CN105683380B - 通过降低rna干扰来提高真核细胞中的转基因表达 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于通过降低RNA干扰(RNAi)来提高真核细胞中的转基因表达的方法，以及由所述方法制备的变体细胞。所述方法和变体细胞可用于例如由真核细胞高效制备治疗用多肽和工业用多肽。

Description

通过降低RNA干扰来提高真核细胞中的转基因表达
优先权
本专利申请要求2013年8月8日提交的美国临时专利申请61/863,829的优先权，该临时专利申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明描述了通过降低RNA干扰(RNAi)来提高真核细胞中的转基因表达的方法，以及由这种方法制备的变体细胞。这些方法和变体细胞可用于例如在真核细胞中高效制备治疗用多肽和工业用多肽。
参考文献
本文引用的下列参考文献和另外的参考文献特此以引用方式并入本文。
Fire,A.et al.(1998).Nature 391:806–11.
Fulci,V.and Macino,G.(2007)Current Opinion in Microbiology 10:199–203.
Janus,D.et al.(2009)Microbiology 155:3946–56.
Nakayashiki,H.(2005)FEBS Letters 579:5950–57.
Brody,H.and Maiyuran,S.(2009)Industrial Biotechnology 5:53-60.
McGinnis,K.(2009)Methods in Molecular Biology:Transgenic Maize 526:91-99.
背景技术
RNA干扰(RNAi)是RNA分子抑制基因表达这一现象。mRNA(通常由转基因转录得到)在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)作用下转变成双链RNA(dsRNA)时，发生RNA干扰。dsRNA成为Dicer样蛋白的底物，被Dicer样蛋白切割成长度为约25个核苷酸或更短的小干扰dsRNA(siRNA)。接着siRNA整合到RNA诱导沉默复合物(RISC)中，RISC以序列特异性方式，基于特定siRNA的序列，靶向作用于另外的转基因mRNA，将其降解。结果造成转基因的表达降低，而且与该转基因具有足够相似核苷酸序列的内源基因的表达也降低。Fire和Mello在Caenorhabditis elegans(Fire,A.et al.(1998).Nature 391:806–11)中首次描述了这种现象。
RNAi普遍存在于多种真核细胞中，并有多种不同的名称，包括共抑制、转录后基因沉默(PTGS)和基因压制。术语“基因压制”通常专指真菌分子生物学领域的RNAi现象。一些真菌可能有强烈的基因压制响应，而其他真菌只有微弱的基因压制响应，甚至根本没有这种响应。20世纪90年代初首次在脉孢菌属(Neurospora)中阐述了基因压制(Romano,N.etal.(1992)Mol.Microbiol.6:3343–53)。
发明内容
本发明描述了一种通过将降低了RNA干扰(RNAi)量的基因改变引入真核细胞来提高该细胞中的转基因表达水平的方法。下列分别编号的段落概述了本发明的方法和变体细胞的诸方面和多个实施方案：
1.在一个方面，本发明提供了一种提高真核细胞中的转基因表达水平的方法，该方法包括将基因改变引入真核细胞，与不存在该基因改变时的RNA干扰量相比，该基因改变降低细胞中的RNA干扰量。
2.在段落1所述方法的一些实施方案中，基因改变减少或阻止细胞中dsRNA和/或siRNA的形成。
3.在段落1或2所述方法的一些实施方案中，基因改变包括Dicer样基因的破坏。
4.在段落1或2所述方法的一些实施方案中，基因改变包括RNA依赖性RNA聚合酶的破坏。
5.在段落3或4所述方法的一些实施方案中，基因的破坏是基因诱变的结果。
6.在段落3至5所述方法的一些实施方案中，基因的破坏采用位点特异性重组来进行。
7.在段落3至6所述方法的一些实施方案中，基因的破坏与在该基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
8.在段落3至7所述方法的一些实施方案中，基因的破坏与引入编码目的蛋白的转基因组合进行。
9.在段落1至8所述方法的一些实施方案中，与不含该基因改变的同等细胞产生的单位量生物质的蛋白总量相比，细胞产生基本上相同量的每单位量生物质的蛋白总量。
10.在段落1至9所述方法的一些实施方案中，其中所述真核细胞为植物细胞、动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。
11.在段落1至9所述方法的一些实施方案中，真核细胞为丝状真菌细胞。
12.在段落10所述方法的一些实施方案中，真核细胞为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种细胞。
13.在段落11所述方法的一些实施方案中，丝状真菌为里氏木霉(Trichodermareesei)。
14.在一些实施方案中，段落1至7或9至13所述的方法还包括将用于表达目的蛋白的转基因引入细胞。
15.在一些实施方案中，段落8或14所述的方法还包括将所述转基因的附加拷贝引入细胞，其中，将所述转基因的附加拷贝引入细胞之后，所述转基因的表达水平不低于将所述转基因的附加拷贝引入细胞之前的表达水平。就段落8的实施方案而言，本段落中提到的“所述转基因的附加拷贝”是除段落8中提到的转基因之外附加的拷贝。
16.在段落14或15所述方法的一些实施方案中，在引入降低或阻止RNA干扰的基因改变之前，细胞中存在编码目的蛋白的转基因。
17.在段落14或15所述方法的一些实施方案中，在引入降低或阻止RNA干扰的基因改变之后，向细胞引入编码目的蛋白的转基因。
18.在另一方面，本发明提供了一种从转化或转染的细胞中筛选出高效表达转基因的细胞的方法，该方法包括：将基因改变引入细胞，与不存在该基因改变时的RNA干扰量相比，该基因改变降低细胞中的RNA干扰量；然后将转基因引入细胞，其中前述基因改变使转化或转染的细胞中的转基因所编码蛋白质的平均表达水平提高；从而与转化或转染的细胞不包含基因改变时所必须筛选的细胞数相比，允许筛选更少的转化或转染的细胞，就可从中识别出高效表达该转基因所编码蛋白质的细胞。段落2至13和15至17中任一段落所述的实施方案可与段落18所述的方法组合使用。
