CN103119159A - 里氏木霉内切葡聚糖酶i的嗜热突变体 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，包括突变体里氏木霉内切葡聚糖酶I。具体而言，本公开涉及突变体热稳定的酶、包含该酶的组合物以及它们的用法。

Description

里氏木霉内切葡聚糖酶I的嗜热突变体
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年9月15日提交的美国临时申请No.61/383,240、以及2010年12月10日提交的美国临时申请No.61/422,081的优先权，这些申请公开以引用方式全文并入本文。
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以下提交的ASCII文本文件形式的内容以引用方式全部并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：677792001140SEQLISTING.TXT，记录日期：2011年8月8日，大小：8KB)。
技术领域
本公开涉及包含氨基酸突变的热稳定糖基水解酶家族7的酶，包括得自里氏木霉的内切葡聚糖酶。具体而言，本公开涉及包含里氏木霉内切葡聚糖酶的组合物、以及它们的使用方法。
背景技术
在将生物质的纤维质内容物转化为可发酵的糖以用于生物燃料的生产中，纤维素酶目前受到了相当大的关注。有多种酶(外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)同样地将纤维素水解为葡萄糖。由于丝状真菌里氏木霉能够显著地分泌大量的水解纤维素的酶，所以其为工业上使用的纤维素酶生产者(＞50g/L)。该真菌至少生产出7种用于结晶纤维素完全降解的细胞外纤维素酶。这些酶包括：2种外切葡聚糖酶，称为Cel7A和Cle6A(CBH I和CBH II)，它们分别占总纤维素酶含量的50％和20％；以及5种内切葡聚糖酶Cel7B、Cel5A、Cel12A、Cel61A和Cel45A(EG1、EG2、EG3、EG4和EG5)，它们分别占总纤维素酶含量的15％、10％、1％、＜1％和＜1％。
在高温下使用纤维素酶进行木质纤维素的水解具有许多潜在的优点，例如由于比浓粘度而具有较高的固体加载量，微生物污染的风险较低，在高温预处理下具有较高的相容性，以及较快的水解速率。但是，里氏木霉纤维素酶和其他真菌的酶在高温下具有相对低的活性和稳定性(Takashima，S et al.，JBiotechnol65(2-3)：163-71，1998)。生产和分泌足量的纤维素酶的能力对于由纤维质生物质经济地生产生物燃料而言是最重要的，并且由非真菌来源表达和生产嗜热纤维素酶到目前为止是非常有限的(＜100mg/L)。
因此，本领域需要能够在高温下高效地水解木质纤维素的热稳定真菌纤维素酶。
发明概述
本公开提供了满足上述需要的多肽、组合物和方法。
本公开涉及突变体热稳定的酶，包括具有内切葡聚糖酶活性的糖基水解酶家族7的酶。这些酶可以用于水解木质纤维素，具体而言，可以用于降解和水解多糖和寡糖，例如转化为可溶性的糖，从而用于(包括)生物燃料的可发酵的生产，食品的加工，纺织品的抛光和清洁，抛光结晶纤维素的生产以及纸浆的漂白。这些酶是热稳定的，它们解决了对能够在高温下高效地水解木质纤维素的水解纤维素酶的需求。本公开还涉及编码突变体热稳定酶的分离的核酸、以及包含这些核酸的载体和宿主细胞。
因此，本发明的一个方面提供了突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，该酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处包含丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。在某些实施方案中，所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处进一步包含亮氨酸或丝氨酸。在其他实施方案中，所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
本发明的另一个方面提供了突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶，该酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处包含赖氨酸。在某些实施方案中，所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处进一步包含亮氨酸或丝氨酸。在其他实施方案中，所述的酶在与SEQ IDNO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
本发明的另一个方面提供了突变体热稳定的里氏木霉内切葡聚糖酶I，该酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处包含丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处进一步包含亮氨酸或丝氨酸。在其他实施方案中，所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
本发明的一个方面提供了突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，该酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处包含亮氨酸。在某些实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
本发明的另一个方面提供了突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶，该酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处包含丝氨酸。在某些实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
在一些实施方案中，其中突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶分别在与SEQ ID NO：1的113和115比对的氨基酸处包含亮氨酸、和苏氨酸或甘氨酸，或者突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶分别在与SEQ IDNO：1的113和115比对的氨基酸处包含丝氨酸、和苏氨酸或甘氨酸，所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处包含丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的第三突变体。
本发明的另一个方面提供了突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，该酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处包含苏氨酸。
本发明的另一个方面提供了突变体热稳定的里氏木霉内切葡聚糖酶，该酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处包含甘氨酸。
在一些实施方案(该实施方案可以与任意实施方案中的之前所述的任意方面结合)中，与酶原相比，所述的酶在大约50℃下温育大约1小时后表现为热稳定性升高。在一些实施方案中，所述的酶在30、35、40、45、50、55、65或70℃下温育大约1小时。在一些实施方案中，突变体热稳定的酶温育0.5、0.75、1.25、1.5、1.75或2小时。
在某些实施方案(该实施方案可以与任意实施方案中的之前所述的任意方面结合)中，所述的酶在大约50℃下温育大约1小时后具有至少大约0.5mMole GE/μMole酶/hr的比活性。在一些实施方案中，所述的酶在大约50℃下温育大约1小时后具有0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mMole GE/μmol酶/小时的比活性。
在某些实施方案(该实施方案可以与任意实施方案中的之前所述的任意方面结合，其中在所述的方面中提供了突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶)中，所述的酶为内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。
在某些实施方案(该实施方案可以与任意实施方案中的之前所述的任意方面结合，其中在所述的方面中提供了突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的内切葡聚糖酶)中，所述的酶为里氏木霉内切葡聚糖酶I。在其他实施方案(该实施方案可以与任意实施方案中的之前所述的任意方面结合，其中在所述的方面中提供了突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的内切葡聚糖酶)中，所述的酶衍生自细菌或真菌，优选选自假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酒用酵母属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、枝顶孢属、伞菌属、交链孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉、耙菌属、香菇属、Leptospaeria、巨座壳属、Melanocarpus、亚灰树花菌属、毛霉属、毁丝霉属、新丽鞭毛菌、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、单鞭毛菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、纤维素属、根毛霉属、裂褶菌属、节格孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、炭角菌属或嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile)。
根据任意实施方案中的之前所述的任意方面，本发明的另一个方面提供了包含突变体热稳定的酶的组合物。
根据任意实施方案中的之前所述的任意方面，本发明的另一个方面提供了编码突变体热稳定的酶的分离的核酸，其中在所述的方面中提供了突变体糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的内切葡聚糖酶或里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶。
本发明的一个方面提供了表达载体，该表达载体包含之前方面所述的与调控序列可操作地连接的核酸。
本发明的另一个方面提供了包含之前方面所述的表达载体的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞选自埃希氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、劳尔氏菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、杆菌属、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、汉逊酵母菌属、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、曲霉属、Chrysosporium lucknowense或里氏木霉。
本发明的另一个方面提供了用于生产突变体热稳定的酶的方法，该方法包括将根据任意实施方案中的之前所述的方面(提供了宿主细胞)中的宿主细胞在适于生产所述的酶的条件下在培养基中培养。
本发明的另一个方面提供了包含宿主细胞和培养基的组合物，其中所述的宿主细胞是根据任意实施方案中的之前所述的方面(提供了宿主细胞)的。
本发明的另一个方面提供了在培养基的上清液中包含突变体热稳定的酶的组合物，其中所述的突变体热稳定的酶是根据任意实施方案中的之前所述的方面(提供了突变体糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的内切葡聚糖酶或里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶)的。
本发明的一个方面提供了通过以下过程来降低预处理生物质混合物的粘度的方法：将具有初始年度的预处理生物质混合物与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触；以及在足以降低所述的预处理生物质混合物的初始粘度的条件下温育经接触的生物质混合物。
本发明的另一个方面提供了将生物质转化为糖的方法，包括将生物质与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触。
本发明的另一个方面提供了水解或降解生物质的方法，包括将生物质与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触。
本发明的另一个方面提供了生产可发酵产物的方法，包括：将生物质与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而形成第一产物；以及在足以生产发酵产物的条件下培养第一产物与一种或多种可发酵的微生物。
本发明的另一个方面提供了生产发酵产物的方法，包括：将生物质与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而形成第一产物；以及在足以生产发酵产物的条件下通过化学工艺温育第一产物和化学溶液。
本发明的一个方面提供了发酵生物质的方法，包括将生物质与一种或多种可发酵微生物相接触，其中所述的生物质通过根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物进行了处理。
