CN104781398A - 处理纤维素和木质纤维素材料的新型酯酶 - Google Patents

处理纤维素和木质纤维素材料的新型酯酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了新型多肽和含有所述多肽的酶制剂，它们即使在升高的温度下也能改善纤维素和木质纤维素降解效率。可利用常规重组DNA技术产生所述多肽。本发明还公开了相关的多核苷酸、载体和宿主细胞。所述多肽和含有所述多肽的酶制剂尤其可用于改善纤维素和木质纤维素降解效率、可用于改善动物饲料的质量、可用于机械洗碗应用、可用于去污剂组合物、可用于纸浆造纸、纺织、食品、烘焙或饮料工业。

Description

处理纤维素和木质纤维素材料的新型酯酶
技术领域
本发明涉及新型多肽和含有所述多肽的酶制剂，它们即使在升高的温度下也可用于各种工业应用。所述多肽和含有所述多肽的酶制剂尤其可用于改善纤维素和木质纤维素降解效率、可用于改善动物饲料的质量、可用于机械洗碗应用、可用于去污剂组合物、可用于纸浆造纸、纺织、食品、烘焙或饮料工业。本发明还涉及多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及生产所述多肽的方法。
背景技术
植物中的大部分碳水化合物都处于木质纤维素的形式，其基本由纤维素、半纤维素和果胶组成。纤维素是高等植物的主要结构组分。半纤维素是主要含有不同的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的碳水化合物聚合物的异质组。果胶由存在于大多数初生细胞壁中的一系列复杂的多糖构成。
纤维素材料，即包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的材料，在自然界中被许多不同的生物体(包括细菌和真菌)降解，所述生物体产生能够水解碳水化合物聚合物的酶。降解通常需要相继或同时发挥作用的不同纤维素酶。含有更复杂纤维素的底物的降解需要范围广泛的不同酶。
木质纤维素可通过发酵、然后水解成可发酵糖，而被转变成生物乙醇和其他化学产物。在常规的木质纤维素变乙醇工艺中，首先对所述木质纤维素材料进行化学或物理预处理，使得所述纤维素级分更容易进行水解。其后，水解所述纤维素级分以得到糖，所述糖可被酵母或其他发酵性生物发酵成为乙醇并蒸馏得到纯乙醇。木质素作为主要副产物得到，其可以用作固体燃料。
加工木质纤维素生物质的方法已经在US 7998713中发布，其公开了包括用氨预处理生物质的方法。在预处理之后，用糖化酶组合、即纤维素-水解糖苷酶处理所述生物质，以产生可发酵糖。所述糖然后与可发酵所述糖并产生乙醇的微生物接触。US 20080032344公开了处理生物质以从其中分别回收全纤维素和近天然木质素的方法，由此所述木质素和全纤维素衍生的糖然后可经受不同的处理以产生燃料、化学品和/或新材料。
木质纤维素分解酶对生物质的加工在生物燃料、淀粉、纺织、去污剂、纸浆造纸、食品、饲料或饮料工业中具有显著的潜在应用。在许多这些应用中，木聚糖酶与各种不同的其他木质纤维素分解酶结合使用。在纸浆造纸工业中，木聚糖酶用于造纸中以减少木浆漂白期间的耗氯量和有毒排放物，用于纺织加工中以减少或代替化学浸解，用于生物除污/生物转化中以处理/再循环利用废物和产生生物燃料和精细化学品，和用于烘焙中以改善面团的弹性和稳定性或烘焙产品的体积和抗陈化性质。WO 2011091260公开了用具有木聚糖酶和纤维素酶活性的双重活性酶处理木质纤维素材料的组合物和方法。所述酶在提高的pH和提高的温度下是稳定和有活性的。US 20120036599公开了从Chrysosporium lucknowense C1(现在重新鉴定为嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophile)；Visser等，2011)分离的新型真菌酶，其适合于生物质工艺、去污剂工艺、浆粕和纸的脱墨和生物漂白、以及废物流的处理。
降解半纤维素的酶，例如半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和酯酶，已经用于改善例如在动物饲料组合物中植物细胞壁的分解。尤其是已经观察到阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用以从植物细胞壁释放阿魏酸。CN101228921公开了用于饲料的阿魏酸酯酶、纤维素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶的组合物，所述组合物通过酶学方式改善糖从动物饲料的释放。US6143543公开了可从曲霉(Aspergillus)获得并具有阿魏酸酯酶活性的酶，其可用于制备食物和动物饲料。US20090151026中公开了来自特异腐质霉(Humicola insolens)的具有阿魏酸酯酶活性的多肽。Kühnel等2012公开了Chrysosporium lucknowense C1的阿魏酸酯酶，其在中性pH和高达45℃的温度下是最有活性的。
酶的成本和水解效率是限制生物水解工艺在生物质转化中的广泛应用的主要因素。木质纤维素糖化过程中酶复合物的水解效率取决于各个酶的性质和所述复合物内每种酶的比率二者。除了改善所述酶复合物中各个酶的特性之外，通过影响纤维素酶的活性来改善纤维素材料的酶促降解也是有益的。此外，需要优化酶复合物中的组分并增补协同作用酶来改善水解效率。
因此，对于降解纤维素底物、特别是木质纤维素底物的新的有效方法，并且对于可显著改善所述纤维素材料的酶促降解并且还减少所需酶剂量的便宜的酶和酶混合物，仍然有持续的需求。此外，对于不仅在中等温度下工作而且还在高温下工作、由此增加反应速率并且能够利用高生物质稠度产生高浓度糖和乙醇的方法，也有需要。因为环境顾虑和消费者需求，期望有替代的酶辅助技术。此外，对于可用于各种农业和工业应用并且允许设计更灵活的工艺配置的酶和方法，也有需要。
本发明旨在满足这些需要中的至少一部分。
发明内容
本发明的目的是提供新型多肽和含有所述多肽的酶制剂，它们可用于不同的工业应用，甚至是在升高的温度下。具体地，本发明的目的是提供多肽，所述多肽尤其可用于改善纤维素和木质纤维素降解效率、可用于改善动物饲料的质量、可用于机械洗碗应用、可用于去污剂组合物、可用于纸浆造纸、纺织、食品、烘焙或饮料工业。
本发明的目的通过从嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)或白马兰诺菌(Melanocarpus albomyces)获得的新型阿魏酸酯酶来实现。
本发明提供了包含与SEQ ID NO:11具有至少76％序列同一性或与SEQ ID NO:12具有至少73％序列同一性的氨基酸序列的阿魏酸酯酶，或其具有阿魏酸酯酶活性的片段或变体。
本发明还涉及选自下列的分离的多核苷酸：
a)包含如SEQ ID NO:9或10中所示的编码序列的多核苷酸；
b)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；
c)编码由a)或b)的多核苷酸所编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段具有阿魏酸酯酶活性；和
d)包含与a)或b)的多核苷酸序列的核苷酸序列简并的核苷酸序列的多核苷酸；
或这样的多核苷酸的互补链。
