibra de vidro, Iava- gem da massa do filtro com água, e secagem da massa durante a noite a 105°C. É preferido que os sólidos de fibra compreendam pelo menos cerca de 20% a cerca de 70% de celulose por peso, ou qualquer quantidade ente estas. Por exemplo, os sólidos suspensos podem compreender 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% ou 70% de celulose por peso.

O pH da pasta fluida aquosa é geralmente ajustado para dentro da faixa do pH ótimo para as enzimas celulase usadas. Geralmente, o pH da pasta fluida aquosa é ajustado para dentro de uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 7,0, ou qualquer pH entre esta. Tipicamente, o pH está dentro de uma faixa de cerca de 4,5 a cerca de 5,5, ou qualquer pH entre esta. Contu- do, deve ser apreciado que o pH da pasta fluida pode ser mais alto do que cerca de 4,5 a cerca de 5,5 se as enzimas celulase usadas são alcalofílicas ou acidofílicas. O pH da pasta fluida pode ser ajustado usando-se qualquer ácido ou base conhecido na técnica. Por exemplo, se a pasta fluida é básica (por exemplo, se um pré-tratamento básico é realizado), ácido sulfúrico pode ser usado. Se a pasta fluida é ácida, o pH pode ser ajustado com bases se- lecionadas a partir do grupo consistindo em amônia, hidróxido de amônio, cal, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, hidróxido de magnésio, hidró- xido de sódio, e mistura destes. Preferivelmente, a base é selecionada a par- tir do grupo consistindo em amônia, hidróxido de amônio e hidróxido de só- dio.

A temperatura da pasta fluida de estoque de alimentação aquo- sa é ajustada de modo que ela esteja dentro da faixa ótima para a atividade das enzimas celulase. Geralmente, uma temperatura de cerca de 45°C a cerca de 55°C, ou qualquer temperatura entre estas, é adequada para mui- tas enzimas celulase. Contudo, a temperatura da pasta fluida pode ser mais alta para enzimas celulase termofílicas.

As enzimas celulase e uma enzima β-glicosidase com agente de ligação são adicionadas à pasta fluida aquosa, antes, durante ou após o a- juste da temperatura e pH da pasta fluida aquosa após pré-tratamento. Pre- ferivelmente, as enzimas celulase e β-glicosidase são adicionadas à pasta fluida de estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado após o ajuste da temperatura e pH da pasta fluida. A hidrólise parcial do material lignoceluló- sico pré-tratado é, em seguida, realizada.

Uma celulase é uma enzima com atividade hidrolítica para celu- lose nos sólidos de fibra, e que compreende pelo menos um domínio catalíti- co. Uma enzima celulase geralmente tem domínios adicionais, incluindo, mas não limitados a, um módulo de ligação de carboidrato, ou outros domí- nios funcionais.

Pelo termo "enzimas celulase" ou "celulases", entende-se uma mistura de enzimas que hidrolisam celulose. A mistura pode incluir glicobio- hidrolases (GBH), celobio-hidrolases (CBH) e endoglucanases (EG). Embora enzimas GBH possam formar um componente da mistura de enzima, seu uso na hidrólise enzimática de celulose é menos comum do que enzimas CBH e EG. Em um exemplo não-limitativo, a mistura inclui enzimas CBH e EG. A enzima GBH hidrolisa principalmente cadeias de polímero de celulose de suas extremidades para liberar glicose, enquanto a enzima CBH hidrolisa principalmente cadeias de polímero de celulose de suas extremidades para liberar celobiose, e a enzima EG hidrolisa principalmente polímero de celulo- se no meio da cadeia. A enzima GBH pode ser uma enzima tendo uma ativi- dade de tipo ECNº3.2.1.73, a enzima CBH pode ter uma atividade de enzima de tipo ECNº-3.2.1.91, e a enzima EG pode ser uma atividade de tipo ECNº3.2.1.4 ou ECNº3.2.1.151.

As enzimas celulase podem ser produzidas por várias plantas e microorganismos. O processo da presente invenção pode ser efetuado com qualquer tipo de enzimas celulase, indiferente de sua fonte. Entre os mais amplamente estudados, celulases caracterizadas e comercialmente produzi- das são aquelas obtidas de fungos do gênero Aspergillus, Humicola e Tri- choderma, e das bactérias do gênero Bacillus e Thermobifida. A celulase produzida pelos fungos filamentosos Trichoderma Iongibraehiatum compre- ende pelo menos duas enzimas celobio-hidrolase denominadas CBHI e C- BHII, e pelo menos quatro enzimas EG. Também, celulases EGI, EGII, EGIII, EG V e EGVI foram isoladas de Humieola insolens (ver, Schulein et ai, Pro- ceedings of the Seeond TRICEL Symposium on Triehoderma reesei Cellula- se and Other Hydrolases, Espoo 1993, P. Suominen and T. Reinikainen, Eds. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, Hel- sinki 8:109-116, que é aqui incorporado por referência).

A enzima CBHI é definida como uma CBH que hidrolisa princi- palmente cadeias por um mecanismo de retenção conforme seria conhecido a um versado no assunto. A enzima CBHII pode ser um membro de uma Família 7, 10 ou Família 48 de glicohidrolases. Em uma concretização prefe- rida, a enzima CBHII é um membro da Família 7. Em uma concretização mais preferida, a enzima CBHI é a CBHI da Família 7 de Triehoderma.

A enzima CBHII é definida como uma enzima que hidrolisa prin- cipalmente cadeias de polímero de celulose por um mecanismo de inversão conforme seria conhecido a um versado no assunto. A enzima CBHII pode ser processiva. A enzima CBHII pode ser um membro da Família 6, 9 ou 74. Em uma concretização preferida, a enzima CBHII é um membro da Família .6. Em uma concretização mais preferida, a enzima CBHII é a CBHII da Fa- mília 6 de Triehoderma.

Exemplos de enzimas EG que podem ser usadas na prática des- ta invenção são colocados na Tabela 1 abaixo: Tabela 1: Exemplos de enzimas EG

<table>table see original document page 26</column></row><table> Preíerivelmente, as enzimas EG são enzimas fúngicas, tais co- mo enzimas expressas de Trichoderma. As enzimas EG preíerivelmente contêm um CBD (domínio de ligação de celulose), embora uma certa pro- porção das enzimas EG possa ser incluída na mistura de enzima celulase que carece de uma CBD.

A dosagem de enzima celulase é escolhida para converter celu- lose do estoque de alimentação pré-tratado em glicose. Por exemplo, uma dosagem apropriada de celulase pode ser cerca de 1,0 a 40,0 Unidades de Papel Filtro (FPU ou IU) por grama de celulose, ou qualquer quantidade en- tre estas. A FPU é uma medição padrão familiar ao versado no assunto, e é definida e medida de acordo com Ghose (Pure and Appl. Chem., 1987,59:257-268).

As enzimas celulase usadas na prática desta invenção se ligam a componentes do estoque de alimentação pré-tratado. Contudo, deve ser aparente que a composição de enzima pode compreender algumas celula- ses que não se ligam ao estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, tais como aquelas que não compreendem um domínio de ligação de celula- se. A percentagem de enzimas celulase que se ligam à celulose (sólidos) pode estar entre cerca de 75% e 100% (p/p) das enzimas celulase totais presentes na composição de enzima: por exemplo, a percentagem de enzi- mas celulases que se ligam à celulose pode ser cerca de 75, 78, 80, 83, 85,87, 90, 93, 95, 97 ou 100% (p/p) das enzimas celulase totais presentes na composição de enzima. A conversão de celobiose em glicose é efetuada pela β- glicosidase. Pelo termo "β-glicosidase" entende-se qualquer enzima que hi- drolisa o dímero de glicose, celobiose, em glicose. A atividade da enzima β- glicosidase é definida por sua atividade pela Comissão de Enzima como ECNe3.2.1.21. As enzimas β-glicosidase para uso nesta invenção são solú- veis em água. Existem muitos micróbios que produzem β-glicosidase, e as propriedades destas enzimas variam, incluindo estrutura (peso molecular, orientação tridimensional, composição de aminoácido, e local ativo), e ativi- dade catalítica (taxa e cinética de hidrólise de celobiose, e capacidade de agir em outros substratos). A enzima β-glicosidase pode vir de várias fontes; contudo, em todos os casos, a enzima β-glicosidase é capaz de hidrolisar celobiose em glicose. A enzima β-glicosidase pode ser uma Família 1 ou Família 3 de glicosídeo hidrolase, embora outros membros de família pos- sam ser usados na prática desta invenção. A enzima β-glicosidase preferida para uso nesta invenção é a proteína BgM de Trichoderma reesei. Outras formas podem incluir outras proteínas Bgl de Trichoderma ou enzimas β- glicosidase de outros organismos.

A ligação da β-glicosidase ao estoque de alimentação pré- tratado é efetuada por um agente de ligação que liga a enzima β-glicosidase ao estoque de alimentação pré-tratado. Pelo termo "agente de ligação", en- tende-se qualquer composto químico para ligação da β-glicosidase aos sóli- dos de fibra. A afinidade do agente de ligação ao estoque de alimentação pré-tratado é forte o bastante para permitir a aderência da enzima β- glicosidase aos sólidos de fibra na pasta fluida de estoque de alimentação aquosa, permitindo, desse modo, que ela seja transportada através da se- gunda hidrólise (hidrólise continuada).

O agente de ligação pode ser um produto químico fixado à en- zima β-glicosidase na forma de uma modificação química. Esta modificação envolve fixação à enzima de um produto químico com afinidade suficiente para os sólidos de fibra. Exemplos de produtos químicos adequados incluem detergentes, tensoativos, poliglicóis, proteínas e fragmentos de proteína. Exemplos de detergentes e tensoativos incluem, mas não estão limitados a, ácidos de bile (colato, deoxicolato, taurocolato, glicolato, e glicodeoxicolato, são exemplos), alquil glicosídeos (n-nonil-p-D-glícopiranosídeo, n-octil- β-D- glicopiranosídeo, n-heptil-p-D-glicopiranosídeo, n-hexil-p-D-glicopiranosídeo, dodecil^-D-maltosídeo, octil- β-D-tioglicopiranosídeo, glicopiranosídeo, e decil-p-D-maltosídeo, são exemplos, e detergentes zwiteriônicos. Exemplos de poliglicóis incluem, mas não estão limitados a, polietileno glicol e polioxie- tilenos.

O agente de ligação pode também ser uma proteína ou fragmen- to de proteína. Exemplos de proteína e fragmentos de proteína incluem a - queles descritos acima para uso como domínios de ligação. Exemplos adi- cionais de proteínas que podem servir como um agente de ligação incluem, mas não estão limitados a, hidrofobin, estreptolisin, swollenin ou expansin. Exemplos de fragmentos de proteína que podem servir como agente de liga- ção incluem, mas não estão limitados a, politriptofan, politrosin e hélices an- tipáticas.

Preferivelmente, o agente de ligação é um domínio de ligação tal

como um módulo de ligação de carboidrato (CBM) que é operavelmente li- gado à enzima β-glicosidase. Pelo termo "módulo de ligação de carboidrato" ou "CBM", entende-se qualquer proteína e seqüência de peptídeo que se ligam não-covalentemente ao(s) carboidrato(s) presente(s) nos sólidos de fibra. Preferivelmente, o módulo de ligação de carboidrato é um domínio de ligação de celulose (CBD) que se liga a celulose nos sólidos de fibra.