本发明的另一个方面提供了生产燃料的方法，包括：将生物质与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而产生糖溶液；以及在足以生产燃料的条件下培养糖溶液和发酵微生物。
本发明的另一个方面提供了生产燃料的方法，包括：将生物质与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而产生糖溶液；以及在足以生产燃料的条件下通过化学工艺温育糖溶液和化学溶液。
在其中可以与之前所述的任意方面(其提供了多种方法，包括与生物质相接触)结合的实施方案中，所述的生物质包含结晶纤维素。在其他的实施方案中，所述的生物质包含木质纤维质植物材料。在其中所述的生物质包含木质纤维质植物材料的实施方案中，木质纤维质植物材料选自：芒属、能源草、象草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、芦苇、麦秆、大麦秆、加拿大油菜秸秆、燕麦稿秆、玉米秸秆、大豆秸秆、燕麦皮、高粱、稻壳、甘蔗渣、玉米纤维、含有可溶物的酒精糟(DDGS)、须芒草、玉米穗、松树、柳树、山杨、杨木和能源甘蔗。
本发明的一个方面提供了食品加工的方法，包括将生物质与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而产生可消化的植物材料。
本发明的另一个方面提供了纺织品抛光的方法，包括将纺织品与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而产生抛光的纺织品。
本发明的另一个方面提供了纺织品清洁的方法，包括将污染的纺织品与根据之前所述的提供了组合物的方面中组合物相接触，从而产生清洁的纺织品。
本发明的一个方面提供了纸浆漂白的方法，包括将纸浆与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而产生漂白的纸浆。
本发明的另一个方面提供了生产抛光的结晶纤维素的方法，包括将结晶纤维素与根据之前所述的提供了组合物的方面中的组合物相接触，从而产生抛光的结晶纤维素。
本发明的一个方面提供了洗衣液组合物，该洗衣液组合物包含根据任意实施方案中的之前所述的方面中的突变体热稳定的酶、以及洗衣液，其中之前所述的方面提供了突变体糖基水解酶家族7的酶、或GH7家族的内切葡聚糖酶、或里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶。
本发明的另一个方面提供了食品添加剂，该食品添加剂包含根据任意实施方案中的之前所述的方面中的突变体热稳定的酶，其中之前所述的方面提供了突变体糖基水解酶家族7的酶、或GH7家族的内切葡聚糖酶、或里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶。
在其中可以与任意实施方案中的之前所述的任意方面(其提供了多种方法，包括接触生物质、植物材料、纺织品、污染的纺织品、纸浆或结晶纤维素)结合的某些实施方案中，所述的接触是在大约50℃至大约55℃的温度、在大约55℃至大约60℃、或者大约60℃至大约70℃的温度下实施的。在优选的实施方案中，所述的接触是在大约50℃至大约55℃的温度下实施的。在其他的实施方案中，所述的接触是在大约60℃至大约70℃的温度下实施的。在一些实施方案中，在接触之前对生物质、植物材料、纺织品、污染的纺织品、纸浆或结晶纤维素进行预处理。
附图说明
图1示出了得自里氏木霉的内切葡聚糖酶I的晶体结构。(a)示出了具有标记为A-G的突变位点的结构。(b)示出了具有标记为氨基酸G230、D113和D115的结构的两个图。蛋白质数据库(PDB)密码为1EG1(Kleywegt，GJ et al.，JMolBiol272(3)：383-397，1997)。
图2示出了野生型里氏木霉EGI的无细胞表达的最佳氧化还原电势。
图3示出了在不同温度下野生型里氏木霉EGI的活性。(a)示出了通过DNS方法测量的在不同的时间长度、不同的温度下温育后，TrEGI的活性。(b)示出了通过在CMC平板上形成斑点来测量的在不同的时间长度、不同的温度下温育后，TrEGI的活性。
图4示出了针对改善的热稳定性来筛选和选择突变体里氏木霉EGI的方案。
图5示出了在热处理之前(左侧)和热处理之后(右侧)里氏木霉EGI突变体的CMC平板测试。
图6示出了不同时间长度的热处理对通过筛选工艺鉴别的里氏木霉EGI突变体的活性的影响。根据突变体在96孔板中的位置在y轴中标记该突变体。
图7示出了在50℃下热处理45分钟之前(a)和之后(b)测试的里氏木霉EGI突变体的活性。
图8示出了导致热稳定性增加的在里氏木霉EGI的G230处的取代。
图9示出了在氨基酸230处的不同的突变对里氏木霉在50℃下的热稳定性的影响。不同的系列表示在50℃下不同的温育时间，然后进行活性测量。GE表示“葡萄糖等价物”。
图10示出了热处理对在位点C(氨基酸113和115)具有突变的里氏木霉EGI的活性的影响。GE表示“葡萄糖等价物”。
图11示出了在氨基酸230、113和115处的突变对里氏木霉EGI在50℃和53℃下的热稳定性的影响。突变体经过不同时间长度的热处理。GE表示“葡萄糖等价物”。
图12示出了里氏木霉EGI突变体对不同纤维质底物的活性。(a)和(c)示出了对
Figure BDA00002907635000081
的活性，而(b)和(d)示出了对
Figure BDA00002907635000082
的活性。GE表示“葡萄糖等价物”。
图13示出了里氏木霉EGI突变体多种底物的活性的比较。(a)示出了对CMC、
Figure BDA00002907635000091
和
Figure BDA00002907635000092
的活性的比较。(b)示出了对
Figure BDA00002907635000093
的活性的比较。(c)示出了对
Figure BDA00002907635000094
的活性的比较。GE表示“葡萄糖等价物”。
图14示出了在不同温度下里氏木霉EGI突变体的无细胞提取物对的活性。GE表示“葡萄糖等价物”。
图15示出了在不同温度下里氏木霉EGI突变体的无细胞提取物对
Figure BDA00002907635000096
的活性。GE表示“葡萄糖等价物”。
图16示出了在不同温度下在酵母菌中表达的具有修整的糖基化的里氏木霉EGI突变体对
Figure BDA00002907635000097
的活性。GE表示“葡萄糖等价物”。
图17示出了在酵母菌中表达的具有修整的糖基化的里氏木霉EGI突变体对
Figure BDA00002907635000098
的T50。
图18示出了在不同温度下在酵母菌中表达的具有修整的糖基化的里氏木霉EGI突变体对
Figure BDA00002907635000099
的活性。GE表示“葡萄糖等价物”。
发明详述
本公开涉及突变体热稳定的酶，包括糖基水解酶家族7的酶，例如内切葡聚糖酶，这些酶在某些氨基酸残基上具有突变。本公开进一步涉及包含突变体热稳定的酶的组合物和表达该酶的宿主细胞，以及它们的使用方法。
I.定义
除非另作说明，否者所有的科学和技术术语均被理解为与这些术语所属的技术领域中常用的含义相同。就本公开的目的而言，定义以下术语。
如本文所用，术语“氨基酸”是指蛋白质的化学构建单元。其包含在蛋白质中常发现的20种标准的氨基酸以及它们的经化学修饰的版本或类似物。
如本文所用，术语“多肽”是指通过肽键连接的单链氨基酸残基构成的化合物。术语“蛋白质”与术语“多肽”是同义的。
如本文所用，术语“酶”是指起到催化功能的多肽。其可以不仅涵盖多肽的催化部分，而且还涵盖可能具有或可能不具有与这些催化结构域的功能不同的功能作用的其他结构域或模体。这些其他的结构域或模体可以得自在自然界发现的多肽或者在商业上发现的其他多肽。
如本文所用，术语“野生型”是指多肽或基因的非突变版本，如同其在物种中自然出现的一样。
如本文所用，术语“比对”是指两条多肽在结构上或功能上比对。如果两种或多种多肽中的氨基酸在不同的多肽中定位于相同的位置，则这些氨基酸被认为是比对的。此外，如果两种或多种多肽中的氨基酸在不同的多肽中发挥相同的功能，则这些氨基酸也被认为是比对的。例如，在两种或多种酶中比对的氨基酸在(例如)各种酶中或在底物中会形成相同的接触；或者在酶功能过程中发挥相同的催化作用。比对可以使用本领域公知的运算法来实施。
如本文所用，术语“热稳定的”描述了蛋白质能够经受有限地暴露于某些温度(例如高温)而不会损失其在其活性是可测量的或是最佳的温度下所具有的活性的性质。术语“活性”定量地描述了给定底物在所定义的反应条件下的转化。术语“比活性”定量地描述了在所定义的反应条件下每一定量的酶的活性。
如本文所用，术语“纤维素酶”是指催化酶反应的酶(或其酶活性)，包括具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(例如葡聚糖水解酶或纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶葡萄糖水解酶)活性以及这些酶的相应酶活性的酶，其中在所述的酶反应中，纤维素被水解成葡萄糖、纤维二糖或纤维三糖。
如本文所用，术语“木质纤维素”是指主要由纤维素、半纤维素和木质素构成的任何材料。
如本文所用，术语“糖基水解酶家族7的酶”是指术语糖基水解酶家族7的酶。术语“GH7”与糖基水解酶家族7是同义的。术语“GH7家族内切葡聚糖酶”是指在具有内切葡聚糖酶功能的糖基水解酶家族7的酶。
II.突变体热稳定的酶
本公开涉及在某些氨基酸残基上包含突变的热稳定的酶，包括术语糖基水解酶家族7的酶。申请人不希望被任何理论所束缚；但是据信，热稳定性的增加可以通过挠性位点处的残基突变而取得，这可以通过酶结晶过程中高的B因子值来表征。在优选的实施方案中，所述的酶为在与SEQ IDNO：1的氨基酸230、113或115比对的氨基酸处具有突变的里氏木霉内切葡聚糖酶I(TrEGI)。在其他实施方案中，所述的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230和/或113和/或115比对的氨基酸位置处具有突变的糖基水解酶家族7(GH7)的成员。
氨基酸序列的比对
与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113或115比对的糖基水解酶家族7的成员的氨基酸为与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113或115在结构上比对的那些。与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113或115比对的糖基水解酶家族7的酶的氨基酸可以定位于与在SEQ ID NO：1中相同的位置；更可能的是，它们未在与SEQ ID NO：1的参照序列的相同位置处发现它们。例如，糖基水解酶家族7的酶除了在氨基酸位置1处具有额外的蛋氨酸外，可以具有与SEQ ID NO：1一致的序列。在这种情况下，在所述酶的位置231处的残基甘氨酸与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对。再例如，得自炭色旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum)的纤维二糖水解酶I(CBHI)的氨基酸赖氨酸238(用于不具有信号肽的成熟酶的残基编号)与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对。例如，通过使用运算法鉴别比对的氨基酸，一些运算法将在下文讨论。
在比较窗或设计区域上，可以比较和比对两条或多条多肽序列的最大相关性，这可以使用以下一种序列比较运算法或者通过人工比对和视觉检查来测量。就序列比较而言，通常，一条序列起到用于比较测试序列的参照序列。但使用序列比较运算法时，将测试序列和参照序列都输入计算机，如果需要设计子序列坐标系，并设计序列运算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或者可以设计备选的参数。如本文所用，“比较窗”包含指连续位置编号的任意一个编号的节段，包括但不限于从20至600，通常大约50至大约200，更通常为大约100至大约150，其中在两条序列经最佳比对之后，可以将一条序列与相同的连续位置编号的参照序列比较。序列比对方法是本领域公知的。其实例为使用BLAST运算法，其在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res25(17)：3389-3402中有所描述。序列最佳比对的其他实例为Smith和Waterman(1981)的本地同源性运算法，Needleman andWunsch(1970)J Mol Biol48(3)：443-453的同源性比对运算法，Pearson andLipman(1988)Proc Natl Acad Sci USA85(8)：2444-2448的相似性方法的检索，这些运算法的计算机实施(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in theWisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575ScienceDr.，Madison，WI)，以及人工比对和目视检验[例如参见Brent et al.，(2003)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(RingbouEd)]。
更优选的是，与参照序列的其他特定氨基酸在结构上比对的氨基酸可以通过比较晶体结构以鉴别相似的结构模体和挠性区域来鉴别，其中挠性区域通过高的B因子值来表征。
氨基酸的突变或取代
所述的酶由包含多个保守的聚合氨基酸残基的氨基酸序列构成。除非另作说明，否则特定的氨基酸序列还无疑涵盖了其保守的经修饰的变体。突变体是指其中一个或多个氨基酸残基通过本领域已知的技术由野生型序列改变的酶。用于改变氨基酸序列的技术包括但不限于定点突变、盒式诱变、随机突变、合成寡核苷酸的构建、克隆以及其他基因工程改造技术(Eijsink V G，et al.，2005.Biomol.Eng.22：21-30)。在本公开中改变的结果是，突变体的酶的热稳定性增加。