19.在另一方面，本发明提供了一种提高真核细胞中的转基因表达水平的方法，该方法包括在与RNA干扰相关的基因的基因座处引入转基因，其中引入转基因破坏了与RNA干扰相关的基因，降低了细胞中的RNA干扰量，从而相比于与RNA干扰相关的基因完好无损时细胞中的转基因表达水平，提高了转基因表达水平。段落2至7、9至13和15至17中任一段落所述的实施方案可与段落18的方法组合使用。
20.在另一方面，本发明提供了一种采用根据权利要求1至19中任一项所述的方法制备的真核细胞。
21.在另一方面，本发明提供了一种采用根据权利要求1至19中任一项所述的方法制备的目的蛋白。
22.在另一方面，本发明提供了衍生自亲本真核细胞的变体真核细胞，这种变体细胞包含基因改变，该基因改变使变体细胞表现出比亲本细胞低的RNA干扰；其中，与亲本细胞相比，这种变体细胞能够产生更多由转基因编码的目的蛋白，和/或在转基因转化之后，变体细胞中由转基因编码的目的蛋白的平均表达水平更高；并且与不含基因改变的同等细胞产生的每单位量生物质的蛋白量相比，变体细胞产生基本上相同量的每单位量生物质的蛋白量。
23.在段落22所述变体细胞的一些实施方案中，基因改变是编码与RNA干扰相关的蛋白的基因的破坏。
24.在段落23所述变体细胞的一些实施方案中，基因改变包括编码Dicer样蛋白的基因的破坏。
25.在段落23所述变体细胞的一些实施方案中，基因改变包括编码RNA依赖性RNA聚合酶的基因的破坏。
26.在段落23至25所述变体细胞的一些实施方案中，破坏是基因的诱变。
27.在段落23至25所述变体细胞的一些实施方案中，破坏是基因的部分或全部缺失。
28.在段落23至27所述变体细胞的一些实施方案中，基因的破坏采用位点特异性重组来进行。
29.在段落23至28所述变体细胞的一些实施方案中，基因的破坏与在该基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
30.在一些实施方案中，段落22至29中任一段落所述的变体细胞还包含编码目的蛋白的转基因。
31.在一些实施方案中，段落22至29中任一段落所述的变体细胞还包含编码目的蛋白的转基因的多个拷贝。
本发明方法和变体细胞的这些和其他的方面和实施方案可以从本说明书(包括所附实施例与附图)中明显看出。
附图说明
图1为标准设计的破坏盒的示意图。在里氏木霉中，5'和3'旁侧区的长度为1至1.5kb，重复区的长度为0.5至0.7kb。
图2为里氏木霉含dcl1基因的染色体区域的示意图。图中注明了两个dcl1旁侧区和一个dcl1重复区。还示出了与Trire 2.0数据库中蛋白ID 69494对应的开放阅读框，以及5'末端延伸至最近的密码子ATG的假定经校正开放阅读框。图中还注明了扩增引物的退火基因座。
图3为里氏木霉含dcl2基因的染色体区域的示意图。图中注明了两个dcl2旁侧区和一个dcl2重复区。还示出了与Trire 2.0数据库中蛋白ID 79823对应的开放阅读框。图中还注明了扩增引物的退火基因座。
图4A和图4B分别为里氏木霉的dcl1染色体区域在基因破坏之后的示意图(4A)，以及在切除pyr2标记基因之后的示意图(4B)。图中注明了用于缺失定位的引物的退火基因座。
图5A和图5B分别为里氏木霉的dcl2染色体区域在基因破坏之后的示意图(5A)，以及在切除pyr2标记基因之后的示意图(5B)。图中注明了用于缺失定位的引物的退火基因座。
图6为示出在两种里氏木霉菌株(即DiMorph(经操纵以降低RNAi)和CelluLight(就RNAi而言为野生型))的各单独转化株中测得的氨肽酶Y(APY)活性水平的柱状图。这两种菌株都用含APY表达盒的相同DNA片段转化过。测量的是随机分组转化株的活性。每根柱代表在单个克隆中检测到的APY活性。数据按从最低到最高活性的顺序排列(分别对于这两种菌株中的每种菌株而言)。
图7示出DiMorph和CelluLight转化株中APY表达水平的SDS-PAGE分析结果。培养上清液由SDS-PAGE分离，并用SIMPLYBLUETM试剂(Invitrogen)染色。每个孔代表单个转化株(顺序随机)。
图8为示出在含氨肽基三肽酶(3PP)表达盒的各单独DiMorph和CelluLight转化株中测得的3PP活性水平的柱状图。测量的是随机分组转化株的活性。每根柱代表在单个克隆中检测到的3PP活性。数据按从最低到最高活性的顺序排列(分别对于这两种菌株中的每种菌株而言)。
图9为示出使用APY表达盒、用两种不同标记进行两轮转化之后，在各单独DiMorph和CelluLight转化株中测得的APY活性水平的柱状图。每根柱(除图中右侧的两根柱之外)代表单个第二轮转化株。右侧的两根柱代表CelluLight菌株和DiMorph菌株表现最好的单轮转化株，它们被用作第二轮转化的转化宿主。
图10为示出使用3PP表达盒、用两种不同标记进行两轮转化之后，在各单独DiMorph和CelluLight转化株中测得的3PP活性水平的柱状图。每根柱(除图中右侧的两根柱之外)代表单个第二轮转化株。右侧的两根柱代表CelluLight菌株和DiMorph菌株表现最好的单轮转化株，它们被用作第二轮转化的转化宿主。
具体实施方式
I.综述
本发明描述了通过破坏RNA干扰(RNAi)机制来提高真核细胞中的转基因表达的方法，以及由这种方法制备的细胞菌株。虽然RNAi机制已在真核细胞中研究多年，而且也已利用RNAi来刻意沉默不需要的基因表达，但迄今为止未曾描述通过破坏RNAi来提高转基因表达。本发明的方法和细胞可用于表达多种所关注的工业用和药用蛋白。
II.定义
在详细描述本发明的菌株和方法之前，为清楚起见，首先给出下列术语的定义。未定义的术语应该符合相关领域使用的普通含义。
如本文所用，术语“RNA干扰”和缩写“RNAi”广义上是指真核细胞中RNA介导的基因沉默机制。RNAi导致在真核细胞内表达的一部分蛋白的表达水平下降。RNAi在植物分子生物学领域也被称作“共抑制”，在真菌分子生物学领域也被称作“基因压制”。本文引用的参考文献详细介绍了RNAi。
如本文所用，术语“基因压制”是指真菌中RNA介导的基因沉默。本文引用的参考文献详细介绍了基因压制。
