CN109234174B - 一种产纤维素酶的嗜热真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种产纤维素酶的嗜热真菌及其应用，所述嗜热真菌(Melanocarpus albomyces)的保藏编号为CGMCC15863；该菌为产纤维素酶的新纪录种，其可在高温下生长并产生纤维素酶，该菌株产生的纤维素酶在高温环境下能保持较高的活性，嗜热纤维素酶可以在高温环境下高效降解纤维素，在食品、酿酒、洗涤及环境保护中具有较为广泛的应用。

Description

一种产纤维素酶的嗜热真菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种产纤维素酶的嗜热真菌及其应用。
背景技术
纤维素作为世界上含量最丰富、分布最为广泛的可再生生物质资源，每年的生成量高达1.0×1011t，相当于我们年消耗生物资源的20多倍。木质纤维素占地球植物生物量的80％，粗略估计世界范围内有89％的植物生物质资源未被人类利用，只有11％用于农作物产品、饲料、造纸和建筑原料等。由于这种多糖物质不能被大多数的动植物直接利用，所以通常被焚烧处理，进而造成了资源的大量浪费及各种环境问题。因此，如何有效的利用纤维素资源已经成为全球热点方向。
纤维素在内切葡聚糖酶(羧甲基纤维素酶，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(微晶纤维素酶，EC3.2.1.91)和纤维二糖酶(β-葡糖苷酶，EC3.2.1.21)三种酶的协同作用下才能完全水解。纤维素酶主要来源于细菌、放线菌、真菌及原生动物的分泌。在大量产酶微生物中，用于生产且研究较多的是丝状真菌中的一些木霉Trichoderma spp.和曲霉Aspergillusspp.。目前市场上的纤维素酶大多属于中温酶，在工业生产中常出现伴随着温度的升高而使酶活力降低的现象，这使得酶制剂的研发和生产受到了严重限制，因此探索研究新的高效的热稳定酶类，逐渐成为解决纤维素降解研发及产业化的关键之一。
嗜热真菌(Thermophilic fungi)是指最低生长温度在20℃或20℃以上，最高生长温度为50℃或50℃以上的一类特殊真菌。嗜热真菌的分布范围较广，主要存在于各种高温环境，如温泉、堆肥、火山地区等，这些特殊的环境使得嗜热真菌对高温表现出较强的适应能力，形成了特殊的生长发育机制以应对这种极端生存条件。近年来，研究发现嗜热真菌在一定条件下可产生纤维素酶，这类酶耐高温、酶活力强，在高温发酵工业中有特殊的优势。因此，来自特殊高温环境的嗜热真菌已成为筛选高效降解纤维素的高温纤维素酶的一个主要来源。目前，国内外报道的嗜热真菌仅有20个属44个种。而关于嗜热真菌产纤维素酶仅有Thermotoga maritime MSB8、Thermotoga neapolitana、Aspergillus fumigatus Z5、Gladaxporism sp.SCSIO 43503等相关报道。
目前嗜热纤维素酶在食品、酿酒、纺织、洗涤、能源、造纸等工业生产中应用非常广泛。如在酱油生产中加入适量嗜热纤维素酶能提高大豆内含物的提取率；在提高酱油纯度的同时，既优化品质又缩短生产周期，并使其各项指标有效提高3％；在酒精生产中可以提高出酒率，降低酒精粘稠度，缩短发酵时间，降低杂醇油含量等；在洗涤剂中使用可以使衣物更加鲜亮柔软；在农业和环境保护中，也可利用嗜热纤维素酶的这些特性，将农业废弃物中的纤维转化为还原糖，再进一步发酵成酒精，从而来弥补化石燃料的不足，这些在有助于环境保护的同时对人类的发展也具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种产纤维素酶的嗜热真菌及其应用，该菌株可在高温下生长并产生纤维素酶。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种产纤维素酶的嗜热真菌，所述嗜热真菌(Melanocarpus albomyces)的保藏编号为CGMCC15863。
优选的，所述嗜热真菌分离自中国西藏部分热泉的水泽沉积物。
优选的，所述嗜热真菌具有产纤维素酶的作用。
所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用。
优选的，将活化嗜热真菌菌株接种于发酵培养基中发酵培养，将得到的发酵液离心，得到上清粗酶液。
进一步的，发酵培养基包括：质量百分比浓度为1％-10％的碳源，质量百分比浓度为0.2％-0.8％的氮源。
进一步的，碳源为羧甲基纤维素钠、淀粉、乳糖、玉米芯粉和稻草粉中的一种。
进一步的，氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、酵母膏和蛋白胨中的一种。
进一步的，发酵培养的温度为41℃-59℃，时间为2-7d。