在与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113或115比对的氨基酸处包含突变的氨基酸残基的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在该酶的野生型氨基酸序列中在与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113或115比对的氨基酸处具有突变的酶。例如，如果里氏木霉内切葡聚糖酶I的野生型序列为SEQ ID NO：1，突变体里氏木霉内切葡聚糖酶I可以具有其中在氨基酸230、113或115处具有突变的或取代的氨基酸的SEQ ID NO：1序列。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶具有这样的氨基酸残基，该氨基酸残基与SEQ ID NO：1的氨基酸230和/或113和/或115比对，并在氨基酸中被取代/突变成残基丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸。在一些实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为内切葡聚糖酶。更优选的是，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为里氏木霉内切葡聚糖酶I。
所述的突变包含使用天然形成的标准的20种氨基酸残基、保守修饰的变体氨基酸残基、非密码子编码的天然形成的氨基酸残基以及非天然形成的氨基酸残基来取代氨基酸。突变的结果是，所述的酶的热稳定性增加。
如本文所用，“保守修饰的变体氨基酸”包含单独的取代、删除或加入到氨基酸序列中，这会导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供了功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。以下8组包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(例如参见Creighton，Proteins(1984))。
除了20种标准的氨基酸，非标准的氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸以及α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、非基因密码子编码的氨基酸以及非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后可以被改性，和/或在它们的侧链中具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以是化学合成的，优选的是市售可得的，并且包括哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、以及3，3-二甲基脯氨酸。
糖基水解酶家族7的酶
在一些实施方案中，突变体热稳定的酶属于糖基水解酶家族7。最优选的是，糖基水解酶家族7的酶可以为内切葡聚糖酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或外切纤维素酶。在一些实施方案中，GH7酶为内切葡聚糖酶。最优选的是，内切葡聚糖酶为具有SEQ ID NO：1的里氏木霉内切葡聚糖酶I。在一些优选的实施方案中，内切葡聚糖酶包含碳水化合物结合结构域(CBM)。在其他实施方案中，内切葡聚糖酶缺乏CBM。
在一些实施方案中，所述的酶得自细菌。细菌物种可以为革兰氏阳性的，例如杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭状芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属或大洋芽孢杆菌属；或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、缠绕杆菌属、产黄菌属、梭形杆菌属、泥杆菌属、奈瑟菌属或脲原体属。在一些优选的实施方案中，所述的酶得自嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌（Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus formus、Bacillus lautus、缓慢牙孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热酯肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)。在其他实施方案中，所述的酶得自马链球菌(Streptococcus equisimilis)、产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、马链球菌马亚种(Streptococcus.equi subsp.Equi)、马链球菌兽疫亚种(Zooepidemicus)、不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)。
在一些实施方案中，所述的酶得自真菌。在优选的实施方案中，所述的酶得自：酵母菌物种，包括假丝酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母、酵母属、裂殖酵母或亚罗酵母；或者得自丝状真菌物种，包括枝顶孢、伞菌属、交链孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉、耙菌属、香菇属、Leptospaeria、巨座壳属、Melanocarpus、亚灰树花菌属、毛霉属、毁丝霉属、新丽鞭毛菌、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、单鞭毛菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、纤维素属、根毛霉属、裂褶菌属、节格孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、炭角菌属或嗜热侧孢霉。在一些实施方案中，所述的酶得自啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁维酵母菌(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomyces norbensis或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)。在其他实施方案中，所述的酶得自解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)、熏烟曲菌(aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉棘孢变种(Aspergillus japonicus)、小巢状曲菌(aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜毛金色孢(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢(Chrysosporium tropicum)、粪状金孢(Chrysosporium merdarium)、Chrysosporium inops、Chrysosporium pannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、Fusariumbactridioides、茄病镰孢(Fusarium cerealis)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)、Fusarium negundi、尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusariumsulphureum)、念珠镰孢菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、显示镰刀菌(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、紫青霉菌(Penicillium PurPurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(TrichodermaLongibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)。在优选的实施方案中，所述的酶得自Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、Thielavia ovispora、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)或太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)。
酶的热稳定性/活性
酶的活性可以用作其热稳定性的量度。在不同的反应条件下(例如在不同的温度下)监测酶的活性转变为在这些条件下监测酶的稳定性。如果所述的酶在某些反应条件下是有活性的，则其被认为在这些条件下是稳定的。
在优选的实施方案中，与非突变的野生型酶原相比，突变体热稳定的酶在大约30、35、40、45、50、55、65或70℃的温度下温育大约1小时后表现为活性/热稳定性增加。在一些实施方案中，突变体热稳定的酶温育0.5、0.75、1.25、1.5、1.75或2小时。
在一些优选的实施方案中，突变体热稳定的酶在大约50℃下温育大约1小时后的比活性为至少大约0.5mMole GE/μmol酶/小时，通常为至少大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mMole GE/μmol酶/小时。所述的酶通常具有纤维素酶活性(例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶)和/或纤维素结合能力。
可以通过多种公知的方法来测量纤维素酶的活性或纤维素的结合能力，包括酶谱、还原糖测试(例如DNS Micro或Macro、Nelson-SomogyiMicro或Macro、Nelson Semi-Micro、Ferricyanide-1、Ferricyanide-2、PAHBAH Micro或Macro、BCA以及Modified BCA)、使用对硝基酚标记的糖苷的测试、产物分析、总糖测试(例如苯酚-H2SO4或蒽酮-H2SO4)、酶法葡萄糖测试、以及纤维素结合测试。
用于纤维素酶活性和纤维素结合能力的底物包括可溶性或不可溶性底物。可溶性底物例如包括纤维糊精及其衍生物(包括放射性标记的纤维糊精)、短链纤维素酶、β-甲基伞形酮-寡糖、p-硝基苯酚-寡糖、长链纤维素衍生物、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)、染色的CMC。不可溶性底物例如包括棉、Whatman No.1滤纸、浆料(例如Solka Floc)、结晶纤维素(例如棉)、微晶纤维素(例如
Figure BDA00002907635000161
)、斛果纤维素、细菌纤维素、不定形纤维素(例如PASC、碱膨胀纤维素)、染色纤维素、荧光纤维素、发色和发荧光的衍生物(例如三硝基苯酚-羧甲基纤维素(TNP-CMC)和胺荧-纤维素)、包含纤维素的实践底物、α-纤维素、以及预处理的木质纤维质生物质。
在氨基酸230处的突变
在一个方面中，本公开涉及在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有赖氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉内切葡聚糖酶I。
在氨基酸113处的突变
在另一个方面中，本公开涉及在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有突变的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有丝氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶。
在氨基酸115处的突变
在另一个方面中，本公开涉及在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有突变的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有苏氨酸。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有甘氨酸的里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶。
包含突变的组合的酶
本公开涉及在某些氨基酸处具有突变的突变体热稳定的酶，包括糖基水解酶家族7的酶。在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113或115比对的氨基酸处具有突变。在一些实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113或115比对的氨基酸处具有突变的组合。例如，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变，并且在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有突变。如上文所述，本公开包括在与氨基酸230、113或115比对的氨基酸处具有突变的所有可能的组合的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶。