本发明还涉及包含所述多核苷酸的载体，和包含所述载体的宿主细胞。具有保藏号DSM 26070和DSM 26071的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株也被包括在本发明中。
本发明提供了生产所述阿魏酸酯酶多肽的方法，所述方法包含以下步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能够表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收和纯化所述多肽。
本发明还提供包含至少一种所述新型阿魏酸酯酶的酶制剂和所述酶制剂在生物质加工，优选在生物燃料、淀粉、纺织、去污剂、纸浆造纸、食品、烘焙、饲料或饮料工业中的应用。
本发明的酶制剂在纸浆造纸工业中具有重大的潜力，例如在脱墨以从纤维表面释放墨中、在改善浆粕排水中、在获得造纸机的更好的运行性能方面和对所有类型的浆粕和纸制品进行纤维改性方面。
本发明还提供了用阿魏酸酯酶或包含所述酯酶的酶制剂处理纤维素材料和木质纤维素材料的方法，其中所述方法包含将所述纤维性/纤维素材料与所述多肽或包含所述多肽的酶制剂反应。
在一个方面，本发明涉及改善去污剂组合物的织物护理性质或纺织品清洁效果的方法，所述方法包括向所述去污剂组合物添加本发明的阿魏酸酯酶。
本发明还提供了包含所述阿魏酸酯酶的去污剂组合物，并涉及改善去污剂组合物的织物护理性质或纺织品清洁效果的方法，所述方法包括向所述去污剂组合物添加本发明的阿魏酸酯酶。
在一个方面，本发明提供了包含所述新型阿魏酸酯酶多肽的动物饲料。所述动物饲料因此可以用于改善动物生长速率和饲料转化率。
在从属权利要求中提出了本发明的具体实施方式。本发明的其他目的、细节和优点将从以下附图、详细描述和实施例中变得显而易见。
本发明人发现，本发明的新型阿魏酸酯酶和方法提供了增加纤维素酶酶混合物的总性能并减少达到有效降解木质纤维素底物所需要的蛋白质负荷的可观潜力。所述新型阿魏酸酯酶适用于降解不同的纤维素材料和木质纤维素材料，特别是与用于降解不同纤维素材料或木质纤维素材料的酶例如纤维素酶和/或木聚糖酶组合。本发明的新型阿魏酸酯酶有效减少通常在洗碗机的过滤器中发现的纤维性/纤维素纤维。本发明人还注意到，新型阿魏酸酯酶对改善动物饲料的质量有益，因此用所述酶处理植物材料。此外，用阿魏酸酯酶或包含所述酯酶的酶制剂处理纤维素材料和木质纤维素材料对除去木质素的棕颜色有益并有降低纸制品强度的倾向，从而改善所述纤维的造纸性质。
本发明人还发现，所述新型阿魏酸酯酶在宽温度范围内都很有效，并且虽然它们在标准水解温度下改善纤维素分解酶的效率，但它们在高温下也很有效。这使得它们极好地适合于既在常规温度下又在升高的温度下进行的变化的纤维素底物水解过程。在常规的分开的水解和发酵过程(SHF)中，酶水解温度通常高于发酵温度。在所述水解中使用热稳定酶提供了潜在的益处，例如在升高的温度下更高的反应速率、由于酶的比活度和稳定性更高而导致的酶负荷量减少、关于工艺配置的灵活性提高以及污染风险降低。所述热稳定酶与嗜温酶相比的全面稳健性也增加了酶在工业过程中的再循环性。总的说来，本发明可以显著节约能量和投资成本。
附图说明
下面将通过优选实施方式并参考附图来更详细地描述本发明。
图1示意性地显示了用于表达里氏木霉(Trichoderma reesei)中fae基因的盒。fae基因在里氏木霉cbh1/cel7A启动子(cbh1启动子)控制下并通过利用里氏木霉cbh1/cel7A终止子序列(cbh1终止子)确保转录终止。包含amdS基因作为转化标志。
图2显示了用包含本发明的白马兰诺菌FAE(Ma_FAE)酶的酶混合物进行的甘蔗渣底物水解的结果。在37℃和50℃下利用不同的酶混合物以2毫克蛋白/克总固体的剂量对具有12％干物质的甘蔗渣底物进行水解。对照酶混合物和包含所测试的FAE蛋白的组合物的详细组成被描述在实施例5中。在48小时水解时间之后从一式三份的试管取出样品，并通过HPLC定量，其中测定木糖的浓度。
图3显示了用包含本发明的FAE蛋白的酶混合物进行的磨碎的苹果/橙/小麦纤维混合物水解的结果。为对照和含有FAE蛋白Ma_FAE或Ct_FAE的混合物示出了在50℃或60℃下水解60min之后的纤维重量百分比。图中包含标准差。
具体实施方式
纤维素是高等植物的主要结构组分。它向植物细胞提供高抗张强度，帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素是由葡萄糖残基的直链通过β-1,4-糖苷键连接构成的β-1,4-葡聚糖。纤维二糖是纤维素的最小重复单元。在细胞壁中，纤维素充填成各种取向的片层，所述片层被包埋在半纤维素和木质素的基质中。
半纤维素是主要含有不同的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的碳水化合物聚合物的异质组。半纤维素由具有β-1,4-连接的残基的线性骨架组成，所述骨架被通常含有乙酰基、葡糖醛酸基、阿拉伯糖基和半乳糖基的短侧链取代。半纤维素可以与木质素化学交联。木质素是多样取代的对羟基苯基丙烷单元的复杂交联聚合物，它向细胞壁提供了承受机械应力的强度，并且它也保护纤维素免遭酶水解。
“纤维素”或“纤维素材料”在本文中使用时是指包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素作为重要组分的任何材料。纤维素通常在例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木质部中发现。所述纤维素材料可以是但不限于草本材料、农业残渣、林业残渣、城市固体废物、废纸、和纸浆造纸厂残渣。纤维素材料的实例包括源自于例如棉、亚麻、大麻、黄麻以及人造纤维素纤维如莫代尔、粘胶和莱赛尔的织物纤维。纤维素材料的实例还包括在自动洗碗机的过滤器中发现的纤维性或纤维素型残渣状污物。
“木质纤维素”是纤维素和半纤维素与木质素的组合。它是物理上坚硬、致密和难以进入的，并且是生物圈中最丰富的生化材料。“生物质”或“木质纤维素材料”是指包含木质纤维素的任何材料。这样的材料是例如：硬木和软木屑，木浆，锯屑和林业与木材工业废物，农业生物质如谷草、甜菜粕、玉米纤维、玉米秸和穗轴、甘蔗渣、茎、叶、壳、皮等等；废产物如城市固体废物、报纸和废办公用纸、例如谷物的碾磨废物；专用能源作物(例如，柳树，白杨，柳枝稷，或草芦等)。优选的实例是玉米纤维、玉米秸、柳枝稷、谷草、甘蔗渣和木材衍生材料。
纤维素材料在自然界中被许多不同的生物体降解，所述生物体包括产生能够水解碳水化合物聚合物的酶的细菌和真菌。降解通常需要相继或同时发挥作用的不同纤维素酶。含有更复杂纤维素的底物的降解需要范围广泛的不同酶。对于所述降解过程来说，所述纤维素材料可以照原样使用或可以经受利用本领域已知的常规方法的预处理。
“纤维素分解酶”或“纤维素酶”是具有“纤维素分解活性”的酶，这是指它们能够将纤维素底物或其衍生物水解成较小的糖类。纤维素分解酶因此包括纤维素酶和半纤维素酶二者。本文中使用的纤维素酶包括(1)内切葡聚糖酶(EG，EC 3.2.1.4)，其切割内部β-1,4-糖苷键；(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH，EC 3.2.1.176，EC 3.2.1.91)，其从结晶纤维素聚合物链的还原或非还原端切割二糖纤维二糖；(3)β-1,4-葡萄糖苷酶(BG，EC 3.2.1.21)，其将所述纤维二糖和其他短纤维低聚糖水解为葡萄糖。
