BR112017005914B1 - Processo para produção de etanol, e, organismo fermentador transgênico - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, E, ORGANISMO FERMENTADOR RECOMBINANTE. A presente invenção se relaciona com processos para produzir etanol compreendendo sacarificação do material celulósico com uma composição de enzimas celulolíticas e fermentação do material celulósico sacarificado com um microrganismo fermentador para produzir etanol. O organismo fermentador é Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA) ou um organismo fermentador que tem propriedades que são as mesmas ou semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260

Description

ÁREA DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se relaciona a processos melhorados para a produção de etanol de material celulósico e organismos fermentadores melhorados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O etanol é um combustível usado em transportes normalmente em mistura com gasolina. Material celulósico é utilizado como matéria-prima nos processos de produção de etanol. Existem vários processos na técnica para fazer hidrolisados de celulose e hemicelulose contendo glucose, manose, xilose e arabinose. A glucose e manose são convertidas eficientemente para etanol durante o metabolismo anaeróbico natural. De longe o microrganismo mais eficiente produzindo etanol é a levedura Saccharomyces cerevisiae. No entanto, a Saccharomyces cerevisiae não tem as enzimas para converter o principal açúcar xilose em xilulose e é incapaz de assim utilizar xilose como fonte de carbono. Para fazê-lo é necessário a manipulação genética da Saccharomyces cerevisiae para expressar enzimas que podem converter xilose em xilulose. Uma das enzimas necessárias é a xilose isomerase (E.C. 5.3.1.5) que converte a xilose em xilulose, que pode ser então convertida em álcool durante a fermentação pela Saccharomyces cerevisiae.

[003] WO 2003/062430 divulga que a introdução de uma xilose isomerase (XI) funcional de Piromyces em Saccharomyces cerevisiae permite o metabolismo lento da xilose através da xiluloquinase endógena (EC 2.7.1.17) codificada por XKS1 e as enzimas da parte não oxidativa da via das pentose fosfato e confere aos transformantes da levedura a capacidade para crescer em xilose.

[004] A patente dos EUA no. 8,586,336-B2 divulga uma estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae expressando uma xilose isomerase obtida por fluido ruminal bovino. A estirpe de levedura pode ser utilizada para produzir etanol através da cultura sob condições anaeróbias de fermentação.

[005] Apesar da melhoria significativa de processos de produção de etanol a partir de material celulósico ao longo da última década existe ainda um desejo e necessidade de proporcionar processos melhorados. Para produzir etanol economicamente é necessário um organismo fermentador que é biologicamente eficiente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção se relaciona também com processos de produção de etanol, compreendendo: (a) sacarificação de um material celulósico com uma composição enzimática celulolítica; (b) fermentação do material celulósico sacarificado com um microrganismo fermentador para produzir etanol; em que o organismo fermentador é Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA) ou uma estirpe do organismo fermentador com propriedades que são semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260.

[007] Em uma modalidade preferencial, o processo compreende a recuperação do etanol a partir da fermentação.

[008] Em uma modalidade, o inoculo de célula de levedura está entre 0,1 e 20 g DWC de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 /L de meio de fermentação, tal como 0,2-10: g/L, preferencialmente 0,3-5 g/L, tal como 0,4 g/L, tal como cerca de 1 g DWC/L ou cerca de 2 g DWC/L.

[009] Em outro aspecto, a invenção se refere a organismos fermentadores recombinantes com propriedades que são as mesmas de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260.

[0010] Em uma modalidade preferencial, o organismo fermentador da presente invenção com propriedades que são aproximadamente as mesmas de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 tem uma ou mais, tal como todas, das seguintes propriedades: - maior consumo de xilose em comparação com BSGX001 após 48 horas de fermentação a 1 g de DWC/L, 35 °C, pH 5,5, em particular, como descrito no Exemplo 3; - maior consumo de glucose em comparação com BSGX001 após 48 horas de fermentação a 1 g de DWC/L, 35 °C, pH 5,5, em particular, como descrito no Exemplo 3; - maior produção de etanol em comparação com BSGX001 após 48 horas de fermentação a 1 g de DWC/L, 35 °C, pH 5,5, em particular, como descrito no Exemplo 3.

[0011] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção compreende um gene codificando a sequência de aminoácidos com atividade de xilose isomerase mostrada em SEQ ID NO: 2 em US 8586336B2 ou SEQ ID NO: 13 do presente documento, ou uma sequência de aminoácidos sendo pelo menos 80%, tal como com pelo menos 85%, tal como com pelo menos 90%, tal como com pelo menos 95%, tal como com pelo menos 96%, tal como com pelo menos 97%, tal como com pelo menos 98%, tal como com pelo menos 99%, tal como 100% de identidade com a SEQ ID NO: 2 em US 8586336B2 ou SEQ ID NO: 13 deste documento. O gene no organismo fermentador codificando a xilose isomerase pode ser o mostrado em SEQ ID NO: 1 da patente EUA No. 8,586,336-B2 (a qual é deste modo incorporada por referência) ou SEQ ID NO: 20 do presente documento ou uma sequência tendo pelo menos 80%, tal como com pelo menos 85%, tal como com pelo menos 90%, tal como com pelo menos 95%, tal como com pelo menos 96%, tal como com pelo menos 97%, tal como com pelo menos 98%, tal como com pelo menos 99%, tal como 100% de identidade com a mesma.

[0012] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção tem uma ou mais, tais como todas, das seguintes modificações genéticas: - gene de xilose isomerase (Ru-XI) obtido a partir de fluido ruminal bovino, em particular o mostrado em SEQ ID NO: 20 deste documento, codificando a xilose isomerase apresentada na SEQ ID NO: 13 deste documento; - opcionalmente um gene transportador de pentose (GXF1) de Candida intermedia, em particular o mostrado em SEQ ID NO: 18; - gene da xiluloquinase (XKS), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da ribulose-5-fosfato 3-epimerase (RPE1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da ribulose-5-fosfato isomerase (RKI1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da transcetolase (TKL1) e gene da transaldolase (TAL1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae;

[0013] Em uma modalidade específica, o organismo fermentador é Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] Fig. 1 mostra um mapa plasmídico do plasmídeo pYIE2- mgXI-GXF1-delta albergando as cassetes de expressão mgXI e GXF.

[0015] Fig. 2 mostra um mapa plasmídico do plasmídeo utilizado pSH47-hyg.

[0016] Fig. 3 mostra um mapa do plasmídeo resultante pYIE2-XKS1- PPP-δ.

[0017] Fig. 4 mostra uma comparação da fermentação de CIBTS1260 versus BSGX001 em Hidrolisado de Palha de Milho Pré-tratada com Ácido no NREL a 1 g DCW/L de inoculo de levedura, 35 °C, pH 5,5, em 72 horas.

[0018] Fig. 5 mostra uma comparação de Saccharomyces cerevisiae vs. BSGX001 em meio modelo: 2/L de inoculo de levedura, 32 °C, pH 5,5, 72 horas.

[0019] Fig. 6 mostra uma comparação da fermentação da Composição de Enzima Celulolítica CA e Composição de Enzima Celulolítica CB do hidrolisado de bagaço gerado com CIBTS1260 a 1 g/L de inoculo de levedura em 72 horas.

[0020] FIG. 7 mostra a percentagem de redução da concentração de DP2 durante a fermentação de hidrolisados gerados com Celulase CA ou CB a 1g/L de inoculo de levedura, 35 °C, pH 5,5, 72 horas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0021] A presente invenção proporciona processos melhorados para a produção de etanol de material lignocelulósico usando um organismo fermentador.

Definições

[0022] Atividade Auxiliar 9: O termo "Atividade Auxiliar 9" ou "AA9" significa um polipeptídeo classificado como uma monooxigenase lítica de polissacarídeo (Quinlan et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 208: 15079-15084; Phillips et al., 2011, ACS Chem. Biol. 6: 1399-1406; Lin et al., 2012, Structure 20: 1051-1061). Os polipeptídeos AA9 foram previamente classificados na Família 61 das glicosídeo hidrolases (GH61) de acordo com Henrissat, 1991, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Biochem. J. 316: 695-696.

[0023] Os polipeptídeos AA9 intensificam a hidrólise de um material celulósico por uma enzima tendo atividade celulolítica. A atividade celulolítica aumentada pode ser determinada por medição do aumento em açúcares redutores ou do aumento do total de celobiose e glucose da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em palha de milho pré-tratada (PCS), em que a proteína total é compreendida por proteína de enzima celulolítica a 50-99,5% p/p e proteína de um polipeptídeo AA9 a 0,5-50% p/p durante 1-7 dias a uma temperatura adequada, tal como 40 °C-80 °C, p.ex., 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, ou 70 °C, e um pH adequado, tal como 4 a 9, p.ex., 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, ou 8,5, em comparação com uma hidrólise de controle com igual carga de proteína total sem atividade celulolítica intensificadora (150 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS).

[0024] A atividade intensificadora do polipeptídeo AA9 pode ser determinada usando uma mistura de CELLUCLAST™ 1.5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) e beta-glucosidase como a fonte da atividade celulolítica, em que a beta-glucosidase está presente a um peso de pelo menos 2-5% de proteína da carga de proteína de celulase. Em um aspecto, a beta-glucosidase é uma beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (p.ex., recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014). Em outro aspecto, a beta-glucosidase é uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae como descrito em WO 02/095014).

[0025] A atividade intensificadora do polipeptídeo AA9 pode ser também determinada por incubação de um polipeptídeo AA9 com celulose inchada com ácido fosfórico (PASC) a 0,5%, acetato de sódio a 100 mM pH 5, MnSO4 a 1 mM, ácido gálico a 0,1%, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus a 0,025 mg/mL, e TRITON® X-100 (4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol) a 0,01% durante 24-96 horas a 40 °C seguido por determinação da glucose liberada da PASC.

[0026] A atividade intensificadora do polipeptídeo AA9 pode ser também determinada de acordo com WO 2013/028928 para composições a temperatura elevada.

[0027] Os polipeptídeos AA9 intensificam a hidrólise de um material celulósico catalisada por enzimas tendo atividade celulolítica por redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para se alcançar o mesmo grau de hidrólise, preferencialmente pelo menos 1,01 vezes, p.ex., pelo menos 1,05 vezes, pelo menos 1,10 vezes, pelo menos 1,25 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[0028] Beta-glucosidase: O termo "beta-glucosidase" significa uma beta-D-glucosídeo glucohidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glucose não redutores terminais com a liberação de betaD-glucose. A atividade de beta-glucosidase pode ser determinada usando p- nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 μmole de ânion p- nitrofenolato produzida por minuto a 25°C, pH 4,8 a partir de p-nitrofenil- beta-D-glucopiranosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 50 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01%.

[0029] Beta-xilosidase: O termo "beta-xilosidase" significa uma beta- D-xilosídeo xilohidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta (1^4)-xilo-oligossacarídeos curtos para remover resíduos de D-xilose sucessivos de terminais não redutores. A atividade de beta-xilosidase pode ser determinada usando p-nitrofenil-beta-D-xilosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 100 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01% a pH 5, 40°C. Uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 μmole de ânion p- nitrofenolato produzida por minuto a 40°C, pH 5 a partir de p-nitrofenil-beta- D-xilosídeo a 1 mM em citrato de sódio a 100 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01%.

[0030] Catalase: O termo "catalase" significa uma peróxido de hidrogênio:peróxido de hidrogênio oxidorreductase (EC 1.11.1.6) que catalisa a conversão de 2 H2O2 para O2 + 2 H2O. Para propósitos da presente invenção, a atividade de catalase é determinada de acordo com a Patente dos EUA No. 5,646,025. Uma unidade de atividade de catalase iguala a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de 1 μmole de peróxido de hidrogênio sob as condições de ensaio.