CBDs são encontrados na natureza como domínios discretos em proteínas, tais como celulases, e também em enzimas não-hidrolíticas. Até aqui, mais de vinte e quatro famílias de seqüências de CBD foram identifica- das. O CBD para a prática desta invenção pode ser derivado de qualquer fonte de CBDs. Por exemplo, o CBD pode ser derivado de uma bactéria ou fungo, embora CBDs tenham sido isolados de uma variedade de outros or- ganismos. Exemplos não-limitativos de micróbios dos quais CBD pode ser derivado incluem Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifi- da, ou uma combinação destes. Seqüências de CBD preferidas para a práti- ca da invenção são CBDs Tipo I, que são derivados de fungos. Alternativa- mente, a seqüência de DNA que codifica um CBD pode ser preparada sinte- ticamente por métodos conhecidos àqueles versados na técnica, tais como método de fosforamidita (Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters, 1981, 22:1859-1869, que é incorporado aqui por referência.

O termo "operavelmente ligado" se refere a uma ligação entre enzima β-glicosidase e o domínio de ligação que capacita o domínio de liga- ção a aderir aos sólidos de fibra na pasta fluida aquosa. A ligação pode ser via um ligante, ou o domínio de ligação pode estar ligado a β-glicosidase sem uma região ligante de intervenção.

Um outro exemplo de um agente de ligação que pode ser usado na prática da invenção é um produto químico que se associa com ambos a enzima β-glicosidase e os sólidos de fibra. Exemplos não-limitativos de tais produtos químicos incluem, mas não estão limitados a, policátions, poliâ- nions, floculantes e moléculas antipáticas. Além disso, este químico pode ser uma proteína ou fragmento de proteína, tais como aqueles descritos acima para uso como domínios de ligação, ou um produto químico tal como aquele descrito acima para uso na modificação química.

Pelo termo "ligante", entende-se uma seqüência de aminoácido unindo o domínio de ligação de celulose de uma enzima celulase ou β- glicosidase, e ligando-as ao domínio cataliticamente ativo da enzima. A regi- ão ligante pode ser hidrofílica e não-mudada, e enriquecida em certos ami- noácidos, incluindo glicina, asparagina, prolina, serina, treonina, glutamina, ou combinações destas. Preferivelmente, a estrutura do ligante concede fle- xibilidade à seqüência. Enquanto não se deseja estar ligado à teoria, a estru- tura flexível é acreditada facilitar a atividade do domínio catalítico. Contudo, conforme seria evidente a um versado no assunto, não é essencial que um ligante esteja presente.

A capacidade de uma enzima β-glicosidase ou uma enzima celu- lase se ligar à celulose pode ser determinada por ensaios de ligação de celu- lose usando-se material lignocelulósico pré-tratado. Tais ensaios são familia- res àqueles versados na técnica, e envolvem contatar 5 gramas de material lignocelulósico pré-tratado com 50 mg de enzima β-glicosidase, com agente de ligação, em uma solução aquosa por 5 a 15 minutos a uma temperatura de 20°C a 40°C, em seguida separando-se os sólidos de fibra da enzima por filtração, e medindo-se a quantidade de enzima que permanece na solução. O agente de ligação se liga a β-glicosidase e aos sólidos de fibra, permitin- do, desse modo, que a enzima β-glicosidase seja retida no reator de hidróli- se junto com sólidos de fibra.

Qualquer fonte de β-glicosidase pode ser usada na prática da invenção. Por exemplo, a enzima β-glicosidase pode ser derivada de Asper- gillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destes. Preferivelmente, a enzima β-glicosidase é derivada de Trichoderma ou Aspergillus. A enzima β-glicosidase derivada de Trichoderma é de peso molecular 74.000 (conforme medido por eletroforese de gel de SDS- poliacrilamida), e tem um ponto isoelétrico de 8,3 (conforme medido por ele- troforese de gel de poliacrilamida de focalização isoelétrica não- desnaturante). A enzima β-glicosidase pode ser nativa ao hospedeiro, ou pode ser nativa a outros gêneros ou espécies, e inserida no hospedeiro em que ela é expressa.

A β-glicosidase contendo um CBM, tal como um CBD, pode ser uma proteína de fusão produzida por um construto genético compreendendo uma seqüência promotora, uma seqüência que codifica β-glicosidase, e uma seqüência que codifica um CBM. O construto genético é expresso em um sistema de expressão adequado, por exemplo, um sistema de expressão bacteriana ou fúngica, tal como Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destes. Em adição, enzimas β- glicosidase que ocorrem naturalmente com um CBM podem ser usadas na prática da invenção. As enzimas β-glicosidase que ocorrem naturalmente podem ser isoladas de Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Ther- mobifida, ou uma combinação destes. Por exemplo, uma β-glicosidase con- tendo CBD que ocorre naturalmente foi purificada e caracterizada a partir do fungo podre branco Phanaerochaete chrysosporium (Lymar et ai, Appi En- viron. Micro., 1995, 61: 2976-2980, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência).

O nível de dosagem da β-glicosidase que é adicionado à pasta fluida aquosa pode ser cerca de 5 a cerca de 400 unidades de β-glicosidase por grama de celulose, ou qualquer quantidade entre estes, ou de cerca de 35 a cerca de 200 unidades de β-glicosidase por grama de celulose, ou qualquer quantidade entre estes. A unidade de β-glicosidase é medida de acordo com o método de Ghose (supra).

É preferido que a concentração de β-glicosidase presente seja alta o bastante para assegurar que a celobiose não se acumule durante a hidrólise, e não iniba a ação de celulase. Será compreendido por aquele ver- sado no assunto que Trichoderma, e outros micróbios de produção de celu- lose, produzem usualmente somente quantidades limitadas de β-glicosidase. Os métodos colocados em White e Hindle, Patente dos Estados Unidos N0 6.015.703 (que é incorporada aqui por referência) podem ser empregados para alcançar níveis aumentados de produção de β-glicosidase por Tricho- derma. Alternadamente, a β-glicosidase pode ser produzida em uma fermen- tação separada de Aspergillus, e adicionada à mistura de celulase.

Deve ser apreciado que nem toda a β-glicosidase na composi- ção de enzima pode se ligar aos sólidos. Por exemplo, a quantidade de en- zima β-glicosidase presente na composição de enzima que compreender um CBD pode ser cerca de 75% a cerca de 100% (p/p), ou qualquer faixa entre estas, ou cerca de 85% a cerca de 100% (p/p), ou qualquer faixa entre es- tas, ou cerca de 90% a cerca de 100% (p/p), ou qualquer faixa entre estas, da β-glicosidase total presente. Por exemplo, a quantidade de β-glicosidase compreendendo um CDB em relação à quantidade total de β-glicosidase presente na composição de enzima pode ser cerca de 75, 78, 80, 83, 85, 87,90, 93, 95, 97 ou 100% (p/p).

As enzimas celulase e enzimas β-glicosidase podem ser mani- puladas em uma solução aquosa, ou como um pó ou grânulo. As enzimas podem ser adicionadas à pasta fluida aquosa em qualquer ponto antes de sua introdução em um reator de hidrólise. Alternativamente, as enzimas po- dem ser adicionadas diretamente ao reator de hidrólise, embora a adição de enzimas antes de sua introdução no reator de hidrólise seja preferida para mistura ótima. As enzimas podem ser misturadas na pasta fluida aquosa usando-se equipamento de mistura que é familiar àqueles versados na téc- nica.

A Figura 1A é um exemplo não-limitativo de como a hidrólise de celulase pode ser efetuada em um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado conforme descrito acima. Antes da hidrólise de celulase, a pasta fluida de estoque de alimentação aquoso 10 é resfriada. Isto pode ser efetu- ado usando-se um primeiro trocador de calor 20 que troca corrente de pro- duto de glicose 30, ou outro fluido adequado. A pasta fluida aquosa 10 pode, em seguida, ser adicionalmente resfriada usando-se um segundo fluido, por exemplo, água fria 45, no segundo trocador de calor 50. A pasta fluida 10 pode, em seguida, ser bombeada em um tanque de produção de hidrólise 60, junto com enzimas celulase e uma enzima β-glicosidase 70 tendo um domínio de ligação de celulose, e amônia 80 para ajustar o pH. Neste exem- plo, os teores do tanque de produção de hidrólise 60 são misturados e bom- beados para fora do tanque de produção 60, ao longo do tubo 120, para um tanque de hidrólise 130. O tanque de produção 60 pode ser usado para ajus- tar o pH e alcançar a temperatura desejada da pasta fluida.

Será aparente àqueles versados na técnica que as enzimas po- dem ser misturadas com a pasta fluida de estoque de alimentação pré- tratado em outra parte, por exemplo, dentro de uma linha que alimenta o tanque de produção 60, incluindo, mas não limitado a, a montante do primei- ro trocador de calor 20, um ponto entre o primeiro 20 e segundo trocador de calor 50, ou um ponto imediatamente antes da entrada do estoque de ali- mentação para o tanque de produção 60. As enzimas podem também ser adicionadas à pasta fluida de estoque de alimentação lignocelulósica pré- tratado 10 após elas saírem do tanque de produção 60; por exemplo, elas podem ser adicionadas ao tubo 120.

Após adição das enzimas, o estoque de alimentação lignoceluló- sica pré-tratado é submetido à hidrólise parcial. Pelo termo "hidrolisação parcial", entende-se hidrolisação da pasta fluida de estoque de alimentação lignocelulósica pré-tratado de modo que conversão completa do estoque de alimentação em glicose não ocorra. A hidrólise é efetuada de modo que uma porção da celulose na pasta fluida aquosa permaneça não-convertida. A ce- lulose remanescente é convertida em celobiose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes, durante uma etapa de hidrólise adicional descrita em maiores detalhes abaixo. A hidrólise pode resultar em cerca de 30% a cerca de 80% (p/p), ou cerca de 30% a cerca de 60% (p/p) da celulose sen- do convertida em glicose; por exemplo, 30, 33, 35, 38, 40, 43, 45, 50, 53, 55, .58, 60, 70 ou 80% (p/p) da celulose pode ser convertida em glicose. A hidró- lise parcial do material lignocelulósico pode ser permitida continuar por cerca de 12 a cerca de 24 horas, ou qualquer quantidade de tempo entre estes. Por exemplo, o tempo de reação pode ser cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, .18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas, ou qualquer tempo entre estes.

Após a hidrólise parcial ser efetuada, sólidos de fibra não- hidrolisados compreendendo celulose e outros componentes insolúveis pro- duzem fase de sólidos da pasta fluida parcialmente hidrolisada. Os compo- nentes insolúveis, em adição à celulose, que podem estar presentes na fase de sólidos, incluem sólidos não-convertidos que não são digeridos pelas en- zimas celulase, bem como componentes não-celulósicos, ou outros materi- ais que são inertes à celulase, tais como Iignina e compostos de sílica. Deve ser apreciado que a fase de sólidos pode compreender licor. A fase de sóli- dos pode ter um teor de umidade de 40-80%; por exemplo, a fase de sólidos pode ter um teor de umidade de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80%.

A fase aquosa da pasta fluida parcialmente hidrolisada contém glicose que inibe enzimas celulase. Componentes solúveis adicionais que podem estar presentes na fase aquosa incluem oligômeros de glicose, pro- dutos de degradação de açúcar, tais como furfural e hidroxil metil furfural, ácidos orgânicos, tais como ácido acético, e compostos fenólicos derivados de lignina.

Pelo termo "reator de hidrólise" entende-se um vaso de reação usado para efetuar hidrólise da pasta fluida de estoque de alimentação Iig- nocelulósica pré-tratado pelas enzimas celulase e β-glicosidase. O reator de hidrólise pode ser de construção apropriada para acomodar a hidrólise. O reator de hidrólise pode ser revestido com vapor, água quente, ou outra fon- te de calor, para manter a temperatura desejada. O reator de hidrólise pode ser uma torre com uma razão de altura para diâmetro de mais do que 2:1, ou um tanque com uma razão de altura para diâmetro de 2:1.

