CN111670250A

CN111670250A - 真菌纤维素酶的变体

Info

Publication number: CN111670250A
Application number: CN201880082135.3A
Authority: CN
Inventors: 卡里·云图宁; 莉娜·瓦尔塔卡里; 苏珊娜·梅基宁; 玛丽卡·阿拉普拉内恩; 昂德里克·赫尔穆特; 彭蒂·奥亚帕洛; 马克·门尼肯; 乌利齐·施瓦内贝格; 大卫·舍恩鲍尔; 泰尔希·普拉宁
Original assignee: Biochemical Enzyme Co ltd
Current assignee: Biochemical Enzyme Co ltd
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: CA3084907A1; CN111670250B; EP3728579A1; KR20200105844A; WO2019122520A8; WO2019122520A1; KR102413168B1; EP3728579A4; BR112020011352A2

Abstract

本发明涉及具有纤维素酶活性的多肽，尤其涉及衍生自20K‑纤维素酶的变体。本发明公开了对纤维素酶的性质并因此对其稳定性和/或性能重要的许多氨基酸残基位置。与亲本纤维素酶相比，该新型变体具有改善的稳定性。特别地，即使在长期实验中，在蛋白酶存在下，在几种洗涤剂组合物中，该新型变体在抗灰应用中具有良好的性能和极好的稳定性。

Description

真菌纤维素酶的变体

技术领域

本发明涉及具有纤维素酶活性的多肽，特别地，本发明涉及水解纤维素的纤维素分解酶的变体。与亲本纤维素酶相比，该酶经过了改造，具有改善的稳定性。本申请提供了新颖的多肽变体及其应用。

背景技术

纤维素酶或纤维素分解酶是参与纤维素水解的酶。在纺织工业中，纤维素酶用于牛仔布的精加工，以在生物石磨过程中在牛仔布中形成时髦的石磨洗涤外观，还用于例如清洁绒毛，并防止棉质衣物表面上形成球状物。在洗涤剂工业中，纤维素酶用于增亮颜色，并防止衣物变灰、起球，以改善清洁效果。纤维素酶还用于食品工业和动物饲料生产中，在生物质水解以及纸浆和造纸工业中具有巨大的潜力，例如，在脱墨以从纤维表面释放油墨和改善纸浆排水方面具有巨大的潜力。

衍生自热白丝菌(Melanocarpus albomyces)的20K-纤维素酶已在纺织和洗涤剂行业中广泛使用了多年，已成为数项专利的主题(例如，EP0857216B1和EP1874927B1)。该纤维素酶已被证实具有良好的性能，特别是在抗灰应用中。原生20K-纤维素酶分子是在90年代克隆的。当前对用于衣物的不同洗涤系统的需求的增加对所需洗涤剂的组成和量具有重大影响。

尽管纤维素分解酶已经成功地在商业应用中使用了很多年，但是仍然需要具有改变性质，例如改善含有蛋白酶的洗涤剂制剂的稳定性的新型纤维素酶。

发明内容

本发明的一个目的是提供与亲本酶相比在洗涤剂中显示出改善的性能和稳定性的20K-纤维素酶的新型变体。本发明的目的通过具有独立权利要求中所述特征的变体多肽及其制备方法和应用来实现。在从属权利要求中公开了本发明的优选实施例。

本发明公开了许多氨基酸残基位置，其对20K-纤维素酶的稳定性是重要的，因此对其性能而言是重要的。本发明提供了基于热白丝菌(Melanocarpus albomyces)20K-纤维素酶核(无CBD)的变体纤维素酶多肽。与源自20K-纤维素酶的亲本纤维素酶MA0相比，该新型变体具有改善的稳定性。特别地，新型变体在抗灰应用中具有良好的性能，在几种洗涤剂组合物中，在蛋白酶存在下具有优异的稳定性。尤其是，即使在高温(如30℃和37℃)下的长期实验中，这些变体在含蛋白酶的洗涤剂中也显示出改善的稳定性。另外，发酵中变体的产量与亲本纤维素酶MA0相当。

附图说明

在下文中，将参照附图通过优选实施例更详细地描述本发明，其中：

图1示意性地示出了用于在里氏木霉中表达MA0变体的表达质粒构建。示出了使用的启动子(Pcbh1)、终止子(Tcbh1)和选择标记基因(amdS)的位置，相关的限制性酶切位点以及氨苄青霉素抗性编码基因(AmpR)在载体中的位置。图片是使用Biomatters创建的Geneious版本10.0生成的。

图2示出了与亲本纤维素酶MA0相比，在蛋白酶存在下，变体MA79和MA15作为温育样品在50℃，30分钟后在市售液体洗涤剂中的残余活性的稳定性。

图3示出了在市售液体洗涤剂中，在碳黑存在下，单次洗涤中变体MA79和亲本纤维素酶MA0的抗灰性能。洗涤条件：40℃，60分钟，16°dH，碳黑0.15克/升，洗涤剂4.4克/升。

图4A示出了与亲本纤维素酶MA0相比，在蛋白酶存在下，37℃时变体MA79作为在市售液体洗涤剂中的残余活性的稳定性。

图4B示出了与亲本纤维素酶MA0相比，在蛋白酶存在下，30℃时变体MA79作为在市售液体洗涤剂中的残余活性的稳定性。

图4C示出了与亲本纤维素酶MA0相比，在蛋白酶存在下，室温(约20℃至22℃)时变体MA79作为在市售液体洗涤剂中的残余活性的稳定性。

图5示出了与亲本纤维素酶MA0相比，37℃时变体MA79作为含I&I洗涤剂的市售蛋白酶中的残余活性的稳定性。

图6示出了与亲本纤维素酶MA0相比，在蛋白酶存在下，30℃时变体MA79在市售液体洗涤剂中存储88天和193天后的相对抗灰性能。

图7示出了与市售纤维素酶Celluclean 5000L(Novozymes公司)相比，在蛋白酶存在下，37℃时变体MA79作为在市售液体洗涤剂中的残余活性的稳定性。

图8A示出了与亲本纤维素酶MA0和市售纤维素酶Celluclean 5000L(Novozymes公司)相比，37℃时变体MA79作为在含蛋白酶的液体洗涤剂浓缩物中的残余活性的稳定性。

图8B示出了与亲本纤维素酶MA0和市售纤维素酶Celluclean 5000L(Novozymes公司)相比，30℃时变体MA79在含蛋白酶的液体洗涤剂浓缩物中的残余活性的稳定性。

图9示出了与亲本纤维素酶MA0变体相比，变体MA79、MA88、MA93和MA103作为在蛋白酶存在下在50℃下孵育样品24小时后在市售液体洗涤剂中的残余活性的稳定性。

具体实施方式

纤维素分解酶或纤维素酶是具有纤维素分解活性的酶，这意味着它们能够将纤维素底物或其衍生物水解成较小的糖。因此，纤维素分解酶包括纤维素酶和半纤维素酶。纤维素酶包括(1)内切葡聚糖酶(EG，EC 3.2.1.4)，可切割内部β-1,4-糖苷键；(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH，EC 3.2.1.176，EC 3.2.1.91)，从纤维素聚合物链的还原或非还原末端切下二糖纤维二糖(dissaccharide cellobiose)；和(3)β-1,4-葡萄糖苷酶(BG，EC3.2.1.21)，将纤维二糖和其他短纤维寡糖水解成葡萄糖。