如本文所用，“转基因”是指引入宿主生物的外源基因。转基因可通过转染、转化、转导或感染引入，并优选地整合进宿主细胞染色体。转基因通常编码目的蛋白，例如工业上或医药上重要的蛋白。转基因编码的蛋白可能是宿主细胞通常不表达的蛋白，或宿主细胞通常要表达的蛋白。后一种情况下，转基因甚至可能与宿主细胞中天然存在的基因相同。尽管如此，转基因毕竟是外源基因，必须借助基因操纵才能被引入宿主细胞。
如本文所用，术语“野生型”是指天然存在的基因、蛋白或细胞。
如本文所用，术语“变体”、“变体细胞”、“变体菌株”和类似表述是指经过转基因改造的真核细胞。
如本文所用，短语“基本没有活性”或类似短语是指特定的活性要么无法从混合物中检出，要么其活性水平不干扰混合物的预定用途。
如本文所用，术语“多肽”和“蛋白”可互换使用，都指包含由肽键连接起来的多个氨基酸残基的任意长度聚合物。本文使用传统的单字母或三字母代码来表示氨基酸残基。术语“多肽”和“蛋白”也涵盖经天然修饰或受到干预的氨基酸聚合物，其中天然修饰或干预例如：形成二硫键、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰(例如与标记成分缀合)。术语“多肽”和“蛋白”的定义还涵盖(例如)包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所用，术语“多肽/蛋白衍生物”是指通过下列方式由某种蛋白衍生出或可衍生出的蛋白：将一个或多个氨基酸添加到该蛋白的N端和/或C端；置换掉氨基酸序列中一个或多个不同位点处的一个或多个氨基酸；缺失掉该蛋白的一端或两端处、或氨基酸序列中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸；以及/或者在氨基酸序列中一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸。可通过下列步骤制备蛋白衍生物：修饰DNA序列(该序列可编码天然蛋白)，将经修饰的DNA序列转化进适宜的宿主，使经修饰的DNA序列表达而形成蛋白衍生物。
如本文所用，术语“菌株蛋白”是指与参考/亲本蛋白(例如野生型蛋白)相比，有少数氨基酸残基置换、缺失和/或插入的蛋白。菌株蛋白与亲本蛋白不同的氨基酸残基数可为一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50个或更多个氨基酸残基。变体蛋白与参考蛋白的氨基酸序列同一性可能为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或甚至至少约99％或更多。变体蛋白与参考蛋白的不同之处也可能是选定的基序、结构域、表位、保守区域等。
如本文所用，术语“同源蛋白”或简称“同源物”是指与参考蛋白的活性和/或结构类似的蛋白。虽然同源物通常在进化上相关，但也不一定如此。同源物通常具有相似的结构，通过一级序列分析、二级或三级结构分析、功能分析和/或免疫交叉反应性分析，可鉴定同源物。
可使用本领域已知的任何适宜方法来测定两条序列的同源程度(参见例如Smithand Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.,48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444；Wisconsin遗传学软件包(Genetics Computer Group,Madison,WI)中的程序，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Res.12:387-95)。举例来说，PILEUP是一种测定序列同源程度的实用程序。PILEUP利用渐进式成对序列比对法，由一组相关的序列产生多序列比对。该算法还可以画出树状图，显示用来产生比对的聚类关系。PILEUP采用的是Feng和Doolittle提出的渐进式比对方法(Feng and Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35:351-60)的简化版本。该方法类似Higgins和Sharp提出的方法((1989)CABIOS 5:151-53)。可用的PILEUP参数包括数值为3.00的默认空位权重、数值为0.10的默认空位长度权重以及加权末端空位。实用算法的另一个实例为BLAST算法，该算法由以下科学家提出：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.215:403-10)，Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-87)。一种非常有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见例如Altschul et al.(1996)Meth.Enzymol.266:460-80)。参数“W”、“T”、“X”确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序采用的默认设置为：字长(W)＝11，BLOSUM62计分矩阵(参见例如Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)＝50，期望值(E)＝10，M＝5，N＝4，比较两条链。
如本文所用，短语“基本类似”和“基本相同”，在提到至少两种核酸或多肽的语境中，通常是指多核苷酸或多肽包含的序列与参考(即野生型)序列的同一性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或甚至至少约99％或更多。可利用已知程序(例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL)，设置标准参数，来测定序列同一性。(参见例如Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Henikoff et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915；Karin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873；Higgins et al.(1988)Gene 73:237-244)。用于执行BLAST分析的软件可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。也可使用FASTA搜索数据库(Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-48)。提示两条多肽基本相同的一种迹象是第一条多肽与第二条多肽可发生免疫交叉反应。通常情况下，因保守氨基酸置换而不同的多肽可发生免疫交叉反应。所以，例如在某条多肽与第二条多肽只因保守氨基酸置换而不同的情况下，这两条多肽基本相同。提示两条核酸序列基本相同的另一种迹象是这两个核酸分子在严格条件(例如，在中等严格度至高严格度范围内)下彼此杂交。