“半纤维素酶”是水解半纤维素的酶。半纤维素酶包括内切作用酶和外切作用酶二者，例如木聚糖酶、β-木糖苷酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、内切阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶。
“木聚糖酶”是水解木聚糖骨架中的β-1,4键、产生短低聚木糖的酶。木聚糖骨架的降解取决于两类酶：内切木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)将木聚糖骨架切割成较小的低聚糖，后者可被β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)进一步降解成木糖。参与木聚糖降解的其他酶包括例如乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡糖苷酸酶、阿魏酸酯酶、和对香豆酸酯酶。
“阿魏酸酯酶”(FAE)(EC 3.1.1.73)是能够水解存在于植物细胞壁中的阿魏酸和双阿魏酸的酯键的一类酶。阿魏酸参与将半纤维素的木聚糖链交联在一起或将木聚糖与木质素交联。具体地说，阿魏酸酯酶具有4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶活性，其催化从酯化的糖水解4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基，产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。若干研究表明，阿魏酸酯酶是具有丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸催化三元组的α/β水解酶。阿魏酸酯酶还被称为例如阿魏酰酯酶、肉桂酰酯酶、肉桂酸酯酶、羟基肉桂酰酯酶。FAE根据它们对合成底物和脱氢双阿魏酸的活性被分类为四个亚组(A，B，C，和D)。在本发明中，所述FAE优选是B型酯酶的FAE。B型阿魏酸酯酶释放与阿魏酸化阿拉伯糖的C-2连接或与C-6阿魏酸化半乳糖残基连接的阿魏酸–酯。
本发明是基于试图发现新型多肽的研究，所述新型多肽会改善纤维素和木质纤维素降解效率并且可用于多用途应用，即使在升高的温度下。得到两种新型阿魏酸酯酶，称为Ct_FAE和Ma_FAE(表1)。
表1.本发明的阿魏酸酯酶基因和多肽
本发明的新型阿魏酸酯酶可从嗜热毛壳菌或白马兰诺菌(Melanocarpus albomyces)获得。优选所述多肽可从具有作为CBS132416保藏的菌株ALKO4265的特性的嗜热毛壳菌菌株或作为CBS132099保藏的菌株ALKO4237的特性的白马兰诺菌菌株获得。“可从......获得”是指它们可从所述物种得到，但是它不排除从其他来源获得它们的可能性。换句话说，它们可以来源于任何生物体，包括植物。优选它们来源于微生物，例如细菌或真菌。所述细菌可以是例如来自选自芽胞杆菌属(Bacillus)、固氮螺菌属(Azospirillum)和链霉菌属(Streptomyces)的属。更优选所述酶来源于真菌(包括丝状真菌和酵母)，例如来源于选自以下的属：热子囊菌属(Thermoascus)、支顶孢霉属(Acremonium)、毛壳霉属(Chaetomium)、无毛毛壳霉属(Achaetomium)、草根霉属(Thielavia)、曲霉属(Aspergillus)、萄萄孢属(Botrytis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、金钱菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinus)、马兰诺菌属(Melanocarpus)、毁丝霉属(Myceliophthora)、麦瑞菌属(Myriococcum)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、灰侧耳菌属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、多孔菌属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、节格孢属(Scytalidium)、密孔菌属(Pycnoporus)、踝节菌属(Talaromyces)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。
本发明的新型阿魏酸酯酶优选包含与SEQ ID NO:11具有至少76％序列同一性或与SEQ ID NO:12具有至少73％序列同一性的氨基酸序列，或其具有阿魏酸酯酶活性的片段或变体。根据本发明的一种实施方式，所述多肽与SEQ ID NO:11具有至少77、78、79、80、85、90、95、98或99％同一性或与SEQ ID NO:12具有至少74、75、80、85、90、95、98或99％同一性，或其具有阿魏酸酯酶活性的片段。
术语“同一性”在此是指两个氨基酸序列从由相应的基因编码的第一个氨基酸到最后一个氨基酸相互比较之间的整体同一性。全长序列的同一性通过在EBI(欧洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上利用EMBOSSNeedle Needleman-Wunsch总体比对程序来测量，参数如下：BLOSUM62，空位开放10，空位延伸0.5。所述算法被描述于Needleman和Wunsch(1970)中。本领域技术人员知道，只有当比对所述序列的相应结构域并且在每次比较中使用相同的参数时，利用Needleman-Wunsch算法的结果才是可比较的。因此，不能进行例如包含纤维素结合模块(CBM)或信号序列的纤维素酶序列与没有那些元件的序列的比较。
术语“具有阿魏酸酯酶活性的片段”是指具有改善由具有阿魏酸酯酶活性的酶催化的纤维素和木质纤维素降解效率的能力且具有定义的序列的任何片段。换句话说，改善纤维素材料降解的片段可以是所述定义的序列的成熟蛋白质部分，或者它可以只是所述成熟蛋白质部分的片段，只要它仍然具有通过水解酯键和释放阿魏酸来改善纤维素和木质纤维素降解的能力即可。
对于本发明的目的而言，通过测量由含有所述阿魏酸酯酶的纤维素分解酶混合物(与没有所述阿魏酸酯酶的相等蛋白质负荷量相比较)水解纤维素材料和木质纤维素材料引起的总木糖浓度的增加，来确定木质纤维素降解的改善。对于清洁洗碗机内部的目的而言，阿魏酸酯酶的性能通过测量在用含有所述阿魏酸酯酶的纤维素分解酶混合物(与相等蛋白质负荷量的没有所述阿魏酸酯酶的纤维素分解酶混合物相比较)处理之后留下的纤维残渣来确定。对于饲料目的而言，阿魏酸酯酶的功效通过改善动物生长速率和饲料转化率来确定。
所述新型阿魏酸酯酶多肽也可以是所述多肽的变体。“变体”可以是例如在相同的菌株、种或属内作为例如等位变体天然存在的多肽，或者它可以通过诱变产生。它可以包含氨基酸取代、缺失或插入，但是它仍然以与以上定义的多肽基本上类似的方式发挥功能，即它包含具有阿魏酸酯酶活性的片段。