A hidrólise pode ser efetuada em um reator de hidrólise que é parte de um sistema de hidrólise que compreende um ou mais do que um reator de hidrólise. O termo "sistema de hidrólise" envolve reatores de hidró- lise, bem como tanques de alimentação, bombas, e outro equipamento auxi- liar. A escolha do número de reatores de hidrólise no sistema de hidrólise depende do custo dos reatores de hidrólise, do volume da pasta fluida aquo- sa, e outros fatores. Para uma fábrica de etanol de escala comercial, o nú- mero típico de reatores de hidrólise é 4 a 12.

A hidrólise pode ser efetuada em um "reator de hidrólise de re- tenção de sólidos". O termo "reator de hidrólise de retenção de sólidos", con- forme aqui usado, se refere a um reator de hidrólise que retém sólidos de fibra mais longos do que a fase aquosa da pasta fluida aquosa para aumen- tar o tempo de reação das enzimas celulase e β-glicosidase com celulose. Um reator de hidrólise de retenção de sólidos pode ser um reator de hidróli- se não-misturado no sentido que nenhuma agitação mecânica dos conteú- dos do reator é efetuada durante a reação de hidrólise. Um exemplo de um reator de hidrólise não-misturado adequado para a prática da invenção é um reator de fluxo ascendente que é descrito em WO 2006/063467 (Foody et al), que é aqui incorporado por referência. O reator de hidrólise de retenção de sólidos pode também ser um reator misturado, em cujo caso agitação mecânica dos conteúdos do reator é efetuada durante a reação de hidrólise. A mistura ativa dentro dos tanques de hidrólise pode ser efetuada por impul- sores ou bombas, conforme é bem-conhecido na técnica.

Se o reator de hidrólise de retenção de sólidos for uma torre, ele pode ser uma torre de fluxo ascendente, em que a pasta fluida aquosa e en- zimas entram na torre diretamente no fundo da torre, e bombeadas para ci- ma através da torre. Alternativamente, a torre pode ser uma torre de fluxo descendente em que a pasta fluida aquosa é bombeada para baixo através da torre. As torres de fluxo ascendente ou fluxo descendente podem ser não-misturadas. Alternativamente, elas podem ser de mistura em níveis dis- cretos.

Referindo-se agora à Figura 1 A, em um exemplo não-limitativo, a pasta fluida hidrolisada compreendendo glicose e sólidos de fibra não- hidrolisados, é removida a partir do topo do reator de hidrólise 130, via linha 170, e introduzida em uma unidade de microfiltração 180. A unidade de mi- crofiltração 180 separa os sólidos de fibra compreendendo celulose da fase aquosa da pasta fluida hidrolisada. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que os sólidos de fibra compreendem licor arrastado. Estes sóli- dos de fibra separados (linha 195) são, em seguida, ressuspensos em um segundo reator de hidrólise 200, e a hidrólise é permitida continuar.

Conforme descrito anteriormente, durante a hidrólise, as celula- ses são ligadas à celulose no estoque de alimentação lignocelulósica pré- tratado. A enzima β-glicosidase, que se liga ao estoque de alimentação Iig- nocelulósica pré-tratado, também estará ligada aos sólidos de fibra. Desse modo, quando os sólidos de fibra são separados da fase aquosa da pasta fluida, não somente exocelobio-hidrolases (CHI) e endoglucanases (EG) permanecerão com a fase de sólidos de fibra, mas também β-glicosidase.

Vários métodos podem ser empregados para separar os sólidos de fibra não-hidrolisados a partir da fase aquosa. Estes podem incluir méto- dos que separam completamente ou quase completamente os sólidos de fibra a partir da fase aquosa, e métodos que somente separam parcialmente os sólidos de fibra a partir da fase aquosa. Por exemplo, os sólidos de fibra podem ser separados a partir da fase aquosa por filtração de membrana, centrifugação, ou filtração de vácuo ou pressão. Um método preferido de filtração de membrana é microfiltração, e um método preferido de centrifuga- ção envolve bombeio da pasta fluida através de um hidroclone.

Um método preferido para efetuar a invenção, que não entende- se para ser limitante, envolve efetuar a hidrólise em um reator de assenta- mento, conforme descrito em WO 2006/063467 (cujos conteúdos são aqui incorporados por referência). Um exemplo de sistema de hidrólise incorpo- rando reatores de hidrólise de fluxo ascendente é mostrado na Figura 1B. Os números de referência que são os mesmos como na Figura 1A indicam eta- pas de processo idênticas. Conforme mostrado na Figura 1B, a pasta fluida aquosa na linha 120 é alimentada ao reator de hidrólise 130. Esta pode ser por uma linha que vai para baixo através da parte intermediária do reator e, em seguida, adiciona-se a pasta fluida no fundo, através do distribuidor 140. Alternativamente, a alimentação de pasta fluida pode ser diretamente para o distribuidor 140 no fundo do reator. A pasta fluida aquosa flui para cima atra- vés do reator com uma velocidade vertical que é baixa o bastante para per- mitir que os sólidos de fibra assentem. Como um resultado, a fase aquosa atravessa o reator em um tempo mais curto do que os sólidos de fibra. A celulase e β-glicosidase ligadas permanecem no reator com os sólidos de fibra, enquanto a fase aquosa sai do reator. A β-glicosidase ligada assegura que a celobiose seja convertida em glicose dentro da hidrólise, e não inibe enzimas celulase. Os sólidos não-hidrolisados são transportados para fora do reator junto com a fase aquosa na linha 170, e são separados a partir da fase aquosa pela unidade de microfiltração 180.

Os sólidos separados obtidos após uma etapa de separação dos sólidos de fibra a partir do produto de hidrólise compreendendo glicose po- dem conter cerca de 50% a cerca de 80% de umidade. O teor de umidade depende do processo de separação usado, em cuja extensão se escolhe desidratar os sólidos e a eficiência de remoção de água. Os sólidos separa- dos podem ser lavados com água para aumentar a quantidade de glicose removida.

Após hidrólise em um reator de hidrólise com ou sem retenção de sólidos, os sólidos de fibra são separados, ressuspensos, e a hidrólise continuada. Os sólidos de fibra são ressuspensos em uma fase aquosa que seja compatível para hidrólise adicional da pasta fluida ressuspensa. A solu- ção aquosa usada para ressuspensão dos sólidos é preferiveImente água, embora outras soluções aquosas possam ser usadas. A água pode ser água fresca, água de processo, ou condensado de vapor. A quantidade de solu- ção aquosa adicionada para ressuspensão pode ser a mesma como estava presente na pasta fluida aquosa antes da hidrólise, ou preferivelmente um tanto menor. A quantidade mínima é aquele requerida para bombear ou transportar e misturar a pasta fluida conforme necessário. A pasta fluida res- suspensa estará livre de glicose e outros inibidores solúveis, ou suas con- centrações significantemente reduzidas. Na ausência de glicose, celobiose e inibidores, ou pela diminuição de sua concentração, a etapa de hidrólise adi- cional pode ser efetuada com eficiência aumentada.

Referindo-se novamente à Figura 1A, a ressuspensão pode ser efetuada pela introdução dos sólidos separados, via linha 195, para um se- gundo reator de hidrólise 200 junto com água 210 e, em seguida, ressus- pensão dos mesmos para produzir uma pasta fluida ressuspensa. Os sólidos podem ser ressuspensos no líquido a uma concentração de sólidos dentre cerca de 3% e cerca de 30% (p/p), ou qualquer concentração entre estas, por exemplo, de cerca de 10% a cerca de 20% (p/p) de sólidos suspensos, ou qualquer concentração entre estas. A concentração de sólidos suspensos na pasta fluida ressuspensa é preferivelmente a mesma ou um tanto mais alta do que a concentração de sólidos suspensos na pasta fluida de estoque de alimentação pré-tratado antes da separação de sólidos.

Após os sólidos de fibra serem ressuspensos, a hidrólise é per- mitida continuar adicionalmente para converter a celulose em um produto de hidrólise compreendendo glicose. A hidrólise da pasta fluida ressuspensa pode ser permitida proceder por cerca de outras 12-120 horas; por exemplo, a hidrólise da pasta fluida ressuspensa pode ser permitida proceder por cer- ca de 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 90 ou 120 horas. O fundo do segundo reator de hidrólise 200 pode ser cônico para proporcionar uma tra- jetória em que os sólidos colhidos podem assentar e serem removidos pela bomba 220, via linha 230. (Ver Figura 1B). Estes sólidos podem, em segui- da, ser enviados para o processamento de Iignina 160.

Geralmente, o pH da pasta fluida ressuspensa está dentro de uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 7,0, ou qualquer faixa de pH entre es- tas; preferivelmente, o pH está dentro de uma faixa de cerca de 4,5 a cerca de 5,5. Contudo, o pH da solução pode ser mais alto ou mais baixo do que cerca de 4,5 a 5,5 se as enzimas celulase usadas são alcalofílicas ou ácido- fílicas, respectivamente.

A temperatura da solução ressuspensa é ajustada de modo que esteja dentro da faixa ótima para a atividade das enzimas celulase. Geral- mente, uma temperatura de cerca de 45°C a cerca de 55°C, ou qualquer temperatura entre estas, é adequada para muitas enzimas celulase. Por e- xemplo, a temperatura da pasta fluida pode ser ajustada para cerca de 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55°C. Contudo, a temperatura da solu- ção pode ser mais alta para enzimas celulase termofílicas.

Referindo-se à Figura 1A, a pasta fluida hidrolisada, que com- preende glicose na fase aquosa e sólidos não-hidrolisados, e quaisquer par- tículas contendo celulose não-hidrolisada nos sólidos de fibra, pode ser reti- rada a partir do topo do segundo reator de hidrólise 200, via linha 240, e, em seguida, introduzida em um tanque de assentamento 250. Os sólidos de fi- bra assentam no fundo do tanque assentador 250. A fase aquosa 30 com- preendendo glicose pode ser removida via uma bomba. Os sólidos não- hidrolisados podem ser bombeados para fora do tanque assentador 250, via linha 280.

O termo "produto hidrolisado" se refere a produtos produzidos durante a hidrólise enzimática, incluindo, mas não limitados à, glicose que está presente na fase aquosa. Em adição à glicose, a fase aquosa do produ- to de hidrólise pode também compreender celobiose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes. Quantidades pequenas de celulose não- convertida, bem como materiais não-celulósicos, ou outros materiais que são inertes à celulase, podem ser conduzidos na fase aquosa. Estes sólidos po- dem ser separados da corrente de glicose para produzir uma preparação que está livre de partículas sólidas.

Embora o sistema descrito acima empregue dois reatores de hidrólise, o processo pode ser realizado em mais do que dois reatores de hidrólise.

Deve ser apreciado que, após a segunda hidrólise, a pasta fluida hidrolisada resultante pode ser submetida à hidrólise adicional. Isto pode envolver separação da fase de sólidos a partir da pasta fluida hidrolisada, e ressuspensão dos sólidos separados para produzir uma pasta fluida ressus- pensa. Estas etapas podem ser repetidas 1 a 5 vezes, ou qualquer número de vezes entre estas, preferivelmente 1 a 2 vezes.

Além disso, os sólidos separados podem ser enviados para um ou mais do que um reator de hidrólise a montante e a jusante através das etapas de processamento. Por exemplo, uma primeira porção dos sólidos separados pode ser reciclada para um reator a montante, e uma segunda porção dos sólidos separados pode ser adicionada a um reator a jusante.

Uma corrente compreendendo glicose obtida após a etapa de hidrólise parcial pode ser combinada com uma corrente compreendendo gli- cose obtida a partir da hidrólise continuada da pasta fluida ressuspensa para produzir uma corrente de açúcar combinada. Por exemplo, com referência à Figura 1A, a solução aquosa contendo glicose pode ser removida, via linha 185, e adicionada à corrente de glicose 30. Alternativamente, fermentação ou processamento adicional é efetuado separadamente na fase aquosa pro- duzida durante a hidrólise parcial e a hidrólise ressuspensa.