A)在氨基酸113和115处的突变
在一个方面中，本公开涉及在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有突变以及在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有另一个突变的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸，并且在与SEQ IDNO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有另一个突变。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸，并且在与SEQ IDNO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有突变并且在与SEQID NO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有另一个突变的GH7家族的内切葡聚糖酶。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有丝氨酸并且在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶。
B)在氨基酸113、115和230处的突变
在优选的实施方案中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸并且在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有甘氨酸的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的第二氨基酸处具有另一个突变。
在优选的实施方案中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸或者在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸的突变体热稳定的糖基家族水解酶家族7的酶在与SEQID NO：1的氨基酸230比对的第二氨基酸处具有丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有丝氨酸以及在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有其他的突变。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有丝氨酸以及在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的第二氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。
C)在氨基酸230和113处的突变
在一个方面中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有其他的突变。
在优选的实施方案中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有其他的突变。
在其他优选的实施方案中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸或丝氨酸。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有其他的突变。
在其他优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有赖氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有其他的突变。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有赖氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸或丝氨酸。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变的里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有其他的突变。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有其他的突变。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处具有亮氨酸或丝氨酸。
D)在氨基酸230和115处的突变
在一个方面中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有其他的突变。
在优选的实施方案中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有其他的突变。
在其他优选的实施方案中，在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有其他的突变。
在其他优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有赖氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有其他的突变。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有赖氨酸的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸。
在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有突变的里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有其他的突变。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有其他的突变。
在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉内切葡聚糖酶I的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处具有苏氨酸或甘氨酸。
III.包含突变体热稳定的酶的多肽
在一些实施方案中，将所提供的酶与包括前导肽、前肽、结合结构域和/或催化结构域的功能结构域融合。合适的结合结构域包括但不限于具有各种特异性的碳水化合物结合结构域(例如CBM)，从而为在突变体热稳定的酶的应用过程中存在的碳水化合物成分提供增加的亲和性。合适的酶活性结构域在生产所需的产物中具有支持突变体热稳定的酶的作用的活性。催化结构域的非限定性实例包括：纤维素酶、半纤维素酶(例如木聚糖酶、内切甘露聚糖酶、外切甘露聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、果胶酶)、和/或其他活性(例如蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶和/或它们的其他或功能片段)。
融合蛋白可任选地通过连接体序列与所述的多肽连接，其中所述的连接体序列在不会显著地影响所提供的突变体热稳定的酶或其片段、以及融合结构域的性质的条件下简单地将这二者连接起来，或者对于预期应用而言，所述的连接体可任选地具有功能重要性。在一些实施方案中，蛋白水解酶的切割位点位于融合蛋白伴侣与所关注的蛋白质序列之间，从而可以除去融合蛋白序列。
IV.核酸、载体和宿主细胞
此外，还提供了载体、宿主细胞和用于生产突变体热稳定的酶的方法。在一个方面中，本公开提供了编码突变体热稳定的酶的分离的核酸。在另一个方面中，本公开提供了包含分离的核酸的表达载体，其中所述的核酸编码了突变体热稳定的酶。在另一个方面中，本公开提供了具有表达载体的宿主细胞，其中所述的表达载体包含编码突变体热稳定的酶的分离的核酸。在另一个方面中，本公开提供了通过以下过程来生产突变体热稳定的酶的方法：在适于酶生产的条件下，培养包含表达载体的宿主细胞，其中所述的表达载体具有编码突变体热稳定的酶的核酸。
在一些实施方案中，编码所述的酶的DNA可以由公开的序列以化学方式合成，或者直接由容纳有所述的基因(例如通过cDNA文库筛选或PCR扩增)的宿主细胞获得。在一些实施方案中，所述的酶包含在表达盒中和/或通过标准的分子克隆技术克隆到合适的表达载体中。此类表达盒或载体包含有助于转录的起始和终止(例如启动子和终止子)的序列，并且通常包含可选择的标记。
表达载体/宿主细胞的组合是公知的，并且可以用于所提供的方法中。通常，将表达盒或载体引入到合适的表达宿主细胞中，然后该细胞表达相应的多肽。特别合适的表达宿主为细菌表达宿主属，包括：埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、假单胞菌属(例如萤光假单胞菌(P.fluorescens)或斯氏假单胞菌(P.stutzerei))、变形菌属(例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、劳尔氏菌属(例如真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha))、链霉菌属、葡萄球菌属(例如肉糖葡萄球菌(S.carnosus))、乳球菌属(例如乳酸乳球菌(L.lactis))或杆菌(枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)。此外，特别合适的为酵母表达宿主，例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母菌、解脂亚罗酵母、汉逊酵母菌、乳酸克鲁维酵母或巴斯德毕赤酵母菌。特别合适的为真菌表达宿主，例如黑曲霉、Chrysosporium lucknowense、曲霉属(例如米曲霉、黑曲霉、小巢状曲菌等)或里氏木霉。此外，合适的为哺乳动物表达载体，例如小鼠(例如NSO)、中国仓鼠卵细胞(CHO)或幼地鼠肾(BHK)细胞系。诸如昆虫细胞之类的其他真核宿主或病毒表达系统(例如噬菌体，例如M13、T7噬菌体或λ噬菌体；或病毒，例如杆状病毒)也适用于生产突变体热稳定的酶。
在所关注的特定宿主中与分泌蛋白质有关的启动子和/或信号序列为在该宿主或在其他宿主中进行异源生产和分泌的候选物。例如，在丝状真菌系统中，驱动纤维二糖水解酶I(cbh1)、葡糖淀粉酶A(glaA)、TAKA-淀粉酶(amyA)、木聚糖酶(exlA)、gpd-启动子cbh1、cbhll、内切葡聚糖酶基因EGI-EGV、Cel61B、Cel74A、egl1-egl5、gpd启动子、Pgk1、pki1、EF-1α、tef1、cDNA1和hex1的基因的启动子是特别合适的，并且可以衍生自大量不同的有机体(例如黑曲霉、里氏木霉、米曲霉、泡盛曲霉和小巢状曲菌)。在一些实施方案中，所述的酶以重组的方式与编码合适的同源或异源的信号序列的多核苷酸有关，其中所述的信号序列使得突变体热稳定的酶被分泌到胞外(周质)空间中，由此允许直接检测细胞上清液(或周质空间或裂解物)中的酶的活性。用于大肠杆菌、其他革兰氏阴性细菌和本领域已知的其他有机体的特别合适的信号序列包括驱动HlyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、OmpA、OmpT或M13噬菌体Gill基因表达的那些。对于枯草芽孢杆菌、革兰氏阳性细菌以及本领域已知的其他有机体而言，特别合适的信号序列进一步包括驱动AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB表达的那些，而对于酿酒酵母或其他酵母菌而言，包括嗜杀毒素、Bar1、Suc2、交配因子α、Inu1A或Ggplp信号序列。信号序列可以通过多种信号肽酶切割，因此将它们由表达蛋白质的其余部分中除去。在一些实施方案中，酶其余部分单独表达或者与其他肽、标记或位于N-或C-末端(例如6XHis、HA或FLAG标记)的蛋白质形成融合物。合适的融合物包含有助于亲和纯化或检测的标记、肽或蛋白质(例如6XHis、HA、几丁质结合蛋白、硫氧化蛋白或FLAG标记)，以及有助于所提供的多肽的表达、分泌或加工的那些。合适的加工位点包括肠激酶、STE13、Kex2或用于体内或体外切割的其他蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述的酶通过大量的转化方法被引入到表达宿主细胞中，所述的方法包括但不限于电穿孔，脂质辅助的转化或转染(“脂转染”)，化学介导的转染(例如使用氯化钙和/或磷酸钙)，醋酸锂介导的转化(例如宿主细胞原生质体的转化)，生物“基因枪”转化，PEG介导的转化(例如宿主细胞的原生质体的转化)，原生质体融合(例如使用原核或真核原生质体)，脂质体介导的转化，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、腺病毒或其他病毒、或噬菌体的转化或转导。
备选地，所述的酶在细胞内表达。可任选的，在所述的酶在细胞内表达或使用信号序列(例如上文提及的那些)被分泌到周质空间中之后，渗透或裂解步骤可以用于将突变体热稳定的酶释放到上清液中。膜屏障的破坏受到机械手段的影响，其中所述的机械手段例如超声波、加压处理(法压)、空泡或者使用膜消化酶(例如溶菌酶或酶混合物)。另外备选地，编码所述的酶的多核苷酸通过使用合适的无细胞表达系统表达。在无细胞系统中，所关注的多核苷酸通常在启动子的辅助下转录，但是连接从而形成环状表达载体是可任选的。在其他实施方案中，在未转录的情况下加入或生成外源RNA，并在无细胞系统中翻译。
在一些实施方案中，所述的酶以重组方式生产，而在其他实施方案中，所述的多肽以合成方式生产，或者由天然来源纯化得到。