进一步的，发酵培养的起始pH为4.5-8.5。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明成功得到嗜热真菌(Melanocarpus albomyces)菌株，该菌为产纤维素酶的新纪录种，其可在高温下生长并产生纤维素酶，该菌株产生的纤维素酶在高温环境下能保持较高的活性，嗜热纤维素酶可以在高温环境下高效降解纤维素，在食品、酿酒、洗涤及环境保护中具有较为广泛的应用。
附图说明
图1为培养基碳源种类对CMCase影响的柱状图；
图2为碳源浓度对CMCase影响的折线图；
图3为培养基氮源种类对CMCase影响的柱状图；
图4为氮源浓度对CMCase影响的折线图；
图5为发酵温度对CMCase影响的折线图；
图6为发酵时间对CMCase影响的折线图；
图7为培养基起始pH对CMCase影响的折线图；
图8为基于ITS序列构建的进化树。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明采用的Melanocarpus albomyces菌株,于2018年6月7日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路中国科学院微生物研究所，邮编:10010，保藏编号:CGMCC15863。
本发明的嗜热产纤维素酶的菌株分离自中国西藏部分热泉的水泽沉积物，通过刚果红固体培养基初步鉴定该菌株具有产生纤维素酶的能力，并对其进行形态学和ITS分子生物学鉴定，确定为Melanocarpus albomyces。经酶学性质的研究，该菌株产生纤维素酶的发酵培养基的最适碳源为乳糖，乳糖在发酵培养中的最佳质量百分比浓度为9％，最适氮源为硫酸铵，硫酸铵在发酵培养中的最佳质量百分比浓度为0.6％，最适培养温度为57℃，最佳培养时间为5天，最佳培养基起始pH为5.5。
本发明发现的嗜热产纤维素酶的真菌经如下具体步骤得到：
1、纤维素酶的初步筛选
采用透明圈法，将该真菌单菌落接种于刚果红培养基上，45℃恒温培养7d，待菌落长成后，测量透明圈直径D与菌落直径d，根据二者差值的大小可初步判断产酶活性大小。
2、菌株的鉴定
(1)形态鉴定
将菌种接种到PDA培养基上，45℃倒置培养7-14d，观察菌落形态，在接种位点旁斜插入无菌盖玻片，经培养待菌丝爬满盖玻片后，取出盖玻片并在高级光学显微镜下观察菌丝的形态特征及产孢结构。
菌落特征：菌落呈淡粉色，菌落圆整，菌丝体发达，呈棉絮状，菌丝粗壮，菌丝有分隔，分隔处有膨大现象，菌丝分支末端膨大。
(2)分子生物学鉴定
a.采用CTAB法提取该菌株的基因组DNA，溶于50μL TE缓冲液中，于-20℃保存备用。
b.使用真菌ITS通用引物序列：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，以该菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增。
a.扩增得到的片段，用电泳检测验证。
b.送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
基于ITS序列构建的进化树如图8所示，图中THN8为该菌株编号。
根据形态学及分子生物学鉴定，确定该株真菌为Melanocarpus albomyces。
3、Melanocarpus albomyces菌株酶学性质测定
见具体实施方式部分的检测实例。
在步骤1中，所用到的刚果红培养基的组成：
Figure BDA0001862648120000051
加水定容至1L，pH自然；121℃灭菌25min。
在步骤2中，所用到的PDA培养基的组成：
去皮马铃薯 200.0g
葡萄糖 20.0g
琼脂 18.0g
加水定容至1L，pH自然；121℃灭菌25min。
本发明嗜热真菌Melanocarpus albomyces的纤维素酶学性质检测如下。
实施例1：Melanocarpus albomyces产纤维素酶发酵培养基的最佳碳源
1.将活化菌株利用无菌操作取0.5mm2小块接种于发酵培养基中，45℃、160r·min-1条件下培养72h；发酵培养基包括：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20.0g，蛋白胨6.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH自然。
2.将发酵液10000r·min-1离心10min，得到上清粗酶液，取1mL粗酶液，加入9mL的pH 4.8、0.05mol/L柠檬酸缓冲液，配制成稀释酶液。取2支10mL试管，一支试管中加入0.5mL稀释酶液和1.5mL 0.5％CMC-Na溶液，另一支对照管中加入2.0mL 0.5％CMC-Na溶液，稀释酶液试管和对照管分别做3个重复。
3.在50℃水浴30min，加入3mL DNS试剂。
4.沸水浴5min，取出后立即置于冰水中冷却至室温，定容至10mL，摇匀。
5.在波长540nm条件下测定吸光值。
分别采用淀粉、乳糖、玉米芯粉和稻草粉替换上述实施例中的羧甲基纤维素钠进行实验。
以酶活值对不同碳源绘制柱状图，结果如图1所示，可以看出，乳糖为最佳碳源。