如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”同义，都指编码蛋白或RNA并引导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的繁殖体通常是单倍体，所以特定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定的表型。
如本文所用，表述“使基因缺失”是指从宿主细胞的基因组中除去基因。在基因包含控制元件(例如增强子元件)，这些控制元件又不紧邻基因编码序列的情况下，“使基因缺失”是指使基因编码序列、任选地使相邻的启动子序列和/或终止子序列缺失。
如本文所用，“使基因破坏”广义上是指在宿主细胞中进行的任一种基本阻止细胞产生功能基因产物(例如蛋白)的基因操纵或化学操纵。使基因破坏的示例性方法包括：完全或部分缺失基因的任一部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另外的调控元件)；或诱变基因的任一部分，其中诱变涵盖置换、插入、缺失、倒位以及这些改变的组合与变型，这些突变中的任一种基本阻止细胞产生功能基因产物。
如本文所用，“基因操纵”是指例如使用优先作用于预选核酸序列的大分子(即酶和/或核酸)，来改变预选目标核酸序列。按这种说法，基因操纵与化学操纵的不同之处在于，化学操纵使用小分子来随机影响不是预先选择的核酸序列，使其改变。
如本文所用，“基因改变”是指基因操纵引起的细胞DNA改变，其不同于化学操纵引起的细胞DNA改变。
如本文所用，“主要遗传决定子”是指一种基因或对这种基因进行的基因操纵，在没有其他基因或未对其他基因进行基因操纵的情况下，这种基因或对这种基因进行的基因操纵是赋予特定表型的必要且充分的条件。
如本文所用，“功能多肽/蛋白”是指具有像酶活性、结合活性、表面活性之类的活性，并且未经受诱变、截短或其他修饰处理(用于消除或降低这种活性)的蛋白。功能多肽可能耐热，也可能不耐热，视具体情况而定。
如本文所用，“功能基因”是指能够被细胞成分用来生成活性基因产物(通常为蛋白)的基因。功能基因与被破坏基因的性质相反，被破坏基因经修饰，目的是不能被细胞成分用来生成活性基因产物。
如本文所用，表述—与亲本细胞(或亲本菌株)相比，变体细胞(或变体菌株)“维持或保持较高的蛋白表达和/或蛋白分泌水平”成立的条件是该变体细胞与亲本细胞的蛋白表达水平差距不足约20％、不足约15％、不足约10％、不足约7％、不足约5％、或甚至不足约3％。
如本文所用，“目的蛋白”是指需要在宿主细胞中产生的蛋白。一般来讲，目的蛋白在工业或医药应用中有重要商业价值，所以值得大量生产。需要把目的蛋白与丝状真菌细胞表达的多种其他蛋白区分开，原因是多种其他蛋白通常不是目的产物，往往被视为蛋白背景污染物。
如本文所用，表述—变体细胞(或变体菌株)与亲本细胞(或亲本菌株)相比，每单位量生物质产生的蛋白量“基本相等”成立的条件是由该变体细胞产生的蛋白量相比亲本细胞产生的蛋白量，减少不超过20％、不超过15％、不超过10％、或甚至不超过5％；其中，蛋白量被归一化为测量蛋白产量的细胞中的生物质总量，并且生物质总量可能以湿重(例如，细胞团块重量)或干重表示。
如本文所用，表述—变体细胞表达的目的蛋白量“基本类似于”亲本细胞表达的目的蛋白量，成立的条件是变体细胞与亲本细胞表达的目的蛋白量相差不足约20％、不足约15％、不足约10％、不足约5％、不足约4％、不足约3％、不足约2％，或甚至不足约1％。
如本文所用，单数冠词“一个”、“一种”、“该”、“所述”也有复数含义，除非具体语境明确规定不是这样。本文引用的所有参考文献全文以引用方式并入本文。除非另外指明，否则下列缩写/首字母缩略词具有下列含义：
EC 酶学委员会
kDa 千道尔顿
kb 千碱基
MW 分子量
w/v 重量体积比
w/w 重量比
v/v 体积比
wt％ 重量百分比
℃ 摄氏度
H2O 水
H2O2 双氧水
dH2O或DI 去离子水
dIH2O 由Milli-Q系统过滤过的去离子水
g或gm 克
μg 微克
mg 毫克
kg 千克
lb 磅
μL和μl 微升
mL和ml 毫升
mm 毫米
μm 微米
M 摩尔
mM 毫摩尔
μM 微摩尔
U 单位
ppm 份每一百万份
S和" 秒
Min和' 分钟
hr 小时
EtOH 乙醇
eq. 当量
N 标称
PCR 聚合酶链反应
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
DNA 脱氧核糖核酸
RNA 核糖核酸
FOA 氟乳清酸
ATP 腺苷-5'-三磷酸
UV 紫外
AAPN 丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺
A540 540nm波长处测得的吸光度
CMC 羧甲基纤维素
rpm 转每分钟
Δ 与缺失有关
RNAi RNA干扰
PTGS 转录后基因沉默
dsRNA 双链RNA
RdRP RNA依赖性RNA聚合酶
siRNA 小干扰dsRNA
POI 目的蛋白
PPD PAZ piwi结构域
DOE 美国能源部
JGI 联合基因组研究院
APY 氨肽酶Y
3PP 氨肽基三肽酶
CBH1 纤维二糖水解酶1
CBH2 纤维二糖水解酶2
III.通过破坏RNAi机制来提高转基因表达
本发明描述了一种通过将可降低RNA干扰(RNAi)量的基因改变引入真核细胞来提高该细胞中的转基因表达水平的方法。本发明还描述了通过这种方法制备的细胞。之前就有文献讲述过可利用RNAi来降低基因表达，但迄今为止尚未有人提出可借助破坏RNAi来提高转基因表达。现已发现，RNAi缺陷型细胞成为高水平表达转基因所编码的目的蛋白(POI)的优异生产性宿主，包括提升细胞的最高表达水平，提升多个转化株的平均表达水平，还可解决在将转基因的多个拷贝引入细胞过程中某一时刻观察到的表达水平降低问题。RNAi被破坏的细胞不出现生长缺陷，至少在深层培养物分批发酵过程中不出现生长缺陷。