A glicose produzida pela hidrólise de celulose a partir do estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado pode ser fermentada em etanol. A fermentação de glicose e outros açúcares em etanol pode ser realizada por processos convencionais conhecidos àqueles versados na técnica, e pode ser efetuada por uma variedade de microorganismos, incluindo levedura e bactérias, ou microorganismos geneticamente modificados, por exemplo, mas não limitados àqueles descritos em WO 95/13362, WO 97/42307, ou conforme descrito em Alcohol Production From Lignocellulosic Biomass: The logen Process (em: The Alcohol Textbook, Nottingham University Press, 2000), que são aqui incorporados por referência.

A presente invenção será adicionalmente ilustrada nos exemplos seguintes. Contudo, é para ser compreendido que estes exemplos são para propósitos ilustrativos somente, e não devem ser usados de qualquer manei- ra para limitar o escopo da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Hidrólise de estoque de alimentação pré-tratado com enzimas celulase e β-glicosidase contendo um CBD em um reator de hidrólise de flu- xo ascendente

Com referência à Figura 1B, a pasta fluida de estoque de ali- mentação pré-tratado é preparada de 91 ton/hora de palha de trigo a 20% de umidade. A palha é moída a malha 20 com um moinho de martelo, e cozida com vapor a 230°C, e 3314 kg/hora de ácido sulfúrico 93% (p/p) diluído em 422.000 kg/hora de água de acordo com o ensinamento de Foody, Patente dos Estados Unidos N0 4.461.648. Quando da saída do reator de pré- tratamento, a pasta fluida de estoque de alimentação lignocelulósico pré- tratado 10 é resfriada usando-se um trocador de calor 20 que troca uma cor- rente de glicose aquosa 30, ou outro fluido adequado. A pasta fluida de es- toque de alimentação pré-tratado 10 é, em seguida, resfriada a uma tempe- ratura de entre cerca de 45°C e cerca de 55°C usando-se um segundo flui- do, por exemplo, água fria 45 em um trocador de calor 50. A pasta fluida de estoque de alimentação pré-tratado 10 é, em seguida, bombeada em um tanque de produção de hidrólise 60, junto com uma solução aquosa de en- zimas 70, que inclui enzimas celulase a partir do fungo Trichoderma a uma dosagem de 19 lU/grama de celulose, e uma enzima β-glicosidase compre- endendo um CDB, produzida conforme descrito no Exemplo 5, a uma dosa- gem de 145 lU/g de celulose. Esta é a alimentação para a torre de hidrólise. Contudo, deve ser notado que as enzimas 70 podem também serem adicio- nadas; por exemplo, as enzimas 70 podem ser adicionadas dentro de qual- quer linha que alimente o reator de hidrólise. Amônia 80 é também adiciona- da à pasta fluida 10 a uma taxa de 1463 kg/hora imediatamente antes da adição de enzima para ajustar o pH para entre cerca de 4,5 e 5,0. Os conte- údos do tanque de produção de hidrólise 60 são misturados com um agita- dor 100 e a pasta fluida 10 é, em seguida, bombeada para fora do tanque de produção 60 pela bomba 110, ao longo do tubo 120, para um de sete reato- res de hidrólise similares, dos quais o reator de hidrólise 130 é um tal reator operado em séries paralelas.

O reator de hidrólise 130 compreende distribuidores 140 para manutenção de uma distribuição uniforme da pasta fluida tratada com enzi- ma. O reator de hidrólise 130 é um reator de assentamento de fluxo ascen- dente não-misturado, conforme descrito em WO 2006/063467. O reator é um tanque de diâmetro de 18,29 m (60 pés) e altura de 18,29 (60 pés). A pasta fluida 10 é adicionada ao fundo do reator de hidrólise 130 a uma taxa de 300 gpm e uma concentração de sólidos de fibra de cerca de 10% (p/p). O tan- que é cônico para proporcionar uma trajetória na qual os sólidos colhidos assentam, e são removidos pela bomba 142, via linha 145. Estes sólidos podem ser enviados para processamento de lignina, via linha 160, ou recu- perados separadamente ou descarregados. A fase aquosa e sólidos de fibra fluem para cima no tanque com os sólidos de fibra assentando e ascenden- do o tanque em uma taxa mais lenta do que o líquido.

A pasta fluida sai do tanque após um tempo de residência da fase aquosa de cerca de 72 horas e dos sólidos de fibra, que mantêm uma concentração de 12% (p/p) de cerca de 130 horas. A conversão de celulose é cerca de 95%. A pasta fluida hidrolisada 150, que compreende uma fase aquosa de 60 g/L de glicose e sólidos de fibra compreendendo principalmen- te celulose não-hidrolisada, bem como lignina e sílica, é removida a partir do topo do reator de hidrólise 130, via linha 170, e introduzida em uma unidade de microfiltração 180 a uma taxa de 300 gpm. A unidade de microfiltração .180 separa os sólidos de fibra compreendendo celulose, lignina e celulase e β-glicosidase ligadas a partir da fase aquosa. A fase aquosa contém pouca enzima com a corrente de glicose, e é removida, via linha 185, e enviada para fermentação a etanol por levedura. Os sólidos de fibra separados con- tendo celulase e β-glicosidase ligadas 195 são adequados para serem envi- ados para um segundo reator de hidrólise para hidrólise adicional. Exemplo 2: Hidrólise de estoque de alimentação pré-tratado com enzimas celulase e β-glicosidase contendo um CBD em um reator de hidrólise de flu- xo ascendente com hidrólise continuada

Este exemplo se refere à hidrólise enzimática de um estoque de alimentação pré-tratado com enzimas celulase e β-glicosidase com um CDB, seguido por separação de sólidos de fibra não-hidrolisados a partir da fase aquosa, e ressuspensão dos sólidos de fibra. Os sólidos de fibra ressuspen- sos, que contêm a enzima β-glicosidase e enzimas celulase ligadas, são hi- drolisados em um segundo reator de hidrólise.

A hidrólise de estoque de alimentação pré-tratado com enzimas celulase e enzima β-glicosidase com um CBD é efetuada em um reator de hidrólise de fluxo ascendente, conforme descrito no Exemplo 1. Contudo, neste caso, as dimensões do reator de hidrólise são selecionadas de modo que o líquido saia do tanque após um tempo de residência de cerca de 24 horas, com uma conversão de celulose de cerca de 55% para produzir uma pasta fluida parcialmente hidrolisada 150. A pasta fluida parcialmente hidroli- sada 150, que compreende uma fase aquosa de 30 g/L de glicose e sólidos de fibra compreendendo celulose principalmente hidrolisada, bem como Iig- nina e sílica, é removida a partir do topo do primeiro reator de hidrólise 130, via linha 170, e introduzida em uma unidade de microfiltração 180 a uma taxa de 900 gpm.

A unidade de microfiltração 180 separa os sólidos compreen- dendo celulose, lignina, celulase e β-glicosidase ligadas a partir da fase a- quosa da pasta fluida parcialmente hidrolisada. A fase aquosa contém pouca enzima com a corrente de glicose, e é removida, via linha 185, e adicionada a corrente de glicose 30. Os sólidos separados 195 contendo celulase e β- glicosidase ligadas, são introduzidos em um segundo reator de hidrólise 200 junto com água 210 para produzir uma pasta fluida ressuspensa e, em se- guida, alimentados ao segundo reator de hidrólise 200, que é também um reator de hidrólise de fluxo ascendente. A taxa de alimentação para o se- gundo reator é cerca de 450 gpm, e o tempo de residência do líquido é cerca de 48 horas. Similar ao primeiro reator de hidrólise 130, o fundo do segundo reator de hidrólise 200 é cônico para proporcionar uma trajetória na qual os sólidos colhidos assentam e são removidos pela bomba 220, via linha 230. Estes sólidos podem, em seguida, ser enviados para processamento de lig- nina, via linha 160, ou removidos separadamente ou descarregados.

A glicose, e quaisquer partículas contendo celulose e contendo lignina não-hidrolisadas são, em seguida, retiradas a partir do topo do se- gundo reator de hidrólise 200, via linha 240, e são introduzidas em um tan- que de assentamento 250. Os sólidos assentam no fundo do tanque assen- tador 250, e a corrente de produto de hidrólise 30 compreendendo glicose é removida, via bomba 260. Os sólidos assentados são bombeados para fora do tanque assentador 250 pela bomba 270, via linha 280. Estes sólidos são, em seguida, enviados para processamento de lignina, via linha 160. A cor- rente 30 é enviada para o primeiro trocador de calor, ou para fermentação a etanol por levedura.

Exemplo 3: Hidrólise de celulose por enzima incluindo β-glicosidade com domínio de ligação de celulose (CBD) Este exemplo ilustra a hidrólise de celulose pré-tratada com se-

paração de sólidos e ressuspensão do substrato. O desempenho da hidróli- se é melhor com β-glicosidase com um CBD presente do que sem um CBD.

Palha de trigo pré-tratada foi preparada por pré-tratamento con- tínuo com 0,6% de ácido sulfúrico (p/p), aquecida a 185°C com vapor por 3 minutos. O estoque de alimentação pré-tratado foi lavado com um excesso de água e filtrado a vácuo para remover muito da água. A massa de estoque de alimentação lavada continha 30% de sólidos, e os sólidos continham 51% de celulose, com o restante sendo composto principalmente xilan, lignina e sílica.

Duas misturas de enzima celulase de fermentações de cultura

submersas em Trichoderma foram usadas neste experimento. Ambas mistu- ras continham níveis aumentados de β-glicosidase para assegurar que a celobiose não se acumule durante a hidrólise. O nível de β-glicosidase foi aumentado pelos métodos de White e Hindle, Patente dos Estados Unidos N0 6.015.703. Uma mistura continha 163 g/L de proteína e 131 lU/mL de ati- vidade de celulase de papel de filtro. Esta batelada ("convencional") continha β-glicosidase nativa carecendo de um domínio de ligação de celulose. A ati- vidade de β-glicosidase foi medida pelo ensaio padrão de Ghose (1987) co- mo 1235 lU/mL. Uma segunda batelada ("βς com CBD") continha 32,5 g/L de proteína, 20,7 IU/mL de atividade de celulase de papel de filtro, e 250 IU/mL de atividade de β-glicosidase. O Exemplo 5 descreve a preparação de β-glicosidase com CBD em maiores detalhes. Hidrólises de celulose foram efetuadas pelo uso de frascos de topo de rosca de 250 mL. O peso de hidrólise total foi 100 g por frasco, com palha de trigo pré-tratada a uma concentração correspondendo a 5% de ce- lulose, enzima adicionada a uma dosagem de 16 a 24 mg de proteína por grama de celulose, e o restante contendo 50 mM de tampão de citrato de sódio, pH 4,8, que continha 0,5% de benzoato de sódio como um conservan- te. Antes da adição da enzima, o substrato de palha de trigo pré-tratado foi hidratado durante toda a noite no tampão a 50°C com os frascos sacudindo. Durante a hidrólise, os frascos foram sacudidos a 250 rpm em um oscilador giratório a 50°C.

Para hidrólises com filtração e ressuspensão, os frascos foram removidos a partir do oscilador em 24 horas, e os conteúdos filtrados a vá- cuo sobre papel de filtro de microfibra de vidro. O volume de filtrado foi me- dido como 40-50 mL, e o filtrado foi substituído por um volume igual de 50 mM de tampão de citrato de sódio, pH 4,8. Similar à hidrólise efetuada antes da filtração e ressuspensão, a hidrólise sacudida foi, em seguida, continuada por 96 horas. Para hidrólises convencionais, os cursos de hidrólise foram efetuados sacudidos por 120 horas sem filtração ou ressuspensão.