[0031] Celobiohidrolase: O termo "celobiohidrolase" significa uma 1,4-beta-D-glucana celobiohidrolase (E.C. 3.2.1.91 e E.C. 3.2.1.176) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo- oligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glucose ligado em beta-1,4, liberando celobiose da extremidade redutora (celobiohidrolase I) ou extremidade não redutora (celobiohidrolase II) da cadeia (Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade de celobiohidrolase pode ser determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581.

[0032] Composição de enzima celulolítica ou celulase: O termo "composição de enzima celulolítica" ou "celulase" significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobiohidrolase(s), beta-glucosidase(s), ou suas combinações. As duas abordagens básicas para medição da atividade de enzima celulolítica incluem: (1) medição da atividade de enzima celulolítica total, e (2) medição das atividades de enzimas celulolíticas individuais (endoglucanases, celobiohidrolases e beta-glucosidases) como revisto em Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade de enzima celulolítica total pode ser medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman N°1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum de atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman N°1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[0033] A atividade de enzima celulolítica pode ser determinada por medição do aumento na produção/liberação de açúcares durante hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em palha de milho pré-tratada PCS (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 37 dias a uma temperatura adequada tal como 40 °C-80 °C, p.ex., 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, ou 70 °C, e um pH adequado tal como 4-9, p.ex., 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, ou 7,0, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína de enzima celulolítica. Condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5% (peso seco), acetato de sódio a 50 mM pH 5, MnSO4 a 1 mM, 50°C, 55°C, ou 60°C, 72 horas, análise de açúcares por cromatografia em coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

[0034] Material celulósico: O termo "material celulósico" significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemicelulose, e o terceiro é pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula ter parado de crescer, contém também polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e assim uma beta-(1-4)-D- glucana linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanas, xiloglucanas, arabinoxilanas, e mananas em complexas estruturas ramificadas com um espectro de substituintes. Embora geralmente polimorfa, a celulose é encontrada em tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glucana. As hemiceluloses estão usualmente ligadas por hidrogênio a celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

[0035] A celulose é geralmente encontrada, por exemplo, nos caules, folhas, peles, cascas, e sabugos de plantas ou folhas, ramos, e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não está limitado a, resíduos agrícolas, material herbáceo (incluindo culturas energéticas), resíduos sólidos urbanos, resíduos de fábricas de pasta celulósica e papel, resíduos de papel, e madeira (incluindo resíduos de silvicultura) (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), páginas 105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor executivo, Volume 65, páginas 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). É entendido aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material das paredes celulares vegetais contendo lignina, celulose, e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto, o material celulósico é qualquer material de biomassa. Em outro aspecto, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses e lignina.

[0036] Em uma modalidade, o material celulósico é resíduos agrícolas, material herbáceo (incluindo culturas energéticas), resíduos sólidos municipais, polpa e resíduos de fábrica de papel, ou madeira (incluindo resíduos de silvicultura).

[0037] Em outra modalidade, o material celulósico é cana-do-reino, bagaço, bambu, sabugo de milho, fibra de milho, palha de milho, miscanto, palha de arroz, grama, ou palha de trigo.

[0038] Em outra modalidade, o material celulósico é choupo, eucalipto, abeto, pinheiro, álamo, espruce ou salgueiro.

[0039] Em outra modalidade, o material celulósico é celulose de algas, celulose bacteriana, línter de algodão, papel de filtro, celulose microcristalina (p.ex., AVICEL®), ou celulose tratada com ácido fosfórico.

[0040] Em outra modalidade, o material celulósico é uma biomassa aquática. Como usado aqui, o termo "biomassa aquática" significa biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode consistir em algas, plantas emergentes, plantas de folhas flutuantes, ou plantas submersas.

[0041] O material celulósico pode ser usado como tal ou pode ser sujeito a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, como descrito aqui. Em um aspecto preferencial, o material celulósico é pré-tratado.

[0042] Endoglucanase: O termo "endoglucanase" significa uma 4- (1,3;1,4)-beta-D-glucana 4-glucanohidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endohidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetilcelulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3-1,4 glucanas mistas tais como beta-D-glucanas ou xiloglucanas de cereais, e outro material vegetal contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinado por um ensaio de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). A atividade de endoglucanase pode ser também determinada usando carboximetilcelulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40°C.

[0043] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo "enzima hemicelulolítica" ou "hemicelulase" significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Current Opinion In Microbiology 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes-chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoíl esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase, e uma xilosidase. Os substratos para estas enzimas, hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando-as em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente anexadas à lignina, formando em conjunto com celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura e organização variáveis de hemiceluloses requerem a ação concertada de muitas enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos das hemicelulases são ou glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam ligações glicosídicas, ou carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações de éster de grupos secundários de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia da sua sequência primária, podem ser atribuídos a famílias GH e CE. Algumas famílias, com um dobramento global similar, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (p.ex., GH-A). Uma classificação muito informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752, a uma temperatura adequada tal como 40 °C-80 °C, p.ex., 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, ou 70 °C, e a um pH adequado tal como 4-9, p.ex., 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, ou 7,0.

[0044] Palha de milho pré-tratada: O termo "Palha de Milho Pré- tratada" ou "PCS" significa um material celulósico derivado de palha de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento neutro, ou qualquer pré-tratamento conhecido na técnica.

[0045] Material contendo xilana: O termo "material contendo xilana" significa qualquer material compreendendo um polissacarídeo da parede celular de plantas contendo uma cadeia principal de resíduos de xilose ligados em beta-(1-4). As xilanas de plantas terrestres são heteropolímeros possuindo uma cadeia principal de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias curtas de carboidratos. Compreendem ácido D- glucurônico ou seu éter de 4-O-metila, L-arabinose, e/ou vários oligossacarídeos, compostos por D-xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose, e D-glucose. Os polissacarídeos do tipo xilana podem ser divididos em homoxilanas e heteroxilanas, que incluem glucuronoxilanas, (arabino)glucuronoxilanas, (glucurono)arabinoxilanas, arabinoxilanas e heteroxilanas complexas. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.

[0046] Nos processos da presente invenção, pode ser usado qualquer material contendo xilana. Em um aspecto preferencial, o material contendo xilana é material celulósico.

[0047] Atividade de degradação de xilana ou atividade xilanolítica: O termo "atividade de degradação de xilana" ou "atividade xilanolítica" significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilana. As duas abordagens básicas para medição da atividade xilanolítica incluem: (1) medição da atividade xilanolítica total, e (2) medição das atividades xilanolíticas individuais (p.ex., endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetilxilana esterases, feruloíl esterases e alfa-glucuronil esterases). O progresso recente em ensaios de enzimas xilanolíticas foi resumido em várias publicações incluindo Biely e Puchard, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86 (11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, FEBS Letters 580 (19): 4597-4601; Herrimann et al., 1997, Biochemical Journal 321: 375-381.

[0048] A atividade de degradação de xilana total pode ser medida por determinação dos açúcares redutores formados a partir de vários tipos de xilana, incluindo, por exemplo, xilanas de espelta de aveia, madeira de faia, e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilana corados liberados de várias xilanas covalentemente coradas. Um ensaio comum de atividade xilanolítica total é baseado na produção de açúcares redutores a partir de 4-O-metil glucuronoxilana polimérica como descrito em Bailey et al., 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23 (3): 257-270. A atividade de xilanase pode ser também determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01% e fosfato de sódio a 200 mM pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em fosfato de sódio a 200 mM pH 6.

[0049] A atividade de degradação de xilana pode ser determinada por medição do aumento na hidrólise de xilana de madeira de bétula (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, EUA) por enzima(s) de degradação de xilana sob as seguintes condições típicas: reações de 1 mL, substrato a 5 mg/mL (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio a 50 mM pH 5, 50°C, 24 horas, análise de açúcares usando ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH) como descrito por Lever, 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279.

[0050] Xilanase: O termo "xilanase" significa uma 1,4-beta-D-xilana- xilohidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanas. A atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01% e fosfato de sódio a 200 mM pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmole de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em fosfato de sódio a 200 mM pH 6.

[0051] Xilose Isomerase: O termo "Xilose Isomerase" ou "XI" significa uma enzima que pode catalisar D-xilose em D-xilulose in vivo, e converter D-glucose em D-frutose in vitro. Xilose isomerase é também conhecida como "glucose isomerase" e é classificada como E.C. 5.3.1.5. Como a estrutura da enzima é muito estável, a xilose isomerase é um dos bons modelos para estudar as relações entre a estrutura e as funções das proteínas (Karimaki et al., Protein Eng Des Sel, 12004, 17 (12):861-869). Além disso, o valor de aplicação industrial extremamente importante faz com que a xilose isomerase seja vista como enzima industrialmente importante como protease e amilase (Tian Shen et al., Microbiology Bulletin, 2007, 34 (2): 355-358; Bhosale et al., Microbiol Rev, 1996, 60 (2): 280-300). Os cientistas mantêm grande preocupação e realizaram uma extensa pesquisa sobre a xilose isomerase. Desde 1970, as aplicações da xilose isomerase têm focado na produção de xarope rico em frutose e etanol para combustível. Nos últimos anos, os cientistas descobriram que sob certas condições, a xilose isomerase pode ser utilizada para produzir muitos açúcares raros importantes, que são os materiais de produção na indústria farmacêutica, tais como ribose, manose, arabinose e lixose (Karlmaki et al., Protein Eng Des Se, 12004, 17 (12): 861-869). Estes achados trazem nova vitalidade na pesquisa sobre a xilose isomerase.

Processos Da Invenção

[0052] A presente invenção se relaciona também com processos de produção de etanol, compreendendo: (a) sacarificação de um material celulósico com uma composição enzimática celulolítica; (b) fermentação do material celulósico sacarificado com um microrganismo fermentador para produzir etanol; em que o organismo fermentador é Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260.

[0053] Em uma modalidade preferencial, o processo compreende a recuperação do etanol a partir do meio de fermentação.

[0054] O processamento do material celulósico de acordo com a presente invenção pode ser alcançado usando métodos convencionais na técnica. Além disso, os processos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer dispositivo convencional de processamento de biomassa configurado para operar de acordo com a invenção.

[0055] Sacarificação (isto é, hidrólise) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem mas não estão limitadas a hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultâneas (SSF); sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e cofermentação separadas (SHCF); hidrólise e cofermentação híbridas (HHCF).

[0056] A SHF usa passos de processo separados para primeiramente hidrolisar enzimaticamente o material celulósico em açúcares fermentáveis, p.ex., monômeros de glucose, celobiose, e pentose, e depois fermentar os açúcares fermentáveis em etanol. Na SSF, a hidrólise enzimática do material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em um passo (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., editor, Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). A SSCF envolve a cofermentação de múltiplos açúcares (Sheehan e Himmel, 1999, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). A HHF envolve um passo de hidrólise separado, e adicionalmente um passo de sacarificação e hidrólise simultâneas, que podem ser levadas a cabo no mesmo reator. Os passos em um processo de HHF podem ser levados a cabo a diferentes temperaturas, i.e., sacarificação enzimática a elevada temperatura seguida por SSF a uma temperatura mais baixa que o organismo da fermentação possa tolerar. É entendido aqui que qualquer método conhecido na técnica compreendendo pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma sua combinação, pode ser usado na prática dos processos da presente invenção.

[0057] Um dispositivo convencional pode incluir um reator agitado descontínuo alimentado, um reator agitado contínuo, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, e/ou um reator de coluna de fluxo de pistão contínuo (de Castilhos Corazza et al., 2003, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov e Sinitsyn, 1985, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu e Lee, 1983, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65). Tipos adicionais de reatores incluem reatores de leito fluidizado, de manta de fluxo ascendente, imobilizados, e reatores do tipo extrusora para hidrólise e/ou fermentação.

Pré-tratamento

[0058] Em uma modalidade, o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação no passo (a).