所述阿魏酸酯酶在细胞中通常作为包含信号序列的多肽前体产生，所述信号序列在所述蛋白质分泌期间被切割掉。它们也可以在分泌期间在N-末端和/或C末端被进一步加工以产生成熟的、具有酶活性的蛋白质。具有阿魏酸活性的片段表示所述多肽可以是不成熟或成熟的形式，优选它为成熟形式，即已经发生过所述加工。另外，“成熟形式”是指已经从它在融合结构中的载体蛋白上切割下来的酶。
本发明的阿魏酸酯酶多肽优选是重组蛋白质，其可以用通常已知的方式产生。分离阿魏酸酯酶基因的多核苷酸片段，将所述基因插入表达载体中在强启动子的控制之下，将所述载体转化到合适的宿主细胞中并在引起所述酶产生的条件下培养所述宿主细胞。在不同的宿主系统中通过重组技术产生蛋白质的方法是本领域公知的(Sambrook和Russel，2001；Coen，2001；Gellissen，2005)。优选所述多肽作为分泌到培养基中的细胞外蛋白质产生，从所述培养基中可容易地回收和分离所述多肽。
所述重组多肽可以是融合多肽，其中另一个多肽被融合在所述多肽的N端或C端。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码所述多肽的编码序列，使得它们在阅读框中而且所述融合多肽的表达在相同的启动子和终止子控制下。
本发明涉及新型多核苷酸，其包含SEQ ID NO:9或10的核苷酸序列，或编码如上定义的新型多肽的序列，包括其互补链。“多核苷酸”在本文中使用时是指RNA和DNA二者，并且它可以是单链或双链的。此外，作为遗传密码的结果，所述多核苷酸可以与如上定义的任何一种序列简并。这意味着不同的密码子可以编码相同的氨基酸。
所述多核苷酸也可以是所述多核苷酸的包含至少20个核苷酸的片段。根据本发明的一种实施方式，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:5、6、7或8所示的序列。
根据本发明的另一种实施方式，所述多核苷酸包含的基因与具有保藏号DSM 26070或DSM 26071的微生物中所包含的基因相似。
本发明涉及重组表达“载体”，其包含编码如上表征的阿魏酸酯酶多肽的多核苷酸，所述多核苷酸与调节序列可操作地连接，所述调节序列能够在合适的宿主中指导编码所述阿魏酸酯酶多肽的基因的表达。所述调节序列与生产生物体可以是同源的或异源的，或者它们可以来源于从中分离出编码本发明的阿魏酸酯酶多肽的基因的生物体。所述表达载体还可以包含用于选择转化体菌株的标记基因，或者该选择标记可以在另一种载体构建物中通过共同转化引入所述宿主。
本发明还涉及生产“宿主”，其可以是能够表达目标多肽的任何同源或异源生物体。优选地，所述宿主是微生物细胞，更优选为真菌。最优选地，所述宿主是丝状真菌。生产本发明的多肽的优选宿主特别是来自木霉属或曲霉属的菌株。优选修饰所述重组宿主以表达和分泌本发明的纤维素分解酶或多肽作为它的主要活性或它的主要活性之一。这可通过缺失编码主要同源分泌酶例如木霉属的四种主要纤维素酶的基因和通过将异源基因以高表达和生产水平整合到基因座来进行。
本发明还涉及生产本发明的阿魏酸酯酶多肽的方法，所述方法包含以下步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能够表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收和纯化所述多肽。所述生产培养基可以是适合于生长所述宿主生物体并含有有效表达诱导剂的培养基。
本发明的多肽可以是分离的，分离在本发明的环境下可以仅仅意味着已经从含有所述多肽的培养基除去细胞和细胞碎片。方便地，所述多肽通过例如向用过的培养基添加阴离子和/或阳离子聚合物(絮凝剂)以提高细胞和细胞碎片的沉淀来分离。然后利用无机过滤剂和过滤器过滤所述培养基以除去形成的沉淀物。此后，利用半渗透膜进一步加工滤液，以除去多余的盐、糖和代谢产物。还可以通过结晶来纯化或浓缩所述多肽。
可通过本发明的方法获得的所述新型阿魏酸酯酶可以是酶制剂的组分。术语“酶制剂”表示包含至少一种本文中描述的所述新型阿魏酸酯酶的组合物。所述酶制剂中的阿魏酸酯酶可以是重组阿魏酸酯酶蛋白质或其具有阿魏酸酯酶活性的变体，所述重组阿魏酸酯酶蛋白质包含与SEQ ID NO:11具有至少76％序列同一性或与SEQ ID NO:12具有至少73％序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的一种实施方式，所述酶制剂包含与SEQ ID NO:11具有至少77、78、79、80、85、90、95、98或99％同一性或与SEQ ID NO:12具有至少74、75、80、85、90、95、98或99％同一性的多肽。
所述酶制剂可以包含本发明的阿魏酸酯酶作为主要的酶组分。或者，所述酶制剂还可以包含至少一种选自以下的酶：有或者没有介质的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖脱氢酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶、包括内切和外切-α-L-阿拉伯糖酶、内切和外切-半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶(endopectinlyase)、果胶酸裂解酶(pectatelyase)和果胶酯酶、苯酚酯酶、包括木质素过氧化物酶的木质素酶、锰依赖性过氧化物酶、H2O2生成酶、昆布多糖酶、壳聚糖酶、GH61蛋白质和漆酶。所述酶制剂可以含有这些酶和本发明的阿魏酸酯酶的任何组合，但是所述酶不限于本文中描述的那些。它们也可以是例如可商购的酶制剂。
优选本发明的酶制剂包含阿魏酸酯酶与木聚糖酶和任选的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和/或β-萄糖苷酶的组合。最优选所述酶制剂包含阿魏酸酯酶与木聚糖酶的组合。阿魏酸酯酶和木聚糖酶或阿魏酸酯酶和纤维素分解酶的不同混合物可以用来适应不同的工艺条件。
除了阿魏酸酯酶之外，本发明的酶制剂可以含有添加剂，例如介质、稳定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基组分。优选的添加剂是这样的，它们在为具体应用设计的酶制剂中是常用的。本发明的酶制剂也可以含有金属和/或氧化还原活性的辅因子。
所述酶制剂可以是液体、粉末或颗粒的形式。它可以是含有一种或多种纤维素分解酶的滤液。优选所述酶制剂是用过的培养基。“用过的培养基”是指包含所产生的酶/多肽的宿主培养基。优选宿主细胞在所述生产之后与所述培养基分离。所述酶制剂或组合物也可以是得到的“全培养液”，任选在没有任何生物质分离、下游加工或目标纤维素分解酶的纯化的情况下将所述生产宿主或微生物失活之后得到。在该联合的生物过程中，所述酶组合物或所述酶组合物中的至少一些酶可以通过发酵型微生物产生。
所述酶制剂可以含有至少部分纯化和分离形式的多肽。有或者没有宿主细胞的培养基可以在没有进一步纯化下原样用作酶制剂，因为阿魏酸酯酶蛋白质可分泌到所述培养基中，并且它们在该用过的培养基的环境条件下显示出活性。
本发明的阿魏酸酯酶在中等到升高的温度下表现良好。术语“中等温度”或“常规温度”在本发明的环境下是指从约30℃至45℃的温度范围。术语“升高的温度”或“高温”是指从约45℃至70℃的温度范围。在这种升高的温度范围下有活性或稳定的酶也称为“热稳定”或“嗜热”酶。本发明的阿魏酸酯酶优选在约35℃和约60℃之间的温度下使用。更优选它们在37℃和60℃之间的温度下、最优选在45℃和60℃之间的温度下使用。