特别地，本发明涉及内切葡聚糖酶。具体地，本发明涉及属于糖基水解酶家族45(Cel45)的真菌内切葡聚糖酶，特别是这些内切葡聚糖酶的变体。更具体地，本发明涉及衍生自热白丝菌(Melanocarpus albomyces)ALKO4237 20kDa葡聚糖内切酶的MA0纤维素酶变体。“糖基水解酶家族45”或“GH45”是指由Henrissat 1991，Henrissat and Bairoch 1993、1996定义的糖基水解酶家族。

突变体的设计基于MA0纤维素酶3D结构和Cel45家族酶的序列比较。源自MA0的热白丝菌(Melanocarpus albomyces)的Cel45 20K-纤维素酶的氨基酸和核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。例如，EP1874927B1和EP0857216B1(AB酶公司)中公开了20K-纤维素酶的分离、酶活性和工业应用。

本发明具体涉及纤维素酶变体多肽或其活性片段，其中，所述变体多肽具有纤维素酶活性，并包含与SEQ ID NO：1的残基22-235具有至少90％，但小于100％的序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：1在选自以下的一个或多个位置包含至少一个取代或缺失：2、22、33、35、39、44、48、54、75、82、92、99、108、122、174、175、177、194、205、206、207、208、209、210、211、212、213和214，其中，所述变体多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ IDNO：3的成熟氨基酸序列对应来编号。

本发明还涉及在SEQ ID NO：1所示的纤维素酶氨基酸序列中包含以下一个或多个取代或缺失的多肽：N2W、N2R、G22A、G22S、G22V、A33R、F35W、F35M、H39P、H39S、V44R、V44Q、V44W、V44L、E48D、S54M、S54A、S54T、S54L、S54V A75H、A75S、A75R、E82S、E82R、E82W、T92I、A99Q、T108I、N122A、N122L、N122S、N122G、N122T、N122V、N122I、Q174R、N175D、D177Q、D177E、A194Q、G205T、F206H、A207R、A207、del(A207-A214)、del(V208-A214)、del(F209-A214)、del(K210-A214)、del(A211-A214)、del(P212-A214)和del(S213-A214)，其中，所述变体多肽的氨基酸位置通过与SEQ ID NO：3的成熟氨基酸序列对应来编号。

本发明还涉及变体多肽，其中，所述变体在氨基酸位置22和/或122处包含取代，其中，在位置22G处优选被取代为A、S或V，在位置122N处优选被取代为A、S、G、T、V或I。在一个实施例中，该变体在位置22和122处包含取代。它还可以包含至少一个另外的取代和/或缺失。该另外的取代可以选自以下的位置：2、35、44、54、75、82、108、174、177、205、206和207，该缺失可以选自以下的位置：del(A207-A214)、del(V208-A214)、del(F209-A214)、del(K210-A214)、del(A211-A214)、del(P212-A214)或del(S213-A214)。

在本发明中，变体衍生自亲本分子MA0(SEQ ID NO：2)，其是编码衍生自不具有纤维素结合结构域(CBD)的热白丝菌(Melanocarpus albomyces)ALKO4237 20K--纤维素酶的纤维素酶催化核结构域的多核苷酸。

本申请所用的术语“变体”是指具有纤维素酶活性的多肽，与SEQ ID NO：1所示的亲本序列MA0相比，该多肽在一个或多个位置包含实验诱导的突变，即插入、取代和/或缺失。MA0与20K-纤维素酶的氨基酸序列的不同之处在于在一个特定位置具有突变。取代是指将占据一定位置的氨基酸替换为其他氨基酸。缺失是指除去占据一个位置的氨基酸。插入是指添加一个或多个氨基酸。本申请在标示第一个和最后一个或多个氨基酸缺失之前使用“del”描述了缺失。

在一个实施例中，多肽变体是表3中公开的具有表2中指定的相应突变的变体。该实施例有利于获得在含有蛋白酶的洗涤剂中具有改善的稳定性的变体。在一个优选的实施例中，该变体是表3中标记为具有至少两个“+”号，甚至更优选至少3、4或甚至5个“+”号的变体，“+”号表示相比对照组，改善的程度。

在一个优选的实施例中，该变体在位置22、54和122具有至少三个取代。更优选地，该取代包括取代G22A、S54T和N122A(MA87)。

在一个优选的实施例中，该变体在位置22、108和122具有至少三个取代。更优选地，该取代包括取代G22A、T108I和N122A(MA93)。

在一个优选的实施例中，该变体在位置22、122、205具有至少三个取代。更优选地，该取代包括取代G22A、N122A和G205T(MA103)。这样的变体在含有蛋白酶的液体洗涤剂中具有改善的稳定性。

多肽变体优选包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，但小于100％的同一性的序列。在一些实施例中，所公开的变体序列包含至少一个突变，该序列的其余部分与SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基22-235具有至少90％的同一性。如本申请所用的，“同一性”是指两个比对序列之间氨基酸残基精确匹配数相对于两个序列中均存在的残基的位置数的百分比。当一个序列的残基在另一序列中没有相应的残基时，比对程序会在比对中留出空位，并且该位置不计入同一性计算的分母中。同一性是使用EMBL-EBI网站(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)上的成对序列比对工具EMBOSS Needle确定的值，具有以下参数：BLOSUM62，空位打开10，空位延伸0.5。

通过刻意引入DNA的变化以产生突变基因产物即蛋白质来产生变体。可以通过几种方法引入亲本核苷酸序列的改变或修饰，例如，所述方法包括定点和随机诱变、重组或重组融合工程。对于定点诱变和融合工程，蛋白质结构和对结构-功能关系的充分理解是有益的。在缺乏这种深刻理解的情况下，可以使用基于随机诱变的方法。

例如，可以通过如下方法获得变体：改变氢键接触、改变电荷分布、引入盐桥、引入金属结合位点、用一个或多个带有较大侧基的氨基酸填充内部结构腔(例如在结构上可移动的区域)、用其他氨基酸取代组氨酸残基、去除脱氨基位点、去除柔性区域、截短末端区域、缩短环或通过螺旋加帽。通过用半胱氨酸残基取代至少一个氨基酸或插入一个或多个半胱氨酸残基产生至少一个二硫键，可以改善蛋白质的稳定性。

本发明的纤维素酶多肽变体优选是重组产生的非天然存在的蛋白质。使用众所周知的重组DNA技术可以方便地进行制备。简而言之，编码内切葡聚糖酶的多核苷酸被克隆并插入表达载体，转化到宿主细胞中并表达。优选地，所使用的宿主菌株优选的密码子将突变引入编码序列。通过重组技术在不同宿主系统中生产蛋白质的方法是本领域众所周知的。优选地，多肽变体作为分泌到培养基中的细胞外蛋白被生产，可以容易地从培养基中回收和分离。

多肽变体除了可以设计成包含酶的活性或功能位点的催化核心结构域之外，还包含一个或多个“纤维素结合域”(“CBDs”)，也称为碳水化合物结合域/模块(CBD/CBM)，位于催化域的N端或C端。CBMs具有碳水化合物结合活性，它们介导纤维素酶与晶态和无定形纤维素的结合，但对酶在可溶性底物上的水解活性影响很小，或没有影响。