[0059] Na prática dos processos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para desagregar componentes de paredes celulares de plantas do material celulósico (Chandra et al., 2007, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 6793; Galbe e Zacchi, 2007, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Bioresource Technology 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Int. J. Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

[0060] O material celulósico pode ser também sujeito a redução do tamanho das partículas, crivagem, pré-embebição, umedecimento, lavagem, e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando métodos conhecidos na técnica.

[0061] Pré-tratamentos convencionais incluem, mas não estão limitados a, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão de fibras com amônia, pré-tratamento com organosolv, e pré-tratamento biológico. Pré- tratamentos adicionais incluem pré-tratamentos de percolação com amônia, ultrassons, eletroporação, micro-ondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítica, ozônio, líquido iônico, e irradiação gama.

[0062] Em uma modalidade preferencial, o material celulósico é pré- tratado antes da sacarificação (isto é, hidrólise) e/ou fermentação. O pré- tratamento é preferencialmente realizado antes da hidrólise. Alternativamente, o pré-tratamento pode ser levado a cabo simultaneamente com hidrólise por enzimas para liberar açúcares fermentáveis, tais como glucose, xilose, e/ou celobiose. Na maioria dos casos, o próprio passo de pré-tratamento resulta em alguma conversão da biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

[0063] Pré-tratamento com Vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para desagregar os componentes de paredes celulares de plantas, incluindo lignina, hemicelulose, e celulose para tornar a celulose e outras frações, p.ex., hemicelulose, acessíveis a enzimas. O material celulósico é passado por ou através de um reator onde é injetado vapor para aumentar a temperatura até à temperatura e pressão requeridas e é retido no mesmo durante o tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferencialmente realizado a 140-250 °C, p.ex., 160-200 °C ou 170- 190 °C, onde a gama de temperaturas ótimas depende da adição opcional de um catalisador químico. O tempo de residência para o pré-tratamento com vapor é preferencialmente 1-60 minutos, p.ex., 1-30 minutos, 1-20 minutos, 312 minutos, ou 4-10 minutos, onde o tempo de residência ótimo depende da temperatura e adição opcional de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite cargas de sólidos relativamente elevadas, de modo que o material celulósico é geralmente apenas umedecido durante o pré-tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão a vapor, isto é, expansão rápida até à pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área superficial acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Pedido de Patente dos EUA No. 2002/0164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos acetila de hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida somente de forma limitada.

[0064] Pré-tratamento Químico. O termo "tratamento químico" se refere a qualquer pré-tratamento químico que promova a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina. Um tal pré-tratamento pode converter celulose cristalina em celulose amorfa. Exemplos de processos de pré-tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, expansão de fibras/por congelamento com amônia (AFEX), percolação com amônia (APR), líquido iônico, e pré-tratamentos com organosolv.

[0065] Um catalisador químico tal como H2SO4 ou SO2 (tipicamente 0,3 a 5% p/p) é por vezes adicionado antes do pré-tratamento com vapor, o que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação, e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). No pré-tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com ácido diluído, tipicamente H2SO4, e água para formar uma pasta, aquecido por vapor até à temperatura desejada, e após um tempo de permanência expandido até à pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido diluído pode ser realizado com um número de desenhos de reatores, p.ex., reatores de fluxo de pistão, reatores contracorrente, ou reatores contracorrente contínuos com encolhimento do leito (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 133; Schell et al., 2004, Bioresource Technology 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115). Em uma modalidade específica, o pré-tratamento com ácido diluído de material celulósico é realizado utilizando ácido sulfúrico a 4% p/p a 180 °C durante 5 minutos.

[0066] Podem ser também usados vários métodos de pré-tratamento sob condições alcalinas. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não estão limitados a, pré-tratamento com hidróxido de sódio, cal, oxidação úmida, percolação com amônia (APR), e expansão de fibras/por congelamento com amônia (AFEX).

[0067] O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio a temperaturas de 85-150 °C e tempos de residência de 1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technology 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, e WO 2006/110901 divulgam métodos de pré-tratamento usando amônia.

[0068] A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200 °C durante 5-15 minutos com adição de um agente oxidante tal como peróxido de hidrogênio ou sobrepressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado com matéria seca a preferencialmente 1-40%, p.ex., matéria seca a 2-30% ou matéria seca a 5-20%, e frequentemente o pH inicial é aumentado por adição de alcalino tal como carbonato de sódio.

[0069] Uma modificação do método de pré-tratamento por oxidação úmida, chamada de explosão úmida (combinação de oxidação úmida e explosão a vapor) pode manipular matéria seca até 30%. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um certo tempo de permanência. O pré-tratamento é depois finalizado por expansão até à pressão atmosférica (WO 2006/032282).

[0070] A expansão de fibras com amônia (AFEX) envolve tratamento do material celulósico com amônia líquida ou gasosa a temperaturas moderadas tais como 90-150°C e elevada pressão tal como 17-20 bar durante 5-10 minutos, onde o conteúdo de matéria seca pode ser tão elevado quanto 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technology 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento por AFEX, a celulose e as hemiceluloses permanecem relativamente intatas. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

[0071] O pré-tratamento com organosolv deslignifica o material celulósico por extração usando etanol aquoso (etanol a 40-60%) a 160-200°C durante 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). Ácido sulfúrico é usualmente adicionado como um catalisador. No pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose e lignina é removida.

[0072] Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108: 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e Pedido Publicado EUA 2002/0164730.

[0073] Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferencialmente levado a cabo como um tratamento com ácido diluído, e mais preferencialmente como um tratamento contínuo com ácido diluído. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas também podem ser usados outros ácidos, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio, ou suas misturas. O tratamento com ácido fraco é conduzido na gama de pH de preferencialmente 1-5, p.ex., 1-4 ou 1-2,5. Em um aspecto, a concentração de ácido está na gama de preferencialmente 0,01 a 10% em peso de ácido, p.ex., 0,05 a 5% em peso de ácido ou 0,1 a 2% em peso de ácido. O ácido é contatado com o material celulósico e mantido a uma temperatura preferencialmente na gama dos 140-200°C, p.ex., 165-190°C, durante períodos variando de 1 a 60 minutos.

[0074] Em outro aspecto, o pré-tratamento tem lugar em uma pasta aquosa. Em aspectos preferenciais, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferencialmente entre 10-80% por peso, p.ex., 20-70% por peso ou 30-60% por peso, tal como cerca de 40% por peso. O material celulósico pré-tratado pode não ser lavado ou ser lavado usando qualquer método conhecido na técnica, p.ex., lavado com água.

[0075] Pré-tratamento Mecânico ou Pré-tratamento Físico: O termo “pré-tratamento mecânico” ou “pré-tratamento físico” se refere a qualquer pré-tratamento que promova redução do tamanho das partículas. Por exemplo, tal pré-tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (p.ex., moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com esferas vibratórias).

[0076] O material celulósico pode ser pré-tratado fisicamente (mecanicamente) e quimicamente. O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado com tratamento com vapor/explosão a vapor, hidrotermólise, tratamento com ácido diluído ou fraco, tratamento a elevada temperatura, elevada pressão, irradiação (p.ex., irradiação de micro-ondas), ou suas combinações. Em um aspecto, elevada pressão significa pressão na gama de preferencialmente cerca de 100 a cerca de 400 psi, p.ex., cerca de 150 a cerca de 250 psi. Em outro aspecto, elevada temperatura significa temperaturas na gama de cerca de 100 a cerca de 300°C, p.ex., cerca de 140 a cerca de 200°C. Em um aspecto preferencial, o pré-tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo descontínuo usando um sistema hidrolisador de pistola a vapor que usa elevada pressão e elevada temperatura como definido acima, p.ex., um Hidrolisador Sunds disponível da Sunds Defibrator AB, Suécia. Os pré-tratamentos físico e químico podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente, como desejado.

[0077] Em conformidade, em um aspecto preferencial, o material celulósico é sujeito a pré-tratamento físico (mecânico) ou químico, ou qualquer sua combinação, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina.

[0078] Pré-tratamento Biológico. O termo "pré-tratamento biológico" se refere a qualquer pré-tratamento biológico que promova a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina do material celulósico. Técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicação de microrganismos e/ou enzimas solubilizadores de lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., editores, ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., editor, Springer-Verlag Berlim Heidelberga, Alemanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Sacarificação

[0079] No passo de sacarificação (isto é, passo de hidrólise), o material celulósico, p.ex., pré-tratado, é hidrolisado para degradar celulose e/ou hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glucose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzimas celulolíticas. As enzimas das composições podem ser adicionadas simultaneamente ou sequencialmente.

[0080] A hidrólise enzimática é preferencialmente levada a cabo em um ambiente aquoso adequado sob condições que podem ser prontamente determinadas por um perito na técnica. Em um aspecto, a hidrólise é realizada sob condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), i.e., ótimas para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser levada a cabo como um processo descontínuo alimentado ou contínuo onde o material celulósico é gradualmente alimentado a, por exemplo, uma solução de hidrólise contendo enzimas.

[0081] A sacarificação é geralmente realizada em reatores ou fermentadores de tanque agitado sob condições controladas de pH, temperatura, e mistura. Condições adequadas de tempo de processo, temperatura e pH podem ser prontamente determinadas por um perito na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas tipicamente é realizada durante preferencialmente cerca de 12 a cerca de 120 horas, p.ex., cerca de 16 a cerca de 72 horas ou cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura se encontra na gama preferencialmente de cerca de 25°C a cerca de 70°C, p.ex., cerca de 30°C a cerca de 65°C, cerca de 40°C a cerca de 60°C, ou cerca de 50°C a cerca de 55°C. O pH se encontra na gama preferencialmente de cerca de 3 a cerca de 8, p.ex., cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6, ou cerca de 4,5 a cerca de 5,5. O conteúdo em sólidos secos se encontra preferencialmente na gama de cerca de 5 a cerca de 50% por peso, p.ex., cerca de 10 a cerca de 40% por peso ou cerca de 20 a cerca de 30% por peso.

[0082] A sacarificação na etapa (a) é realizada utilizando uma composição de enzimas celulolítica. Tais composições enzimáticas são descritas abaixo na seção "Composição de Enzimas Celulolíticas" abaixo. As composições de enzima celulolítica podem compreender qualquer proteína útil na degradação do material celulósico. Em um aspecto, a composição de enzimas celulolíticas compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (p.ex., várias) proteínas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo AA9 (GH61), uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma enzima ligninolítica, uma oxidorreductase, uma pectinase, uma protease e uma swolenina.

[0083] Em outro aspecto, a celulase é preferencialmente uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase.

[0084] Em outro aspecto, a hemicelulase é preferencialmente uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloíl esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase, e uma xilosidase. Em outro aspecto, a oxidorreductase é preferencialmente uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma catalase, uma lacase, e uma peroxidase.

[0085] As enzimas ou composições enzimáticas usadas em uns processos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células, um lisado celular com ou sem detritos celulares, uma preparação de enzimas semipurificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzimas pode ser um pó ou granulado seco, um granulado que não forma poeira, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas por adição de estabilizantes tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

[0086] Em um aspecto, uma quantidade eficaz de composição de enzima celulolítica ou hemicelulolítica em relação ao material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, p.ex., cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, ou cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g do material celulósico.