引入一种或多种基因改变，破坏与RNAi机制相关的一个或多个基因，便可破坏RNAi机制。示例性基因包括：qde-1，其编码细胞的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)；qde-2，其编码Argonaute或PAZ piwi结构域(PPD)蛋白；qde-3，其编码RecQ DNA解旋酶；qip，其编码与QDE-2相互作用的核酸外切酶；dcl-1和dcl-2，它们编码Dicer样蛋白，Dicer样蛋白参与dsRNA分子的加工，以ATP依赖性方式将dsRNA分子加工成长度为约21至25个核苷酸的siRNA。Dicer样蛋白在有些生物体中，似乎存在功能上的部分冗余。已在多种生物体(包括丝状真菌、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞)中鉴别出前述基因的同源物。借助氨基酸序列比对和其他成熟的生物信息学技术，可鉴定另外的同源物。
使用任一种适宜的方法来基本阻止一种或多种前述基因编码的功能蛋白表达，就可破坏一种或多种前述基因。使基因破坏的示例性方法包括完全或部分缺失基因，包括完全或部分缺失(例如)编码序列、启动子、终止子、增强子或另外的调控元件。使基因破坏也可通过完全或部分缺失染色体的一部分(包括基因的任一部分)而实现。使基因破坏还可通过在基因任一部分(例如，编码序列、启动子、终止子、增强子或另外的调控元件)进行核苷酸置换或插入而实现。尽管可通过化学诱变来进行缺失、插入和/或置换(总称突变)，但优选采用序列特异性分子生物学技术、通过基因操纵来进行缺失、插入和/或置换。
基因突变可能有下列作用：降低启动子的效率；降低增强子的效率；妨碍mRNA拼接或编辑；妨碍mRNA翻译；将终止密码子引入编码序列，阻止翻译出全长蛋白；改变蛋白编码序列，产生活性较低或失活的蛋白，或降低蛋白与其他细胞成分的相互作用；改变蛋白编码序列，产生不太稳定的蛋白，或靶向蛋白进行破坏；导致蛋白错误折叠或出现不当修饰(例如发生糖基化)；或者妨碍蛋白在细胞内转运。一般来讲，这些及其他基因操纵的目的是降低或阻止与RNAi相关的功能蛋白表达，或者降低或阻止这类蛋白的正常生物活性。
使基因破坏的示例性方法包括位点特异性重组、靶向插入、利用转座元件、利用病毒转导以及化学诱变。使基因破坏还可通过下述操作实现：同步插入或相继插入(例如)选择性标记、荧光标记或其他可辩认标记、克隆位点或克隆盒、指纹序列，便于后续能够鉴定菌株；或者进行其他基因修饰，使所得细胞更容易被区分开或增加所得细胞的功能。
RNAi机制被破坏的细胞可能已包含期望以高水平表达的目的转基因的一个或多个拷贝。另一种方法是，可以先破坏细胞的RNAi机制，再把目的转基因的一个或多个拷贝引入细胞。还有一种方法是，可以在破坏与RNAi相关的基因的过程中，引入目的转基因的一个或多个拷贝。照此看来，本发明的方法设想的是在与RNAi相关的基因位点处整合转基因，因而在将转基因加入细胞染色体的同时，就可破坏RNAi机制。
RNAi机制可能被破坏的真核细胞包括源自人类、猴和啮齿动物的细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH/3T3细胞、COS细胞、293细胞、VERO细胞、昆虫细胞(例如果蝇属(Drosophila)昆虫细胞和鳞翅目昆虫细胞)、植物细胞(例如烟草细胞、玉米细胞、大米细胞、藻类细胞和浮萍属细胞)、真菌细胞(例如酵母细胞和丝状真菌细胞)。示例性丝状真菌细胞来自子囊菌门下的盘菌亚门，尤其是处于营养菌丝状态的那些。具体的示例性真菌细胞是那些用于生产有重要商业价值的工业用蛋白和药用蛋白的真菌细胞，包括但不限于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种、木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰孢属(Fusarium)物种、丝孢菌属(Scedosporium)物种、青霉菌属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头孢霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)物种、毁丝霉属(Myceliophthora)物种、脉孢菌属(Neurospora)物种。特别的生物体包括但不限于里氏木霉[先前归类为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)]、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、分解乌头酸曲霉(Aspergillusitaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、多育赛多孢(Scedosporium prolificans)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌(白乔史密斯霉)(Talaromyces(Geosmithia)emersonii)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)以及拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。
本发明的方法和变体细胞可用于众多应用。这些方法和变体细胞可能有下列用途：提升生产性生物体中的转基因表达水平，从而在生产工业用蛋白或药用蛋白的过程中提高蛋白的产量和相对纯度；缩短在转染、转化或转导转基因之后鉴别可高水平表达蛋白的细胞所需的时间；缩短鉴别能够高水平表达蛋白的生产性宿主所需的时间；减少与使用多个转基因拷贝相关的问题，使用多个转基因拷贝可能显著降低某些宿主生物中的蛋白表达水平；提升细胞中的转基因表达，在这种情况下，转基因所编码蛋白的量增加，导致目的代谢物的量增加。
本领域技术人员在阅读前述具体实施方式和所附实施例部分后，能够清楚地知道本发明方法和变体细胞的这些和其他的方面和实施方案。
实施例
实施例1：构建含被破坏的dcl1基因和dcl2基因的里氏木霉菌株
A.鉴别里氏木霉中的dicer基因