本发明提供了处理纤维素材料或木质纤维素材料的方法，其中所述纤维素材料或木质纤维素材料与有效量的阿魏酸酯酶多肽或包含所述多肽的酶制剂在纤维素分解酶存在下在合适的条件例如适当的pH和温度下反应，并且让所述反应持续足以发生所述酶促反应的时间。所述阿魏酸酯酶多肽改善纤维素分解酶在酸性、中性或碱性pH范围内的活性。
根据本发明的一种实施方式，所述处理纤维素材料的方法包括通过将洗碗机内部的至少部分与本发明的阿魏酸酯酶或酶制剂接触来清洁所述洗碗机的内部。所述酶制剂可以被直接放入该机器的内部或者放入该机器的分配抽斗(draw)或杯或者放到洗碗机内部需要除去纤维性污物的区域(例如过滤器)。清洁洗碗机的有用方法被描述在例如WO2011161459中。所述酶制剂也可以特别应用于洗碗机中沉积纤维性/纤维素性污物的那些区域。在洗碗机没有运行时或者在洗碗机正在进行有负荷或无负荷的洗涤和/或漂洗循环时，所述方法可以手工应用。此外，本发明的阿魏酸酯酶可以在洗碗系统的所有洗涤温度下使用。
本发明的一个方面涉及改善去污剂组合物的织物护理性质或织物清洁效果的方法，所述方法包括向所述去污剂组合物添加本发明的多肽或酶制剂。
根据本发明的另一种实施方式，所述处理纤维素材料的方法包括处理任何纤维素材料或木质纤维素材料，例如纺织材料、用于动物饲料的植物、或者木材衍生的机械或化学浆粕或二级纤维。所述阿魏酸酯酶也可以被添加到废水中以减少固体例如淤渣的量。本发明还涉及在纸浆造纸工业、通常在浆粕漂白中酶处理植物生物质并除去木质素组分。
在本发明的环境中，阿魏酸酯酶可以与其他水解植物细胞壁的降解酶协同作用，以促进复杂植物细胞壁的完全或改善的降解。“协同作用酶”是能够水解木质纤维素或者改善或促进纤维素降解的任何其他酶，其中除了核心酶或核心酶组以外，通常还提供协同作用酶。协同作用酶可以具有与所述核心酶组中的酶相同或类似的功能或不同的功能。所述核心酶可以包括纤维素分解酶，例如纤维素酶、木聚糖酶、木质酶、淀粉酶、脂肪酶或葡萄糖醛酸酶。本发明的阿魏酸酯酶“改善”由具有纤维素分解活性的酶催化的“纤维素和木质纤维素降解”。换句话说，与只存在纤维素分解酶相比，在阿魏酸酯酶存在下用纤维素分解酶转化纤维素材料或木质纤维素材料增加了纤维素材料或木质纤维素材料的降解。
阿魏酸酯酶改变植物细胞壁的物理性质并使得它们更容易受到例如纤维素酶和木聚糖酶的进一步酶攻击。利用阿魏酸酯酶，可以增加来自木质纤维素材料的可发酵糖的生产率。所述可发酵糖然后可以被酵母发酵成为乙醇，并作为燃料使用。它们还可以在化学工业的工艺例如在所谓的生物精制中用作生产各种化学品或结构单元的中间体或原料。在本发明的环境中可使用本领域已知的包含预处理、酶水解、发酵或其组合的任何方法。现行的预处理包括机械、化学或热工艺及其组合。所述材料可以例如通过蒸汽喷发或酸水解进行预处理。
本发明的阿魏酸酯酶、酶制剂和方法可以应用于涉及纤维素分解酶的任何工艺，例如生物质加工，并且可以应用于生物燃料、淀粉、纺织、去污剂、纸浆造纸、食品、饲料或饮料工业。
所述阿魏酸酯酶可以用于降解以其他方式可能难以从洗碗机内部例如过滤器除去的顽固的纤维性/纤维素性污物。可被本发明的阿魏酸酯酶或酶制剂分解的污物包括谷物、水果和蔬菜。一些具体的实例包括苹果和橙子皮以及小麦纤维。
本发明的阿魏酸酯酶和酶制剂可以在造纸中与纤维素分解酶组合使用，以减少木浆漂白和纸脱墨期间的耗氯量和有毒排放物。此外，所述阿魏酸酯酶可以用于造纸用浆粕的生物精制。用于浆粕和纸改性的阿魏酸酯酶或酶制剂的量通常取决于所使用的材料、系统的pH和温度以及保留时间而异。
本发明的阿魏酸酯酶可与其他酶活性组合用于去污剂组合物中。它们可以用作适合于洗衣去污剂和洗碗组合物(包括自动洗碗组合物)的去污添加剂。去污剂是指旨在帮助清洁或具有清洁性质的物质或材料。优选本发明的阿魏酸酯酶可以用于自动洗碗机清洁组合物。
本发明的阿魏酸酯酶和酶制剂可用于处理纺织材料，例如织物和衣服。纺织材料可以由含有纤维的天然纤维素或含有纤维的人造纤维素或其混合物、或者含有纤维的合成纤维和纤维素的掺合物制造而成。本发明的酶制剂尤其可用于生物精整。“生物精整”是指在纤维素纤维的受控水解中利用酶，以便以一定方式改性所述织物或纱线表面，所述方式能够防止永久起球、改善织物手感如柔软和光滑度、通过减少起毛来清理表面结构以导致颜色澄清、改善织物悬垂性、改善水分吸收性并且这还可以改善可染色性。其他应用还包括用于粗斜纹布的生物石磨。“生物石磨”是指酶促粗斜纹布精整工艺，其中纤维素酶代替浮石或与浮石一起使用以赋予织物它期望的“磨损”或“磨蚀”外观。受控的酶处理导致对衣物和机器的损伤较少并消除对石头处理的需要。
本发明的阿魏酸酯酶和酶制剂还可用于烘焙以改善面团的起发、弹性和/或稳定性和/或焙烤产品的体积、面屑结构和/或抗陈化性质。此外，它们还可以用于饮料工业，例如用于啤酒酿造以改善可过滤性、用于制备水果或蔬菜汁以增加产率、或用于葡萄酒生产以改善澄清和过滤并增加颜色提取。
本发明涉及包含本发明的阿魏酸酯酶或酶制剂和任选的一种或多种表面活性剂的去污剂组合物。优选去污剂组合物含有本发明的酶制剂，所述酶制剂包含至少一种FAE多肽和选自有或者没有介质的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或氧化酶的其他酶，以及选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、增洁剂、抗再沉积剂、光学增亮剂、染料、颜料、苛性碱、研磨剂和防腐剂等的合适添加剂。纤维素分解酶可以用于去污剂组合物，例如，用于通过抗起球、抗发灰、颜色澄清和软化来改善织物护理性质的目的，以及用于改善织物清洁效果，例如去污。
本发明的酶制剂可以含有表面活性剂，其可以是阴离子、非离子、阳离子、两性的表面活性剂或这些类型的混合物，尤其是当用作去污剂组合物时。有用的去污剂组合物被描述在例如WO 94/07998、美国专利No.5,443,750和美国专利No.3,664,961中。
本发明还涉及包含本发明的阿魏酸酯酶或酶制剂的动物饲料。此外，所述动物饲料还含有谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米，但不限于它们。淀粉、蛋白质和脂肪可容易地被单胃动物例如家禽和猪的消化系统降解，然而大部分非淀粉多糖(NSP)(包括例如大麦和燕麦的混合连接的β-葡聚糖)由于在所述动物内缺乏这种酶活性而保持完好。此外，其他组分(特别是基于动物的脂肪)的可消化性在NSP存在下降低。本发明的动物饲料和在动物饲料制造中使用的酶制剂改善了动物对植物营养物的利用，因此改善了动物表现，这可从改善体重增加和饲料转化率看出。
通过以下非限制性实施例描述了本发明。随着技术进步，本发明的构思可通过多种方式实施对本领域技术人员来说将是显而易见的。本发明和它的实施方式不限于所描述的实施例，而是可以在权利要求书的范围内变化。
实施例1.从嗜热毛壳菌ALKO4265纯化FAE蛋白