[0087] Em um aspecto, um tal composto é adicionado a uma razão molar do composto em relação a unidades glucosila de celulose de cerca de 10-6 a cerca de 10, p.ex., cerca de 10-6 a cerca de 7,5, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2,5, cerca de 10-6 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 10-1, cerca de 10-4 a cerca de 10-1, cerca de 10-3 a cerca de 10-1, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2. Em outro aspecto, uma quantidade eficaz de um tal composto é cerca de 0,1 μM a cerca de 1 M, p.ex., cerca de 0,5 μM a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 μM a cerca de 0,5 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,25 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,1 M, cerca de 5 μM a cerca de 50 mM, cerca de 10 μM a cerca de 25 mM, cerca de 50 μM a cerca de 25 mM, cerca de 10 μM a cerca de 10 mM, cerca de 5 μM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

[0088] O termo “licor” significa a fase de solução, aquosa, orgânica, ou uma sua combinação, proveniente do tratamento de um material de lignocelulose e/ou hemicelulose em uma pasta, ou seus monossacarídeos, p.ex., xilose, arabinose, manose, etc., sob condições como descrito em WO 2012/021401, e os seus conteúdos solúveis. Um licor para intensificação celulolítica de um polipeptídeo AA9 polipeptídeo GH61) pode ser produzido por tratamento de um material (ou matéria-prima) de lignocelulose ou hemicelulose por aplicação de calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, p.ex., ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com disrupção física do material, e depois separação da solução dos sólidos residuais. Tais condições determinam o grau de enriquecimento celulolítico obtenível através da combinação de licor e um polipeptídeo AA9 durante hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de enzimas celulolíticas. O licor pode ser separado do material tratado usando um método padrão na técnica, tal como filtração, sedimentação, ou centrifugação.

[0089] Em um aspecto, uma quantidade eficaz do licor em relação à celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10 g por g de celulose, p.ex., cerca de 10-6 a cerca de 7,5 g, cerca de 10-6 a cerca de 5 g, cerca de 10-6 a cerca de 2,5 g, cerca de 10-6 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-4 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-3 a cerca de 10-1 g, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2 g por g de celulose.

Fermentação

[0090] Os açúcares fermentáveis obtidos a partir do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (p.ex., vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares diretamente ou indiretamente em um produto da fermentação desejado. "Fermentação" ou "processo de fermentação" se refere a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo compreendendo um passo de fermentação. Processos de fermentação incluem também processos de fermentação usados na indústria do álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), indústria de lacticínios (p.ex., produtos lácteos fermentados), indústria do couro, e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e organismo fermentador e podem ser facilmente determinadas por um perito na técnica.

[0091] No passo de fermentação, açúcares liberados do material celulósico como resultado dos passos de pré-tratamento e hidrólise enzimática, são fermentados em um produto, p.ex., etanol, por um organismo fermentador, tal como uma levedura. A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas.

[0092] Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado no passo de fermentação na prática da presente invenção. O material é geralmente selecionado com base na economia, i.e., custos por potencial de açúcar equivalente, e recalcitrância para conversão enzimática.

[0093] O termo "meio de fermentação" é entendido aqui como se referindo a um meio antes de o(s) microrganismo(s) fermentador(es) ser(em) adicionado(s), tal como um meio resultante de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

Organismo Fermentador Da Invenção

[0094] Neste aspecto a invenção se relaciona a organismos fermentadores recombinantes capazes de converter hexoses e pentoses em etanol.

[0095] Em uma modalidade, a invenção se refere a organismos fermentadores recombinantes com propriedades que são as mesmas de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA) ou um organismo fermentador com propriedades que são semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260.

[0096] Em uma modalidade, o organismo fermentador com propriedades que são aproximadamente as mesmas de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 tem uma ou mais, tal como todas, das seguintes propriedades: - maior consumo de xilose em comparação com BSGX001 após 48 horas de fermentação a 1 g de DWC/L, 35 °C, pH 5,5, em particular, como descrito no Exemplo 3; - maior consumo de glucose em comparação com BSGX001 após 48 horas de fermentação a 1 g de DWC/L, 35 °C, pH 5,5, em particular, como descrito no Exemplo 3; - maior produção de etanol em comparação com BSGX001 após 48 horas de fermentação a 1 g de DWC/L, 35 °C, pH 5,5, em particular, como descrito no Exemplo 3.

[0097] Em uma modalidade, o organismo fermentador com propriedades que são semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 proporciona o consumo total de xilose por 48 horas de fermentação nas condições do processo no Exemplo 3, isto é, 1 g de DCW/L, 35 °C, pH 5,5.

[0098] Em uma modalidade, o organismo fermentador com propriedades que são semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 proporciona o consumo total de glucose por 24 horas de fermentação nas condições do processo no Exemplo 3, isto é, 1 g de DCW/L, 35 °C, pH 5,5.

[0099] Em uma modalidade, o organismo fermentador com propriedades que são semelhantes às de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 proporciona mais de 30 g/L de etanol, tal como mais de 40 g/L de etanol, tal como mais de 45 g/L de etanol, tal como como aproximadamente 47 g/L de etanol após 48 horas de fermentação nas condições do processo no Exemplo 3, isto é, 1 g DCW/L, 35 °C, pH 5,5.

[00100] Em uma modalidade preferencial, o organismo fermentador recombinante é Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA).

[00101] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção compreende um gene codificando uma sequência de aminoácidos com atividade de xilose isomerase mostrada em SEQ ID NO: 2 em US 8586336B2 ou SEQ ID NO: 13 do presente documento, ou uma sequência de aminoácidos sendo pelo menos 80%, tal como com pelo menos 90%, tal como com pelo menos 95%, tal como com pelo menos 96%, tal como com pelo menos 97%, tal como com pelo menos 98%, tal como com pelo menos 99%, tal como 100% de identidade com a SEQ ID NO: 2 em US 8586336B2 ou SEQ ID NO: 13 deste documento.

[00102] Em uma modalidade opcional, o organismo fermentador da invenção compreende um gene transportador de pentose, tal como um gene GFX, em particular GFX1 de Candida intermedia, p.ex., a sequência apresentada em SEQ ID NO: 18.

[00103] Em uma modalidade, o gene transportador de pentose compreendido no organismo fermentador tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 18 deste documento.

[00104] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção superexpressa um gene da xiluloquinase (XKS), em particular a partir de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae.

[00105] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção superexpressa um gene da ribulose-5-fosfato 3-epimerase (RPE1), em particular a partir de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae.

[00106] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção superexpressa um gene da ribulose-5-fosfato isomerase (RKI1), em particular a partir de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae.

[00107] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção superexpressa um gene da transcetolase (TKL1) e superexpressa um gene da transaldolase (TAL1), em particular a partir de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae.

[00108] Em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção tem uma ou mais, tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou todas, das seguintes modificações genéticas: - gene de xilose isomerase (Ru-XI) obtido a partir de fluido ruminal bovino, em particular o mostrado em SEQ ID NO: 20 deste documento, codificando a xilose isomerase apresentada na SEQ ID NO: 13 deste documento; - opcionalmente um gene transportador de pentose (GXF1) de Candida intermedia, em particular o mostrado em SEQ ID NO: 18; - gene da xiluloquinase (XKS), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da ribulose-5-fosfato 3-epimerase (RPE1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da ribulose-5-fosfato isomerase (RKI1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da transcetolase (TKL1) e gene da transaldolase (TAL1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae;

[00109] Por exemplo, em uma modalidade, o organismo fermentador da invenção tem as seguintes modificações genéticas: - gene de xilose isomerase (Ru-XI) obtido a partir de fluido ruminal bovino, em particular o mostrado em SEQ ID NO: 20 deste documento, codificando a xilose isomerase apresentada na SEQ ID NO: 13 deste documento; - gene da xiluloquinase (XKS), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da ribulose-5-fosfato 3-epimerase (RPE1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da ribulose-5-fosfato isomerase (RKI1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae; - gene da transcetolase (TKL1) e gene da transaldolase (TAL1), em particular de uma estirpe tipo de Saccharomyces cerevisiae;

Estimuladores da Fermentação

[00110] Pode ser usado um estimulador da fermentação em um processo da invenção descritos aqui para melhorar adicionalmente a fermentação e, em particular, o desempenho do organismo fermentador, tal como aumento da velocidade e rendimento do produto (p.ex., rendimento de etanol). Um "estimulador da fermentação" se refere a estimuladores do crescimento dos organismos fermentadores, em particular levedura. Estimuladores da fermentação preferenciais para o crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina, e Vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado por referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes compreendendo P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu.

Produtos de fermentação

[00111] O produto de fermentação da invenção é etanol.

Recuperação

[00112] O produto de fermentação, isto é, etanol, pode ser opcionalmente recuperado do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo mas não se limitando a cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação, ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. Pode ser obtido etanol com uma pureza até cerca de 96% por volume, que pode ser usado como, por exemplo, etanol para combustível, etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas neutras potáveis, ou etanol industrial.

ENZIMAS

[00113] As seções abaixo descrevem polipeptídeos, enzimas e composições enzimáticas que podem ser usadas em processos da invenção.

Composição de Enzimas Celulolíticas

[00114] De acordo com a invenção, uma composição de enzimas celulolíticas pode estar presente ou ser adicionada durante a sacarificação na etapa (a). Uma composição de enzimas celulolíticas é uma preparação de enzimas contendo uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase, celobiohidrolase, beta-glucosidase, e/ou respectivas combinações.

[00115] A composição de enzima celulolítica pode ser de qualquer origem. Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é derivada de uma estirpe de Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei; uma estirpe de Humicola, tal como uma estirpe de Humicola insolens, e/ou uma estirpe de Chrysosporium, tal como uma estirpe de Chrysosporium lucknowense. Em uma modalidade preferencial, a preparação de enzimas celulolíticas é derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00116] A composição de enzima celulolítica pode compreender adicionalmente um ou mais dos seguintes polipeptídeos, tais como enzimas: O polipeptídeo AA9 (polinucleotídeo GH61) com atividade celulolítica intensificadora, beta-glucosidase, xilanase, beta-xilosidase, CBH I, CBH II, ou uma mistura de dois, três, quatro, cinco ou seis desses.

[00117] O(s) polipeptídeo(s) adicionais (p.ex., polipeptídeo AA9) e/ou enzima(s) (p.ex., beta-glucosidase, xilanase, beta-xilosidase, CBH I e/ou CBH II) pode(m) ser estranho(s) ao organismo produtor da composição de enzimas celulolíticas (p.ex., Trichoderma reesei).

[00118] Em uma modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo AA9 com atividade celulolítica aumentada e uma beta-glucosidase.

[00119] Em uma outra modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo AA9 com atividade celulolítica intensificadora, uma beta-glucosidase, e uma CBH I.

[00120] Em uma outra modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo AA9 com atividade celulolítica intensificadora, uma beta-glucosidase, uma CBH I, e uma CBH II.

[00121] Outras enzimas, tais como endoglucanases, também podem estar compreendidas na composição de enzimas celulolíticas.

[00122] Como mencionado acima, a composição de enzimas celulolíticas pode compreender alguns polipeptídeos diferentes, incluindo enzimas.

[00123] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica aumentada (p.ex., WO 2005/074656), e proteína de fusão beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (p.ex., a divulgada em WO 2008/057637, em particular a mostrada como SEQ ID NOs: 59 e 60).

[00124] Em uma outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica intensificadora (p.ex. SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 4 do presente documento) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 deste documento).

[00125] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 7 do presente documento, e betaglucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 do presente documento).

[00126] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397, e a beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 do presente documento) ou uma variante divulgada em WO 2012/044915 (aqui incorporada por referência), em particular uma que compreende uma ou mais, tais como todas as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[00127] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada, em particular o derivado de uma estirpe de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 7 do presente documento), beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 do presente documento) variante com uma ou mais, em particular todas das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y e divulgada em WO 2012/044915; CBH1 Cel7A de Aspergillus fumigatus, p.ex., a divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 e SEQ ID NO: 10 do presente documento, e CBH II de Aspergillus fumigatus, por ex, a divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 11 do presente documento.

[00128] Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente uma hemicelulase ou uma composição de enzimas hemicelulolíticas, tal como uma xilanase Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 8 aqui apresentada) e beta-xilosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 9 do presente documento).

[00129] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende também uma xilanase (p.ex., derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, em particular Aspergillus aculeatus ou Aspergillus fumigatus; ou uma estirpe do gênero Talaromyces, em particular Talaromyces leycettanus) e/ou uma beta- xilosidase (p.ex., derivada de Aspergillus, em particular Aspergillus fumigatus, ou uma estirpe de Talaromyces, em particular Talaromyces emersonii).