在一些实施方案中，所述的酶以N-和/或C-末端融合蛋白质的方式生产，从而帮助(例如)提取、检测和/或纯化。融合蛋白质伴侣的实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6XHis、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)、FLAG标记、MYC标记或本领域的任何技术人员公知的其他标记。在一些实施方案中，在融合蛋白质伴侣与所关注的蛋白质序列之间提供蛋白水解酶切割位点，从而允许除去融合蛋白质序列。优选的是，融合蛋白质捕获妨碍所提供的多肽的活性。
V.组合物
在一些方面中，本公开提供了包含突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶的组合物，其中所述的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶在某些氨基酸残基处具有突变。在一些实施方案中，本公开提供了包含宿主细胞的组合物，其中所述的宿主细胞包含表达载体，该表达载体具有编码突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶的核酸。在其他实施方案中，本公开提供了在培养基上清液中包含突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶的组合物。在优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为GH7家族的内切葡聚糖酶。在另一个优选的实施方案中，突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶为里氏木霉内切葡聚糖酶I。
在一些实施方案中，所述的组合物包含一种或多种所关注的其他蛋白质。可以在所述的组合物中找到的所关注的蛋白质的非限定性实例包括：半纤维素酶、α-半乳糖酶、β-半乳糖酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、内切-甘露聚糖酶、外切-甘露聚糖酶、果胶酶、胶质裂解酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、聚鼠李糖半乳糖醛酸水解酶、漆酶、还原酶、氧化酶、苯酚氧化酶、木质酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸酶、脂肪分解酶、角质酶和/或其他酶。
VI.使用方法
本公开所述的酶、载体、宿主细胞和组合物在多种工业应用中具有用途，包括：生物质的降解，例如在生物燃料生产、纺织品方法(包括清洁、棉软化和牛仔染整)、洗涤剂的生产和使用(例如护色、清洁和抗沉积)中生物质(例如纤维素和木质纤维素)被降解为单糖和寡糖；用于基于食品的方法，包括食品加工和捣碎；用于浆料和纸张方法，例如纸浆漂白、纸浆精化、排水改善、抛光结晶纤维素的生产以及纤维改性。由此，还提供了所提供的酶、核酸和组合物用于此类目的(例如降解或水解含纤维素的组合物从而生产可溶性的糖，然后例如进行酶或化学发酵)的方法和用途。
突变体热稳定的酶在高温下保留了酶活性。在一些实施方案中，在50至55℃的温度下使用突变体热稳定的酶，通常为大约50、51、52、53或54℃；在大约55至60℃的温度下使用所述的酶，通常为大约55、56、57、58或59℃；或者在大约60至70℃的温度下使用所述的酶，通常为大约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃。
这种增加的热稳定性使得突变体的酶特别适用于木质纤维素的水解，这理想的是在高温下实施。由于突变体热稳定的酶的这种性质，该酶可以用于下文所述的多种工业应用中。
预处理生物质混合物的粘度的降低
包含突变体热稳定的酶的所提供的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶在多种工业应用中具有用途，包括例如在生物燃料生产中，降低预处理生物质混合物的粘度，然后将该生物质混合物降解成单糖和寡糖。
例如在生物燃料的生产中用作原料的生物质通常包含高水平的木质素，该木质素可能阻断生物质的纤维质成分的水解。通常，例如采用高温和/或高压来对生物质进行预处理，从而增加纤维质成分水解的可达性。但是，预处理通常得到高粘性的生物质混合物。此外，预处理生物质混合物的高粘度还可能干扰预处理生物质的有效的水解。有利的是，本公开的多肽和组合物可以用于降低预处理生物质混合物的粘度，然后进一步降解生物质。
因此，本公开的某些实施方案涉及通过以下过程来降低预处理生物质混合物的粘度的方法：将具有初始粘度的预处理生物质混合物与本公开的包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或者在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶中的一者相接触；以及在足以降低预处理生物质混合物的初始粘度的条件下温育经接触的生物质混合物。
在一些实施方案中，所公开的方法作为预处理工艺的一部分实施。预处理工艺可以包括在高温下预处理生物质、并在足以降低混合物的粘度的条件下将预处理生物质与本公开的包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该不变体热稳定的酶的宿主细胞或在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶一起温育的步骤之后，将包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或培养基上清液中的突变体热稳定的酶中的一者加入到预处理生物质混合物中的步骤。可以将包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该突变体热稳定的酶宿主细胞或在培养物的上清液中的突变体热稳定的酶加入到预处理生物质混合物中，同时混合物的温度是高的，或者是在混合物的温度升高后进行。在一些实施方案中，所述的方法在其中实施热处理的同一器皿或容器中进行。在其他实施方案中，所述的方法在其中实施热处理的不同器皿或容器中进行。
生物质可以包括但不限于植物材料、城市固体废物和废纸。植物材料包括但不限于芒属、能源草、象草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、芦苇、麦秆、大麦秆、加拿大油菜秸秆、燕麦稿秆、玉米秸秆、大豆秸秆、燕麦皮、oat spelt、高粱、稻壳、甘蔗渣、玉米纤维、大麦、燕麦、亚麻、小麦、亚麻籽、桔浆、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔胶、黄豆、含有可溶物的酒精糟(DDGS)、须芒草、玉米穗、松树、针叶树软木材、桉树、桦木、柳树、山杨、杨木、杂交杨树、能源甘蔗、短期轮作木本农作物、作物残余、庭院垃圾或它们的组合。
生物质包括但不限于植物材料、城市固体废物和废纸，包括木质纤维素原料，例如农业残余物，例如玉米秸、小麦秆、大麦秆、燕麦秸、大米草、加拿大稻草、豆秸、草(例如柳枝稷、芒草，大米草、草芦)；纤维处理残余物，例如谷物纤维、甜菜浆、纸浆厂细粉和废品、以及蔗糖渣；园林废物，例如山杨木、其他硬木、软木和锯末；以及消费后的废纸产物；棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、大豆。用于生产生物质的合适的额农作物残余物包括但不限于棕榈仁粉、棕榈仁粕、椰子饼粉、椰子肉干饼以及豆皮。
生物质的降解
包含突变体热稳定的酶的所提供的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶可以用于降解多种类型的纤维质生物质，这些纤维质生物质是本领域公知的，包括植物生物质、微生物生物质、纯化的纤维素和木质纤维素原料。
生物能量原料主要由植物细胞壁成分的纤维素和半纤维素构成。这些多肽水解成它们的单糖涉及一组协同作用从而切割不同的化学键的酶(Dodd and Cann，GCB Bioenergy，1：2，2009)。在生物质(及其他物质，包括半纤维素、木质素和果胶)中，纤维素为主要的多糖。纤维素为无水纤维二糖的均聚物(线性β-(1-4)-D-葡聚糖)，并包括在β-1，4-糖苷键中连接在一起的葡萄糖单元。半纤维质成分在化学组成上可以改变。半纤维素在具有广谱取代基的络合支化结构中包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。但是，在植物组织中发现的主要为平行葡聚糖链的不溶性结晶基质形式。
纤维质生物质包括木质纤维素生物质，其包含纤维素、半纤维素和木质素。纯化的纤维素包括：综纤维素酶(例如Solka Flok)、微晶纤维素(例如
Figure BDA00002907635000281
和
Figure BDA00002907635000282
)、以及高度可溶性纤维素醚、羧甲基纤维素(CMC)。含纤维素的底物包括：可溶性底物，例如纤维糊精及其衍生物、短链纤维素酶、β-甲基伞形酮-寡糖、p-硝基苯酚-寡糖、长链纤维素衍生物、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)；和不溶性底物，包括棉、Whatman No.1滤纸、浆料(例如Solka Floc)、结晶纤维素(例如棉)、微晶纤维素(例如
Figure BDA00002907635000283
)、斛果纤维素、细菌纤维素、不定形纤维素(例如PASC、碱膨胀纤维素)、染色纤维素、荧光纤维素、发色和发荧光的衍生物(例如三硝基苯酚-羧甲基纤维素(TNP-CMC)和胺荧-纤维素)、包含纤维素的实践纤维素、α-纤维素、以及预处理的木质纤维质生物质。
在一些方面中，包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或者在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶可以用于接触结晶纤维素，从而产生抛光的结晶纤维素，该结晶纤维素可以用于测试纤维素酶、棒曲霉素以及纤维素结合蛋白质。
在其他方面中，包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或者在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶可以用于接触生物质，从而水解/降解该生物质或者将该生物质转化为糖。在一些实施方案中，包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或者在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶可以用于接触生物质，并且将所得的产物在足以生产发酵产物的条件下与发酵微生物一起培养，或者与化学溶液一起温育。在其他实施方案中，通过包含突变体热稳定的酶的组合物、表达该突变体热稳定的酶的宿主细胞或者在培养基的上清液中的突变体热稳定的酶处理生物质，并将该生物质与一种或多种发酵微生物相接触，从而发酵生物质。在优选的实施方案中，生物质经预处理。
生物燃料的生产
本公开所提供的酶和组合物在降解和水解纤维素酶和包含纤维素的生物质和原料中具有用途，例如作为化学品或发酵原料由生物质生产单糖、二糖和寡糖，从而用于生产生物燃料，例如乙醇、丁醇、其他产物或中间体。针对所提供的多肽的此类用途，提供了方法和组合物，例如将木质纤维素生物质转化为用于发酵生产生物燃料的可溶性糖，将预处理木质纤维素转化为可溶性糖，在高盐或离子液体存在下将木质纤维素转化为可溶性糖，在高温下将结晶纤维素转化为可溶性糖，其中所述的温度例如为50、51、52、53、54或55℃，或者高于该范围，例如在60℃至70℃。
在一个实施方案中，所提供的组合物包括在除去或未除去细胞的条件下或者以半纯化或纯化的酶的制备物形式处于发酵液粗品的组合物。备选地，本公开所提供的宿主细胞在使用生物质的发酵工艺中用作多肽的来源。
在一个实施方案中，本公开的酶在为了帮助降解生物质而降解纤维素从而形成生物燃料(例如乙醇)中具有用途。通过酶降解生物质并将释放的糖类转化为乙醇来生产乙醇。这种乙醇通常称为生物乙醇或生物燃料。其作为燃料添加剂或混合剂在共混物中为低于1％至至多100％(燃料取代物)。在一个实施方案中，为了由生物质生产生物燃料，所提供的酶、组合物和方法用于将纤维素转化为其单体(葡萄糖)或其他可溶性糖，以便通过发酵(例如通过微生物发酵或化学发酵)随后转化为生物燃料(例如乙醇)。例如，所提供的酶和方法可以通过酶水解而用于此类转化，可任选地包括酸预处理，该处理通常在高温下实施，然后使用所提供的多肽进行水解。
在一个实施方案中，所提供的酶与其他糖酶(例如甘露聚糖酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，α-半乳糖苷酶和/或纤维素酶)结合使用，以便更大范围地地水解植物材料。
食品加工
此外，包含本公开的酶的组合物还在食品或动物饲料的加工和制造中具有用途。多种抗营养因子限定了特定植物材料在动物饲料和人类食品的制备中的用途。包含木质纤维质材料的植物材料(例如纤维素)可以大幅降低动物对植物材料的消化能力。这种作用通过使用纤维质降解酶(即，突变体热稳定的酶)而降低，其中所述的酶允许更高比例的植物材料被转化为饲料，从而降低了饲料的成本。此外，通过热稳定的酶的活性，纤维质材料被分解成简单的糖，这些糖可以更容易地被同化从而提供额外的能量。因此，包含本公开的酶的组合物优选用于食品或动物饲料的加工和/或制造。
本公开所提供的酶可用作单胃动物(例如家禽和猪)的饲料及人类食品的添加剂。在一些实施方案中，所述的酶可用于预处理所述的饲料而非作为饲料添加剂。在一些优选的实施方案中，所述的酶被加入或用于预处理断奶仔猪、保育猪、猪仔、肥育猪、生长猪、生长肥育猪、产卵鸡、肉鸡和/或火鸡的饲料。在一些实施方案中，所述的酶被加入或用于预处理得自植物材料的饲料，其中所述的植物材料例如为棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、黄豆、大麦、燕麦、亚麻、小麦、玉米、亚麻籽、桔浆、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆和羽扇豆。
由于所述的酶的热稳定性，它们在生产球状饲料的工艺中具有用途，其中在所述的方法中，在制粒步骤之前对饲料混合物加热，如同在大多数商业化制粒机中的情况那样。在一个实例中，在制粒步骤之前将所述的酶加入到其他饲料组分中，或在制粒步骤之后将所述的多肽加入到已经成形的饲料球状物中。