真菌菌株嗜热毛壳菌ALKO4265(CBS 132416)和白马兰诺菌ALKO4237(CBS 132099)在马铃薯右旋糖(PD)琼脂(Difco)上生长、维持和生成孢子。将所述ALKO4265菌株的PD斜面接种到复合培养基中，所述培养基含有：18g/l纤维素(InternationalFiber Europe N.V.，Belgium)，18g/l酒糟，9g/l刺槐豆胶，9g/l燕麦斯佩耳特小麦木聚糖(oats spelt xylan)，4.5g/l大豆粉，3g/l麦麸，2g/lCaCO3，4.5g/l(NH4)HPO4，1.5g/l KH2PO4，1.5g/l MgSO4x H2O，0.9g/l KNO3，0.5g/l NaCl，以及痕量元素MnSO4、ZnSO4、CoCl2和FeSO4。在灭菌之前用KOH将所述培养基的pH调节到6.5-7.5，并且将所述培养基在121℃下压热灭菌15分钟。将所述微生物在振荡器(250rpm)上在42℃培养7天。通过离心从用过的培养基除去细胞和固体。将用过的培养基上清液在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上进行分析。
在琼脂平板检测中利用肉桂酸乙酯(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)作为底物和溴甲酚绿(Merck，Darmstadt，德国)作为pH指示剂测试(根据Donaghy和McKay，1994以及Donaghy、Kelly和McKay，1998二者修改)FAE活性的产生。在121℃下压热灭菌具有2％琼脂和5–10mM Tris-HCl pH 6.8的溶液15分钟，并调温到80℃，之后添加1％肉桂酸乙酯底物和0.008％溴甲酚绿，来制备板。将所述混合物调温到54℃并彻底搅拌，然后将它倒入陪替氏培养皿。在将样品液滴在30℃温育3–16h之后，根据琼脂平板上的颜色改变来观察阿魏酸活性。
将嗜热毛壳菌ALKO4265的培养上清液通过0.44μm过滤器(MILLEX HV Millipore，MA，USA)过滤并利用Macrosep 10K离心装置(PALL Life Sciences，NY，USA)浓缩10X。将5ml浓缩样品利用Superdex 26/6075pg凝胶过滤柱(GE Healtcare Bio-Sciences，AB，瑞典)分级。用5mM Tris、150mM NaCl pH 7.5平衡所述柱。利用FAE活性板检测和SDS PAGE分析来分析级分。将在板检测上显示正染色的级分合并。利用以20mM Tris pH 7.5平衡的HiPrep 26/10脱盐柱(GEHealtcare Bio-Sciences，AB，瑞典)改变合并样品的缓冲。利用QSepharose HP 1ml柱(GE Healtcare Bio-Sciences，AB，瑞典)将样品进一步分级。用20mM Tris pH 7.5平衡柱。从流过的级分发现了FAE活性。在SDS PAGE上，在所述流过的级分中有～27kDa和～55kDa的两条主带。通过氨基酸测序鉴定这两条带(实施例2)。
实施例2.来自嗜热毛壳菌ALKO4265的纯化蛋白质的氨基酸测序
为了测定内部序列，从所述聚丙烯酰胺凝胶中切出考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)染色带并基本上如Shevchenko等(1996)所述进行“凝胶内(in-gel)”消化。在用胰蛋白酶(测序级改性胰蛋白酶，V5111，Promega，WI，USA)消化和质量测定之前将蛋白质用二硫苏糖醇还原并用碘乙酰胺烷基化。
利用与Ultimate纳米液相色谱仪(LC-Packings，荷兰)连接的Q-TOF仪器(Micromass，Manchester，UK)，基本上如以前(Poutanen等，2001)所述，但是利用150μm x 1.0mm捕集柱(3μm，#222403，SGE Ltd，UK)用于肽预浓缩，生成用于从头测序的电喷射离子化四极飞行时间串联质谱。
为了进行N-端序列分析，将SDS-PAGE分离的蛋白质通过电印迹转移到聚偏二氟乙烯膜(ProBlott；Perkin Elmer Applied BiosystemsDivision，CA，USA)中。用考马斯亮蓝染色之后，取出感兴趣的蛋白质带并在Procise 494A蛋白质测序仪(Perkin Elmer Applied BiosystemsDivision，CA，USA)上通过Edman降解进行N-端序列分析。
分析从该纯化蛋白质测定到的肽序列。来自嗜热毛壳菌ALKO4265的55kDa纯化蛋白质的内部肽显示出与发表的来自粗糙链孢菌(Neurospora grassa)(保藏号XP_963215)的阿魏酰酯酶的相似性。来自嗜热毛壳菌ALKO4265的27kDa纯化蛋白质的N-端肽显示出与发表的来自保藏号XP_963215的粗糙链孢菌的阿魏酰酯酶的相似性。感兴趣的蛋白质(来自嗜热毛壳菌ALKO4265)因此被命名为Ct_FAE。从蛋白质Ct_FAE得到的所述内部和N-端肽序列(SEQ ID NO:1-4)被显示在表1中。
表1.从来自嗜热毛壳菌的纯化蛋白质Ct_FAE测定到的内部肽序列
实施例3.来自嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237的fae基因的克隆
标准分子生物学方法用于DNA的分离和酶处理(例如分离质粒DNA，消化DNA以产生DNA片段)、用于大肠杆菌转化、测序等等。所使用的基本方法如所述酶、试剂或试剂盒制造商所描述的，或如标准分子生物学手册例如Sambrook和Russell(2001)中所描述的。基因组DNA的分离如Raeder和Broda(1985)的详细描述进行。
根据从所述纯化的Ct_FAE蛋白质得到的肽的氨基酸序列(表1)设计简并寡核苷酸。所述简并寡核苷酸用来合成编码来自嗜热毛壳菌ALKO4265的所述蛋白质的基因的探针。
此外，通过利用来自嗜热毛壳菌的简并引物分析数个其他嗜热菌株，并且意外地通过异源克隆得到来自白马兰诺菌ALKO4237的探针。用作引物的所述简并寡核苷酸的序列被显示在表2中(SEQ ID NO:5-6)。
表2.用作PCR引物以扩增针对来自嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237的fae基因的探针的寡核苷酸
(a所述肽序列被包括在表1中。
(b N＝A或G或T或C，Y＝T或C，R＝A或G；括号中的“s”＝有义链，括号中的“as”＝反义链。
用嗜热毛壳菌ALKO4265基因组DNA作为模板，在PCR条件下，FAEF1和FAER2(SEQ ID NO:5和6)的引物组合产生898bp PCR产物，所述条件包括：1x Phusion HF缓冲液，0.2mM dNTP，1μM引物FAEF1和FAER2(Table 2)，4单位的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，3％DMSO，和1.5μg ALKO4265基因组DNA/200μl反应体积。PCR反应条件如下：在98℃下30秒初始变性，然后25个循环的98℃下10秒、在52.5℃(±7.5℃梯度)退火30秒、在72℃下30秒延伸，以及在72℃最终延伸7分钟。从PCR反应混合物分离并纯化PCR产物，并根据制造商说明书(Invitrogen，USA)将其克隆到通过测序来表征插入片段。
以白马兰诺菌ALKO4237基因组DNA作为模板，FAEF1和FAER2(SEQ ID NO:5和6)的引物组合产生855bp PCR产物。PCR条件以及产物分离、纯化、克隆到和测序的方法与以上对于嗜热毛壳菌ALKO4265的那些一致。