[00130] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica intensificadora (p.ex. WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 4 do presente documento), proteína de fusão beta-glucosidase Aspergillus oryzae (p.ex., um divulgada em WO 2008/057637, em particular como SEQ ID NOs: 59 e 60) e xilanase de Aspergillus aculeatus (p.ex., Xyl II em WO 94/21785 ou SEQ ID NO: 6 do presente documento).

[00131] Em outra modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende uma preparação celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica aumentada (p.ex., SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 4 do presente documento), beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 aqui) e xilanase de Aspergillus aculeatus (Xyl II revelada em WO 94/21785 ou SEQ ID NO: 6 do presente documento).

[00132] Em uma outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica intensificadora (p.ex. SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 4 do presente documento), beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 do presente documento) e xilanase de Aspergillus aculeatus (p.ex., Xyl II divulgada em WO 94/21785 ou SEQ ID NO: 6 do presente documento).

[00133] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 7 do presente documento, betaglucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 do presente documento) e xilanase de Aspergillus fumigatus (p.ex., Xyl III em WO 2006/078256 ou SEQ ID NO: 8 do presente documento).

[00134] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 7 do presente documento, betaglucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 do presente documento), xilanase de Aspergillus fumigatus (p.ex., Xyl III em WO 2006/078256 ou SEQ ID NO: 8 do presente documento), e CBH I de Aspergillus fumigatus, em particular CBH1 Cel7A divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO2011/057140 ou SEQ ID NO: 10 deste documento.

[00135] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 7 do presente documento, betaglucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 do presente documento), xilanase de Aspergillus fumigatus (p.ex., Xyl III em WO 2006/078256 ou SEQ ID NO: 8 do presente documento), CBH I de Aspergillus fumigatus, em particular CBH1 Cel7A divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 10 do presente documento, e CBH II derivado de Aspergillus fumigatus em particular o divulgado como SEQ ID NO: 4 em WO 2013/028928 ou SEQ ID NO: 11 deste documento.

[00136] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 7 do presente documento, betaglucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou na SEQ ID NO: 5 do presente documento) ou sua variante com uma ou mais, em particular todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y; xilanase de Aspergillus fumigatus (p.ex., Xyl III em WO 2006/078256 ou SEQ ID NO: 8 do presente documento), CBH I de Aspergillus fumigatus, em particular CBH I Cel7A divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 10 do presente documento, e CBH II derivado de Aspergillus fumigatus em particular o divulgado em WO 2013/028928 ou SEQ ID NO: 11 deste documento.

[00137] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo a CBH I da SEQ ID NO: 14 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49536 (WO2012/103293); uma CBH II da SEQ ID NO:15 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49446 (WO2012/103288); uma variante de beta-glucosidase da SEQ ID NO: 5 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZU67153 (WO 2012/44915)), em particular com uma ou mais, em particular todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y; e AA9 (polipeptídeo GH61) da SEQ ID NO: 7 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP BAL61510 (WO 2013/028912)).

[00138] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo a CBH I da SEQ ID NO: 14 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49536 (WO2012/103293)); a CBH II da SEQ ID NO: 15 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49446 (WO2012/103288); a xilanase GH10 da SEQ ID NO: 16 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP BAK46118 (WO 2013/019827)); e a beta-xilosidase da SEQ ID NO: 17 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZI04896 (WO 2011/057140)).

[00139] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo a CBH I da SEQ ID NO: 14 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49536 (WO2012/103293)); a CBH II da SEQ ID NO: 15 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49446 (WO2012/103288)); e o AA9 (polipeptídeo GH61) da SEQ ID NO: 7 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP BAL61510 (WO 2013/028912)).

[00140] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo a CBH I da SEQ ID NO: 14 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49536 (WO2012/103293)); a CBH II da SEQ ID NO: 15 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZY49446 (WO2012/103288)), o AA9 (polipeptídeo GH61) da SEQ ID NO: 7 do presente documento (Número de Acesso BAL61510 (WO 2013/028912)), e a catalase da SEQ ID NO: 19 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP BAC11005 (WO 2012/130120)).

[00141] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo a CBH I da SEQ ID NO: 14 do presente documento (Número de Acesso AZY49446 (WO2012/103288); a CBH II da SEQ ID NO: 15 do presente documento (Número de Acesso AZY49446 (WO2012/103288); a variante de beta-glucosidase da SEQ ID NO: 5 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZU67153 (WO 2012/44915)), com uma ou mais, em particular todas, das seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y; o AA9 (polipeptídeo GH61) da SEQ ID NO: 7 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP BAL61510 (WO 2013/028912)), a xilanase GH10 da SEQ ID NO: 16 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP BAK46118 (WO 2013/019827)), e a beta-xilosidase da SEQ ID NO: 17 do presente documento (Número de Acesso GENSEQP AZI04896 (WO 2011/057140)).

[00142] Em uma modalidade, a composição celulolítica é uma preparação de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo EG I da SEQ ID NO: 21 do presente documento (Número de Acesso Swissprot P07981), EG II da SEQ ID NO: 22 do presente documento (Número de Acesso EMBL M19373), CBH I da SEQ ID NO: 14 do presente documento; CBH II da SEQ ID NO: 15 do presente documento; uma variante de beta-glucosidase da SEQ ID NO: 5 do presente documento com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y; o AA9 (polipeptídeo GH61) da SEQ ID NO: 7 do presente documento, uma xilanase GH10 da SEQ ID NO: 16 do presente documento; e uma beta-xilosidase da SEQ ID NO: 17 deste documento.

[00143] Todas as composições de enzimas celulolíticas divulgadas em WO 2013/028928 são também contempladas e deste modo incorporadas a título de referência.

[00144] A composição de enzimas celulolíticas compreende ou pode compreender adicionalmente uma ou mais (várias) proteínas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo AA9 (isto é, GH61) com atividade celulolítica aumentada, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina.

[00145] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição comercial de enzimas celulolíticas. Exemplos de composições comerciais de enzimas celulolíticas adequadas para uso em um processo da invenção incluem: CELLIC® CTec (Novozymes A/S), CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S), CELLIC® CTec3 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), ACCELLERASE™ 1000, ACCELLERASE 1500, ACCELLERASE™ TRIO (DuPont), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), or ALTERNAFUEL® CMAX3™ (Dyadic International, Inc.). A composição de enzimas celulolíticas pode ser adicionada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,001 a cerca de 5,0% em peso de sólidos, p.ex., cerca de 0,025 a cerca de 4,0% em peso de sólidos ou cerca de 0,005 a cerca de 2,0% em peso de sólidos.

Endoglucanase

[00146] A composição de enzima celulolítica usada em um processo da invenção pode compreender uma endonuclease de qualquer origem.

[00147] Exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; Patente dos EUA No. 5,275,944; WO 96/02551; Patente dos EUA No. 5,536,655; WO 00/70031; WO 05/093050); endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanase III de Thermobifida fusca (WO 05/093050), e endoglucanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

[00148] Exemplos de endoglucanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, endoglucanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263), endoglucanase I de Trichoderma reesei Cel7B (GenBank: M15665), endoglucanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22), endoglucanase II de Trichoderma reesei Cel5A (GenBank: M19373), endoglucanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, GenBank:AB003694), endoglucanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, GenBank: Z33381), endoglucanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglucanase de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanase de Fusarium oxysporum (GenBank: L29381), endoglucanase de Humicola grisea var. thermoidea (GenBank: AB003107), endoglucanase de Melanocarpus albomyces (GenBank: MAL515703), endoglucanase de Neurospora crassa (GenBank: XM_324477), endoglucanase V de Humicola insolens, endoglucanase de Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanase I de Thermoascus aurantiacus (GenBank: AF487830), endoglucanase de Trichoderma reesei estirpe No. VTT-D-80133 (GenBank: M15665), endoglucanase de Penicillium pinophilum (WO 2012/062220); e (WO 2013/019780).

[00149] Em uma modalidade, a endoglucanase, tal como uma derivada de Trichoderma reesei ou sua homóloga, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma endoglucanase (EG) compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 21 deste documento; (ii) uma endoglucanase (EG) compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 deste documento.

[00150] Em uma modalidade, a endoglucanase, tal como uma derivada de Trichoderma reesei ou sua homóloga, é selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma endoglucanase (EG) compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 22 deste documento; (ii) uma endoglucanase (EG) compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 deste documento.

Polipeptídeo AA9 (isto é, GH61) com atividade celulolítica aumentada

[00151] A composição de enzimas celulolíticas usada de acordo com a invenção pode compreender em uma modalidade um ou mais polipeptídeos AA9 (GH61) com atividade celulolítica aumentada. A composição de enzimas celulolíticas usada em um processo da invenção pode compreender um polinucleotídeo AA9 (GH61) de qualquer origem.

[00152] Exemplos de polipeptídeos AA9 úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, polipeptídeos de Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131, e WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 e WO 2010/065830), Trichoderma reesei (WO 2007/089290 e WO 2012/149344), Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868, e WO 2009/033071), Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754), Penicillium pinophilum (WO 2011/005867), Thermoascus sp. (WO 2011/039319), Penicillium sp. (emersoni0 (WO 2011/041397 e WO 2012/000892), Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504), Aspergillus aculeatus (WO 2012/125925), Thermomyces lanuginosus (WO 2012/113340, WO 2012/129699, WO 2012/130964, e WO 2012/129699), Aurantiporus alborubescens (WO 2012/122477), Trichophaea saccata (WO 2012/122477), Penicillium thomii (WO 2012/122477), Talaromyces stipitatus (WO 2012/135659), Humicola insolens (WO 2012/146171), Malbranchea cinnamomea (WO 2012/101206), Talaromyces leycettanus (WO 2012/101206), e Chaetomium thermophilum (WO 2012/101206), e Talaromyces thermophilus (WO 2012/129697 and WO 2012/130950).

[00153] Em um aspecto, o polipeptídeo AA9 é usado na presença de um cátion de metal divalente ativador solúvel de acordo com WO 2008/151043, p.ex., manganês ou cobre.

[00154] Em outro aspecto, o polipeptídeo AA9 é usado na presença de um composto dioxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto de quinona, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido de um material celulósico pré-tratado tal como palha de milho pré-tratada (WO 2012/021394, WO 2012/021395, WO 2012/021396, WO 2012/021399, WO 2012/021400, WO 2012/021401, WO 2012/021408, e WO 2012/021410).

[00155] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo AA9 (GH61) com atividade celulolítica aumentada, tal como um derivado do gênero Thermoascus, tal como uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, tal como o descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 neste documento; ou um derivado do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como o descrito em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 2; ou um derivado de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como o descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2; ou um derivado de uma estirpe derivada de Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium emersonii, tal como o divulgado em WO 2011/041397 como SEQ ID NO: 7 deste documento.

[00156] Em uma modalidade, o polipeptídeo AA9 (GH61) de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica aumentada ou um seu homólogo é selecionado do grupo consistindo em: (i) um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica aumentada compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4 deste documento; (ii) um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica aumentada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4 deste documento.

[00157] Em outra modalidade, o polipeptídeo AA9 (GH61) de Penicillium sp. com atividade celulolítica aumentada ou um seu homólogo é selecionado do grupo consistindo em: (i) um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica aumentada compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7 deste documento; (ii) um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica aumentada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7 deste documento.

Beta-Glucosidase

[00158] De acordo com a invenção, uma beta-glucosidase pode estar presente e/ou ser adicionada na etapa (a) de sacarificação. A composição de enzima celulolítica usada em um processo da invenção pode compreender uma beta-glucosidase de qualquer origem.