在包含用于食品加工或作为食品补充剂的、包含所述的酶的组合物中，该组合物可任选地包含其他取代物，例如着色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其他饲料或食品增强的酶等。这特别应用于所谓的预混合物。根据本公开的食品添加剂可以与其他食品成分结合，从而生产经加工的食品产物。所得的结合的食品添加剂以合适的量与其他食品成分(例如谷物或植物蛋白质)混合，从而形成经加工的食品产物。
纺织品清洁及洗衣洗涤剂
此外，所提供的酶、方法和组合物还在纺织品方法(包括清洁、棉软化、牛仔染整、在高温处理下的棉纤的抛光)以及在洗涤剂的生产和使用(例如护色、清洁和抗沉积)中具有用途。例如，所述的酶在洗涤剂组合物中具有用途，从而有利于除去包含纤维素的污点和污物。在一个实施方案中，所述的酶用于洗涤剂组合物中；提供了此类洗涤剂组合物及它们的使用方法。在一个实施方案中，所述的洗涤剂组合物包含与得自淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的其他酶相结合的酶。
报案所述的酶的本公开的洗涤剂组合物为任何方便的形式(例如条、片、粉末、颗粒、糊状物或液体)。液体洗涤剂通常是水性的，通常包含至多70％的水和0-30％有机溶剂，或非水性的成分。
所述的洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂(例如包含半极性的非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂)。表面活性剂通常以0.1重量％至60重量％的水平存在。当洗涤剂包含阴离子表面活性剂时，其通常包含大约1％至大约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、脂肪醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或者肥皂。当洗涤剂包含非离子表面活性剂时，其通常包含大约0.2％至大约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、乙氧基壬基苯酚、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺)。
洗涤剂组合物可任选地包含0-65％洗涤剂促净剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三醋酸、乙二胺四醋酸、二亚乙基三胺五醋酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐。洗涤剂组合物可任选地包含一种或多种聚合物，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸盐(例如聚丙烯酸盐)、马来酸/丙烯酸共聚物和月桂基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。洗涤剂可任选地包含漂白系统(例如过氧化氢来源)，例如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白活化剂(例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸盐)结合。备选地，漂白系统包含酰胺、酰亚胺或砜类的过氧化物过氧酸。
在一个实施方案中，以相应于每升洗液0.01-100mg酶蛋白质的量加入所述的酶，优选的是每升洗液0.05-5mg酶蛋白质，特别是每升洗液0.1-1mg酶蛋白质。
纸浆加工
在另一个实施方案中，所提供的组合物和酶在纸浆和纸方法中具有用途，例如在纸浆漂白、纸浆精化，排水改善和纤维改性中，例如在用于水解纤维素材料的制浆的高温应用中。提供了所提供的酶用于此类目的方法和组合物。例如，在一些实施方案中，所述的酶在纸浆的酶辅助的漂白中具有用途，例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐方法制备的纸浆。在一些实施方案中，所述的纸浆为使用氧、臭氧、过氧化物或过氧酸漂白的无氯纸浆。在一些实施方案中，所述的酶用于酶辅助的纸浆漂白中，其中所述的纸浆是通过经修改的或连续的制浆方法生产的，其中所述的方法表现出较低的木质素含量。在一些实施方案中，所述的酶单独使用；在其他实施方案中，它们与诸如木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶之类的其他酶结合使用。
提供以下实施例来说明所提供的实施方案，并且无意于限定本发明的范围。
实施例
实施例1-里氏木霉内切葡聚糖酶I的突变形成
由于里氏木霉内切葡聚糖酶I(TrEGI)的晶体结构是可得的，并且其是里氏木霉所生产的最丰富的内切葡聚糖酶，所以初始选择该酶以用于工程改造增强的热稳定性。用于改善TrEGI的人稳定性的原始方法依赖于使用B因子向导的方法(B-FIT方法)(Reetz，MT et al.，Angew Chem IntEdEngl45(46)：7745-51，2006)。由晶体结构得到的B因子为多肽中残基流动性的量度。在该方法中，选择具有最高平均B因子(相当于最具有挠性的位点)的残基用于突变形成，从而得到改善的热稳定性。该方法基于这样的假设：可以通过增加噬温性酶结构中最具有挠性的位点处的刚性来增强该酶的热稳定性。使用TrEGI酶的晶体结构，鉴别出具有最高B因子值的20种残基(表1)。选择7个位点(由一个或多个氨基酸构成){位点A(aa284-287)、位点B(aa301-302)、位点C(aa113，115)、位点D(aa238)、位点E(aa230)、位点F(aa323)、位点G(aa291)}用于突变形成(图1；表1)。表1示出了在里氏木霉EGI中具有最高的B因子值的残基。
残基 编号 突变位点 B-因子 B-因子次序
GLY 287 A 99.6 1
GLY 286 A 98.8 2
ASN 265 - 95.3 3
THR 371 - 84.2 4
GLY 238 D 83.8 5
GLY 230 E 77.1 6
ASN 276 - 77 7
GLN 284 A 76.9 8
THR 217 - 75.5 9
GLN 28 - 74.4 10
GLY 277 - 74.2 11
ASN 323 F 73.7 12
SER 291 G 72.8 13
ASP 113 C 72 14
ASP 115 C 71.8 15
PRO 285 A 70.9 16
LEU 302 B 70.7 17
ASP 366 - 70.5 18
LYS 18 - 69.7 19
GLY 301 B 69.2 20
里氏木霉内切葡聚糖酶I的克隆
使用大肠杆菌密码子偏好合成的TrEGI基因(cel7b，UniProt No.P07981)购自GenScript(GenScript Corporation，Piscataway，NJ，USA)。该基因通过使用正向引物
(5’-AAAAAACATATGCAACAACCGGGCACCTCC-3’)(SEQ ID NO：2)和反向引物
(5’-AAAAAAGTCGACTTACAGACATTGCGAGTAGTA-3’)(SEQ ID NO：3)由质粒经PCR扩增得到。接着，将PCR产物在使用NdeI和SalI双消化后克隆到pIVEX2.4d载体(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，USA)中，从而产生质粒pIVEX2.4d-TrEG1。克隆基因的测序在ElimBiopharmaceuticals(Hayward，CA，USA)中进行。
里氏木霉EGI的定点突变
使用定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，根据制造商的方案在里氏木霉EGI的氨基酸238、291和323处进行定点突变，其中引物如表2所示。
表2示出了用于里氏木霉突变形成的引物的列表。
Figure BDA00002907635000341
Figure BDA00002907635000351
＊位点A：氨基酸284-287；位点B：氨基酸301-302；位点C：氨基酸113，115；位点D：氨基酸238；位点E：氨基酸230；位点F：氨基酸323；位点G：氨基酸291
使用OE-PCR在里氏木霉EGI(pIVEX2.4d-TrEG1作为模板质粒)的氨基酸230、113&115、284-287和301-302位点处进行突变形成。使用质粒模板pIVEX2.4d-TrEG1以及尽在预期突变的位置处不同于EGI目标序列的引物(表1)来生成第一PCR的产物。在凝胶纯化后，使用PCR片段作为用于OE-PCR的引物和模板，从而构建突变形成的里氏木霉EGI基因。所有的PCR反应都是使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)进行的。用于OE-PCR的最佳条件如下：1个循环，在98℃下变性30秒；30个循环，在98℃下变性10秒，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸40秒，以及在72℃下最终延伸5分钟。将该OE-PCR产物进行凝胶纯化，然后用作以pIVEX2.4d-TrEG1作为模板质粒的大引物来用于构建带有pIVEX2.4d质粒的突变体EGI基因。所有的引物均由IDT友好提供(Integrated DNATechnologies Inc.，Coralville，IA，USA；表2)。在1.2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物的量和纯度。在Elim Biopharmaceuticals(Hayward，CA，USA)
上对所有的嵌合基因进行测序。
突变体里氏木霉EGI基因的PCR
将1μL包含突变体里氏木霉EGI基因的过夜细胞培养物用于PCR反应，从而生成用于物细胞EGI表达的模板。由100μM T7正向和T7反向引物、1x PCR缓冲剂、2.5mM dNTP以及0.2单位LA Taq聚合酶构成的各个反应混合物的最终总体积为20μL。使用以下方案：1个循环，在95℃下变性5分钟；30个循环，在95℃下变性20秒，在55℃下退火20秒，在72℃下延伸1分钟，以及在72℃下最终延伸5分钟。
实施例2-里氏木霉EGI的无细胞合成
使用无细胞合成平台(Kim，T et al.，BiotechnolBioeng DOI：10.1002/bit.22856，2010)用于按照上文所述生成的里氏木霉EGI突变体的蛋白质的表达。
S30细胞提取物的制备
根据Pratt(Pratt，JM，Transcription and translation：A practical approach，179，1984)的程序，并有一些修改，由大肠杆菌菌株BL21StarTM(DE3)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)及其衍生菌株[BL21StarTM(DE3)-pGro7]制备细胞提取物。编码GroEL/ES的伴侣蛋白质粒pGro7购自Takara Bio(TAKARA BIO，Shiga，Japan)。在37℃下，细胞在3L2xYTPG培养基(2xYT，补充有22mM NaH2PO4、40mM Na2HPO4和100mM葡萄糖)中在剧烈搅拌和通风下生长。对于容纳有pGro7的细胞，将0.05％L-果胶糖加入到所述的培养基中，并且当细胞密度(OD600)达到0.6时，加入异丙基-硫代半乳糖苷(IPTG，1mM)，以诱导T7RNA聚合酶的表达。在对数中期(OD600≈4.5)收获细胞，并通过将细胞悬浮在缓冲剂A(20Ml/g潮湿的细胞)中然后离心而洗涤3次。缓冲剂A包含10mM Tris-醋酸盐缓冲剂(pH8.2)、14mM醋酸镁、60mM谷氨酸钾、以及1mM包含0.05％(v/v)2-巯基乙醇(2-ME)的二硫苏糖醇(DTT)。在将细胞团储存在-80℃下之前，将潮湿的细胞团称重。
将解冻的细胞(10g)悬浮在12.7mL缓冲剂B(不具有2-ME的缓冲剂A)中，并在20000psi恒压下在弗氏细胞压碎器(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)中分裂。然后，在4℃下将裂解物在30000g下离心30分钟，并将上清液与细胞团级份分离，接着再次离心。将最终的上清液在100rpm摇动，然后将3mL欲温育的溶液(293.3mM Tris-醋酸盐pH8.2、2mM醋酸镁、10.4mMATP、200mM磷酸肌酸、4.4mM DTT、0.04mM氨基酸、26.7μg/mL肌酸激酶)逐渐加入到10mL上清液中，接着将所得溶液在37℃下温育80分钟，并温和地摇动。使用分子量阻断(MWCO)为10000的Pierce膜(SnakeSkinTM Pleated Dialysis Tubing，Rockford，IL，USA)，在4℃下对50体积的缓冲剂B将欲温育的样品均透析4x45分钟。将保留的提取物在4℃下在4000g下离心10分钟，从而得到上清液。为了耗尽细胞提取物的降低的活性，将S30提取物在30℃下与10mM氧化的谷胱甘肽温育2小时。通过对200体积的缓冲剂C(不具有DTT和2-ME的缓冲剂A)将经处理的提取物在4℃下透析3小时来除去残余的谷胱甘肽分子。将所得的提取物分成小的等分物，并储存在-80℃下，然后将其用于无细胞蛋白质的合成。
蛋白质的合成