Para todas as hidrólises, amostras de 800 μΙ_ foram periodica- mente tomadas e transferidas em filtros de micro-centrífuga, e centrifugadas a 12.000 rpm por 2 minutos para separar os sólidos insolúveis da fase aquo- sa. O sobrenadante foi recuperado e usado para análise de glicose. Muitas amostras foram verificadas assegurar que a celobiose não se acumule por ebulição por 5 minutos antes da centrifugação.

As concentrações de glicose no sobrenadante foram medidas por um método enzimático. Concentrações de celobiose baixas (<1 g/L) fo- ram confirmadas pela medição em uma HPLC. Um ensaio de celulose base- ado na hidrólise com ácido sulfúrico concentrado foi realizado no final de todo curso de hidrólise, e foi confirmada a concentração de celulose não- convertida baseada em medição de glicose.

A Figura 2A mostra os resultados de hidrólise por celulase com β-glicosidase contendo CBD, com dosagens de celulase de 16 mg de prote- ína por grama de celulose. A hidrólise ressuspensa realiza a hidrólise con- vencional que foi efetuada sem ressuspensão. A razão é que a filtração da hidrólise após 24 horas remove uma quantidade significante da glicose pre- sente. Pala remoção da glicose, a inibição do produto final da celulose é re- movida, e a hidrólise procede a uma taxa mais alta, e alcança um nível mais alto de conversão do que na presença de glicose na hidrólise convencional. A β-glicosidase, que é necessária para uma hidrólise efetiva, é ligada à celu- lose, e é transportada na hidrólise de ressuspensão.

A Figura 2B mostra um resultado similar conforme a Figura 2A, exceto que a dosagem de enzima é 24 mg/g, ao invés de 16 mg/g na Figura 2A.

A Figura 3 mostra hidrólise com uma celulase convencional, on- de a β-glicosidase carece de um CBD. As hidrólises foram efetuadas por 24 horas em dosagens de 16 e 24 mg/g. Neste ponto, as pastas fluidas foram filtradas, e as hidrólises ressuspensas e continuadas. A taxa de hidrólise a- pós ressuspensão é muito baixa, com muito pouca glicose produzida. A ra- zão para esta taxa baixa de hidrólise é que a β-glicosidase carece de um CBD, e não se liga à celulose, mas preferiveImente é perdida para o filtrado durante filtração. A composição de celobiose inibe a celulase e diminui a ta- xa de hidrólise.

Exemplo 4: Ligação de β-glicosidase com CBD à celulose de palha de trigo lixiviada

β-glicosidase e β-glicosidade contendo um CBD foram purifica- das de misturas de celulase totais por cromatografia de troca de ânion, se- guida por cromatografia de troca de cátion. As proteínas purificadas foram incubadas com 2,56 g/L de palha de trigo pré-tratada ajustada para pH 4,8 com tampão de citrato de sódio, ou com tampão de citrato somente pH 4,8 por 30 minutos a 4°C ou 50°C. Em seguida à incubação, as amostras foram centrifugadas e as frações de sobrenadante foram analisadas por SDS- PAGE (Figuras 4A e 4B).

Conforme mostrado na Figura 4A, após incubação a 4°C na pre- sença e ausência de palha de trigo pré-tratada, quantidades idênticas de β- glicosidase foram detectadas no sobrenadante. Isto é identificado pelas fai- xas a 66 kDa, e indica que a β-glicosidase carecendo de um CBD não se liga à palha de trigo pré-tratada. Em contraste, β-glicosidase purificada-CBD completamente ligada à palha de trigo pré-tratada, e não detectada no so- brenadante, conforme indicado pela faixa a 70 kDa na ausência de palha de trigo pré-tratada. Isto mostra que o CBD é requerido para β-glicosidase para se ligar aos sólidos de fibra. Resultados similares foram observados a 50°C(Figura 4B).

Exemplo 5: Expressão de uma fusão de β-glicosidase/CBD em Trichoderma reesei

Este exemplo descreve o isolamento de DNA genômico de cepa de Trichoderma reesei M2C38 e derivados geneticamente modificados, a construção de bibliotecas de DNA genômico, a clonagem de vários genes, construtos genéticos de Trichoderma reesei cepa M2C38, e a transformação e expressão de β-glicosidase/construtos genéticos de CBD em Trichoderma reesei cepa BTR213.

Cepas de Triehoderma reesei M2C38 e BTR213 são cepas prio- ritárias de Iogen Corporation que foram derivadas de Triehoderma reesei RutC30 (ATCC 56765, Montenecourt and Eveleigh, Adv. Chem. Ser., 1979, 181:289-301), que foi, por sua vez, derivado de Triehoderma reesei Qm6A (ATCC 13631 Mandeis and Reese, J. Baeteriol., 1957, 73:269-278).

Neste exemplo, endonucleases de restrição, T4 DNA polimera- se, T4 DNA Iigase e fragmento de Klenow de E. eoii DNA polimerase 1 foram comprados de Gibco/BRL, New England Biolabs, Boehringer Mannheim ou Pharmacia, e usados conforme recomendado pelo fabricante. Polimerase Pwo com atividade de correção de erros (Boehringer Mannheim) foi usada em todas as reações de cadeia de polimerase (PCR) de acordo com o pro- tocolo do fabricante. Hygromycin B foi comprado de CaIBiochem. 5.1 Clonagem dos genes T. reesei bg/1, ebhl, ebh2, xln2 e pgk

Para isolar DNA genômico, 50 mL de Caldo de Dextrose de Ba- tata (Difco) foi inoculado com esporos de T. reesei coletados de uma placa Ágar de Dextrose de Batata com um circuito de inoculação estéril. As cultu- ras foram sacudidas a 200 rpm por 2-3 dias a 28°C. Os micélios foram filtra- dos em um filtro de microfibra de vidro GFA (Whatman), e lavados com água deionizada fria. As massas de fungo foram congeladas em nitrogênio líquido, trituradas em um pó com um pilão pré-resfriado e pilão; 0,5 g de biomassa em pó foram ressuspensos em 5 mL de Tris a 100 mM, EDTA a 50 mM, pH 7,5, mais 1% de sódio sulfato de dodecila (SDS). O Iisato foi centrifugado (5000 g por 20 minutos, 4°C) em fragmentos de célula em pélete. O sobre- nadante foi extraído com 1 volume de tampão saturado com fenol (Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 8,0), seguido por extração com 1 volume de tampão- fenol saturado:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) de modo a remover proteínas solúveis. DNA foi precipitado a partir da solução pela adição de 0,1 volume de acetato de sódio a 3 M, pH 5,2, e 2,5 volumes de etanol frio a 95%. Após incubação por pelo menos 1 hora a -20°C, o DNA foi peletizado por centrifugação (5000 g por 20 minutos, 4°C), enxaguado com 10 mL de etanol a 70%, secado com ar, e ressuspenso em 1 mL de Tris a 10 mM, ED- TA de 1 mM, pH 8,0. O RNA foi digerido pela adição de Ribonuclease A (Boehringer Mannheim) adicionado a uma concentração final de 0,1 mg/mL a 37°C por 1 hora. Extrações seqüenciais com 1 volume de fenol, saturado com tampão, e 1 volume de fenol saturado com tampão:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) foram usados para remover a ribonuclease a partir da solução de DNA. O DNA foi novamente precipitado com 0,1 volume de ace- tato de sódio a 3 M, pH 5,2, e 2,5 volumes de etanol frio a 95%, peletizado por centrifugação, enxaguado com etanol a 70%, secado com ar, e ressus- penso em 50 μΙ de Tris a 10 mM, 1 mM de EDTA, pH 8,0. A concentração de DNA foi determinada pela medição da absorvância da solução a 260 nm (p. C1 em Sambrook, Fritsch and Maniatis1 "Modecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Press 1989, daqui por diante referido como Sambrook et ai).

Duas bibliotecas de plasmídeo e uma biblioteca de fago foram construídas usando-se DNA genômico isolado de cepa de T. reesei M2C38. As bibliotecas de plasmídeo foram construídas no vetor pUC119 (Viera and Messing, "Isolation of single-stranded plasmid DNA", Methods Enzymol., 153:3, 1987), conforme se segue: 10 pg de DNA genômico foi digerido por 20 horas a 37°C em 100 μΙ_ de volume com 2 unidades/pg de enzimas de restrição HinchU, SamHI ou EcoR1. O DNA digerido foi fracionado em um gel de agarose a 0,75% operando em Tris-acetato a 0,04M, EDTA a 1 mM, e manchado com brometo de etídio. Fatias de gel correspondentes ao tama- nho dos genes de interesse (baseado na informação publicada e manchas de Southern) foram cortadas e submetidas à eletroeluição para recuperar fragmentos de DNA (Sambrook et ai, pp. 6.28-6.29). Estas frações enrique- cidas de DNA foram ligadas em pUC119 de modo a criar bibliotecas de gene em reações de ligação contendo 20-50 μg/mL de DNA em uma razão molar de 2:1 de vetor:DNA de inserto, ATP a 1 mM e 5 unidades de T4 DNA Iigase em um volume total de 10-15 μΙ a 4°C por 16 horas. A cepa de Escherichia coli HB101 foi eletroporada com as reações de ligação usando-se o Cell Po- rator System (Gibco/BRL), seguindo-se o protocolo do fabricante e transfor- mantes selecionados em LB ágar contendo 70 μg/mL de ampicilina.

Transformantes de E. coli HB101 abrigando clones cbhl, cbh2 ou bgll a partir das bibliotecas pUC119-H/Vid III, -BamH 1 ou -EcoRI recom- binantes foram identificados por hibridização de elevação de colônia: 1,3 χ 104 colônias foram transferidas nas membranas de náilon HyBond® (Amer- sham); as membranas foram colocadas no lado da colônia em papel de manchamento (VWR 238), saturadas com NaOH a 0,5 M, NaCI a 1 M por 5 minutos para Iisar as células bacteriais e desnaturar o DNA: as membranas foram, em seguida, neutralizadas pela colocação das mesmas no lado da colônia em papel de manchamento (VWR 238), saturadas com Tris a 1,5 M, pH 7,5, mais NaCI a 1 M por 5 minutos; as membranas foram permitidas se- car com ar por 30 minutos, e o DNA foi, em seguida, fixado às membranas por cozimento a 80°C por 2 horas.

Sondas etiquetadas 32P foram preparadas por amplificação de PCR de fragmentos curtos (0,7-1,5 kB) das regiões de codificação bgll, c- bh1 e cbh2 a partir da reunião enriquecida de fragmentos Hind\\\, BamW ou EcoR1, respectivamente, em uma reação de etiquetação contendo 10-50 DNA-alvo, d(GCT)TP a 0,2 mM cada, dATP a 0,5 μΜ, a-32P-dATP a 20-40 uCi, 10 pmol de iniciadores de oligonucleotídeo e 0,5 unidade de Taq poli- merase em um volume total de 20 μΙ_. A reação foi submetida a 6-7 ciclos de amplificação (95°C, 2 minutos; 56°C, 1,5 minuto; 70°C, 5 minutos). O DNA etiquetado 32P amplificado foi precipitado pela adição de 0,5 mL de ácido tricloroacético a 10% (p/v) e 0,5 mg de tRNA de levedura. O DNA foi peleti- zado por microcentrifugação, lavado duas vezes com 1 mL de etanola 70%, secado com ar, e ressuspenso em TRis a 1M pH 7,5, EDTA a 1 mM.