本发明的变体还可任选地包含通过柔性且通常高度糖基化的区域连接CBM和催化结构域的接头(linker)。术语“接头”或“间隔区”是指包含至少两个氨基酸的多肽，其可以存在于多结构域蛋白(例如包含酶核心和结和结构域(例如为碳水化合物结合模块(CBM))的酶或任何其他酶杂合体)的结构域之间，，或者作为融合多肽(例如包含两种核心酶的融合蛋白)产生的两个蛋白质或多肽之间。例如，通过将编码酶核心的DNA序列、编码接头的DNA序列和编码CBM的DNA序列依次融合到一个开放阅读框中并表达该构建体，来提供酶核心与CBM的融合蛋白。包含碳水化合物结合模块和/或接头区域的纤维素酶的模块化结构是本领域众所周知的。碳水化合物结合模块和接头区域可以是异源或同源的。本申请中使用的“异源的”是指变体多肽的CBM和/或可能的接头部分来自与纤维素分解活性核结构域不同的生物。如本申请所用，“同源的”是指变体的CBM和/或可能的接头部分来自与纤维素分解活性核心相同的生物。本发明公开了在变体多肽中可以使用任何接头或CBM。

本发明的变体还可任选地包含信号序列。术语“信号序列”表示编码作为较大多肽的组分的多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为较大多肽的组分引导该较大多肽通过其所产生的宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列可以是天然的，也可以用来自另一个来源的分泌信号序列或载体序列代替。取决于宿主细胞，较大的肽可以在通过分泌途径转运的过程中被切割以除去分泌肽。

“酶活性片段”是指特定氨基酸序列中足够长以具有所需酶活性的部分。换句话说，片段可以是例如，仅多肽的成熟部分，或甚至是成熟部分的子序列。它可能包含也可能不包含接头和CBM域。在本申请中，酶活性是指纤维素分解活性，指多肽水解纤维素或其衍生物的催化能力。

本发明还涉及编码本发明的纤维素酶变体多肽的新型多核苷酸。该多核苷酸包含具有SEQ ID NO：2或其片段的核苷酸序列，其长度足以编码具有酶活性的纤维素酶变体，或编码如上定义的新型多肽变体的序列，包括其互补链。本发明的多核苷酸是含有基因工程改造的非天然存在序列的重组分子。如本申请所用，“多核苷酸”是指RNA和DNA，可以是单链或双链的。也可以是互补DNA(cDNA)。cDNA是指由从真核或原核生物获得的信使RNA模板合成的DNA分子。此外，由于遗传密码，多核苷酸可以简并为如上定义的任何序列。这意味着不同的密码子可以编码相同的氨基酸。

本发明涉及重组表达“载体”，包含编码如上表征的多肽变体的多核苷酸，其与调控序列可操作地连接，所述调控序列能够引导在合适的宿主中编码所述多肽变体的基因的表达。所述调节序列可以源自宿主生物或另一生物。表达载体可以进一步包含用于选择转化株的标记基因，或者可以通过共转化将选择标记引入另一载体构建体中的宿主。

本发明还涉及生产“宿主”，其可以是能够表达所需多肽的任何生物。如本申请所用的“宿主细胞”是指易于被包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、交配、杂交等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而不同的任何后代。宿主细胞的非限制性实例是真菌细胞、丝状真菌细胞，其来自子囊菌门、盘菌亚门；优选来自以下组：粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目和小囊菌目，以及曲霉属、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属和腐质霉属；更优选地选自下组：肉座菌科、从赤壳科、麦角菌科、小囊菌科和木霉属(无性型肉座菌属)、镰孢菌属、赤霉菌属、丛赤壳属、葡萄状穗霉属、麦角菌属、绿僵菌属、稻绿核菌属(Villosiclava)、蛇形虫草属、头孢霉属和赛多孢子菌属；更优选地选自下组：里氏木霉(红褐肉座菌)、柠檬绿木霉(T·citrinoviridae)、长枝木霉(T·longibrachiatum)、绿木霉(T·virens)、哈茨木霉(T·harzianum)、棘孢木霉(T·asperellum)、深绿木霉(T·atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢霉、禾本镰孢霉、假禾谷镰孢霉、镶片镰孢霉(F.venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G·moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G.zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria(Haematonectria)haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、S·chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhiziumacridum)、金龟子绿僵菌、稻绿核菌(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)和尖端赛多孢子菌和黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉、特异腐质霉和灰腐质霉，最优选为里氏木霉。宿主细胞的非限制性实例是酵母(例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶氏酵母)和细菌细胞，优选革兰氏阳性杆菌(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)、革兰氏阴性杆菌(例如大肠杆菌)和放线菌目(例如链霉菌)。

在一个实施例中，宿主细胞是真菌细胞，优选丝状真菌细胞，例如木霉或里氏木霉。在一个实施例中，宿主细胞是细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。

“重组细胞”或“重组宿主细胞”是指已被遗传修饰或改变以包含对于所述细胞或宿主细胞非天然的核酸序列。在一个实施例中，遗传修饰包括将多核苷酸整合在宿主细胞的基因组中。在另一个实施例中，多核苷酸在宿主细胞中是外源的。

本发明还涉及产生本发明的变体多肽的方法，所述方法包括以下步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，并在能够产生所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，任选地回收并纯化所述多肽。生产培养基可以是适合于宿主生物生长的培养基，任选地包含有效基因表达的诱导剂。

本发明涉及包含本发明的变体纤维素酶多肽的酶组合物。如本申请中所用，“酶组合物”是指任何酶产物、制剂或组合物，其包含至少一种本申请所述的新型纤维素酶多肽。这样的酶组合物可以是含有一种或多种变体纤维素酶多肽，或一种或多种变体纤维素酶多肽和一种或多种其他酶的废培养基或滤液。废培养基是指包含所产生的酶的宿主的培养基。优选在生产后将宿主细胞与所述培养基分离。酶组合物可以是“整个培养液”，任选地使生产宿主或微生物失活之后，无需任何生物质分离，下游加工或所需纤维素分解酶的纯化，因为变体多肽可以被分泌到培养基中，它们在废培养基的环境条件下表现出活性。

所述酶组合物可以包含至少部分纯化和分离的形式的酶。它甚至可能基本上由所需的一种或多种酶组成。如果需要，可以对酶组合物进行干燥、喷雾干燥或冻干、制粒，或者可以将酶活性浓缩和/或稳定化以便储存。如果需要，可以根据常规方法，例如过滤、萃取、沉淀、色谱、亲和色谱、电泳等，将所需的酶结晶或分离或纯化。

在本发明的一个实施例中，酶组合物还包含一种或多种其他酶，选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、DNA酶、漆酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。

本发明的酶组合物包含纤维素酶和另外的酶，这在提供协同作用方面是有利的。当本发明的包含纤维素酶的酶组合物用于洗涤剂例如洗涤污垢时，需要这些其他的酶。与纤维素酶一起作用的特别有利的协同酶是淀粉酶、蛋白酶和甘露聚糖酶或其组合，例如包含纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的组合物。酶的完美组合可实现最佳性能。