[00159] Exemplos de beta-glucosidases úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, beta-glucosidases de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499), Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980), Aspergillus oryzae (WO 02/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 e WO 2010/088387), Thielavia terrestris (WO 2011/035029), e Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

[00160] A beta-glucosidase pode, em um modalidade, ser uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, como Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae, como a divulgada em WO 2002/095014 ou a proteína de fusão com atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637 como SEQ ID NOs: 59 e 60, ou Aspergillus fumigatus, como a aqui divulgada em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 aqui ou uma variante de betaglucosidase Aspergillus fumigatus como a revelada em WO 2012/044915, tal como a que apresenta as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando a SEQ ID NO: 5 apresentada neste documento para numeração).

[00161] Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de uma estirpe do gênero Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium brasilianum divulgada em WO 2007/019442, ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00162] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma betaglucosidase de Aspergillus fumigatus ou seu homólogo selecionado do grupo consistindo em: (i) uma beta-glucosidase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5 deste documento; (ii) uma beta-glucosidase compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5 deste documento.

[00163] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma variante que compreende uma substituição em uma ou mais (várias) posições correspondendo às posições 100, 283, 456, e 512 do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5 aqui, em que a variante tem atividade de beta-glucosidase.

[00164] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma variante de (a) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5 aqui; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5 aqui ou (c) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 aqui, que tem atividade beta-glucosidase.

[00165] Em uma modalidade, a variante da beta-glucosidase tem pelo menos 80%, p. ex., pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos de 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 deste documento.

[00166] Em uma modalidade, a beta-glucosidase provém de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 5 aqui apresentada), que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo de L89M, G91L, F100D, I140V, I186V, S283G, N456E, e F512Y; como uma respectiva variante com as seguintes substituições: - F100D + S283G + N456E + F512Y; - L89M + G91L + I186V + I140V; - I186V + L89M + G91L + I140V + F100D + S283G + N456E + F512Y.

[00167] Em uma modalidade, o número de substituições está situado entre 1 e 10, como 1 e 8, como 1 e 6, como 1 e 4, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições.

[00168] Em uma modalidade, a variante compreende uma substituição de uma posição compreendendo à posição 100, uma substituição correspondendo à posição 283, uma substituição correspondendo à posição 456, e/ou uma substituição correspondendo à posição 512.

[00169] Em uma modalidade preferencial, a variante de betaglucosidase compreende as seguintes substituições: Phe100Asp, Ser283Gly, Asn456Glu, Phe512Tyr em SEQ ID NO: 5 deste documento.

Celobiohidrolase

[00170] A composição de enzima celulolítica utilizada em um processo da invenção pode compreender uma celobiohidrolase, tal como CBH I e/ou CBH II, de qualquer origem.

[00171] Exemplos de celobiohidrolases úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, celobiohidrolase II de Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740), celobiohidrolase I de Aspergillus fumigatus (WO 2013/028928), celobiohidrolase II de Aspergillus fumigatus (WO 2013/028928), celobiohidrolase I de Chaetomium thermophilum, celobiohidrolase II de Chaetomium thermophilum, celobiohidrolase I de Humicola insolens, celobiohidrolase II de Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871), celobiohidrolase I de Penicillium occitanis (GenBank:AY690482), celobiohidrolase I de Talaromyces emersonii (GenBank:AF439936), celobiohidrolase II de Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325), celobiohidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A, WO 2006/074435), celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, e celobiohidrolase II de Trichophaea saccata (WO 2010/057086).

Celobiohidrolase I. Celobiohidrolase I

[00172] A composição de enzimas celulolíticas usada em um processo da invenção pode, em uma modalidade, compreender uma ou mais CBH I (celobiohidrolase I). Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende uma celobiohidrolase I (CBH I), tal como uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a CBH I Cel7A divulgada na SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 10 do presente documento; uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como a estirpe de Trichoderma reesei; ou uma estirpe do gênero Talaromyces, tal como a estirpe de Talaromyces leycettanus. preferencialmente a mostrada na SEQ ID NO: 14 do presente documento ou Número de Acesso GENSEQP AZY49536 (WO2012/103293).

[00173] Em uma modalidade, a celobiohidrolase I de Aspergillus fumigatus ou um seu homólogo é selecionado do grupo que consiste em: (i) uma celobiohidrolase I compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 deste documento; (ii) uma celobiohidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 deste documento.

[00174] Em outra modalidade, a celobiohidrolase I, p.ex., uma derivada de uma estirpe de Talaromyces leycettanus, é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma celobiohidrolase I compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14 deste documento; (ii) uma celobiohidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 14 do presente documento.

Celobiohidrolase II

[00175] A composição de enzimas celulolíticas usada de acordo com a invenção pode, em uma modalidade, compreender uma ou mais CBH II (celobiohidrolase II). Em uma modalidade, a celobiohidrolase II (CBH II), tal como uma derivada de uma estirpe do gênero de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a da SEQ ID NO: 11 do presente documento ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou uma estirpe do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como celobiohidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris; ou uma estirpe do gênero Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces leycettanus, preferencialmente a apresentada na SEQ ID NO: 15 do presente documento ou Número de Acesso GENSEQP AZY49446 (WO2012/103288).

[00176] Em uma modalidade, a celobiohidrolase II de Aspergillus fumigatus ou um seu homólogo é selecionado do grupo que consiste em: (i) uma celobiohidrolase II compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 deste documento; (ii) uma celobiohidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11 deste documento.

[00177] Em outra modalidade, a celobiohidrolase II, p.ex., uma derivada de uma estirpe deTalaromyces leycettanus, é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma celobiohidrolase II compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 deste documento; (ii) uma celobiohidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15 deste documento.

Hemicelulases

[00178] De acordo com a invenção, uma hemicelulase pode estar presente e/ou ser adicionada durante a sacarificação na etapa (a). A hemicelulase pode estar na forma de uma composição de enzima hemicelulolítica. A hemicelulase pode ter qualquer origem, mas preferencialmente é de origem fúngica ou bacteriana.

[00179] O termo "hemicelulase" ou "enzima hemicelulolítica" significa uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, "Microbial hemicellulases". Current Opinion In Microbiology, 6(3): 219-228. As hemicelulases são componentes-chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloíl esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoíl esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase, e uma xilosidase. Os módulos catalíticos das hemicelulases são ou glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam ligações glicosídicas, ou carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações de éster de grupos secundários de acetato ou ácido ferúlico. Esses módulos catalíticos, com base na homologia da sua sequência primária, podem ser atribuídos a famílias GH e CE marcadas por números. Algumas famílias, com dobramento global similar, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação muito informativa e atualizada dessas e de outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752.

[00180] Em uma modalidade, a hemicelulase presente e/ou adicionada na sacarificação é uma composição de enzimas hemicelulolíticas. Em uma modalidade, a composição de enzimas hemicelulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente uma xilanase e/ou uma beta-xilosidase. Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas hemicelulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente a xilanase de Aspergillus fumigatus (XYL III mostrada na SEQ ID NO: 8 do presente documento) e beta-xilosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 9 do presente documento).

[00181] A hemicelulase ou preparação de enzimas hemicelulolíticas pode ser preferencialmente adicionada numa concentração entre 0,01 e 20 mg PE/g de celulose, tal como 0,1-1 mg PE/g de celulose.

Xilanases

[00182] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase é uma xilanase ou a composição de enzimas hemicelulolíticas compreende uma xilanase. O termo "xilanase" significa uma 1,4-beta-D-xilana-xilohidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanas. Para propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01% e tampão fosfato de sódio 200 mM, pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmole de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em tampão fosfato de sódio 200 mM, pH 6.

[00183] Exemplos de xilanases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thermomyces lanuginosus (GeneSeqP:BAA22485), Talaromyces thermophilus (GeneSeqP:BAA22834), Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210), e Trichophaea saccata (WO 2011/057083).

[00184] Exemplos de xilanases especificamente contempladas incluem xilanases GH10, tal como uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a divulgada como Xyl III em WO 2006/078256, ou Aspergillus aculeatus, tal como a divulgada em WO 94/21785 como SEQ ID NO: 5 (Xyl II).

[00185] A xilanase pode estar compreendida em uma preparação de enzimas celulolíticas que inclui adicionalmente uma xilanase. Em uma modalidade, hemicelulase é uma preparação de enzimas celulolíticas compreendendo adicionalmente uma xilanase, preferencialmente uma xilanase GH10, tal como uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a divulgada como Xyl III em WO 2006/078256, ou Aspergillus aculeatus, tal como a divulgada em WO 94/21785 como SEQ ID NO: 5 (Xyl II) ou SEQ ID NO: 6 deste documento.

[00186] Em uma modalidade, a xilanase é derivada de Aspergillus aculatues, como a da SEQ ID NO: 6 deste documento. Em uma modalidade preferencial, a xilanase é derivada de Aspergillus fuminatus, como a apresentada na SEQ ID NO: 8 deste documento.

[00187] Xilanases contempladas também incluem as que compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a xilanase de Aspergillus fumigatus em WO 2006/078256 ou SEQ ID NO: 8 aqui apresentada, ou a xilanase de Aspergillus aculeatus divulgada em WO 94/21785 como SEQ ID NO: 5 (Xyl II) ou SEQ ID NO: 6 do presente documento.

[00188] Em uma modalidade, a xilanase, p.ex., derivada de uma estirpe de Talaromyces leycettanus, compreendida na composição de enzimas celulolíticas, tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 16 do presente documento.

Beta-Xilosidase

[00189] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase usada em um processo da invenção é uma beta-xilosidase, ou a composição de enzimas hemicelulolíticas compreende uma beta-xilosidase. O termo "beta-xilosidase" significa uma beta-D-xilosídeo xilohidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de pequenos beta (1 ^4)-xilo-oligossacarídeos. para remover resíduos sucessivos de D-xilose dos terminais não redutores. Para finalidades da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 μmole de ânion p-nitrofenolato produzida por minuto a 40 °C, pH 5, a partir de p-nitrofenil-beta-D-xilosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01%.

[00190] Exemplos de beta-xilosidases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, beta-xilosidases de Neurospora crassa (SwissProt:Q7SOW4), Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL:Q92458), Talaromyces emersonii (SwissProt:Q8X212), e Talaromyces thermophilus (GeneSeqP:BAA22816).

[00191] Exemplos de beta-xilosidase especificamente contemplada incluem a derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a divulgada em WO 2013/028928 (Exemplo 16 e 17) ou SEQ ID NO: 9 aqui apresentada, ou derivada de uma estirpe de Trichoderma, como uma estirpe de Trichoderma reesei, como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 58 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 1 do presente documento.

[00192] A beta-xilosidase usada em um processo da invenção pode estar compreendida em uma composição de enzimas celulolíticas. Em uma modalidade, a hemicelulase é uma composição de enzimas celulolíticas; tal como a composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei; compreendendo adicionalmente uma beta-xilosidase, tal como uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus (p.ex., uma divulgada na WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 9 do presente documento), tal como uma divulgada em WO 2013/028928 (Exemplos 16 e 17), ou derivada de uma estirpe de Trichoderma, como uma estirpe de Trichoderma reesei, como o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 58 em WO 2011/057140.

[00193] Beta-xilosidases contempladas também incluem as que compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a beta-xilosidase de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 206 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 9 aqui apresentada ou quaisquer das beta-xilosidases mencionadas aqui.

[00194] Em uma modalidade, a beta-xilosidase, p.ex., derivada de uma estirpe de Talaromyces emersonii, compreendida na composição de enzimas celulolíticas, tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 17 do presente documento.

[00195] A hemicelulase usada em um processo da invenção pode compreender um produto de hemicelulase comercial. Exemplos de produtos comerciais de hemicelulase incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec2 (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec3 (Novozymes), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), Xilanase MULTIFECT® (Genencor), ECOPULP® TX- 200A (AB Enzymes), Xilanase HSP 6000 (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, País de Gales, RU), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, País de Gales, RU), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, País de Gales, RU).