从这两个PCR片段推断的氨基酸序列与发表的FAE序列具有相似性(在NCBI国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的2.2.9版BLAST程序)。因此，所述未知基因被命名为Ct_fae和Ma_fae。
表3中提供了为了克隆来自嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237菌株的全长基因而被选择用作探针的所得PCR片段。
表3.为了克隆来自嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237菌株的全长fae基因而选择的探针。显示了基因组模板DNA、用于PCR反应的引物、得到的PCR片段的大小、含有探针片段的质粒名称和探针序列的SEQ ID NO。
含有用于克隆编码Ct_FAE的全长基因的PCR扩增探针的质粒被命名为pALK3204，并且包括这种质粒的大肠杆菌菌株RF9344以保藏号DSM26068保藏在DSM保藏中心。含有用于基因Ma_fae的PCR扩增探针的质粒被命名为pALK3206，并且包括这种质粒的大肠杆菌菌株RF9346以保藏号DSM26069保藏在DSM保藏中心。
用若干限制性内切酶消化嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237基因组DNA以供Southern印迹分析。用于杂交的探针是分别从质粒pALK3204和pALK3206用EcoRI消化切割得到或PCR扩增得到的具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的PCR片段。利用洋地黄毒苷按照供应商的说明书(Roche，德国)对上述探针进行标记。在68℃下进行杂交过夜。杂交之后，将过滤器在室温下利用2x SSC-0.1％SDS洗涤2x 5min，然后在68℃下利用0.1x SSC-0.1％SDS洗涤2x15min。
从嗜热毛壳菌ALKO4265的基因组DNA，得到大约4.8kb HindIII-消化片段。利用来自质粒pALK3206的洋地黄毒苷标记的探针片段，从白马兰诺菌ALKO4237的基因组DNA，得到大约4.8kb SacI-消化片段。杂交的基因组DNA片段根据它们的大小从消化的基因组片段库分离。从琼脂糖凝胶分离基因组片段并将其克隆到用HindIII或SacI切割的pBluescript II KS+(Stratagene，CA，USA)载体。将连接混合物转化到大肠杆菌XL10-Gold细胞(Stratagene，CA，USA)并在含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB(Luria-Bertani)板上铺板。利用菌落杂交，以pALK3204和pALK3206插入片段作为探针，在对应于上面对Southern印迹分析描述的杂交条件下(唯一的差异是65℃杂交温度)，筛选大肠杆菌菌落的阳性克隆。从所述板收集若干阳性克隆。它们通过限制性消化显示出含有预期大小的插入片段，并且利用以pALK3204和pALK3206插入片段作为探针的Southern杂交进一步筛选所述插入片段。Southern印迹在所收集的克隆的插入片段上进行，其中在65℃进行杂交，并在室温下利用2x SSC-0.1％SDS洗涤2x 5min，然后在68℃下利用0.1x SSC-0.1％SDS洗涤2x 15min。
从4.8kb HindIII插入片段测序编码嗜热毛壳菌ALKO4265蛋白Ct_FAE的全长基因，并且含有这种插入片段的质粒被命名为pALK3216。包含质粒pALK3216的大肠杆菌菌株RF9727以保藏号DSM26071保藏于DSM保藏中心。编码嗜热毛壳菌ALKO4265蛋白Ct_FAE的基因被命名为Ct_fae(SEQ ID NO:9)。相应地，从4.8kb SacI插入片段测序编码Ma_FAE的全长fae基因，含有这种插入片段的质粒被命名为pALK3214。包含质粒pALK3214的大肠杆菌菌株RF9726以保藏号DSM26070保藏于DSM保藏中心。编码白马兰诺菌ALKO4237蛋白Ma_FAE的基因被命名为Ma_fae(SEQ ID NO:10)。所述基因序列(SEQ ID NO:9和10)的相关信息总结在表4中。
表4.对从嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237分离的fae基因的总结。显示了有和没有内含子的基因长度以及所述基因的SEQ IDNO。
(a包括终止密码子。
(b不包括终止密码子。
基因Ct_fae的推导氨基酸序列包括Ct_FAE肽1199,656(SEQ IDNO:1)、1414,697(SEQ ID NO:2)、1906,045(SEQ ID NO:3)和#4276(SEQ ID NO:4)的序列(表1)。这证实了从克隆得到的Ct_fae基因是编码纯化Ct_FAE蛋白质的基因。基因Ma_fae的推导氨基酸序列包括Ma_FAE肽#4276(SEQ ID NO:4)的序列，并且从基因序列Ma_fae推导的蛋白质被命名为Ma_FAE。关于推导的蛋白序列(SEQ ID NO:11和12)的相关信息总结在表5中。
表5.从来自嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237的fae基因序列推导的氨基酸序列的总结
(a利用程序SignalP V3.0(Nielsen等，1997；Nielsen和Krogh，1998；Bendtsen等，2004)进行对信号序列的预测。
(b不包括预测的信号序列。利用Clone Manager 9程序完成所述预测。
从嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237推导的FAE序列与从数据库发现的序列的比较显示在表6中。
表6.与来自嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237的推导FAE氨基酸序列的最高同一性序列。比对包含信号序列的全长氨基酸序列。在http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/利用FASTA(EMBL-EBI，FASTA–蛋白质相似性搜索，UniProt知识库和NRPL 1，BLOSUM62空位开放-7，空位延伸-1)进行数据库搜索，并且在http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/的EMBOSS Needle(EMBL-EBI，EMBOSS-Needle–配对序列比对，BLOSUM62，空位开放10，空位延伸0.5)用于确定同一性程度。
生物体和保藏号 同一性(％)
Ct_FAE 100
US20090151026 75
Ma_FAE 100
US20090151026 72
实施例4.在里氏木霉中生产重组FAE蛋白