用于无细胞蛋白质合成的标准的反应混合物由以下成分构成(总体积为15μL)：57mM肝素-KOH(pH7.5)；1.2mM ATP；均为0.85mM的CTP、GTP和UTP；0.17mg/mL大肠杆菌总tRNA混合物(得自菌株MRE600)；90mM谷氨酸钾；80mM醋酸铵；12mM醋酸镁；34μg/mL L-5-甲酸基-5，6，7，8-四氢叶酸(亚叶酸)；所有20种氨基酸均为2.0mM；2％PEG(8000)；67mM磷酸肌酸(CP)；3.2μg/mL肌酸激酶(CK)；2.5mM氧化的谷胱甘肽；2.5mM还原的谷胱甘肽；150μg/mL DsbC；16.7μg/mLPCR产物；27％(v/v)S30-GroEL/ES细胞提取物。使无细胞反应在30℃下进行2小时。为了测定使用无细胞合成方法合成的蛋白质的量，还将10μM L-[U-14C]亮氨酸(11.3GBq/mmol，Amersham Biosciences/GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)加入到无细胞反应物中。为了分析无细胞表达的蛋白质的溶解度，将无细胞混合物在4℃下在15000下离心10分钟。合成的蛋白质的可溶的量通过分析离心物的上清液来确定。按照其他所述(Kim，DM and Choi，CY，Biotechnol Prog12(5)：645-649，1996)，使用液体闪烁计数器(Tri-Carb2810TR液体闪烁分析仪，Perkin-Elmer Inc.，Waltham，MA，USA)由TCA-不溶性放射性评价各种无细胞合成的纤维素酶的量。
里氏木霉EGI的无细胞表达的最佳氧化还原电势
TrEGI具有7个二硫键。在各种氧化还原电势下表达所述的酶(通过改变还原的谷胱甘肽和氧化的谷胱甘肽的量，同时进行无细胞合成)来探索正确形成这些二硫键所需的氧化还原空间。在无细胞合成中氧化的谷胱甘肽和还原的谷胱甘肽的量改变如下：还原的谷胱甘肽为0∶5，1∶4，2∶3，3∶2，4∶1和5∶0mM。在无细胞合成反应中，谷胱甘肽的总浓度总是保持在5mM下。在各种氧化还原条件下合成的TrEGI酶点样在CMC平板上。将该平板在50℃下温育过夜，然后使用刚果红染色。
结果表明无论无细胞表达反应的氧化还原电势如何都得到由所形成的正确的二硫构成的活性酶(图2)。
实施例3-具有改善的热稳定性/活性的TrEGI突变体的筛选
在筛选工艺中第一步将识别多个条件，在该条件下，野生型TrEGI失去其全部或大部分的活性。然后将这些条件用作筛选条件以识别具有增加的热稳定性的突变体。
选择用于TrEGI突变体的筛选条件
为了测量野生型TrEGI的热稳定性，将10μL无细胞合成的TrEGI(20pmol)与100mM醋酸钠缓冲剂(pH5.0)混合。在将酶混合物在各种温度(45、50、55、60、65、70℃)下温育不同的时间长度(0、10、20、30、40、50、60分钟)后，将1.5％(w/v)CMC加入到预热处理的酶混合物中，从而在50℃下开始1小时的水解反应。通过DNS方法测量还原糖的浓度(Miller，GL，Anal Chem 31(3)：426-428，1959)。
此外，通过在CMC琼脂平板上点样来测试野生型TrEGI的热稳定性。将10μL无细胞合成的TrEGI(20pmol)与2μL1M醋酸钠缓冲剂(pH4.85)混合。在将酶混合物在53、55、57、60和65℃下温育不同的时间长度(10、30、60分钟)后，将2μL酶混合物点样在CMC平板上。将该平板在50℃下温育过夜，然后使用刚果红染色。
基于图3所示的结果，由于野生型TrEGI酶原在50℃下预处理30分钟的条件下失去了其大部分的活性，则选择该条件用于所有突变体的筛选工艺。
突变体TrEI的筛选和选择方案示于图4中，并在下文中描述。
用于选择TrEGI突变体的筛选工艺
将突变体在大肠杆菌中转化并平板接种。对于各位点(除了位点A以外)而言，将序列空间的覆盖率为95％的菌落挑出，并在深孔96孔板上过夜生长。接着，使用过夜培养物作为模板在96孔板中进行这些克隆物的PCR，从而提供～300ng/μL线性TrEGI基因产物，随后将这些产物用于无细胞的表达。向15μL无细胞表达的TrEGI突变体中加入2μL1M醋酸钠缓冲剂pH4.85，从而将pH降低至大约5。然后，将TrEGI突变体加热至50℃并持续30分钟，其后将它们点样在CMC-琼脂平板(1％CMC、1.5％琼脂、50mM醋酸盐缓冲剂pH4.85)上，并在烤箱中在50℃下温育过夜。由于使用无细胞合成表达的重组TrEGI通过在50℃下温育30分钟而失去了全部的活性(图3)，所以将该无细胞表达的突变体TrEGI酶在50℃下温育30分钟，然后在CMC平板上点样。第二天，使用15mL1％刚果红将CMC-琼脂平板染色5分钟。比酶原的热稳定性更高的突变体在热处理之后保持了活性，因此在使用过刚果红染色的CMC平板上产生了晕轮或清晰的区域。由此，针对活性酶来分析平板(命中(hit))，该酶可以用作随后一连串突变形成的酶原。相对于重组TrEGI而言，在位点A-G的突变形成生成了～500种在50℃下具有改善的热稳定性的突变体(图5；表3)。
表3示出了里氏木霉EGI突变体的筛选结果。
Figure BDA00002907635000391
实施例4-具有改善的热稳定性的里氏木霉EGI突变体的表征
通过与TrEGI突变体一起温育来测量CMC水解，从而针对增加的热稳定性测试通过筛选识别的突变体。
测量里氏木霉EGI突变体的活性/热稳定性
为了测量TrEGI突变体的活性/热稳定性，将10μL无细胞合成的酶(20pmol)与100mM醋酸钠缓冲剂(pH4.85)混合。在将酶混合物在50℃下温育不同的时间长度(0、15、30、45、60分钟)之后，将1.1％(w/v)CMC加入到预热处理的酶混合物中，从而在50℃下开始1小时的水解反应。通过DNS方法测量还原糖的浓度(Miller，GL，AnalChem31(3)：426-428，1959)。
图6所示的结果表明，与无细胞合成的野生型TrEGI相比，测试突变体具有增加的活性。所述的突变对TrEGI热稳定性的影响在加入CMC之前热处理时间较长的样品中是特别剧烈的。通过测序识别TrEGI酶中的突变残基：F2、F3、H6和F6突变体由G230E/V119M/Q93H突变构成，F12突变体由G230Q突变构成，G1突变体由G230K突变构成，G8和H3突变体由G230A突变构成，G12突变体由G230X突变构成，而H1突变体由G230S突变构成。
图7示出了在测试之前经过(a)在50℃下处理45分钟和未经过(b)在50℃下处理45分钟的条件下测试的所有突变体的结果。如所示的那样，一组突变体酶比野生型TrEGI具有更高的热稳定性。
里氏木霉EGI在位点E(G230)处的突变
在50℃下温育30分钟之后显示出较高的保留活性的70种突变体的测序表明除了6种突变体以外的所有突变体在位点E处均具有突变(氨基酸230，甘氨酸)。在位点E处丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和蛋氨酸取代代替天然甘氨酸残基会得到改善的热稳定性，其中一些示于图8中。在50℃下热处理不同的时间长度之前和之后一些此类突变体的特异活性概括于图9中。上文所述的方案用于测量活性。与酶原TrEGI相比，最稳定的突变体G230K在50℃下温育1小时后保留了大约80％的活性，其中所述的酶原在这些条件下失去了其所有的活性。
里氏木霉EGI在位点C(D113，D115)处的突变
此外，位点C处(aa113，115)的突变显示形成了更加热稳定的TrEGI变体(在热处理时保留了～80％的活性)。在所述的位点处形成热稳定TrEGI突变体的氨基酸取代为D113S、D113L、D115T和D115G。里氏木霉EGI二倍突变体D113L/D115T和D113S/D115G在50℃下热处理下和未经50℃下热处理下都具有活性，如图10所示。
里氏木霉EGI在位点E(G230)和C(D113，D115)处的突变
按照上文所述的方案测试具有多处突变的TrEGI变体的热稳定性(表4)。酶的浓度为0.15-0.3μM。
表4示出了通过将在G230处的9种取代与在D113/D115处的2种取代结合而得到的里氏木霉EGI的18种不同的三倍突变体。
突变体编号 AA230 AA113，115 突变体编号 AA230 AA113，115
1 G230K D113SD115T 10 G230K D113LD115G
2 G230A D113SD115T 11 G230A D113LD115G
3 G230S D113SD115T 12 G230S D113LD115G
4 G230R D113SD115T 13 G230R D113LD115G
5 G230Q D113SD115T 14 G230Q D113LD115G
6 G230E D113SD115T 15 G230E D113LD115G
7 G230L D113SD115T 16 G230L D113LD115G
8 G230M D113SD115T 17 G230M D113LD115G
9 G230T D113SD115T 18 G230T D113LD115G
在3个氨基酸处D113S、D115T和G230X(X＝K、A、S、R、E、M或T)(表4)具有突变的TrEGI变体证明与野生型TrEGI相比热稳定性增加。此外，与单倍G230突变体相比，三倍突变体还具有增加的比活性。此外，TrEGI变体G230T/D113S/D115T显示在53℃处理30分钟之后具有活性。具有取代D113L/D115G的二倍TrEGI突变体和包含这些取代(表4中突变体编号10-18)的三倍TrEGI突变体在50℃下未显示出实质性的活性。
综上，实验结果表明在里氏木霉内切葡聚糖酶中在氨基酸残基230和/或113和/或115处的取代改善了所述的酶的热稳定性。在该位置处改变为不同的氨基酸会导致突变体酶在50℃或更高的温度下雨酶原相比具有更加改善的热稳定性。热稳定性的这种增加允许突变体酶在高温下长期保持活性，由此允许底物更完全地转化为产物。
实施例5-里氏木霉EGI突变体对纤维质底物的活性
此外，还测试了TrEGI突变体对不同纤维质底物的影响(图12和13)。
对不溶性纤维质底物的内切葡聚糖酶活性的测量
在96孔板中，在终体积为70μL(包含1％(w/v)底物、100mM醋酸钠缓冲剂pH4.85、0.15-0.3μM纤维素酶)中，在50、53或55℃下对不溶性底物进行所有水解纤维素的测试，并测试2个重复。将96孔板用铝箔密封，并在具有顶部加热以减少蒸发的热循环仪中温育。针对
Figure BDA00002907635000421
和离子液体预处理的
Figure BDA00002907635000422
测量纤维素酶的活性。将混合物在50、53或55℃下温育15小时，此后将它们冷却至4℃，然后测量使用下文所述的葡萄糖氧化酶-过氧化酶测试测量释放的可溶性还原糖的量。
葡萄糖氧化酶-过氧化酶测试
使用Amplex Red作为底物的葡萄糖氧化酶-过氧化酶测试来测量释放的可溶性糖的量。简言之，将8μL得自水解反应的上清液与8μLβ-葡萄糖苷酶(5mg/mL)在室温(RT)下温育1小时，从而将所有的可溶性纤维二糖转化为葡萄糖。然后，通过加入总体积为64μL的包含125mM磷酸盐缓冲剂pH7.45的葡萄糖氧化酶(1.25U/mL)、HR(1.25U/mL)以及Amplex Red(60μM)，以及在RT下温育10分钟来测量释放的葡萄糖的量。所形成的试卤灵的量符合存在的葡萄糖的量。通过在530nm激发并在590nm进行发射检测来测量试卤灵的荧光。
如图12(a)和(b)所示，在50℃下水解和中，在G230处具有谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丙氨酸或丝氨酸取代的所识别的TrEGI突变体与野生型TrEGI具有增加的活性。相似地，在50、53或55℃的温度下水解和
Figure BDA00002907635000426
中，具有突变D113S、D115T以及在G230处具有赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或苏氨酸取代的TrEGI三倍突变体显示出活性增加[图12(c)和(d)]。不同的突变体的活性的改善超出野生型TrEGI的大约1.5-5倍。
TrEGI突变体对不同纤维质底物的活性的比较示于图13中。所测试的突变体与野生型TrEGI相比在水解底物中具有增加的活性。与在G230处具有单一氨基酸取代的TrEGI突变体相比，在3个氨基酸处(G230、D113、D115)具有突变的TrEGI突变体活性增加直至2.5倍[图12(b)和(c)]。
实施例6-得自糖基水解酶家族7的突变体热稳定的酶
本实施例的目的在于是糖基水解酶家族7的酶突变从而相对于野生型非突变的酶而言增加所述的图便民的热稳定性。采用的不同技术在早期有所讨论。
第一步为将所述的酶的多肽序列与SEQ ID NO：1的序列比对，从而识别与SEQ ID NO：1的氨基酸230、113和115比对的氨基酸残基。
第二步为将这些识别的氨基酸中的一个或多个突变为丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或甘氨酸。然后表达并纯化突变的酶。
第三步为测量突变的酶的热稳定性。将突变的酶在例如50-70℃的温度下温育不同长度的时间，例如15-60分钟。温育后测试突变体酶的纤维素酶的活性。使用多种纤维质底物进行测试。在该测试中，使用野生型版本的酶作为对照。
在高温下最具有活性的突变的酶可以用于多种工业应用中，例如生物燃料的生产、食品加工、纺织品清洁等。
实施例7-热稳定的里氏木霉EGI突变体
本实施例测试了TrEGI突变体对不同纤维质底物的热稳定性。
里氏木霉EGI在酿酒酵母中的表达
为了在酿酒酵母中生产里氏木霉EGI和经过基因工程改造的突变体，在6个组氨酸残基在pCu424载体中添加在C-末端之后，克隆该基因(Labbe，S and Thiele，DJ，Methods Enzymol.1999，306，145-153)。将经过基因工程改造的α-因子AppS4信号肽(Rakestraw，JA，et al.，Biotechnol.Bioeng.2009，103，1192-1201)添加在所述的基因的N-末端，从而能够分泌所述的酶。使用LiAc方法将包含里氏木霉EGI基因的pCu424载体转化到具有额外pmrl敲除的酿酒酵母菌株YVH10(Robinson，AS et al.，Biotechnology(NY)1994，12，381-384)中(Gietz，RD and Schiestl，RH，Nat.Protoc.2007，2，31-34)。为了表达，使用饱和的YPD培养基预培养物来接种1L选择性培养基(SC-Trp)并在30℃下生长3天。将培养物在4000g下离心5min并在25℃下再次悬浮于补充有500μM CuSO4的YPD培养基中以进行3天的诱导。使用Ni亲和层析由培养物上清液纯化EGI。
修整在酿酒酵母中表达的里氏木霉EGI的糖基化