Membranas de náilon nas quais os plasmídeos pUC119 recom- binantes tinham sido fixados foram hidrolisadas em sacos vedados por calor por 1 hora a 60-65°C em NaCI a 1 M, 1% de SDS, Tris a 50 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,5, com 100 pg/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado des- naturado. Hibridizações foram realizadas em sacos vedados com calor no mesmo tampão com somente 50 pg/mL de DNA de esperma de salmão ci- salhado desnaturado, e 5 χ 106 - 5 χ 107 cpm de sonda blg1, cbhl ou cbh2 desnaturada por 16-20 horas a 60-65°C. As membranas foram lavadas uma vez por 15 minutos com NaCI a 1 M, 0,5% de SDS a 60°C, duas vezes por 15 minutos cada com NaCI a 0,3 M, 0,5% de SDS a 60°C, e uma vez por 15 minutos com NaCI a 0,03 M, 0,5% de SDS a 55°C. As membranas foram novamente colocadas em sacos vedados com calor e expostas a filme de raios X Kodak RP por 16-48 horas a -70°C. O filme de raios X foi desenvol- vido seguindo os protocolos do fabricante. Colônias dando sinais forte ou fraco foram captadas e cultivadas em meio 2 χ YT, suplementado com 70 pg/mL de ampicilina. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir destas culturas usando-se o método de Iise alcalina (Sambrook, et al., pp. 1.25-1.28), e ana- lisado por digestão de restrição. Hibridização de Southern (Sambrook, et al., pp. 9.38-9.44) e análise de PCR (Sambrook, et al., pp. 14.18-14.19).

Clones conduzindo o gene bgll foram identificados por hibridiza- ção de elevação de colônia da biblioteca pUC119-H/nc/com um 1,0 de uma sonda bgll preparada usando-se iniciadores de oligonucleotídeos designa- dos para amplificar bp 462-1403 da seqüência bgll publicada (Barnett, Ber- ka, and Fowler, em "Cloning and Amplification of the Gene Encoding na Ex- tracellular β-glicosidase de Trichoderma reesei: Evidence for Improved Rates of Saccharification of Cellulosic Substrates" Bio/Technology, Volume 9, Ju- nho de 1991, p. 562-567, aqui referido como "Barnett, et ai"). Um clone bgll, pJEN200, foi isolado contendo 6,0 kb de fragmento Hind Ill correspondente ao promotor, gene estrutural e seqüências de terminação. Clones conduzin- do o gene cbhl foram identificados pela hibridização de elevação de colônia da biblioteca pUC119-Sa/77H1 com 0,7 kb de uma sonda cbhl preparada usando-se iniciadores de oligonucleotídeo para amplificar bp 597-1361 da seqüência de cbhl publicada (Shoemaker, Schweikart, Landner, Gelfand, Kwok, Myambo and Innis, "Molecular cloning of exo-cellobiohydrolyase 1 derived from Trichoderma reesei strain L27", Bio/Technology 1: 691-696, 1983 daqui por diante referido como Shoemaker et al.)· Um clone cbhl, pCOR132, foi isolado contendo 5,7 kb de fragmento BamW correspondente ao promotor (4,7 kb) e 1 kb do gene estrutural cbhl. A partir deste, um frag- mento de 2,5 kb de EcoRI contendo o promotor de cbhl (2,1 kb) e 5' termi- nal da região de codificação cbhl (0,4 kb) foi subclonado em pUC119 para gerar pCB152. Clones conduzindo o gene cbh2 foram identificados por hibri- dização de elevação de colônia da biblioteca pUC119-EcoR1 com uma 1,5 kb de sonda cbh2 preparada usando-se iniciadores de oligonucleotídeo de- signados para amplificar bp 580-2114 da seqüência de cbh2 publicada (Chen, Gritzali and Stafford, "Nucleotide sequence and deduced primary s- tructure of cellobiohydrolase Il from Trichoderma reesef, Bio/Technology 5: 274-278, 1987, daqui por diante referido como Chen et al.). Um clone cbh2, pZUK600, foi isolado contendo 4,8 kb de fragmento EcoRI correspondente ao promotor (600 bp), gene estrutural (2,4 kb), e terminador (1,9 kbp).

Uma biblioteca de fago foi construída em vetor lâmbda ADASH (Stratagene, Inc.) conforme segue: DNA genômico (3 pg) foi digerido com 2.1, 0,5 e 0,5 unidade/ pg de Bam Hl por 1 hora a 37°C para gerar fragmen- tos de 9-23 kB de tamanho. O DNA de cada digestão foi purificado por ex- tração com 1 volume de Tris:fenol saturado:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), seguido por precipitação com 10 μΙ de acetato de sódio a 3 M, pH 5.2, e 250 μΙ de etanol a 95% (-20°C). O DNA digerido foi peletizado por mi- crocentrifugação, enxaguado com 0,5 ml_ de etanol frio a 70%, secado com ar, e ressuspenso em 10 μΙ de água deionizada estéril. O enriquecimento de fragmentos de DNA de 9-23 kb em tamanho foi confirmado por eletroforese de gel de agarose (0,8% de agarose em Tris-acetato a 0,04 M, EDTA a 1 mM). O DNA digerido (0,4 pg) foi ligado a braços de 1 pg de ADASH pré- digeridos com BamH\ (Stratagene) em uma reação contendo 2 unidades de T4 DNA Iigase e 1 mM de ATP em um volume total de 5 μΙ a 4°C durante toda a noite. A mistura de ligação foi acondicionada nas partículas de fago usando-se os extratos de acondicionamento GigaPack® Il Gold (Stratage- ne), seguindo-se os protocolos do fabricante. A biblioteca foi titulada usando- se o hospedeiro E. coli cepa XL-1-BIue MRA (P2), e verificado conter 3 χ 105 clones independentes.

Sondas etiquetadas Digoxigen-11-dUTP foram preparadas de regiões de codificação amplificadas de PCR dos genes cbhl, xln2 e pgk por etiquetação de prímer aleatório usando-se o kit de Etiquetação e Detecção DIG (Boehringer Mannheim), e seguindo os protocolos do fabricante. Clones genômicos contendo os genes cbhl, xln2 e pgk foram identificados por hibri- dização de elevação de placa da biblioteca ADACH. Para cada gene de inte- resse, 1 χ 104 clones foram transferidos para membranas de náilon Nytran® (Schleicher e Schull). As partículas de fago foram lisadas, e o DNA do fago desnaturado pela colocação da placa das membranas no lado do papel de manchamento (VWR 238), saturada com NaOH a 0,5 M, NaCI a 1 M por 5 minutos; as membranas foram, em seguida, neutralizadas pela colocação das mesmas na placa no lado do papel de manchamento (VWR 238), satu- rada com Tris a 1,5 M, pH 7,5, mais NaCI por 5 minutos; as membranas fo- ram permitidas secar com ar por 30 minutos, e o DNA foi, em seguida, fixado às membranas por cozimento a 80°C por 2 horas. As membranas foram pré- hibridizadas em sacos vedados com calor em uma solução de 6 X SSPE, 5X Denhardfs, 1% de SDS, mais 100 μΙ/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado, cisalhado a 65°C por 2 horas. As membranas foram, em se- guida, hibridizadas em sacos vedados com calor na mesma solução conten- do 50 μΙ/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado, cisalhado, e 0,5 μg de sondas etiquetadas digoxigen-dUTP a 65°C durante toda a noite. As membranas foram lavadas duas vezes por 15 minutos em 2X SSPE, 0,1% de SDS à temperatura ambiente, duas vezes por 15 minutos em 0,2X SSPE, 0,1% de SDS a 65°C, e uma vez por 5 minutos em 2X SSPE. Clones de hi- bridização positiva foram identificados por reação com um conjugado de an- ticorpo antidigoxigenante/fosfatase alcalina, 5-bromo-4-cloro-3-indoil fosfata- se e 4- cloreto de azul de 4-nitrotetrazólo (Boehringer Mannheim), seguindo- se o protocolo do fabricante. Clones de hibridização positiva foram purifica- dos adicionalmente por uma segunda etapa de classificação com as sondas etiquetadas digoxigen-dUTP. Clones individuais foram isolados, e o DNA do fago purificado conforme descrito em Sambrook et al. (1998) pp. 2.118-2.121, com a exceção que a etapa de gradiente de CsCI foi substituída por extração com 1 volume de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), e 1 volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). O DNA foi precipitado com 0,1 volume de acetato de sódio a 3 M, pH 5,2, e 2,5 volumes de etanol frio a 95%. O DNA do fago precipitado foi lavado com 0,5 ml_ de etanol frio a 70%, e secado com ar e ressuspenso em 50 μΙ de TRis a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 8,0. Os fragmentos de restrição contendo os genes de interesse foram identificados por digestões de restrição do DNA do fago purificado e hibridi- zação de mancha de Southern (Sambrook, et al., pp, 9.38-9.44), usando-se as mesmas sondas etiquetadas digoxigen-dUTP usadas para classificar a biblioteca ADASH. AS membranas foram hibridizadas e fragmentos de hibri- dização positiva visualizados pelos mesmos métodos usados para as eleva- ções de placa. Uma vez que os fragmentos de restrição desejados de cada clone de ADASH foram identificados, as digestões de restrição foram repeti- das, os fragmentos foram decompostos em um gel de agarose a 0,08% em TAE, e as faixas desejadas cortadas. O DNA foi eluído a partir das fatias de gel usando-se o Kit Sephaglas BandPrep (Pharmacia) seguindo-se o proto- colo do fabricante.

Clones conduzindo o gene cbhl foram identificados por hibridi- zação de elevação de colônia da biblioteca ADASH (exemplo 2) com uma sonda cbhl compreendendo bp 45-222 da seqüência de cbhl publicada (Shoemaker et al.). Um fragmento BamH\ de 1,8 kb contendo o terminal 3' da região de codificação de cbhl (0,5 kb) e o terminador de cbhl (1,3 kb) foi isolado por digestão de restrição de DNA do fago purificado de um clone c- bh1 ADASH. Este fragmento foi subclonado no local de BamHI do vetor de plasmídeo de E. coli pUC119 para gerar o plasmídeo pCBITa. Os clones conduzindo o gene xln2 foram identificados por hibridização de elevação de colônia da biblioteca ADASH (exemplo 2) com uma sonda de xln2 compre- endendo bp 100-783 da seqüência de xln2 publicada (Saarelainen, Polahei- mo, Fagrestrom, Suominen and Nevalainen, "Cloning, sequencing and e- nhanced expression of the Trichoderma reesei endoxylanase Il (p19) gene xln2', Mol. Gen. Genet. 241:497-503, 1993, daqui por diante referido como Saarelainen et a!.). Um fragmento de 5,7 kb de Kpnl contendo o promotor (2,3 kb), região de codificação (0,8 kb) e terminador (2,6 kb), o gene xln2 foi isolado por digestão de restrição de DNA do fago purificado de um clone xln2 ADASH. Este fragmento foi subclonado no local de Kpnl de pUC119 para gerar o plasmídeo pXYN2K-2. Os clones conduzindo o gene pgk foram identificados por hibridização de elevação de colônia da biblioteca ADASH (exemplo 2) com uma sonda pgkl compreendendo bp 4-1586 a seqüência de pgk publicada (Vanhanem, Penttila, Lehtovaara and Knowles, "Isolation and characterization of the 3-phosphoglycerate kinase gene {pgk) de fungo filamentoso de Trichoderma reesef, Curr. Genet. 15:181-186, 1989). Um fragmento de 5,0 kb de EcoRI contendo o promotor (2,9 kb), região de codi- ficação (1,6 kb), e terminador (0,5 kb), o gene pgk foi isolado por digestão reversa de DNA do fago purificado de um clone pgk ADASH. Este fragmento foi subclonado no local de EcoRI de pUC119 para gerar o plasmídeo pGK5.0.

5.2 Construção de vetor de sobre-expressão de β-glicosidase pC/XBG-CBD- TV

Este exemplo descreve a construção de um vetor designado pa- ra expressar uma proteína de fusão da região de codificação de β- glicosidase matura, e um peptídeo compreendendo o domínio de ligação de celulose Iigante de Trichoderma celobio-hídrolase I. Neste construto, a ex- pressão da proteína de fusão é dirigida pelo promotor de Trichoderma ceio- bio-hidrolase I (cbM) e peptídeo de sinal de secreção de xilanase 2 (xln2).