Catalases

[00196] As composições de enzimas celulolíticas pode compreender a catalase. A catalase pode ser qualquer catalase. A catalase pode incluir, mas não se limita a, um E.C. 1.11.1.6 ou E.C. 1,11:1,21 catalase.

[00197] Exemplos de catalases úteis incluem, mas não se limitam a, catalases de Alcaligenes aquamarinus (WO 98/00526), Aspergillus lentilus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger (Patente EUA No. 5,360,901), Aspergillus oryzae (JP 2002223772A; Patente EUA No. 6,022,721), Bacillus thermoglucosidasius (JP 1 1243961A), Humicola insolens (WO 2009/104622, WO 2012/130120), Malbranchea cinnamomea, Microscilla furvescens (WO 98/00526), Neurospora crassa, Penicillium emersonii (WO 2012/130120), Penicillium pinophilum, Rhizomucor pusillus, Saccharomyces pastorianus (WO 2007/105350), Scytalidium thermophilum, Talaromyces stipitatus (WO 2012/130120), Thermoascus aurantiacus (WO 2012/130120), Thermus brockianus (WO 2005/044994), e Thielavia terrestris (WO 2010/074972).

[00198] Exemplos não limitativos de catalase úteis são catalases de Bacillus pseudofirmus (UNIPROT:P30266), Bacillus subtilis (UNIPROT:P42234), Humicola grisea (GeneSeqP: AXQ55105), Neosartorya fischeri (UNIPROT:A1DJU9), Penicillium emersonii (GeneSeqP:BAC10987), Penicillium pinophilum (GeneSeqP:BAC10995), Scytalidium thermophilum (GeneSeqP:AAW06109 ou ADT89624), Talaromyces stipitatus (GeneSeqP:BAC10983 ou BAC11039; UNIPROT:B8MT74), e Thermoascus aurantiacus (GeneSeqP:BAC11005). Os números de acesso são aqui incorporados na sua totalidade.

[00199] As composições de enzimas celulolíticas podem, em uma modalidade preferencial, compreender uma catalase, p.ex., uma derivada de Thermoascus, em particular Thermoascus aurantiacus, em particular a mostrada em WO 2012/130120 ou SEQ ID NO: 19 do presente documento.

[00200] Em uma modalidade, a catalase, p.ex., uma derivada de uma estirpe de Thermoascus auranticus, é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma catalase compreendendo o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 deste documento; (ii) uma catalase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 do presente documento.

[00201] O teor de proteína da catalase fica entre cerca de 0,5% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 0,5% a cerca de 7%, cerca de 0,5% a cerca de 5%, cerca de 0,5% a cerca de 4%, cerca de 0,5% a cerca de 3%, cerca de 0,5% a cerca de 2%, e cerca de 0,5% a cerca de 1% da proteína de enzima total na reação de sacarificação/hidrólise.

[00202] Em uma modalidade, a proporção de proteína de catalase para composição de enzimas celulolíticas fica entre cerca de 1:200 a cerca de 1:10, por exemplo, cerca de 1:100 a cerca de 1:15 ou cerca de 1:50 a cerca de 1:25.

[00203] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

MATERIAIS E MÉTODOS Materiais:

[00204] Composição de Enzimas Celulolíticas CA ("CA"): A preparação de enzimas celulolíticas derivada de Trichoderma reesei que compreende adicionalmente um polipeptídeo GH61A com atividade celulolítica aumentada derivado de uma estirpe de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 7 aqui apresentada), beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 aqui apresentada) variante F100D, S283G, N456E, F512Y) divulgada em WO 2012/044915; Cel7A CBH1 de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 e SEQ ID NO: 10 apresentada neste documento e CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 e SEQ ID NO: 11 do presente documento. Adicionalmente, a Preparação de Enzimas Celulolíticas CA compreende ainda 10% de uma preparação de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente xilanase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 8 aqui apresentada) e beta-xilosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 9 do presente documento).

[00205] Composição de Enzimas Celulolíticas CB ("CB"): Preparação de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo EG I da SEQ ID NO: 21 do presente documento, EG II da SEQ ID NO: 22 do presente documento, CBH I da SEQ ID NO: 14 do presente documento; CBH II da SEQ ID NO: 15 do presente documento; uma variante de beta-glucosidase da SEQ ID NO: 5 aqui com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y; o AA9 (polipeptídeo GH61) da SEQ ID NO: 7 do presente documento, uma xilanase GH10 da SEQ ID NO: 16 do presente documento; e uma beta-xilosidase da SEQ ID NO: 17 deste documento.

[00206] CIBTS1260: A levedura Saccharomyces cerevisiae depositada por Novozymes A/S sob os termos do Tratado de Budapeste no Agricultural Research Service Culture Collection, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA) e atribuído o seguinte número de acesso:

[00207] BSGX001 é divulgada na patente EUA No. 8,586,336-B2 (a qual é deste modo incorporada por referência) e foi construída como se segue: A estirpe BSPX042 do hospedeiro Saccharomyces cerevisiae (fenótipo: ura3- 251, superexpressão de XKS1; superexpressão de RPE1, RKI1, TAL1 e TKL1, que são genes em PPP; nocaute do gene da aldose redutase GRE3; e danos da cadeia respiratória transportadora de electrões por deleção do gene COX4 após evolução adaptativa), foi transformada com o vetor pJFE3-RuXI inserido com o gene da xilose isomerase (SEQ ID NO: 1 na patente EUA No. 8,586,336-B2 ou SEQ ID NO: 20 do presente documento) codificando a RuXI apresentada na SEQ ID NO: 2 na patente EUA No. 8,586,336-B2 ou SEQ ID NO: 13 deste documento.

Métodos: Identidade

[00208] A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de polinucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade".

[00209] Para propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado pelo método de Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando o software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplo: Penalidade de intervalo de 10 e penalidade de comprimento de intervalo de 10. Parâmetros de alinhamento par a par são Ktuple=1, penalidade de intervalo=3, janelas=5, e diagonais=5.

[00210] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de polinucleótidos é determinada pelo método de Wilbur-Lipman (Wilbur e Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science EUA 80: 726-730) usando o software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplo: Penalidade de intervalo de 10 e penalidade de comprimento de intervalo de 10. Parâmetros de alinhamento par a par são Ktuple=3, penalidade de intervalo=3, janelas=20.

[00211] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos revelados no presente documento, já que esses aspectos são concebidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. É pretendido que quaisquer aspectos equivalentes estejam dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição acima mencionada. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições, imperará.

EXEMPLOS Exemplo 1 Construção da estirpe CIBTS1000.

[00212] Foi identificada uma estirpe diplóide de Saccharomyces cerevisiae que é conhecida por ser um produtor eficiente de etanol a partir de glucose. Foi utilizada a estirpe CCTCC M94055 de S. cerevisiae do Chinese Center for Type Culture Collection (CCTCC).

[00213] Uma xilose isomerase denominada mgXI foi clonada de um projeto de meta genômica, o que significa que o organismo doador não é conhecido. O isolamento e as características desta xilose isomerase estão descritas no pedido de patente China No. 102174549A ou na Publicação de patente EUA No. 2012/0225452.

[00214] Um transportador de pentose denominado GXF foi clonado a partir de Candida intermedia utilizando métodos padrão. Este transportador de xilose foi descrito por D. Runquist et al. (Runquist D, Fonseca C, Radstrom P, Spencer-Martins I, Hahn-Hagerdal B: "Expression of the Gxfl transporter from Candida intermedia improves fermentation performance in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae". Appl Microbiol Biotechnol 2009, 82:123-130).

[00215] O gene da xilose isomerase foi fundido com o promotor da Triose Fosfato Isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae e o terminador TPI utilizando métodos padrão de modo que a expressão da xilose isomerase emS. Cerevisiae fosse controlada pelos sinais de expressão de TPI.

[00216] O gene GXF foi fundido aos sinais de expressão TPI da mesma forma.

[00217] Estas duas cassetes de expressão foram inseridas em um vetor de clonagem de Escherichia coli contendo: • A origem de replicação colE1 de E. coli assegurando que o plasmídeo poderia ser propagado em E. coli. • Um fragmento da sequência delta (δ) de Saccharomyces cerevisiae. • Um marcador de resistência à Zeocina de Streptoalloteichus hindustanus para seleção de transformantes resistentes a Zeocina de E. coli ou S. cerevisiae. Um duplo promotor foi fundido com a extremidade 5' do gene da Zeocina consistindo em um promotor do Fator de Alongamento da Tradução (TEF1) de S. cerevisiae e um promotor EM7 de E. coli. O terminador CYC1 de S. cerevisiae foi adicionado à extremidade 3' do gene da Zeocina. Toda a cassete de expressão de Zeocina foi flanqueada por sítios loxP para permitir a deleção desta cassete de expressão por recombinação Cre-lox (B. Sauer: "Functional expression of the Cre-Lox site specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Mol. Cell. Biol. 1987, 7: 2087-2096).

[00218] O plasmídeo de expressão do transportador de Xilose isomerase/pentose foi denominado pYIE2-mgXI-GXF1-δ e é mostrado na Fig. 1.

[00219] O plasmídeo pYIE2-mgXI-GXF1-delta foi inicialmente linearizado por digestão com XhoI e depois transformado na estirpe genitora de Saccharomyces cerevisia CCTCC M94055 seguido de seleção para transformantes resistentes à zeocina. Uma estirpe denominada CIBTS0912 foi isolada tendo o plasmídeo integrado em uma sequência delta. A cassete de resistência à zeocina localizada entre os dois sítios loxP foi então eliminada por expressão transiente da recombinase CRE resultando na estirpe CIBTS0914.

[00220] A expressão transiente da recombinase CRE foi conseguida de modo semelhante ao método padrão em levedura descrito por Prein et al. (Prein B, Natter K, Kohlwein SD. "A novel strategy for constructing N- terminal chromosomal fusions to green fluorescent protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae". FEBS Lett. 2000: 485, 29-34.) transformando com um plasmídeo instável que expressa a recombinase CRE seguido por cura para esse plasmídeo novamente. Neste trabalho o gene da canamicina do vetor padrão de levedura pSH47 foi substituído por um marcador de resistência à higromicina de modo que, em vez de selecionar a resistência à canamicina, foi utilizada a seleção à higromicina. Um mapa plasmídico do plasmídeo utilizado pSH47-hyg é mostrado na Fig.2.

[00221] A estirpe CIBTS0914 foi transformada com pYIE2-mgXI- GXF1-δ digerido com XhoI novamente para aumentar o número de cópias das duas cassetes de expressão e uma estirpe resistente à zeocina, foi selecionado CIBTS0916.

[00222] Para a superexpressão dos genes da via das pentose fosfato, foi montado um plasmídeo de expressão albergando os genes selecionados da via das pentose fosfato.

[00223] Os genes selecionados para superexpressão foram: 1. Xiluloquinase (XKS1). 2. Transaldolase (TAL1). 3. Ribulose-5-fosfato epimerase (RPE1). 4. Transcetolase (TKL1). 5. Ribose-5-fosfato isomerase (RKI1)

[00224] Para além destes genes, a cassete de seleção de KanMX rodeada por sítios loxP foi incluída como parte do vetor de transporte de E. coli - S. cerevisiae pUG6 (Güldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. "A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast." NAR 1996, 24:2519-24).

[00225] Um mapa do plasmídeo resultante pYIE2-XKS1-PPP-δ é mostrado na Fig.3. Uma tabela listando os elementos genéticos usados é mostrada abaixo:

[00226] O plasmídeo pYIE2-XKS1-PPP-δ foi digerido com NotI e os elementos do vetor foram removidos por eletroforese em gel de agarose. O fragmento linear contendo todas as cassetes de expressão foi então transformado em CIBTS0916 para a recombinação homóloga dupla seguida pela seleção da resistência à canamicina (G418). Uma colônia resistente à canamicina foi selecionada e denominada CIBTS0931.

[00227] CIBTS0931 contém o marcador de seleção de zeocina e o marcador de seleção de canamicina. Ambos são flanqueados com sítios de recombinação loxP.