将在酿酒酵母中表达的3-5mg纯化的里氏木霉EGI在pH7.025mM磷酸盐缓冲剂中与200单位的PNGaseF(NEB)一起在30℃下温育18h，此后，加入额外的100单位的PNGaseF，并温育另外的24h。使用凝胶过滤层析纯化PNGaseF处理的里氏木霉EGI。
无细胞里氏木霉EGI蛋白质的热稳定性
发现当基于大肠杆菌细胞提取物(其不具有糖基化在G230位点和D113D115位点处具有多种氨基酸取代的里氏木霉EGI突变体的能力)，使用无细胞蛋白质合成表达的在G230位点和D113D115位点处具有多种氨基酸取代的里氏木霉EGI突变体时，该酶对
Figure BDA00002907635000441
和
Figure BDA00002907635000442
比酶原更具有热稳定性。如图14所示，与酶原比，里氏木霉EGI突变体在50℃下对的活性改善大约2倍。如图15所示，与酶原相比，里氏木霉EGI突变体在50℃下对
Figure BDA00002907635000444
的活性改善大约2倍。
在酿酒酵母中表达的里氏木霉EGI的热稳定性
在酵母菌(酿酒酵母)中表达热稳定的里氏木霉EGI突变体，以便研究这些酶变体的糖基化对它们的活性/稳定性的影响。使用Ni-NTA层析纯化酵母菌表达的在G230位点处具有多个氨基酸(A、E、R、L、T和S)并组合有D113SD15T突变的里氏木霉EGI突变体。由于这些酶在酵母菌中表达时被高度糖基化(MW100-200Kda)，使用PNGaseF修整N-糖基化从而得到带有糖基化水平(MW～55-60Kda)与在里氏木霉中表达的天然酶的糖基化水平机器相似的TrEGI酶。这些具有修整的糖基化的经基因工程改造的酶的活性测量显示在50℃-65℃的温度下对和
Figure BDA00002907635000446
的活性得到改善(图16-18)。最佳突变体(G230AD113SD115T突变)与酶原相比，显示在60℃下对
Figure BDA00002907635000447
的活性改善2.5倍(图16)，并且与酶原相比，在65℃下对
Figure BDA00002907635000448
活性改善2倍(图18)。图17示出G230AD113SD115T突变体与酶原相比对
Figure BDA00002907635000449
的T50升高大约4℃(图17)。
Figure IDA00002907635800011
Figure IDA00002907635800021
Figure IDA00002907635800041
Figure IDA00002907635800051
Figure IDA00002907635800071
Figure IDA00002907635800081
Figure IDA00002907635800091
Figure IDA00002907635800101
Figure IDA00002907635800111

Claims (52)

1.一种突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处包含丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。
2.一种突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处包含赖氨酸。
3.一种突变体热稳定的里氏木霉内切葡聚糖酶I，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处包含丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。
4.一种突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处包含亮氨酸。
5.一种突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处包含丝氨酸。
6.一种突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处包含苏氨酸。
7.一种突变体热稳定的里氏木霉内切葡聚糖酶I，其在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处包含甘氨酸。
8.权利要求4所述的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
9.权利要求5所述的突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
10.权利要求8或9所述的突变体热稳定的酶，其中所述的酶在与SEQID NO：1的氨基酸230比对的氨基酸处进一步包含丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。
11.权利要求1所述的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处进一步包含亮氨酸或丝氨酸。
12.权利要求2所述的突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处进一步包含亮氨酸或丝氨酸。
13.权利要求3所述的突变体热稳定的里氏木霉内切葡聚糖酶I，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸113比对的氨基酸处进一步包含亮氨酸或丝氨酸。
14.权利要求1所述的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
15.权利要求2所述的突变体热稳定的GH7家族的内切葡聚糖酶，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
16.权利要求3所述的突变体热稳定的里氏木霉内切葡聚糖酶I，其中所述的酶在与SEQ ID NO：1的氨基酸115比对的氨基酸处进一步包含苏氨酸或甘氨酸。
17.上述权利要求的任意一项所述的突变体热稳定的酶，其中所述的酶在大约50℃下温育大约1小时后表现为比野生型酶增强的热稳定性。
18.上述权利要求的任意一项所述的突变体热稳定的酶，其中所述的酶在大约50℃下温育大约1小时后具有至少大约0.5mMole GE/μMole酶/hr的比活性。
19.权利要求1、4、6、8、10、11或14的任意一项所述的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶为内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。
20.权利要求1、4、6、8、10、11或14的任意一项所述的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，或者权利要求2、5、9、10、12或15的任意一项所述的GH7家族的内切葡聚糖酶，其中所述的酶为里氏木霉内切葡聚糖酶I。
21.权利要求1、4、6、8、10、11或14的任意一项所述的突变体热稳定的糖基水解酶家族7的酶，或者权利要求2、5、9、10、12或15的任意一项所述的GH7家族的内切葡聚糖酶，其中所述的酶衍生自真菌或细菌。
22.权利要求21所述的突变体热稳定的酶，其中所述的酶衍生自选自以下的真菌：假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、Saccharomyces、裂殖酵母属、亚罗酵母属、枝顶孢属、伞菌属、交链孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉，耙菌属、香菇属、Leptospaeria、巨座壳属、Melanocarpus、亚灰树花菌属、毛霉属、毁丝霉属、新丽鞭毛菌，脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、单鞭毛菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、纤维素属、根毛霉属、裂褶菌属、节格孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、炭角菌属或嗜热侧孢霉。
23.一种包含权利要求1至22的任意一项所述的突变体热稳定的酶的组合物。
24.一种编码权利要求1至22的任意一项所述的突变体热稳定的酶的分离的核酸。
25.一种表达载体，其包含与调控序列可操作的连接的权利要求24所述的核酸。
26.一种包含权利要求25所述的表达载体的宿主细胞。
27.权利要求26所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞选自：埃希氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、劳尔氏菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、杆菌属、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母菌、解脂亚罗酵母、汉逊酵母菌属、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母菌、曲霉属、Chrysosporiumlucknowense或里氏木霉。
28.一种用于生产突变体热稳定的酶的方法，其包括：在培养基中，在适于生产所述的酶的条件下培养权利要求26或27所述的宿主细胞。
29.一种包含权利要求26或27所述的宿主细胞和培养基的组合物。
30.一种在所述的培养基的上清液中包含权利要求1至22的任意一项所述的突变体热稳定的酶的组合物。
31.一种降低预处理生物质混合物的粘度的方法，包括：
将具有初始粘度的预处理生物质混合物与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触；以及
在足以降低所述的预处理生物质混合物的初始粘度的条件下温育所述的经接触的生物质混合物。
32.一种将生物质转化为糖的方法，其包括将所述的生物质与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触。
33.一种水解和降解生物质的方法，其包括将所述的生物质与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触。
34.一种生产发酵产物的方法，包括：
将生物质与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而形成第一产物；以及
在足以生产发酵产物的条件下培养所述的第一产物和一种或多种发酵微生物。
35.一种生产发酵产物的方法，包括：
将生物质与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而形成第一产物；以及
在足以通过化学工艺来生产发酵产物的条件下温育所述的第一产物和化学溶液。
36.一种发酵生物质的方法，包括：
将所述的生物质与一种或多种发酵微生物相接触，其中所述的生物质经过权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物的处理。
37.一种生产燃料的方法，包括：
将生物质与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而产生糖溶液；以及
在足以生产燃料的条件下培养所述的糖溶液和发酵微生物。
38.一种生产燃料的方法，包括：
将生物质与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而产生糖溶液；以及
在足以通过化学工艺来生产燃料的条件下温育所述的糖溶液和化学溶液。
39.权利要求31至38的任意一项所述的方法，其中所述的生物质包含结晶纤维素。
40.权利要求31至38的任意一项所述的方法，其中所述的生物质包含木质纤维质植物材料。
41.权利要求40所述的方法，其中所述的植物材料选自：芒属、能源草、象草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、芦苇、麦秆、大麦秆、加拿大油菜秸秆、燕麦稿秆、玉米秸秆、大豆秸秆、燕麦皮、高粱、稻壳、甘蔗渣、玉米纤维、含有可溶物的酒精糟(DDGS)、须芒草、玉米穗、松树、柳树、山杨、杨木和能源甘蔗。
42.一种食品加工方法，包括：
将植物材料与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而产生可消化的植物材料。
43.一种纺织品抛光方法，包括：
将纺织品与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而产生抛光的纺织品。
44.一种纺织品清洁方法，包括：
将污染的纺织品与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而产生清洁的纺织品。
45.一种纸浆漂白方法，包括：
将纸浆与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而产生漂白的纸浆。
46.一种生产抛光的结晶纤维素的方法，包括：
将结晶纤维素与权利要求23、29和30的任意一项所述的组合物相接触，从而产生抛光的结晶纤维素。
47.一种包含权利要求1至22的任意一项所述的酶和洗涤剂的洗衣洗涤剂组合物。
48.一种包含权利要求1至22的任意一项所述的酶的食品添加剂。
49.权利要求31至46的任意一项所述的方法，其中所述的接触是在大约50℃至大约55℃、大约55℃至大约60℃、或者大约60℃至大约70℃的温度下实施的。
50.权利要求31至46的任意一项所述的方法，其中所述的接触是在大约50℃至大约55℃的温度下实施的。
51.权利要求31至46的任意一项所述的方法，其中所述的接触是在大约60℃至大约70℃的温度下实施的。
52.权利要求31至46以及49至51的任意一项所述的方法，其中所述的生物质、植物材料、纺织品、污染的纺织品、纸浆或结晶纤维素在接触前经预处理。
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