实施例2：Melanocarpus albomyces产纤维素酶碳源的最适浓度
发酵培养基采用乳糖作为碳源，乳糖的质量百分比浓度分别为1％、3％、5％、7％、9％、10％进行实验，其他步骤及条件同实施例1。
以酶活值对不同浓度绘制折线图，结果如图2所示，可以看出，乳糖为最适的质量百分比浓度为9％。
实施例3：Melanocarpus albomyces产纤维素酶发酵培养基的最佳氮源
发酵培养基采用质量百分比浓度为9％的乳糖作为碳源，分别以硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、酵母膏、蛋白胨为氮源进行实验，其他步骤及条件同实施例1。
以酶活值对不同氮源绘制柱状图，结果如图3所示，可以看出，硫酸铵为最佳氮源。
实施例4：Melanocarpus albomyces产纤维素酶氮源的最适浓度
发酵培养基采用质量百分比浓度为9％的乳糖作为碳源、硫酸铵为氮源，氮源的质量百分比浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％进行实验，其他步骤及条件同实施例1。
以酶活值对不同浓度绘制折线图，结果如图4所示，可以看出，硫酸铵最适的质量百分比浓度为0.6％。
实施例5：Melanocarpus albomyces产纤维素酶发酵培养的最适温度
发酵培养基采用质量百分比浓度为9％的乳糖作为碳源、质量百分比浓度为0.6％的硫酸铵为氮源，分别在41℃、45℃、49℃、53℃、57℃、59℃培养温度下进行实验，其他步骤及条件同实施例1。
以酶活值对不同温度绘制折线图，结果如图5所示，可以看出，发酵培养的最适温度为57℃。
实施例6：Melanocarpus albomyces产纤维素酶发酵培养的最佳时间
发酵培养基采用质量百分比浓度为9％的乳糖作为碳源、质量百分比浓度为0.6％的硫酸铵为氮源，发酵培养时间分别替换为2d、3d、4d、5d、6d、7d。
以酶活值对培养时间绘制折线图，结果如图6所示，可以看出，发酵培养的最佳时间为5d。
实施例7：Melanocarpus albomyces产纤维素酶发酵培养的最适起始pH
发酵培养基采用质量百分比浓度为9％的乳糖作为碳源、质量百分比浓度为0.6％的硫酸铵为氮源，发酵培养基的pH分别替换为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5作为起始pH进行实验。
以酶活值对起始pH绘制折线图，结果如图7所示，可以看出，发酵培养的最适起始pH为5.5。
本发明经过如下方法得到：保藏号为CGMCC15863的嗜热真菌Melanocarpusalbomyces分离自中国西藏部分热泉的水泽沉积物，通过刚果红固体培养基初步鉴定该菌株具有产生纤维素酶的能力，并对其进行形态学和ITS分子生物学鉴定，确定为Melanocarpus albomyces。经酶学性质的研究，该菌株产生纤维素酶的发酵培养基的最适碳源为乳糖，乳糖在发酵培养中的最佳质量百分比浓度为9％，最适氮源为硫酸铵，硫酸铵在发酵培养中的最佳质量百分比浓度为0.6％，最适培养温度为57℃，最佳培养时间为5天，最佳培养基起始pH为5.5。该菌株产生的纤维素酶在高温环境下能保持较高的活性，在食品、酿酒、纺织、洗涤、能源、造纸等工业生产中具有广泛的应用。

Claims (8)

1.一种产纤维素酶的嗜热真菌(Melanocarpus albomyces)，其特征在于，所述嗜热真菌的保藏编号为CGMCC No.15863。
2.权利要求1所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用，其特征在于，将活化嗜热真菌菌株接种于发酵培养基中发酵培养，将得到的发酵液离心，得到上清粗酶液。
4.根据权利要求3所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用，其特征在于，发酵培养基包括：质量百分比浓度为1％-10％的碳源，质量百分比浓度为0.2％-0.8％的氮源。
5.根据权利要求4所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用，其特征在于，碳源为羧甲基纤维素钠、淀粉、乳糖、玉米芯粉和稻草粉中的一种。
6.根据权利要求4所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用，其特征在于，氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、酵母膏和蛋白胨中的一种。
7.根据权利要求3所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用，其特征在于，发酵培养的温度为41℃-59℃，发酵培养的时间为2-7d。
8.根据权利要求3所述的产纤维素酶的嗜热真菌在产纤维素酶中的应用，其特征在于，发酵培养的起始pH为4.5-8.5。
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