通常，所选酶的性质应与所选洗涤剂相容(即，pH最佳，与其他酶和非酶成分的相容性等)，酶应以有效量存在。在一个实施例中，本发明的酶组合物还包含：

a.至少一种选自有机酸的防腐剂，所述有机酸例如为苯甲酸、柠檬酸、抗坏血酸、山梨酸及其盐、苯甲酸钠、羟基苯甲酸酯、苯并异噻唑啉酮(BIT)或其组合；

b.任选地，至少一种多元醇，选自丙二醇、甘油、糖、糖醇、山梨糖醇、己二醇；

c.任选地，至少一种抑制剂，选自甲酸、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、苯基硼酸衍生物、肽、其他可逆枯草杆菌蛋白酶抑制剂或其组合；

d.任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂合酶、糖水解酶、阿拉伯聚糖酶、半乳糖苷酶、漆酶、过氧化酶、有介质或没有介质的氧化酶，或其组合；

e.任选地，至少一种盐，选自氯化钠、氯化钾、(氢)磷酸钾、(氢)磷酸钠、硫酸铵、硫酸钾或其组合；和

f.任选地，至少一种填充剂或载体，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸钠、硫酸钠、焦磷酸钠、焦磷酸四钠、聚乙二醇或其组合。

其他组分a-f为本发明的酶组合物提供了改善的性能。该酶组合物与其他组分相容，改善了酶组合物在各种应用中的适用性。盐，例如氯化钠和硫酸钠用作干燥助剂。

在一个实施例中，本发明的酶组合物为液体组合物或固体组合物的形式，例如溶液、分散液、糊剂、粉末、微粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼(cake)、晶体、晶体浆液、凝胶或丸粒。

酶组合物可用于清洁剂或增强剂中，在洗涤期间或洗涤之前，该清洁剂或增强剂，例如以液体、凝胶、粉末、颗粒或片剂的形式，被添加到洗涤剂的顶部。酶组合物和洗涤剂组分也可以浸泡在诸如纺织品的载体中。

在一个实施例中，酶组合物用于纺织和洗涤剂工业，生物质加工和生物质水解，优选用于生物燃料、淀粉、纸浆和造纸、食品、烘焙、饲料或饮料工业。

本发明还涉及洗涤剂组合物，包含至少一种新的变体纤维素酶多肽或其酶组合物。本发明还涉及本发明的变体纤维素酶多肽在洗涤剂应用中的应用。除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂”包括任何形式的所有洗涤剂，例如固体、颗粒或粉末形式、液体、凝胶或糊状形式，及其任意组合。洗涤剂组合物可以是小囊(sachet)、小袋(pouch)、片剂或条形，包括多隔室产品。洗涤剂组合物可以是自由流动的粉末或液体。除非另有说明，否则这些术语包括通用或重型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液态精细织物，特种或低负荷洗涤剂；洗手剂或轻型洗碗剂，尤其是高泡沫型洗碗剂；机械洗碗剂，包括各种用于家庭和机构的片剂、粒状、液体和助洗剂；液体清洁和消毒剂、汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂；金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“染色棒(stain-stick)”或预处理类型，以及洗衣助剂。

术语“洗涤剂”、“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配方”是指混合物，旨在用于洗涤介质中清洗脏物的混合物。在一些实施例中，该术语是指洗涤织物和/或衣物(例如，“衣物洗涤剂”)。在可替代实施例中，该术语是指其他洗涤剂，例如用于清洁盘子、刀具等的那些洗涤剂(例如“餐具洗涤剂”)。这并不意味着本发明限于任何特定的洗涤剂制剂或组合物。除本发明的纤维素酶变体之外，该术语还涵盖可以包含以下物质的洗涤剂，例如：表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelators)或者螯合试剂(chelating agents)、漂白剂体系或漂白剂组分、聚合物、织物调理剂、泡沫增强剂、抑泡剂、染料、香料、鞣质抑制剂(tannishinhibitors)、光学增白剂、杀菌剂、杀真菌剂、尘粒悬浮剂、防腐剂、水溶助长剂、织物色调剂(fabric hueing agents)、分散剂，染料转移抑制剂、荧光增白剂、污渍释放聚合物、抗再沉积剂、抗缩剂、抗皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、香料、颜料、缓冲剂、防腐剂、sod抑制剂、液体洗涤剂的溶剂和结构化剂、结构弹性剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、蓝化剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。

用于固体衣物洗涤剂的组合物，例如，按组合物的重量计，可包含0.000001％-5％，例如0.000005％-2％，例如0.00001％-1％，例如0.00001％-0.1％的变体纤维素酶多肽。

用于洗衣液的组合物，例如，按组合物的重量计，可包含0.000001％-3％，例如0.000005％-1％，例如0.00001％-0.1％的变体纤维素酶多肽。

用于自动洗涤餐具的组合物，例如，按重量计，可以包含0.000001％-5％，例如0.000005％-2％，例如0.00001％-1％，例如0.00001％-0.1％的纤维素酶变体。

洗涤剂组合物可以是条状、均质片剂、具有两层或多层的片剂、具有一个或多个隔室的袋、规则或致密的粉末、颗粒、糊剂、凝胶或规则的形式、致密或浓缩液体。在一个实施例中，洗涤剂组合物可以是衣物洗涤剂组合物，优选液体或固体衣物洗涤剂组合物。有许多洗涤剂配方形式，例如层(相同或不同的相)、小袋，以及用于机器计量单元的形式。

当用于洗涤剂和纺织工业中时，本发明的变体纤维素酶多肽和包含它们的酶组合物或洗涤剂组合物具有优异的性能和稳定性。

术语“稳定性”包括储存稳定性和使用过程中，例如，在洗涤过程中(在洗涤稳定性方面)的稳定性。本发明的纤维素酶的稳定性基于时间而变化，例如当纤维素酶保存在溶液中，特别是在洗涤剂溶液中时，可以保留多少活性。

稳定性受许多因素影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物例如蛋白酶、稳定剂、助洗剂、表面活性剂等。

在本发明中，术语“改善的洗涤稳定性”是指纤维素酶变体在洗涤剂溶液中在储存和/或洗涤期间比亲本酶更好地保留了其活性和/或性能。在某些条件下温育之后，例如，如实施例2、4和5中所述，在37℃或更低的温度下温育1周或几周后或在50℃下温育较短时间后，可以通过测定添加到洗涤剂中的酶的残留活性来测定稳定性。可以使用实施例1中所述的方法或文献中公开的任何其他方法测定纤维素酶的残留活性。

稳定性也可以被测定为储存后的洗涤性能，例如，如实施例5中所述的抗灰性能。

变体纤维素酶多肽及其酶组合物可用于处理任何纤维素材料。在本申请中，“纤维素材料”是指包含纤维素或其衍生物作为重要成分的任何材料。这样的材料可以是纺织材料、用于食品或动物饲料的植物或植物来源的材料、用于提取油的植物材料，或源自木材的机械或化学纸浆或二次纤维。