(WO2012/054554和US2012107872)已描述了DURAΔEG5 18菌株。我们将该菌株的衍生菌株653MU用作本实施例的起始物。653MU与DURAΔEG5 18相比，另外有三处基因缺失(两种纤维素酶基因：egl3和egl6，一种甘露聚糖酶基因man1)。653MU还缺少功能性基因pyr2(其编码乳清酸磷酸核糖转移酶)。这些缺失对本发明的方法或变体细胞都无关紧要。
我们使用粗糙脉胞菌DCL1和DCL2蛋白(分别由dcl1基因和dcl2基因编码)的序列，在美国能源部(DOE)联合基因组研究院(JGI)的数据库中进行同源性检索，鉴别出了编码两种推定Dicer样酶的里氏木霉基因。Trire2.0中的蛋白ID 69494与粗糙脉胞菌DCL1蛋白的同源性最高，故本文将蛋白ID 69494称为里氏木霉DCL1蛋白，而将编码该蛋白的基因称为dcl1。JGI的注释提到，Trire 2.0中蛋白69494的N端不含甲硫氨酸残基，因此这条注释可能不完全准确。为实现本实施例的目的，我们假设真正的N端位于JGI所注释序列中第一个残基上游第126位氨基酸残基处。我们预测里氏木霉中的DCL1蛋白总长超过1,400个氨基酸残基，这些残基为基因破坏提供了相当多的靶标。Trire 2.0中的蛋白ID 69494与粗糙脉胞菌DCL2蛋白的同源性最高，故本文将蛋白ID 69494称为里氏木霉DCL2蛋白，而将编码该蛋白的基因称为dcl2。
B.制备dcl1破坏载体
按以前使用DNA构建体破坏纤维素酶基因的方法(参见例如WO2012/054554和US2012107872)，使用DNA构建体来破坏基因。破坏盒包含下列区段(依次从5'到3')：(i)5'旁侧区，即1至1.5kb长的pyr2标记基因；(ii)0.5至0.7kb长的“重复”区，选自5'旁侧区更上游的初始染色体序列；最后是(iii)1至1.5kb长的3'旁侧区。这种方法如图1所示。
可采用标准技术，以许多不同的方式组装这种破坏盒。或者，可从头合成破坏盒。下文会详细描述用于破坏dcl1基因的具体方法。表1列出了多种引物。
表1：用于构建dcl1破坏载体的PCR引物
Figure BDA0000959648940000161
首先，以里氏木霉653MU的染色体DNA为模板，分别使用引物对DCL_5加DCL_31和DCL_51加DCL_3，扩增出标示为5'旁侧区和3'旁侧区的两个区域(图2)。采用琼脂糖凝胶电泳纯化1.6kb和1.5kb长的产物，以约1:1的比率混合，将混合物用作PCR反应的模板，与一对引物DCL_5加DCL_3反应，制得3.1kb长的融合产物。使用Invitrogen提供的试剂盒，将该片段克隆进pCRTM-Blunt
Figure BDA0000959648940000172
载体，生成质粒pCR(DCL1UD)。
以里氏木霉653MU的染色体DNA为模板，按平行方式，使用引物DCL1R_5加DCL1R_3扩增dcl1重复区(图2)，使用引物oPYR2_55和oPYR2_35扩增里氏木霉pyr2基因。然后将两个片段各自克隆进pCRTM-Blunt
Figure BDA0000959648940000173
载体，分别生成质粒pCR(DCL1R)和pCR(FlexiPyr2)。用限制性核酸内切酶SalI和BglII消化质粒pCR(DCL1UD)，再利用制备性琼脂糖电泳分离出5.7kb长的DNA片段。用XbaI和BamHI消化质粒pCR(DCL1R)，从中切除含dcl1重复区的0.6kb长片段。用XhoI和SpeI消化质粒pCR(FlexiPyr2)，从中切除含pyr2基因的1.7kb长片段。纯化这两个DNA片段，然后在存在DNA连接酶的情况下与用SalI加BglII消化过的pCR(DCL1UD)载体一起温育，依靠由XhoI和SalI、SpeI和XbaI、以及BamHI和BglII产生的配伍末端进行连接。所得载体pCR(DCL1RPyr)携带组装完毕的dcl1基因破坏盒。
C.制备dcl2破坏载体
构建dcl2破坏载体的方法与构建dcl1破坏载体的方式类似。下文将详细讲述该方法，引物列于表2中。
表2：用于构建dcl2破坏载体的PCR引物
Figure BDA0000959648940000171
Figure BDA0000959648940000181
分别使用引物对oDCL2_56加oDCL2_37和oDCL2_57加oDCL2_36，对5'旁侧区(1.6kb)和3'旁侧区(1.3kb)进行PCR扩增。然后执行融合PCR，步骤如下：用琼脂糖凝胶电泳纯化这两种PCR产物，使用两者的混合物为模板，与引物oDCL2_56加oDCL2_36进行反应。将得到的2.9kb长融合产物克隆进pCRTM-Blunt
Figure BDA0000959648940000182
载体，生成质粒pCR(DCL2_UD)。
使用oDCL2R_5加oDCLR_3扩增dcl1重复区(0.7kb)。使用XbaI和BamHI消化PCR产物。使用SalI和BglII消化pCR(DCL2_UD)，再纯化得到的大片段。如前所述，用XbaI和SpeI消化pCR(FlexiPyr2)，从中切除pyr2基因。在存在DNA连接酶的情况下将这三个片段一起温育，得到dcl2基因破坏载体pCR(DCL2RPyr)，这也依靠由SpeI和XbaI、以及BamHI和BglII产生的配伍末端进行连接。
生成携带被破坏dcl1基因的里氏木霉菌株的操作如下：使用以pCR(DCL1RPyr)为模板并以DCL1_5加DCL1_3为引物获得的约4.4kb长PCR产物，转化菌株653MU。分离一组稳定的原养型转化株，再分离出它们的染色体DNA，使用引物对oDCL1R_D1加oDCL1D_R1(表3和图3)，通过PCR分析染色体DNA。分析显示生成了1.67kb长PCR产物，表明转化DNA己同源整合到里氏木霉染色体的dcl1基因座处。再取一份这种克隆产物，使用引物oDCL1R_D1加oDCL1D_R2分析其DNA。分析显示生成了1.8kb长产物，证实破坏盒已正确整合到dcl1基因座处。使携带被破坏dcl1基因的转化株形成孢子，将孢子悬液接种到补充有1.2g/L氟乳清酸(FOA)的琼脂基本培养基上。因为这种菌株的染色体中有“重复区”的两个拷贝(图4A)，所以两条重复序列通过高频通过同源重组而生成耐受FOA的pyr2突变株。接着，重复序列的两个拷贝之间的DNA在通常被称作“环出”的过程中丢失，得到图4B所示的结构。为了在缺失dcl1基因并切除pyr2标记后核实dcl1染色体区域的正确结构，从数株耐受FOA的菌株提取DNA。使用引物对oDCL1FU_D1加oDCL1D_R2以及oDCL1FU_D2加oDCL1D_R1，执行PCR分析。结果在所有受检克隆中分别检测到了2.3kb和2.4kb长的PCR产物。这正是切除标记之后，已缺失dcl1基因周围的染色体结构预期生成的PCR产物的长度(图4B)。将这些能生成预期的PCR产物的耐受FOA克隆之一命名为356MUΔdcl1菌株。