Na região de codificação de β-glicosidase menos o resíduo de alanina de terminal C (bp 474-2679) foi amplificada com Pwo polimerase a partir do clone bgll genômico pJEN200 usando-se iniciadores para inserir um local de Xba 1 diretamente a montante de bp 474 na seqüência de bgll publicada (Barnett et aí) e um local de Kpn 1 em bp 2676, que é um códon fora do códon de parada. Este fragmento amplificado foi subclonado sem digestão no local de Smal de pUC19 para gerar o plasmídeo pBgnsl. O fragmento bgll que carece do códon de parada foi liberado a partir do pBgnsl por digestão com Xbal e Kpnl e inserido no pCB219N digerido com Xbal e Kpn1 para gerar PBgns2. Para produzir pCB219N, um fragmento de terminador cbn2 foi amplificado a partir do gabarito pZUK600 usando-se um homólogo de prímer para bp 2226-2242 da região 3'-não-transladada publi- cada do gene cbr>2 (Chem et ai, 1987) contendo um local Kpn1 no terminal 5' e o prímer de avanço pUC (Cat. N0 1224, New England Biolabs) que se fortalece a jusante do local EcoRI no terminal 3' em pZUK600. Este frag- mento foi digerido nos locais projetados LpM e EcoR1, e inserido nos locais correspondentes de pUC119 para gerar pCB219. Um adaptador de EcoRI (Cat. N0 35310-010.Gibco/BRL) foi inserido no local único de EcoRI de PCB219 para gerar pCB219N.

Um fragmento de 2,3 kb contendo o promotor e sinal de secre- ção do gene xln2 (bp-2150 a +99 onde + 1 indica o códon de partida de ATG) foi amplificado com Pwo polimerase a partir do subclone xln2 genômi- co pXYN2K-2 usando-se um prímer específico de xln2 contendo o local de Nhel diretamente a jusante de bp102 da seqüência de xln2 publicada (Saa- relainen et a!) e o prímer reverso de pUC (Cat. N0 18432-013.Gibco/BRL) que se fortalece a jusante do local EcoRI no terminal 5' do gene xln2. Este produto de PCR xln2 foi digerido com EcoRI (que foi amplificado como parte do poliligante pUC119 de pXYN2K-2) e Nhe1, e inserido no plasmídeo p- BR322L, que foi preparado a partir do plasmídeo pBE322 por inserção de um Iigante Sph1-Not1-Sal1 entre os locais SpM e Sal 1. O EeoRI no termi- nal 5' do promotor de xlr>2 no plasmídeo resultante pBR322LXN foi, em se- guida, agrupado com Iigantees Klenov e Spel (Cat. N0 1086. New England Biolabs), foram adicionados para gerar pBR322pXN. Um fragmento Hind\\\ de 1,2 kb compreendendo bp-1399 a 204 do promotor de cbhl foi isolado por digestão de Hind\\\ do subclone genômico pCB152. Este fragmento foi usado para reduzir o fragmento de HindiW compreendendo bp 1400 a bp 121 do promotor de xln2 no vetor pBR322pXN para gerar o plasmídeo p- BR322C/X.

O plasmídeo pBgns2 foi cortado com Xba 1 e Not 1 e um frag- mento de 4,2 bp, contendo a região de codificação de bgll que carece do códon de parada, seguido pelo terminador de cbh2 foi isolado. Este fragmen- to foi inserido no plasmídeo pBR322CYX com Nhel e Notl (Nhel e Xbal têm projeções compatíveis). Esta clonagem resultante em um cassete de expressão do qual a β-glicosidase matura carecendo de códon de parada pode ser expressa sob o controle do promotor de cbhl e o peptídeo de sinal de secreção de xln2. Este plasmídeo de cassete de expressão é pC/XBgns, e tem um local único de Kpn 1 entre a região de codificação de bgll e o ter- minador de cbh2.

Para obter o Iigante de cbhl e região de CBD1 um fragmento de DNA compreendendo bp 1665 a bp 1882 do gene cbhl publicado (Shoema- ker et a!) foi amplificado por PCR usando iniciadores para inserir Kpn 1 e Spe 1 em ambos terminal 5' e um local de Kpnl no terminal 3' do fragmento. O local 5' Kpn 1 está localizado de modo a produzir uma fusão precisa entre a estrutura de leitura entre a região de codificação de bgll em pC/XBgns e a estrutura de leitura do Iigante de cbhl + CBD. O local 3' Kpnl está localizado imediatamente após o códon de parada da região de codificação de cbhl nativa. Este produto de PCR de 215 bp foi digerido com Kpnl e inserido no local único de Kpm 1 de pC/XBgns, para produzir o plasmídeo de cassete de expressão final pC/XBg-CBD. Como um resultado da inserção dos locais de reação, a proteína de fusão final expressa por este construto conterá três aminoácidos extras (Pro-Thr-Ser) entre Val713 da seqüência de codificação de bgll e o Ile474 da região de codificação de cbhl.

O gene E. coli de higromicina fosfotransferase (hph) usado como um marcador selecionável para T. reeseifoi amplificado com Pwo polimerase a partir do plasmídeo pVU1005 (Van den Elzen, Townsend1 Lee and Bedbrook, "A chimaeric hygromycin resistance gene as a selectable marker in plant cells", Plant Mol. Biol. 5:299-302, 1989). Os iniciadores foram designados para intro- duzir locais de Sphl e Kpn 1 nos terminais 5' e 3' da região de codificação de hph (bp 211-1236 da seqüência de hph publicada, Gritz e Davies, "Plamid- encoded hycromycin b resistance: the sequence of hygromycin B phospho- transferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae" Gene 25: 179-188,1983), respectivamente. O produto de PCR foi digerido com Sph 1 e Kpn1, e inserido nos locais correspondentes na região poliligante de pUC119. O plasmídeo resultante, pHPTIOO, foi usado como o plasmídeo de partida para a construção do cassete de seleção. Duas novas regiões Iigantes foram introduzidas neste plasmídeo para facilitar a inserção dos fragmentos do promotor e terminador requeridos para expressar o gene hpn em um hospedeiro de Trichoderma. Um Iigante HindIII-Xbal-Xhol-Sphl foi inserido entre os locais HindIII e Sphl no terminal 5' da seqüência de hph e um ligante de Kpn1-Not1-Sacl que foi inserido entre os locais de Kpnl e Sacl no terminal 3' da seqüência de hph. Este construto foi designado como pHPT102. Os iniciadores usados para amplificar o promotor de pgk (Vanhanen, Salohei- mo, llmen, Knowles and Penttila. "Promoter structure and expression of the 3- phosphoglycerate gene (pgkl) of Trichoderma reesei'. Gene 106: 129-133, 1991) foram designados para introduzir um local de Xhol e um local de Sphl nas posições -970 + 1 do promotor respectivamente. Estes locais foram sub- seqüentemente usados para inserir o promotor de pgk nos locais Xhol e Sohl de pHPT102 para gerar pHPT115. Um fragmento de terminador de cbhl de 1,3 kb foi amplificado com Pwo polimerase de pCBITa usando um prímer que fortalece a região 3' não-transladada de cbhl (bp 1864-1899 da seqüência de cbhl publicada) contendo um local de Kpn 1 em bp 1877-1882 e o prímer re- verso pUC (Cat. N°. 18432-013. Gibco/BRL) que se fortalece a jusante do local de EcoRI no terminal 3' do terminador de cbhl em pCBITa. O produto de PCR de terminador de cbhl foi digerido com Kpn 1 e inserido no local único de Kpn 1 de pHPT115, para gerar o plasmídeo de cassete de seleção pHPT1136. Para produzir o vetor de transformação, o cassete de expressão de 5,8 kb compreendendo uma região 5' distai do promotor de xln2, bp-1399 a .204 do promotor de cbhl, bp-121 a +99 do promotor de xln2 e peptídeo de sinal de secreção, a região de codificação para a β-glicosidase/fusão de CBD1 e o terminador de cbh2 foi isolado de pC/XBg-CBD por digestão com Not1, agrupamento do local Notl com Klenow DNA polimerase, e digestão com Spe 1. Este fragmento de Spe1/Not1 de 5,8 kb foi inserido entre o único casse- te de secreção de hph de PHPT136 a montante que tinha sido digerido com Xho1, agrupado com Klenov DNA polimerase e digerido com Xbal (Spel e Xba 1 têm projeções compatíveis). O vetor de transformação final, pC/XBg- CBD-TV, foi Iinearizado no local único de Notl no terminal 3' do terminador de cbh 1 no cassete de seleção de hph, e introduzido como um vetor linear em T. reeseiBTR213, via bombardeio de microprojétil conforme descrito abaixo. .5.3 Transformação de T. reeseiBTR213 via bombardeio de microprojétil

O sistema Biolistic PDS-1000/He (BioRad; Ε. I. DuPont de Ne- mours and Company) foi usado para transformar esporos de cepa de T. reesei BTR213, e todos os procedimentos foram realizados conforme recomendado pelo fabricante. Partículas de tungstênio M-10 (diâmetro médio de 0,7 um) fo- ram usadas como microtransportadores. Os seguintes parâmetros foram usa- dos na otimização da transformação: uma pressão de ruptura de 7584,23 KPa (1100 psi), uma pressão de hélio de 29 mm Hg, uma distância de folga de 0,95 cm, uma distância de curso de macrotransportador de 16 mm, e uma distância alvo de 9 cm. Placas foram preparadas com 1 χ 106 esporos de meio Ágar de Dextrose de Batata (PDA). As placas bombardeadas foram incubadas a 28°C. Quatro horas de pós-bombardeio, os esporos são submetidos à seleção primá- ria pelo revestimento de meio de PDA seletivo suplementado com 40 unida- des/mL de HygB. As placas de bombardeio são incubadas a 28°C. Os trans- formantes podem ser observados após 3-6 dias de crescimento; contudo, incu- bação adicional é necessária para alcançar esporulação.

Após a esporulação ter ocorrido, um processo de seleção se- cundária é realizado para isolar os transformantes individuais. Os esporos são coletados da placa com um circuito de inoculação e ressuspensos em água estéril. Esta suspensão é, em seguida, filtrada através de uma seringa estéril tampada com microfibras de vidro. Isto permite a passagem de espo- ros, enquanto retém micélios indesejados. Uma determinação da concentra- ção de esporos nesta suspensão é requerida, e diluições subsequentes são colocadas nas placas de PDA suplementadas com 0,75% de Oxgall (Difco) e HygB (20 unidades/mL) para obter 20-50 esporos por placa. O Oxgall age como um restritor de colônia, permitindo, desse modo, o isolamento de colô- nias individuais nestas placas de seleção secundárias. As colônias isoladas podem ser observadas após 2-3 dias.

5.4 Produção de β-glicosidase em culturas líquidas

Colônias individuais de Trichoderma são transferidas para pla- cas de PDA para a propagação de cada cultura. Esporulação é necessária para a inoculação uniforme de frascos de sacudir que são usados no teste da capacidade da cultura produzir a β-glicosidase e celulase. O meio de cul- tura é composto do seguinte:

Tabela 2: Componentes do meio de cultura

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*A solução de elementos de traço contém 5 g/L de FeS04.7H20; 1,6 g/L de MnSO4-H2O; 1,4 g/L de ZnS04.7H20.

**5 g/L de glicose mais 10 g/L de floco Solka (quando o cbhl ou outro pro- motor de celulase é usado). 10 g/L de xylan (quando o promotor de xln2 é usado), ou outra fonte de carbono compatível com o promotor direcionando a expressão da β-glicosidase. A fonte de carbono pode ser esterilizada se- paradamente como uma solução aquosa em pH 2, e adicionada ao meio remanescente.

O volume líquido por frasco de 1 litro é 150 mL, o pH inicial é 5,5, e cada frasco é esterilizado por autoclave de vapor por 30 minutos a 121 cC antes da inoculação.