术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线、纱线中间体、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织材料、由这些材料制成的织物，以及由织物制成的产品(例如衣物、亚麻布和其他物品)。纺织品或织物可以是针织物、编织物、牛仔布、无纺布、毛毡、纱线和毛巾的形式。纺织品可以是基于纤维素的，例如天然纤维素材料，包括棉、亚麻(flax/linen)、黄麻、麻、剑麻或椰壳纤维或人造纤维素材料(例如，源自木浆)，人造纤维素包括粘胶纤维/人造丝、麻、醋酸纤维素纤维(tricell公司)、莱赛尔纤维(lyocell)或其混合物。纺织品或织物也可以是基于非纤维素的，例如天然聚酰胺，天然聚酰胺包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和丝绸，或者合成聚合物，合成聚合物例如为尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和斯潘德克斯纤维/弹性纤维，或其混合物，以及基于纤维素和非纤维素的纤维的混合物。混合物的例子是棉和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴随材料的混合物，伴随材料例如为羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、氨纶纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、麻、亚麻(flax/linen)、黄麻，醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤的衣物，例如染色的家庭衣物。当使用术语织物或服装时，也指包括较宽泛的术语的纺织品。

在合适的条件下，例如合适的pH和温度下，纤维素材料与本发明的变体多肽或包含所述变体多肽的酶组合物反应，并使反应持续足以进行酶促反应的时间，由此得到至少部分水解的纤维素材料。酶以酶促有效量，例如同时以酶混合物的形式加入或依次加入。

可以将变体纤维素酶多肽和包含它们的酶组合物添加到洗涤剂组合物中，例如通过去除颜料污垢和通过抗再沉积和抗灰，从而改善织物清洁。变体纤维素酶还可以通过预防和除去绒毛和纤维绒球而改善纤维和颜色护理性能，从而使颜色变亮或变淡，并使其柔软。术语“去球”(去除绒球)和“颜色恢复”通常用于描述纤维素酶对旧的，用过的棉纺织品的影响。术语“防起球”(防止起球)，“颜色保持”或“颜色护理”通常用于描述纤维素酶对新服装的影响。纤维和颜色护理性能的影响可通过可见的和可测量的亮度降低(即暗度增加)或暴露于重复洗涤循环的有色棉纺织品的颜色变化来检测。商业上可以买到预起绒和未起绒的新型织物的标准化测试监视器。

变体内切葡聚糖酶多肽和包含它们的酶组合物用作抗灰剂在洗涤剂应用中是特别有用的。如本申请所用，术语“抗灰性能”或“抗灰效果”是指抗再沉积和去除颜料性能。随着洗涤循环次数的增加，颜料、颗粒和可溶性污垢，盐分及其他物质会粘附在纺织品纤维上，最有可能出现在棉纤维受损的区域。这可能会导致棉纺织品变灰，以及变黑或变黄。从理论上讲，纤维素酶会在这些区域的随机位置水解具有非晶结构的纤维素链，从而导致除去带有附着颗粒的纤维或表面活性剂的可及性更高，因此显示出增白或抗灰作用。另外，洗涤液中的纤维素材料的痕迹可能被消化，从而防止了此类纤维在服装的棉布表面上的粘附。这些效应称为抗灰或抗再沉积，可以使用光学测量进行评估。合适的测试方法是本领域公知的，通常基于在洗衣机中重复洗涤循环中使用带有标准白色测试织物的人工沉着污垢系统(artificial ballast soil systems)。还可以使用基于碳黑的再沉积液，通过单次洗涤作为压力测试来测试抗灰效果。

还可以将变体纤维素酶多肽添加到洗涤剂组合物中，以通过除去色素上的污垢或通过与洗涤剂中通常使用的其他酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶和甘露聚糖酶)对某些污渍产生协同作用来改善织物清洁或污渍的去除。可以通过增加亮度或改变染色材料的颜色来测量去污效果，例如，通过光学测量在人造污垢的样本或测试布中进行检测，视觉上可以观察到污渍的褪色。

变体纤维素酶多肽和包含它们的酶组合物还可用于纺织工业的精加工工序，例如织物、衣物或纱线的生物整理。如本申请所用，表述“生物整理”(也称为去球、去绒毛，脱毛或生物抛光)是指变体酶在纤维素纤维的受控水解中的应用，以便以某种方式修饰织物或纱线表面，永久防止起球的趋势，改善织物的手感(如柔软度和平滑度)，并通过减少起毛清除表面结构。生物整理可以使颜色更清晰，改善织物的悬垂性并改善吸湿性，从而进一步改善染色性。生物整理可以在染色之前，之后或同时进行。

可以在纺织品湿法加工的任何阶段进行酶去球，优选在任选的退浆和/或漂白之后进行，可以使用与生物石化相似的条件。也可以处理衣物形式的纺织品。

变体纤维素酶多肽和包含它们的酶组合物可用于牛仔布的生物染色。如本申请中所用，表述织物或衣物的“生物石磨”是指用酶代替浮石或除浮石之外，用酶处理织物或服装，特别是牛仔布，以获得老化或磨损外观。术语“老化或磨损的外观”是指由于不均匀去除染料而导致的染色区域与已去除染料的区域之间存在对比。

在生物石磨和生物整理中的液体比率(液体体积/单位重量织物的比率)可以在约3∶1至20∶1，优选5∶1至10∶1的范围内。处理时间可在15分钟至90分钟之间变化，优选在30分钟至60分钟之间变化。应该强调的是，酶的用量在很大程度上取决于织物的类型、机器、工艺条件(pH、温度、浴比、处理时间、牛仔布负载、工艺规模)和酶制剂或组合物的类型。工业生物整理典型的工艺参数例如在40℃至65℃的温度下，pH值为4.5-8。本领域技术人员能够确定合适的剂量和条件。

序列表

SEQ ID NO：1：包含Met1至Ala235的氨基酸，衍生自热白丝菌(Melanocarpusalbomyces)ALKO4237GH45 20K-纤维素酶的MA0纤维素酶的全长氨基酸序列。

SEQ ID NO：2：衍生自热白丝菌(Melanocarpus albomyces)ALKO4237cel45 20K--纤维素酶的全长MA0纤维素酶的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3：包含Ala1至Ala214的氨基酸，衍生自热白丝菌(Melanocarpusalbomyces)ALKO4237GH45 20K-纤维素酶的成熟MA0纤维素酶的氨基酸序列。

保藏

热白丝菌(Melanocarpus albomyces)ALKO4237于2012年3月2日保藏在荷兰乌得勒支Upsalalaan 8，3584CT的荷兰微生物菌种保藏中心(CBS：CentraalbureauvoorSchimmelcultures)，保藏号为CBS132099。

实施例

在大肠杆菌转化，测序等中，使用标准分子生物学方法对DNA进行分离和酶处理(例如，分离质粒DNA，消化DNA以产生DNA片段)。所用的基本实验室方法如酶、试剂或试剂盒制造商或如标准分子生物学手册中所述，例如Sambrook和Russell(2001)或如以下实施例中所述。

实施例1.在里氏木霉中产生热白丝菌(Melanocarpus albomyces)MA0变体

热白丝菌(Melanocarpus albomyces)cel45 20K-纤维素酶变体来自亲本分子，在此命名为MA0(核酸序列SEQ ID NO：2，对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1)。构建表达质粒以生产重组cel45MA0变体(图1)。如Paloheimo等人2003所述，构建体包含里氏木霉cel7A启动子和终止子以及amdS标记基因。变体基因在位置1-63nt处含有信号序列，在位置84-154nt和404-473nt处含有内含子序列。合成基因，包括在亲本分子核心区域引入的突变(表1)，通过连接准确地作为SacII-BamHI片段与里氏木霉cel7A启动子融合。为了构建MA79变体的表达质粒，分离了pALK4472的328bp SalI-BamHI片段，并连接到pALK4458的8523bp SalI-BamHI片段中。表达质粒列于表1。