表3：用于dcl1和dcl2缺失定位的引物
Figure BDA0000959648940000191
以质粒pCR(DCL2RPyr)为模板，使用引物oDCL2_56加oDCL2_36生成4.75kb长PCR产物，用该PCR产物来转化菌株356MUΔdcl1，使其转变成尿苷原养型菌株。分离各克隆的染色体DNA，使用引物对oDCL2R_D1加oDCL2D_R1执行PCR分析，从而筛选出稳定的原养型转化株。取产生预期长度(1.86kb)PCR产物的转化株，使用另一组引物(oDCL2R_D2与oDCL2D_R2)进一步分析。观察到了2.1kb长的PCR产物，证实在该克隆中，破坏盒已整合到dcl2位点处(图5B)。然后使用FOA，采用与上述相同的方式，切除该克隆中的标记。使用引物oDCL2_5F和oDCLD_R1，对耐受FOA克隆进行PCR分析。获得预期长度(2.4kb)的PCR产物后，将其克隆进PCRTM-Blunt
Figure BDA0000959648940000202
载体，进行DNA测序。测序数据证实，在缺失dcl2基因并切除pyr2标记之后，dcl2染色体基因座具有预期的结构。将通过了所有PCR和测序核查的菌株命名为DiMorph，使用该菌株研究里氏木霉中基因压制体系失活造成的影响。
实施例2：检测存在强效基因压制和基因压制被破坏的里氏木霉菌株中目的蛋白 的表达
我们使用了两种不同的分泌性蛋白分解蛋白来研究里氏木霉中基因压制体系失活造成的影响。一种蛋白是与多种生物体的氨肽酶Y同源的蛋白，称为APY(Trire 2.0中的蛋白ID 81070)。另一种蛋白是氨肽基三肽酶的同源物，称为3PP(Trire 2.0中的蛋白ID82623)。使用在研究里氏木霉表达时经常使用的功能元件构建APY和3PP的表达盒。表达由cbhI启动子驱动，编码序列在3'端上侧接cbhI转录终止子。为每个目的基因构建两个相似的表达载体：(i)携带amdS标记基因的载体(即pTrex3gM(APY)和pTrex3gM(3PP))，和(ii)携带pyr2标记基因的载体(即pTrex8gM(APY)和pTrex8gM(3PP))。
组装表达盒的方法是基因工程领域的常规方法，本文不作详细描述。简言之，通过PCR扩增APY和3PP基因的编码序列，将其克隆进pENTRTM/D
Figure BDA0000959648940000203
载体(Invitrogen)，然后使用
Figure BDA0000959648940000204
LR
Figure BDA0000959648940000205
酶混合物(Invitogen)，在cbhI启动子与终止子之间插入克隆的编码序列。或者，可直接从DNA合成服务供应商处订购APY和3PP表达盒。使用表4列出的引物，以前述载体为模板制备不含细菌载体序列的表达盒。引物oTrex3_AMP_5在所有反应中均用作正义引物。引物oTrex3_Amds_3则用作反义引物来扩增携带amdS标记的表达盒(以pTrex3gM(APY)和pTrex3gM(3PP)为模板)，并且以类似方式使用引物oTrex8_Pyr2_3来扩增携带pyr2标记的表达盒(以pTrex8gM(APY)和pTrex8gM(3PP)为模板)。最后，使用反义引物oCBHT_3(以pTrex3gM(APY)和pTrex3gM(3PP)为模板)来扩增无标记表达盒，该表达盒在共转化实验中用作“过客”DNA。
表4：用于扩增表达盒的APY和3PP基因的引物
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然后评估基因压制破坏对目的蛋白的表达水平的影响，步骤如下：以pyr2为转化标记，用APY和3PP表达盒转化DiMorph，和几乎等基因但基因压制呈阳性的里氏木霉菌株CelluLight(653MU，另外缺失了编码内切葡聚糖酶4的egl4基因)。在每个转化实验中，使用约10μg携带pyr2标记的PCR产物和30μg无标记表达盒(携带相同的目的基因)。采用标准的原生质体-PEG方法执行转化(
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M.et al.(1987)Gene 61:155-164)。
第一个实验使用经含pyr2标记的APY表达盒转化的DiMorph和CelluLight菌株，从每种菌株中大约取出30个显示稳定表型的转化株，置于甘氨酸槐糖培养基(6g/L甘氨酸，4.7g/L硫酸铵，5g/L磷酸二氢钾，1g/L七水硫酸镁，33g/L PIPPS，1g/L经高压灭菌氯化钙，16g/L葡萄糖，0.3g/L槐糖)中培养6天。将培养物置于含1mM氯化锌和2mM赖氨酸对硝基苯胺的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，室温(25℃)下测定APY蛋白的氨肽酶活性。测量410nm处的吸光度，由此评估反应的动力学规律。从图6的柱状图可以看出，这两组转化株的APY活性分布截然不同。就基因压制呈阳性的CelluLight菌株来说，所有转化株中约有一半未测出APY活性，而基因压制被破坏的DiMorph菌株中几乎全部转化株都产生了APY活性。基因压制被破坏的菌株的平均表达水平和最高表达水平均明显更高。这些观察结果都建立在与SDS-PAGE数据密切关联的活性测量数据基础上(图7)。
第二个实验使用经含pyr2标记的3PP表达盒转化的DiMorph和CelluLight菌株，从每种菌株中大约取出40个显示稳定表型的转化株，置于前述诱导培养基中培养。然后使用三肽衍生物即丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(AAPN；Bachem)作为底物，测定转化株的三肽酶活性。该测定在含1mM AAPN的0.1M乙酸钠缓冲液(pH 4.0)中于室温下进行，通过测量410nm处的吸光度，得到对硝基苯胺的释放动力学。结果与APY表达实验的结果类似，但基因压制被破坏的菌株与存在强效基因压制的菌株(分别是DiMorph和CelluLight)的表达效率反差甚至更显著(图8)。几乎全部DiMorph转化株都产生了显著的三肽酶活性，然而只有少量CelluLight转化株产生显著的三肽酶活性。基因压制被破坏的菌株的平均表达水平和最高表达水平均明显更高。