Para ambas as células nativas e transformadas, os esporo são isolados das placas de PDA conforme descrito na Seção 5.3 acima, e 1-2 χ 106 esporos são usados para inocular cada frasco. Os frascos são sacudidos a 200 rpm a uma temperatura de 28°C por um período de 6 dias. O filtrado contendo a proteína secretada foi coletado por filtração através de filtros de microfibra de vidro GF/A (Whatman). A concentração de proteína é determi- nada usando-se o Ensaio de Proteína Bio-Rad (Cat. N0 500-0001) usando- se Trichoderma celulase como um padrão. A atividade de β-glicosidase é determinada conforme descrito em Ghose, 1987.

5.5 Produção de β-glicosidase por cepas de T. reesei BTR213 e 1059 usan- do-se fonte de carbono de floco Solka

A cepa nativa BTR213 e a cepa transformada a partir deste hos- pedeiro 1059A foram cultivadas usando-se os procedimentos do Exemplo 5D com 10 g/L de floco Solka e 5 g/L de glicose como fontes de carbono. Os resultados são mostrados na tabela 2.

A cepa nativa produziu 0,19 IU de β-glicosidase por mg de prote- ína.

O transformante 1059A que expressa a β-glicosidase/fusão de CBD a partir do promotor de cbhl e sinal de secreção de xln2 produziu 7,6 lU/mg de β-glicosidase. Isto representa um aumento de 40 vezes sobre a cepa nativa, que representa a vasta maioria da β-glicosidase.

Tabela 3: Produção de atividade de β-glicosidase de cepas de T. reesei B- TR213 e 1059A em culturas com frasco de 150 mL

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Claims

1. Composição de enzima para a hidrólise enzimática de celulo- se para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose a partir de um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, a composição de enzima compreendendo enzimas celulase, uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase e um agente de ligação para ligação da enzima β-glicosidase ao estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, no qual a hidrólise é efetuada por: (i) hidrolisação parcial de uma pasta fluida aquosa do estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado com a composição de enzima para produzir uma pasta fluida hidrosilada compreendendo glicose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes, e sólidos de fibra não-hidrosilados compreendendo celulose e lignina; (ii) separação dos sólidos de fibra não-hidrosilados a partir da pasta fluida hidrosilada para produzir sólidos de fibra separados, no qual as enzimas celulase e a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase se li- gam aos sólidos de fibra separados; (iii) ressuspensão dos sólidos de fibra separados em uma solu- ção aquosa para produzir uma pasta fluida ressuspensa; e (iv) continuação da hidrólise da pasta fluida ressuspensa para produzir o produto de hidrólise compreendendo glicose.

2. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 1, na qual o agente de ligação é um módulo de ligação de carboidrato operavel- mente ligado a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase.

3. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 2, na qual o módulo de ligação de carboidrato é um domínio de ligação de celulo- se.

4. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 1, na qual as enzimas celulase são produzidas por Aspergillus, Humicola, Tricho- derma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destas.

5. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 4, na qual as enzimas celulase são produzidas por Trichoderma.

6. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 1, na qual a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase é produzida por As- pergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combina- ção destas.

7. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 6, na qual a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase é produzida por Tri- choderma ou AspergMus.

8. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 3, na qual o domínio de ligação de celulose é um domínio de ligação de celulose de Família I.

9. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 3, na qual o domínio de ligação de celulose é um domínio de ligação de celulose bacteriana ou fúngica.

10. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 3, na qual a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase compreende um Iigan- te que liga operavelmente o domínio de ligação de celulose à enzima β- glicosidase.

11. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 1, na qual a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase está ocorrendo natu- ralmente.

12. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 1, na qual a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase é uma proteína de fusão geneticamente modificada.

13. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 3, na qual cerca de 75% a cerca de 100% (p/p) da enzima β-glicosidase total pre- sentes na composição de enzima compreendem um domínio de ligação de celulose.

14. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 13, na qual cerca de 90% a cerca de 100% (p/p) da enzima β-glicosidase total presentes na composição de enzima compreendem um domínio de ligação de celulose.

15. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 1, na qual as enzimas celulase compreendem uma enzima celobio-hidrolase sele- cionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase CBHI e CBHII, e combinações destas, e uma enzima endoglucanase selecionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase EGI1 EGII, EGIII, EGIV1 EGV1 e combinações destas.

16. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 1, na qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), cerca de 75% a cerca de 100% (p/p) das enzimas celulase totais presentes na composição de enzima se ligam aos sólidos de fibra presentes na pasta fluida aquosa.

17. Uso de uma composição de enzima para a hidrólise enzimá- tica de celulose para produzir um produto de hidrólise compreendendo glico- se a partir de um estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, a com- posição de enzima compreendendo enzimas celulase, uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase e um agente de ligação para ligação da enzima β- glicosidase ao estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, na qual o uso da composição de enzima compreende: (i) hidrolisação parcial de uma pasta fluida aquosa do estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado com a composição de enzima para produzir uma pasta fluida hidrosilada compreendendo glicose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes, e sólidos de fibra não-hidrosilados compreendendo celulose e lignina; (ii) separação dos sólidos de fibra não-hidrosilados a partir da pasta fluida hidrosilada para produzir sólidos de fibra separados, na qual as enzimas celulase e a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase se Ii- gam aos sólidos de fibra separados; (iii) ressuspensão dos sólidos de fibra separados em uma solu- ção aquosa para produzir uma pasta fluida ressuspensa; e (iv) continuação da hidrólise da pasta fluida ressuspensa para produzir o produto de hidrólise compreendendo glicose.

18. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 17, no qual o agente de ligação é um módulo de ligação de carboidrato operavelmente ligado a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase.

19. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 18, no qual o módulo de ligação de carboidrato é um domínio de ligação de celulose.

20. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 17, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), as enzimas celu- lase são produzidas por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Ther- mobifida, ou uma combinação destas.

21. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 20, no qual as enzimas celulase são produzidas por Trichoderma.

22. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 17, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase é produzida por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destas.

23. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 22, no qual a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase é produzi- da por Trichoderma ou Aspergillus.

24. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 19, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), o domínio de ligação de celulose é um domínio de ligação de celulose de Família I.

25. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 19, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), o domínio de ligação de celulose é um domínio de ligação de celulose bacteriana ou fún- gica.

26. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 19, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase compreende um Iigante que liga opera- velmente o domínio de ligação de celulose à enzima β-glicosidase.

27. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 17, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase está ocorrendo naturalmente.

28. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 19, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase é uma proteína de fusão geneticamente modificada.

29. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 19, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), cerca de 75% a cerca de 100% (p/p) da enzima β-glicosidase total presentes na composição de enzima compreendem um domínio de ligação de celulose.

30. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 29, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), cerca de 90% a cerca de 100% (p/p) da enzima β-glicosidase total presentes na composição de enzima compreendem um domínio de ligação de celulose.

31. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 17, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), as enzimas celu- Iase compreendem uma enzima celobio-hidrolase selecionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase CBHI e CBHII, e combinações des- tas, e uma enzima endoglucanase selecionada a partir do grupo consistindo em enzimas celulase EGI, EGII, EGIII, EGIV, EGV1 e combinações destas.

32. Uso da composição de enzima, de acordo com a reivindica- ção 17, no qual, na etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), cerca de 75% a cerca de 100% (p/p) das enzimas celulase totais presentes na composição de enzima se ligam aos sólidos de fibra presentes na pasta fluida aquosa.

33. Processo para a hidrólise enzimática de celulose com uma composição de enzima compreendendo enzimas celulase, uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase e um agente de ligação para ligação da en- zima β-glicosidase ao estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado, para produzir um produto de hidrólise compreendendo glicose de um esto- que de alimentação lignocelulósico pré-tratado, o processo compreendendo: (i) hidrolisação parcial de uma pasta fluida aquosa do estoque de alimentação lignocelulósico pré-tratado com a composição de enzima para produzir uma pasta fluida hidrosilada compreendendo glicose, oligômeros de glicose, ou uma combinação destes, e sólidos de fibra não-hidrosilados compreendendo celulose e lignina; (ii) separação dos sólidos de fibra não-hidrosilados a partir da pasta fluida hidrosilada para produzir sólidos de fibra separados, nos quais as enzimas celulase e a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase se ligam aos sólidos de fibra separados; (iii) ressuspensão dos sólidos de fibra separados em uma solu- ção aquosa para produzir uma pasta fluida ressuspensa; e (iv) continuação da hidrólise da pasta fluida ressuspensa para produzir o produto de hidrólise compreendendo glicose.

34. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual o agen- te de ligação é um módulo de ligação de carboidrato operavelmente ligado a uma ou mais do que uma enzima β-glicosidase.

35. Processo, de acordo com a reivindicação 34, no qual o mó- dulo de ligação de carboidrato é um domínio de ligação de celulose.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a pasta fluida aquosa tem um teor de sólidos de fibra suspensos ou não-dissolvidos de cerca de 3% a cerca de -30% (p/p).

37. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual os sóli- dos de fibra não-hidrosilados são separados por microfiltração, centrifuga- ção, filtração a vácuo, ou filtração por pressão.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 37, no qual os sóli- dos não-hidrosilados são separados por microfiltração.

39. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual a pasta fluida aquosa é concentrada antes da etapa de hidrolisação parcial (etapa0))·

40. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual o pro- cesso é efetuado em um sistema de hidrólise compreendendo um ou mais do que um reator de hidrólise selecionado a partir do grupo consistindo em um tanque agitado, um tanque não-misturado, uma torre agitada, e uma tor- re não-misturada.

41. Processo, de acordo com a reivindicação 40, no qual a torre agitada é uma torre de fluxo ascendente.

42. Processo, de acordo com a reivindicação 40, no qual a torre não-misturada é uma torre de fluxo ascendente.

43. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual o pro- cesso é um processo em batelada.

44. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual o pro- cesso é um processo contínuo.

45. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, cerca de 70% a cerca de 100% de celulose da pasta fluida aquosa são convertidos em glicose.

46. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual uma corrente compreendendo glicose produzida na etapa (i) é combinada com uma corrente compreendendo glicose produzida na etapa (iv), para produzir uma corrente de açúcar combinada.

47. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), o estoque de alimentação Iignocelu- lósico pré-tratado é obtido de palha de trigo, palha de aveia, palha de ceva- da, palha de milho, palha de forragem, palha de feijão-soja, palha de canola, palha de arroz, cana de açúcar, bagaço, palha de vara, grama de capim de corda, grama de corda, ou miscanthus.

48. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), as enzimas celulase são adicionadas a uma dosagem de cerca de 1,0 a cerca de 40,0 IU por grama de celulose.

49. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a uma ou mais do que uma enzima β- glicosidase é adicionada a uma dosagem de 35 a cerca de 200 IU por grama de celulose.

50. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), as enzimas celulase são produzidas por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destas.

51. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), a enzima β-glicosidase é produzida por Aspergillus, Humicola, Trichoderma, Bacillus, Thermobifida, ou uma combinação destas.

52. Processo, de acordo com a reivindicação 51, no qual a en- zima β-glicosidase é produzida por Aspergillus ou Trichoderma.

53. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual a etapa de continuação da hidrólise (etapa (iv)) é efetuada por cerca de 12 a cerca de 200 horas.

54. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual a etapa de hidrolisação parcial (etapa (i)) é efetuada por cerca de 12 a cerca de cer- ca de 24 horas.

55. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (i)), cerca de 75% a cerca de 100% (p/p) das enzimas celulase totais presentes se ligam aos sólidos de fibra presen- tes na pasta fluida aquosa.

56. Processo, de acordo com a reivindicação 33, no qual, na e- tapa de hidrolisação parcial (etapa (iii)), a solução aquosa é uma água de processo.