表1.用于构建在里氏木霉氨基酸位置生产MA0纤维素酶变体的表达盒的合成基因通过与没有信号序列的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：3)对应而编号。

通过EcoRI消化从载体主链中分离线性表达盒，或将环状质粒直接用于里氏木霉原生质体转化。用乙酰胺作为唯一的氮源选择转化体。宿主菌株缺乏四种主要的内源纤维素酶：

CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A。根据

等人(1987)，的描述进行转化，并按照Karhunen等人(1993)，的描述进行修饰。将转化体通过单分生孢子在选择板上纯化，然后将其在马铃薯葡萄糖琼脂上形成孢子。

从摇瓶培养(50ml)的培养物上清液分析转化体的纤维素酶产生。转化体在pH 5.5的5％KH2PO4缓冲过的30℃，250rpm的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等，1993)中生长7天。基本上如Bailey和Nevalainen，1981；Haakana等，2004(NCU活动)所述，随着还原糖从羧甲基纤维素(3％CMC)中在50℃的50mM HEPES缓冲液pH 7.0中释放，从培养物上清液中测量重组蛋白的酶活性。还通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)从培养物上清液中检测到重组蛋白的产生。

在摇瓶或生物反应器中，在复杂的纤维素酶诱导培养基中培养所选的产生亲本MA0纤维素酶的转化体和参考菌株，以获得用于应用测试的材料(实施例2至6)。

实施例2.基于MA0变体MA1-MA79在市售液体洗涤剂中在50℃下的稳定性进行筛选

通过在蛋白酶存在下的快速测试，基于洗涤剂在50℃下的稳定性，筛选如实施例1中所述在木霉中产生的MA0变体。亲本纤维素酶MA0用作参考。将0.8％w/ww的蛋白酶Savinase 16L(诺维信公司，丹麦)添加到不含酶的商品液体洗涤剂中。表2描述了洗涤剂的组成。

将5％w/w的纤维素酶的培养物上清液添加到洗涤剂中，将带盖塑料管中的样品在50℃水浴中温育30分钟。温育后，通过实施例1中所述的活性测定法测量酶活性(NCU)，不同的是使用30分钟的较长反应时间。计算结果为残余活性(％)，通过将在50℃温育后样品的活性除以样品的初始活性而得到。

表2.市售液体洗涤剂的组成

成分	％
		阴离子表面活性剂	15–30
非离子表面活性剂、肥皂	5–15
		膦酸酯、肥皂	<5
硼酸	≤1
		其他成分：例如光学增白剂、香料
pH 8.2-8.6

与亲本MA0纤维素酶相比，几种变体在50℃的市售液体洗涤剂中显示出改善的酶活性稳定性。结果示于表3。使用变体MA15、MA28，尤其是MA79获得了最佳的稳定性。与MA0相比，变体MA15和MA79的稳定性显示为残余活性。两种变体均显示出比亲本纤维素酶明显更好的稳定性。

表3.在蛋白酶存在下(50℃，30分钟)在洗涤剂中MA0变体的稳定性。与亲代MA0纤维素酶相比，符号“+”表示稳定性有所提高(测定为残余活性)，“+++++”表示在测试组中实现的最佳稳定性。

变体	稳定性
		MA1	++
MA3	++
		MA9	++
MA14	+
		MA15	++++
MA16	+++
		MA26	+
MA28	++++
		MA29	+++
MA30	+
		MA31	+
MA37	++
		MA46	+
MA53	+
		MA54	+
MA56	+
		MA61	++
MA66	+++
		MA71	++
MA79	+++++

实施例3.在耐水洗色牢度测试仪(Launder-Ometer)中测试MA0变体的抗灰性能

通过单洗涤方法(40℃，60min，16°dH)，使用除洗涤剂(4.4g/l)以外的碳黑(约0.15g/l)在洗涤溶液中，测试了来自实施例2的最稳定的变体MA79的抗灰性能。亲本纤维素酶MA0用作参考。

使用由CFT(荷兰测试材料NV的中心)提供的具有光学增白剂(CN-42)的棉质互锁双层运动衫用作测试织物。首先将织物在洗衣机中预洗(在50℃下放置15分钟，在60℃下放置60分钟)，然后进行滚筒干燥，然后切成约14-14.5厘米(4个样本的总重量25克)的布样。

作为碳黑RD-liq 01的来源，在塑料瓶中，CFT含有7g碳黑液体(约33％的碳黑)，通常用于洗衣机的全尺寸洗涤(每次洗涤测试织物用一瓶)。在该实施例中，该方法适用于小规模，使用的碳黑和水的比例与全比例时大致相同。首先，将开瓶的RDliq 01(即约2.3g碳黑)放在装有1升去离子水的倾析瓶中，制备储备液碳黑。用磁力搅拌器将溶液搅拌过夜，直到瓶中的内容物完全释放为止。之后，将65g储备液与935ml硬度为17.1°dH的合成自来水混合，最终制成稀释的碳黑溶液，其硬度为16°dH，碳黑含量约为0.15g/l(或0.45g RD-liq01)。

对于硬度为17.1°dH的合成自来水，在去离子水(Milli-Q或同等水平)中制备以下储备溶液：

钙硬度为1000°d的储备溶液：CaCl₂x 2H₂O

(1.02382.1000，德国默克公司)26.22克/升

镁硬度为200°d的储备溶液：MgSO₄x 7H₂O

(1.05886.1000，德国默克公司)8.79g/l H₂O

NaHCO3储备溶液：NaHCO₃(1.06329.1000德国默克公司)29.6g/l。

将制备的NaHCO3溶液按给定顺序添加到容量瓶中，用去离子水补充至1升并混合。通过络合滴定法测定水的硬度，发现正确。

在Atlas LP-2Launder-Ometer中进行了如下防灰测试。首先将Launder-Ometer预热至40℃。将60g钢球(直径0.6cm)、1.1g实施例2中所述的市售液体洗涤剂、250ml稀释的碳黑液和稀释的酶(＜1.0ml)加入1.2升的容器中。之后，加入4个样品的预洗涤的测试织物CN-42，并且将Launder-Ometer在40℃下以42rpm的转速运行60分钟。酶的剂量为每升0、0.25、0.05、0.1和0.2活性单位(NCU)。如实施例1中所述测量活性。

在Launder-Ometer上进行纤维素酶处理后，首先将样品在流动的自来水(约20℃)下分别快速漂洗以除去钢球，然后在流动的水中在装有孔的特定杯子中分别漂洗3次，最后浸入在盛有水的桶中。之后，将样品从洗衣机中提取，并在室温下在网格上干燥。用酶处理过的织物和不含酶的对照物分别漂洗和提取以避免污染。

通过用柯尼卡美能达CM3610A分光光度计测量测试织物的反射率为Y值(D65/10°，切割420nm)，来评估纤维素酶的抗灰性能。纤维素酶性能计算为ΔY(ΔY)，这是指酶处理过的织物的Y值减去用碳黑和含有无酶洗涤液的洗涤剂处理过的织物的Y值(酶空白，对照)。值为4个样本的平均值。Y或ΔY值越高，织物的防灰效果和白度越好。