实施例3：重复多轮转化对基因压制呈阴性和基因压制呈阳性的菌株中的目的蛋 白表达水平的影响
取由实施例2得到的包含携带pyr2标记的APY表达盒、表达水平最高的DiMorph和CelluLight转化株，将其用作第二轮转化的宿主。转化操作本身按与第一轮转化相同的方式执行，不同的是将amdS基因用作选择性标记。将从DiMorph或CelluLight宿主衍生的48个显示稳定表型的双转化株，置于甘氨酸槐糖培养基中培养，然后如前所述测定APY活性。就存在强效基因压制的里氏木霉菌株来说，48个第二轮转化株中只有一个转化株的APY活性高于任一个单轮转化株(图9)。转化株另外经历一轮转化后，得到的第二轮转化株中绝大多数活性不升反降。此外，所有双转化株中约有三分之一完全测不出APY活性。然而，就基因压制被破坏的DiMorph菌株来说，情形并非如此。虽然有些第二轮转化株的APY活性低于亲本菌株，但这些转化株都未完全丧失APY活性，而且所有双转化株中约四分之一的APY活性甚至高于其亲本(即单轮转化株)。DiMorph背景菌株中表现最高APY活性的菌株，其APY表达水平比存在强效基因压制的CelluLight背景菌株中表现最高APY活性的菌株的APY表达水平高出50％左右。
取由实施例2得到的包含携带pyr2标记的3PP表达盒、表达水平最高的DiMorph和CelluLight转化株，进行相似的实验。在该实验中，定性趋势与用APY表达盒进行的双转化实验类似。然而，这两个实验的结果在量上差异非常明显(图10)。就存在强效基因压制的菌株(CelluLight)来说，绝大多数第二轮转化株丧失了大部分3PP表达，或完全丧失了3PP表达。48个双转化株中只有一个转化株相比其亲本(即最佳的单轮3PP转化株)略有改善。然而，就基因压制被破坏的菌株(DiMorph)来说，第二轮转化后得到的多个转化株相比其第一轮转化株亲本，表达水平大约翻了一番。同样，DiMorph菌株的双转化株都没有因为另外经历了一轮转化而完全丧失3PP表达。值得注意的是，分别就单轮转化株和双轮转化株来说，DiMorph菌株中3PP表达水平最高的转化株，相比CelluLight菌株中3PP表达水平最高的转化株，3PP的产量都大约增加了两倍。
实施例4：检测存在强效基因压制和基因压制被破坏的里氏木霉菌株中的另一种 目的蛋白的表达
我们还制备了一些dcl1和dcl2基因被破坏的里氏木霉菌株，用于评估其他整合转基因的表达，这些转基因分别为棒曲霉α-淀粉酶转基因和里氏木霉纤维二糖水解酶2(CBH2)转基因，都受里氏木霉纤维二糖水解酶1(CBH1)启动子控制。这两种情况下，dcl1和dcl2基因被破坏的里氏木霉细胞与RNA干扰机制完好无损的同等细胞相比，蛋白最高表达水平和多个转化株的蛋白平均表达水平都较高(数据未示出)。
虽然出于清晰理解的目的以例证和举例的方式描述了上述组合物和方法的一些细节，对于本领域的技术人员来说可能进行某些改变和修改将是显而易见的。因此，本说明书不应理解为对本发明的范围构成限制，本发明的范围只由所附权利要求书限定。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请为一切目的特此全文以引用方式并入本文，与特别指明每份出版物、专利或专利申请悉数以引用方式并入本文的效果一致。
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Claims (9)

1.一种用于提高真菌细胞中转基因的表达水平的方法，所述方法包括将基因改变引入所述真菌细胞，与不存在所述基因改变时的RNA干扰量相比，所述基因改变降低所述细胞中的RNA干扰量，其中所述基因改变包括Dicer样基因dcl-1和dcl-2的破坏，以及引入表达目的蛋白的转基因，其中所述真菌为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因改变减少或阻止所述细胞中siRNA的形成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因的所述破坏是所述基因诱变的结果。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因的所述破坏使用位点特异性重组来进行，和/或所述基因的所述破坏与在所述基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中与不含所述基因改变的同等细胞产生的每单位量生物质的蛋白量相比，所述细胞产生相同量的每单位量生物质的蛋白总量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述转基因的附加拷贝引入所述细胞，其中，将所述转基因的附加拷贝引入所述细胞后，所述转基因的表达水平不低于将所述转基因的附加拷贝引入所述细胞之前所述转基因的表达水平。
7.一种衍生自亲本真菌细胞的变体真菌细胞，所述变体细胞包含基因改变以及编码目的蛋白的转基因，所述基因改变使所述变体细胞表现出比所述亲本细胞低的RNA干扰，其中所述基因改变包括编码Dicer样蛋白DCL1和DCL2的基因的破坏；其中与所述亲本细胞相比，所述变体细胞能够产生更高水平的由转基因编码的目的蛋白，和/或在所述转基因转化之后，所述变体细胞中由所述转基因编码的目的蛋白的平均表达水平更高；其中与不含所述基因改变的同等细胞产生的每单位量生物质的蛋白量相比，所述变体细胞产生相同量的每单位量生物质的蛋白量。
8.根据权利要求7所述的变体细胞，其中所述破坏是所述基因的诱变，和/或所述破坏是所述基因的部分或全部缺失，和/或所述基因的所述破坏使用位点特异性重组来进行，和/或所述基因的所述破坏与在所述基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
9.根据权利要求7所述的变体细胞，所述变体细胞还包含编码目的蛋白的转基因的多个拷贝。
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