[00228] Para remover os marcadores de resistência à zeocina e à canamicina, a estirpe foi transformada novamente com o plasmídeo epissomal pSH47-hyg e os transformantes foram selecionados em placas contendo higromicina. Subsequentemente, foi efetuado o rastreio para os transformantes que tinham perdido a resistência à zeocina e à canamicina e depois disso foi feito o rastreio para uma estirpe que também perdeu o marcador de resistência à higromicina. Uma estirpe CIBTS1000 foi selecionada e mostrou ter perdido o plasmídeo pSH47-hyg.

Exemplo 2 Adaptação da estirpe CIBTS1000 à absorção de xilose elevada e resistência ao acetato.

[00229] A estirpe CIBTS1000 foi modificada para que pudesse utilizar xilose como uma fonte de carbono e fermentar esta para etanol. No entanto, a utilização de xilose foi muito ineficiente. Uma maneira bem conhecida de melhorar isso no campo da engenharia metabólica é usar a adaptação. Isso também foi feito neste caso. A estirpe CIBTS1000 foi transferida em série de frasco agitado para frasco agitado em um meio contendo xilose como única fonte de carbono e inibidores de crescimento de levedura conhecidos por estarem presentes em hidrolisados de biomassa celulósicos. Durante estas transferências em série são acumuladas mutações que permitem a estirpe crescer melhor sob as condições proporcionadas - e assim utilizar xilose melhor.

[00230] Em uma primeira fase de adaptação, CIBTS1000 foi transferida em série em um sistema de frasco agitado utilizando meio YPX (10 g/L de extrato de Levedura, 20 g/L de peptona e 20 g/L de xilose) e YPDX (10 g/L de extrato de Levedura, 20 g/L de peptona, 10 g/L de glucose e 10 g/L de xilose).

[00231] Em uma segunda fase de adaptação, a transferência em série foi realizada em YPXI (YPX suplementado com formato de sódio a 43 mM, acetato de sódio a 50 mM e sulfato de sódio a 100 mM) e YPDXI (YPDX suplementado com formato de sódio a 43 mM, acetato de sódio a 50 mM e sulfato de sódio a 100 mM).

[00232] Em uma fase final de adaptação, a transferência em série foi realizada utilizando hidrolisado de palha de milho pré-tratada com ácido diluído no NREL (ver Exemplo 3) suplementado com 10 g/L de extrato de Levedura, 20 g/L de peptona, 10 g/L de glucose e 10 g/L de xilose.

[00233] Uma estirpe denominada CIBTS1260-J132-F3 foi selecionada como uma estirpe adaptada.

Exemplo 3 Comparação da Fermentação de CIBTS1260 e BSGX001 em Hidrolisado de Palha de Milho Pré-tratada com Ácido Diluído no NREL

[00234] Duas estirpes de Saccharomyces cerevisiae, CIBTS1260 e BSGX001, foram testadas em hidrolisado de palha de milho pré-tratada com ácido diluído no NREL (4% p/p de ácido sulfúrico a 180 °C por 5 minutos). O hidrolisado foi produzido após 3 dias de hidrólise em um reator de 20 kg a 50 °C com 20 mg de proteína de enzima/g de glucana da Composição de Enzima Celulolítica CA. O hidrolisado de palha de milho pré-tratada com ácido diluído tinha uma composição final de 63,2 g/L de glucose, 44,9 g/L de xilose, 0,8 g/L de glicerol e 9,5 g/L de acetato. Antes da fermentação, cada estirpe foi propagada em um agitador de ar a 30 °C a 150 rpm em meio YPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 20 g/L de glucose). Após 24 horas de crescimento, estas duas estirpes de levedura foram testadas em 50 mL de hidrolisado em frascos Erlenmeyer com chicanas de 125 mL a um inoculo de levedura de 1 g de peso de células secas (DCW)/L. Foram utilizadas rolhas de borracha equipadas com agulha romba de enchimento de calibre 18 para selar cada frasco e os frascos foram colocados em um agitador de ar a 35 °C a uma velocidade de 150 rpm. As amostras foram tiradas às 24, 48 e 72 horas para a determinação das concentrações de glucose, xilose e etanol através de análise por HPLC. Foi realizada a média dos resultados para cada conjunto de 3 repetições, e são apresentados na Figura 1, que mostra uma comparação de CIBTS1260 versus BSGX001 em hidrolisado de palha de milho pré-tratada com Ácido no NREL a 1 g/L de inoculo de levedura em 72 horas. Conforme ilustrado na Fig. 4, às 48 horas, a estirpe CIBTS1260 completou o consumo total de xilose e produziu aproximadamente 47 g/L de etanol. A estirpe BSGX001, no entanto, demorou a absorver glucose para conversão de etanol e assim consumiu apenas 3 g/L de xilose. Estes resultados indicam que CIBTS1260 resulta em melhor absorção de xilose e utilização para conversão em etanol em comparação com BSGX001.

Exemplo 4 Comparação de CIBTS1260 e BSGX001 para o Desempenho de Fermentação em Meios Modelo

[00235] O desempenho de fermentação da CIBTS1260 e sua precursora BSGX001 foi comparado. Antes da fermentação, cada estirpe foi propagada em um agitador de ar a 30 °C a 150 rpm em meio YPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 20 g/L de glucose). Após 24 horas de crescimento, estas duas estirpes de levedura foram testadas em meio YPX (5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de peptona e 50 g/L de xilose). Para testar o desempenho de fermentação, cada estirpe foi inoculada em 50 mL de meio YPX em frascos Erlenmeyer com chicanas de 125 mL a um inoculo de levedura de 2 g DCW/L. Foram utilizadas rolhas de borracha equipadas com agulha romba de enchimento de calibre 18 para selar cada frasco e os frascos foram colocados em um agitador de ar a 32 °C a uma velocidade de 150 rpm. As amostras foram tiradas às 24, 48 e 72 horas para a determinação das concentrações de glucose, xilose e etanol através de análise por HPLC. Foi realizada a média dos resultados para cada conjunto de 3 repetições, e são apresentados na Fig. 5.

[00236] Conforme ilustrado na Fig. 5, CIBTS1260 (linhas a tracejado) utilizou completamente toda a xilose disponível em 24 horas e produziu 21,3 g/L de etanol. No tempo de fermentação de 72 horas, BSGX001 (linhas contínuas) consumiu 1,5 g/L de xilose e a concentração de etanol resultante foi de 1,3 g/L.

Exemplo 5 Fermentação da Composição de Enzima Celulolítica CA ("CA") e Composição de Enzima Celulolítica CB ("CB") do Hidrolisado de Bagaço com CIBTS1260

[00237] CIBTS1260 foi utilizado em ensaios de fermentação com hidrolisados de bagaço pré-tratados com ácido diluído no NREL gerados na Novozymes North America, EUA. O hidrolisado foi produzido após 5 dias de hidrólise em reatores de 2 L IKA a 50 °C com 6 mg de proteína de enzima/g de dose de glucana das duas composições de enzimas celulolíticas denominadas "CA" e "CB". Estes materiais são referências representativas para os hidrolisados de bagaço pré-tratado com ácido diluído com composições finais de 40,7 e 58,7 g/L de glucose, 42,5 e 44,7 g/L de xilose, 0,19 e 0,08 g/L de glicerol e 8,99 e 11,3 g/L de acetato para "CA" e " CB ", respectivamente. Antes da fermentação, a levedura foi propagada em um agitador de ar a 30 °C a 150 rpm em meio YPD a 2% (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 20 g/L de glucose). Após 24 horas de crescimento, CIBTS1260 foi testada em 50 mL de hidrolisado "CA" e "CB" em frascos Erlenmeyer com chicanas de 125 mL a um inoculo de levedura de 1 g de DCW/L. Foram utilizadas rolhas de borracha equipadas com agulha romba de enchimento de calibre 18 para selar cada frasco e os frascos foram colocados em um agitador de ar a 35 °C a uma velocidade de 150 rpm. As amostras foram tiradas às 24, 48 e 72 horas para a determinação das concentrações de glucose, xilose, etanol, acetato e glicerol através de análise por HPLC. Foi realizada a média dos resultados para cada conjunto de 3 repetições, e são apresentados na Fig. 6. Mais de 95% da glucose e xilose presentes nos dois sistemas foram consumidos dentro do período de tempo de 72 horas com rendimentos de etanol sobre açúcares totais de 84,1% para o hidrolisado "CA" e 86,4% para o hidrolisado "CB".

Exemplo 6 Redução de DP2 durante Fermentações de CIBTS1260 e BSGX001 de Hidrolisados de Palha de Milho e Bagaço de Cana-de-Açúcar Pré-Tratados com Ácido Diluído

[00238] Palha de milho e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratados com ácido diluído do National Renewable Energy Laboratory (NREL), EUA, foram hidrolisados com uma dose de 6 mg de proteína de enzima/g glucana de dois cocktails de produto de enzimas denominados CA e CB durante 5 dias em reatores de 2L IKA a 50 °C. Antes da fermentação, as leveduras CIBTS1260 e BSGX001 foram propagadas em um agitador de ar a 30 °C a 150 rpm em meio YPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 20 g/L de glucose). Após 24 horas de crescimento, as células de cada estirpe foram colhidas por centrifugação e adicionadas a 50 mL de hidrolisado CA e CB suplementado com 2 g/L de ureia em frascos Erlenmeyer com chicanas de 125 mL a um inoculo de levedura de 1 g de DCW/L (Peso de Células Secas/L), respectivamente. Foram utilizadas rolhas de borracha equipadas com agulha romba de enchimento de calibre 18 para selar cada frasco e os frascos foram colocados em um agitador de ar a 35 °C a uma velocidade de 150 rpm. As amostras foram tiradas às 0 e 72 horas para a determinação das concentrações de DP2 por análise de HPLC. Foi realizada a média dos resultados para cada conjunto de repetições (n = 3 para CIBTS1260 e n = 2 para BSGX001). Conforme ilustrado na Figura 7, nos mesmos hidrolisados, as concentrações de DP2 foram reduzidas mais para fermentações conduzidas com CIBTS1260 do que para fermentações com BSGX001. O pico DP2, tal como medido em HPLC, contém celobiose e açúcares de cadeia curta.

Claims (12)

1. Processo para produção de etanol, que compreende: (a) sacarificação de um material celulósico com uma composição enzimática celulolítica; (b) fermentação do material celulósico sacarificado com um microrganismo fermentador transgênico para produzir o produto de fermentação; em que o organismo fermentador transgênico é Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA).

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a recuperação do produto de fermentação da fermentação.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é pré-tratado ácido antes da sacarificação.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição de enzimas celulolíticas é caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo AA9, uma hemicelulase, uma CIP, uma esterase, uma expansina, uma enzima ligninolítica, uma oxidorreductase, uma pectinase, uma protease, e uma swolenina.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a celulase é caracterizada pelo fato de ser uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma endoglucanase, uma celobiohidrolase e uma beta-glucosidase.

6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que a hemicelulase é caracterizada pelo fato de que é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma xilanase, uma acetilxilana esterase, uma feruloíl esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os passos (a) e (b) são realizados simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os passos (a) e (b) são realizados sequencialmente (SHF).

9. Organismo fermentador transgênico, caracterizado pelo fato de que é Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado sob o N° de Acesso NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EUA).

10. Organismo fermentador transgênico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que proporciona o consumo total de xilose por 48 horas de fermentação a 1 g de Peso Celular Seco/L, 35 °C, pH 5,5.

11. Organismo fermentador transgênico de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que proporciona o consumo total de glucose por 24 horas de fermentação a 1 g de Peso Celular Seco/L, 35 °C, pH 5,5.

12. Organismo fermentador transgênico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que proporciona mais de 30 g/L de etanol após 48 horas de fermentação a 1 g de Peso Celular Seco/L, 35 °C, pH 5,5.