图3中的结果表明，最稳定的变体MA79与液体洗涤剂中的亲代MA0纤维素酶相似，具有出色的抗灰性能。

来自实施例2的其他几种变体，如MA1、MA3、MA15、MA29，也具有与MA0一样好的抗灰性能(数据未显示)。

实施例4.用酶活性测量变体MA79在液体洗涤剂中的长期稳定性

使用亲本纤维素酶MA0作为参照，在37℃、30℃和室温(约20-22℃)的液体洗涤剂中测试了变体MA79的培养样品的长期稳定性。在添加的蛋白酶(0.8％w/w Savinase16L)存在下，用实施例2中所述的市售液体洗涤剂进行测试。将1％w/w的纤维素酶制剂添加到洗涤剂中，将带盖塑料管中的样品在每个温度下孵育数周或数月。如实施例2中所述测量酶活性并计算结果作为残余活性。

在市售液体洗涤剂中用蛋白酶得到的测试结果如图4A-C所示。与MA0相比，变体MA79在所有温度下(尤其是在37℃时)的长期稳定性都得到了显着改善。

还在包含蛋白酶和除纤维素酶之外的其他酶的商业I&I(工业和机构)洗涤剂配方中进行了变异MA79和MA0的稳定性测试。将0.5％w/w的纤维素酶制剂添加至洗涤剂中，并将样品在37℃下孵育6周。在这种I&I洗涤剂中，变体MA79的稳定性也比MA0好得多(图5)。

实施例5.变体MA79在液体洗涤剂中的长期稳定性，测量为抗灰性能

与亲本MA0纤维素酶相比，变体MA79的稳定性也被评价为抗灰性能。用在30℃下储存88天和193天的洗涤剂样品进行类似于实施例3中所述的抗灰化试验。首先将纤维素酶以这样的量添加到洗涤剂中，即，剂量是每升洗涤溶液0.2个活性单元(NCU)。将存储的样品的性能与洗涤液进行比较，在洗涤液中，将新鲜的酶添加到含有洗涤剂和碳黑的洗涤液中，并将结果计算为表示残留性能水平的相对性能。

图6中的结果表明，变体MA79在诸如30℃的高温下储存超过6个月后仍具有优异的抗灰性能。12周后与MA79相比，MA0的性能已大大降低。

实施例6.与市售纤维素酶相比，变体MA79在液体洗涤剂中的稳定性

从MA79的中试规模发酵样品制备了类似样品的样品，并在各种温度下于液体洗涤剂中重新测试了6周的稳定性，使用亲本纤维素酶MA0和/或市售纤维素酶Celluclean5000L(丹麦诺维信公司)进行比较。

如实施例4中所述，在添加的蛋白酶存在下，在市售液体洗涤剂(表2/实施例2中描述)中进行测试。还测试了包含蛋白酶和除纤维素酶以外的其他酶的浓缩液体洗涤剂。将0.5％w/w的纤维素酶加入洗涤剂中。

根据图7所示的结果，在37℃的市售液体洗涤剂中，变体MA79的稳定性比Celluclean 5000L好得多。用另一种洗涤剂，液态洗涤剂浓缩物获得的结果表明，在37℃下，变体MA79的稳定性显着高于MA0和Celluclean 5000L(图8A)。在这种洗涤剂中，MA79的稳定性在30℃(图8B)下和室温约20℃至22℃(数据未显示)下也要比Celluclean 5000L要好。

实施例7.基于MA0变体MA80-MA116在市售液体洗涤剂中在50℃下的稳定性进行筛选

如实施例2中所述亲本纤维素酶MA0和稳定的变体MA79用作参照，在50℃下，测试了在市售洗涤剂中实施例1中所述的木霉中生产的MA0变体MA80-MA116的稳定性。

当在50℃下孵育30分钟时，与亲本MA0纤维素酶相比，几种变体在市售液体洗涤剂中显示出改善的稳定性。为了区分具有比来自实施例2的最稳定的变体MA79更高的稳定性的变体，温育时间必须增加到24小时。使用热培养箱代替水浴。50℃下孵育24小时后，最佳变体的残余活性如图9所示。尤其是与MA79相比，变体MA88和MA93具有更高的稳定性。亲本分子MA0在24小时后几乎没有活性。当如实施例3中所述测试时，变体MA88、MA93和MA103还显示出优异的抗灰性能，至少与亲本分子M0一样好(数据未显示)。

参考文献

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Haakana H、Miettinen-Oinonen A、Joutsjoki V、

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Henrissat B，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类，生物化学杂志，280：309-316。

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SEQUENCE LISTING

<110> 生化酶股份有限公司

<120> 真菌纤维素酶的变体

<130> GP202000123

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 1

Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Ala Leu Leu Ala Ala Ala Leu Pro

1 5 10 15

Leu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

20 25 30

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Val Asn Gln Pro

35 40 45

Val Tyr Ser Cys Asp Ala Asn Phe Gln Arg Ile His Asp Phe Asp Ala

50 55 60

Val Ser Gly Cys Glu Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser

65 70 75 80

Pro Trp Ala Ile Asn Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

85 90 95

Leu Ser Gly Gln Thr Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu

100 105 110

Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser

115 120 125

Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile

130 135 140

Pro Gly Gly Gly Val Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly

145 150 155 160

Gly Leu Pro Gly Ala Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gln Glu Cys

165 170 175

Asp Ser Phe Pro Glu Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp

180 185 190

Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln

195 200 205

Cys Pro Glu Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp

210 215 220

Gly Gly Phe Ala Val Phe Lys Ala Pro Ser Ala

225 230 235

<210> 2

<211> 849

<212> DNA

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 2

atgcgctcta ctcccgttct ccgcgccctc ctggccgcag cattgcccct cggggccctc 60

gccgccaacg gtcagtccac gaggtaactg atcacccgcc tcattacgcg tgccgaccgg 120

accgcgttca gggctcactg ctcaccgcat ccagatactg ggactgctgc aagccgtcgt 180

gcggctgggc cggaaagggc cccgtgaacc agcccgtcta ctcgtgcgac gccaacttcc 240

agcgcatcca cgacttcgat gccgtctcgg gctgcgaggg cggccccgcc ttctcgtgcg 300

ccgaccacag cccctgggcc attaatgaca acctctcgta cggcttcgcg gcgactgcac 360

tcagcggcca gaccgaggag tcgtggtgct gtgcctgcta cgcgtgagtg tgcttgggcc 420

caacgtcggt gattccggag ttcagaccac tgacccagcg acccgctcgc cagtctgacc 480

tttacatcgg gtcccgtggc cggcaagacc atggtcgtcc agtcgaccag cacgggcggc 540

gacctcggca gcaaccactt cgacctcaac atccccggcg gcggcgtcgg cctcttcgac 600

ggctgcactc cccagttcgg cggcctcccg ggcgcacggt acggcggcat ctcgtcgcgc 660

caggagtgcg actcgttccc cgagccgctc aagcccggct gccagtggcg cttcgactgg 720

ttccagaacg ccgacaaccc gtcctttacc ttcgagcggg tccagtgccc cgaggagctg 780

gtcgctcgga ccggctgcag gcgccacgac gacggcggct tcgccgtctt caaggccccc 840

agcgcctga 849

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 3

Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys

1 5 10 15

Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Val Asn Gln Pro Val Tyr Ser Cys Asp

20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg Ile His Asp Phe Asp Ala Val Ser Gly Cys Glu

35 40 45

Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala Ile Asn

50 55 60

Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gln Thr

65 70 75 80

Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly

85 90 95

Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly

100 105 110

Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Val

115 120 125

Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala

130 135 140

Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gln Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala

165 170 175

Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln Cys Pro Glu Glu Leu

180 185 190

Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Ala Val

195 200 205

Phe Lys Ala Pro Ser Ala

210

Claims

1.一种纤维素酶变体多肽或其活性片段，其特征在于，所述变体多肽具有纤维素酶活性，并且包含与SEQ ID NO：1的残基22-235具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在一个或多个位置处的取代或缺失，所述一个或多个位置选自：22、122、2、33、35、39、44、48、54、75、82、92、99、108、174、175、177、194、205、206、207、208、209、210、211、212、213和214，其中所述变体多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO：3的成熟氨基酸序列对应来编号。

2.根据权利要求1所述的纤维素酶变体多肽，其特征在于，所述多肽包含以下一个或多个取代或缺失：N2W、N2R、G22A、G22S、G22V、A33R、F35W、F35M、H39P、H39S、V44R、V44Q、V44W、V44L、E48D、S54M、S54A、S54T、S54L、S54V A75H、A75S、A75R、E82S、E82R、E82W、T92I、A99Q、T108I、N122A、N122L、N122S、N122G、N122T、N122V、N122I、Q174R、N175D、D177Q、D177E、A194Q、G205T、F206H、A207R、A207S、del(A207-A214)、del(V208-A214)、del(F209-A214)、del(K210-A214)、del(A211-A214)、del(P212-A214)和del(S213-A214)。

3.根据权利要求1或2所述的纤维素酶变体多肽，其特征在于，所述变体包含在位置22和/或122处的取代，其中在位置22G处取代为A、S或V，在位置122N处取代为A、S、G、T、V或I。

4.根据权利要求3所述的纤维素酶变体多肽，其特征在于，所述变体包含在位置22和122处的取代和至少一个另外的取代或缺失。

5.根据权利要求4所述的纤维素酶变体多肽，其特征在于，所述另外的取代选自以下位置的取代：2、35、44、54、75、82、108、174、177、205、206或207。

6.根据权利要求4所述的纤维素酶变体多肽，其特征在于，所述另外的缺失选自以下：del(A207-A214)、del(V208-A214)、del(F209-A214)、del(K210-A214)、del(A211-A214)、del(P212-A214)或del(S213-A214)。

7.一种分离的核酸分子，包含对权利要求1至6中任一项所述的纤维素酶变体多肽进行编码的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQ ID NO：2所定义的核苷酸序列。

9.一种重组表达载体，包含对权利要求1至6中任一项所述的纤维素酶变体多肽进行编码的核苷酸序列，所述核苷酸序列与能够指导编码所述纤维素酶变体的基因在合适的宿主中表达的调控序列可操作地连接。

10.一种宿主细胞，包含权利要求9所述的重组表达载体。

11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主选自：

真菌细胞，

丝状真菌细胞，其选自子囊菌门，盘菌亚门；优选地，选自下组：粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、小囊菌目、曲霉属、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属和腐质霉属；

更优选地选自下组：肉座菌科、从赤壳科、麦角菌科、小囊菌科、木霉属(无性型肉座菌属)、镰孢霉属、赤霉菌属、丛赤壳属、葡萄状穗霉属、麦角菌属、绿僵菌属、稻绿核菌属(Villosiclava)、蛇形虫草属、头孢霉属、赛多孢子菌属；

更优选地选自下组：里氏木霉(红褐肉座菌)、柠檬绿木霉(T·citrinoviridae)、长枝木霉(T·longibrachiatum)、绿木霉(T·virens)、哈茨木霉(T·harzianum)、棘孢木霉(T·asperellum)、深绿木霉(T·atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢霉、禾本镰孢霉、假禾谷镰孢霉、镶片镰孢霉(F.venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G·moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G.zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria(Haematonectria)haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、S·chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhiziumacridum)、金龟子绿僵菌、稻绿核菌(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)、顶头孢霉、尖端赛多孢子菌、黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝菌、特异腐质霉和灰腐质霉，

细菌细胞，优选为革兰氏阳性杆菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌；革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌；放线菌例如链霉菌，以及

酵母，例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶氏酵母，最优选里氏木霉或芽孢杆菌。

12.一种生产权利要求1至6中任一项所述的纤维素酶变体多肽的方法，所述方法包括培养权利要求9至10中任一项所述的宿主细胞并回收所述多肽的步骤。

13.一种获得酶组合物的方法，所述酶组合物包含权利要求1至5中任一项所述的纤维素酶变体多肽，所述方法包括以下步骤：培养根据权利要求10至11中任一项所述的宿主细胞，并且，从所述细胞中回收所述多肽或者从所述培养基中分离所述细胞，并获得整个培养液。

14.一种酶组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的纤维素酶变体多肽。

15.根据权利要求14所述的酶组合物，其特征在于，所述组合物还包含选自以下的其他酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶裂解酶、分解果胶酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶(有或没有介体)。

16.根据权利要求14或15所述的酶组合物，其特征在于，所述组合物包含选自以下的合适添加剂：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、助洗剂(builders)、漂白剂、介体、抗腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂(caustics)、磨料、光学增白剂、染料、颜料和防腐剂。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物为溶液组合物，或固体组合物，例如：溶液、分散液、糊剂、粉剂、微粒、颗粒、包衣颗粒剂、片剂、饼(cake)、晶体、晶体浆液、凝胶或丸剂(pellet)。

18.如权利要求1至6中任一项所述的纤维素酶变体多肽或如权利要求14至17中任一项所述的酶组合物在用于洗涤剂，用于处理纤维、木材衍生的纸浆、生物质水解、食品或饲料的用途，或者在涉及改性、降解或去除含纤维素材料的用途。

19.一种用于防灰、去污、纤维和颜色护理、生物染色或生物整理的方法，包括将权利要求1至6中任一项所述的纤维素酶变体多肽或权利要求14至17中任一项所述的酶制剂添加到用于处理含棉的织物或衣服或其他纺织材料例如织物或衣服或纱线的液体步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述纺织材料由包含天然纤维素的纤维或包含人造纤维素的纤维或其混合物制成。

21.一种洗涤剂组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的纤维素酶变体多肽或权利要求14至17中任一项所述的酶组合物。

22.根据权利要求21所述的洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物为液体洗涤剂或固体洗涤剂的形式，优选为条形、均质片剂、具有两层或多层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、普通或致密粉末、颗粒、糊剂、凝胶，或普通、致密或浓缩液体。

23.根据权利要求21或22所述的洗涤剂组合物，其特征在于，所述组合物包含一种或多种另外的酶，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、DNA酶、果胶酶、果胶裂解酶、分解果胶酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。

24.一种处理含纤维素纤维的纺织材料的方法，其中，所述方法包括使所述纺织材料与权利要求21至23中任一项所述的洗涤剂组合物接触。