构建表达质粒，用于在里氏木霉中生产来自嗜热毛壳菌ALKO4265和白马兰诺菌ALKO4237的重组FAE蛋白。所述重组fae基因(包括它们自己的信号序列)通过PCR准确地与里氏木霉cbh1/cel7A启动子融合。通过PCR在终止密码子之后产生BamHI位点，以在3′末端将所述基因与里氏木霉cbh1/cel7A终止子融合。这在构建物中在cbh1终止子序列之前留下的不是原来的终止子。A.nidulansamdS标记基因用于如Paloheimo等(2003)所述选择转化体。在NotI消化(Ct_fae)或EcoRI消化(Ma_fae)之后从载体骨架分离线性表达盒(图1)。Ct_fae(6468bp)和Ma_fae(6424bp)的表达盒被转化到里氏木霉原生质体中。所使用的宿主菌株不产生四种主要的里氏木霉纤维素酶(CBHI，CBHII，EGI，EGII)中的任一种。如等(1987)中所述进行转化，其中的修改为如Karhunen等(1993)中所述，选择乙酰胺作为唯一的氮源(amdS标记基因)。在转化体在PD上形成孢子之前，在选择板上通过单一分生孢子来纯化所述转化体。
从摇瓶培养的培养上清液分析所述转化体的FAE蛋白质生产。将所述转化体从PD斜面接种到含有50ml复合乳糖基纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等，1993)的摇瓶，所述培养基用5％KH2PO4缓冲。在30℃、250rpm下培养7天之后，分析FAE蛋白质生产。重组蛋白质的异源生产通过SDS-PAGE与随后的考马斯染色进行分析。所选择的转化体的基因型通过Southern印迹分析证实，其中包括基因组消化并且相应的表达盒被用作探针。
选择最佳生产转化体在实验室规模的生物反应器中在28℃下在纤维素酶诱导复合培养基中培养3-4天，pH控制在4.5±0.2或5.5±0.2(NH3/H3PO4)，以得到用于应用试验的材料。通过离心和通过Seitz-K150和EK过滤器(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach，德国)过滤来回收上清液。
实施例5.用包含重组FAE蛋白的酶制剂水解甘蔗渣底物
将甘蔗渣悬浮在pH 4.8的0.05M柠檬酸钠缓冲液中。水解混合物的最终重量是1g，其中总固体浓度是12％(w/w)。利用不同的酶混合物以2mg蛋白质/g总固体的剂量在2ml反应管中水解所述底物。利用产品号码23227的Pierce BCA检测试剂盒(Thermo Scientific，MA，USA)测定所述酶组分的蛋白质含量，其中产品号码23209的牛血清清蛋白(Thermo Scientific，MA，USA)作为标准。将反应管在来自GFL的线性振荡水浴1086中搅拌，所述水浴调节成不同的温度。对于每个取样点，从一式两份的反应管取0.5ml样品并离心。将上清液煮沸20分钟以终止酶水解，并分析水解的反应产物。
利用下列组分制备不同的热稳定木质纤维素分解酶的基础混合物：
含有重组嗜热支顶孢霉(Acremonium thermophilum)ALKO4245CBHI/Cel7A(WO2007071818)的CBHI/Cel7A制剂，
含有重组嗜热支顶孢霉ALKO4245CBHII/Cel6A(WO2011080317)的CBHII/Cel6A制剂，
含有重组橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)ALKO4242EGII/Cel5A(WO2007071818)与遗传连接的里氏木霉EGII/Cel5A的CBM(WO2007071818)的EGII/Cel5A制剂，
含有重组里氏木霉EGI/Cel7B的嗜温EGI/Cel7B制剂，
含有嗜热支顶孢霉ALKO4245β-葡萄糖苷酶/Cel3A(WO2007071818)的β-葡萄糖苷酶制剂，
含有橙色热子囊菌ALKO4242Xyn10A木聚糖酶(WO2007071818)的木聚糖酶制剂。
所有纤维素酶在具有无纤维素酶背景(编码四种主要的纤维素酶的基因CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A被缺失)的里氏木霉宿主菌株中作为单组分异源产生。在混合物中使用粗培养上清液。将酶组分如下组合以制备基础混合物：纤维二糖水解酶CBHI/Cel7A制剂60％，纤维二糖水解酶CBHII/Cel6A制剂15％，内切葡聚糖酶EGII/Cel5A制剂10％，内切葡聚糖酶EGI/Cel7B制剂8％，木聚糖酶Xyn10A制剂3％和β-萄糖苷酶βG/Cel3A制剂4％。这种酶混合物被命名为混合物1。
为了测试在所述水解中的FAE分子性能，制备三种不同的混合物组合，其含有80％、90％或95％的混合物1以及20％、10％或5％的下列FAE组分：
嗜热毛壳菌FAE酶制剂(Ct_FAE)和
白马兰诺菌FAE酶制剂(Ma_FAE)。
对于所有混合物，水解都在37℃和50℃下进行。水解48h之后取样品，通过HPLC定量并测定木糖的浓度。Ma_FAE水解结果显示在图2中。
结果显示了与对照混合物1相比，Ma_FAE在测试温度(37℃和50℃)下具有更好的性能。在50℃时，Ma_FAE表现得比对照混合物——混合物1好高达7％(用20％Ma_FAE)。在37℃下，Ma_FAE表现得比对照混合物——混合物1好高达10％(用20％Ma_FAE)。
实施例6.用包含重组FAE酶的酶制剂从自动洗碗机过滤器除去纤维性残渣
在500ml摇瓶中用悬浮在pH 4.0的稀释柠檬酸盐缓冲液中的来自苹果、橙和小麦的磨碎纤维测量聚积在自动洗碗机中的纤维性残渣的水解，所述缓冲液含有大约0.5％丙二醇。添加等量的每种纤维并且最终总固体浓度是4g/l。以25毫克蛋白质/克总固体的剂量添加酶。通过Bio-Rad蛋白质检测(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)，利用牛丙种球蛋白(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)作为标准，测定来自所述酶制剂的蛋白质的量。该水解实验在50℃和60℃进行。在稀释柠檬酸盐缓冲液中含有纤维和酶的烧瓶在230rpm振荡下被加热到50℃/60℃。在50℃/60℃温育60分钟时间之后，所述溶液通过200μm筛过滤并将留在筛上的纤维在50℃干燥至少20小时。对干燥的纤维称重以测量所述纤维的重量损失。重量损失按空白的重量的百分比计算。在所述缓冲液中只含有纤维的空白(没有酶)与其他样品同样地制备。
基础里氏木霉纤维素酶混合物(Roal Oy，经典的里氏木霉酶产品)用于所述比较。只含有基础里氏木霉纤维素酶混合物的酶混合物(对照)或含有72％(18mg)里氏木霉纤维素酶混合物和28％(7mg)Ct_FAE或Ma_FAE的混合物用于测试水解中FAE的性能。所述FAE酶在具有无纤维素酶背景(编码四种主要的纤维素酶CBHI、CBHII、EGI和EGII的基因被缺失)的里氏木霉宿主菌株中作为单组分异源产生。粗培养上清液用于所述酶混合物中。
来自对照和含有FAE蛋白的样品的一式三份样品的平均结果显示在图3中。当用嗜热毛壳菌Ct_FAE部分代替所述基础里氏木霉纤维素酶混合物时，发现留在筛中的纤维残渣的重量在50℃时减少了20％并在60℃时减少了29％。相应地，当用白马兰诺菌Ma_FAE酶部分代替所述基础里氏木霉纤维素酶混合物时，发现留在筛中的纤维残渣的重量在50℃时减少了25％并在60℃时减少了11％。因此，所述结果显示，当用FAE蛋白Ct_FAE或Ma_FAE补充里氏木霉纤维素酶混合物时性能更好。
实施例7.在向童子鸡饲料添加含有重组FAE蛋白的酶制剂之后营养物的可消化性和生长性能
包含小麦和大豆或玉米和大豆的颗粒动物饲料通过将酶溶液喷洒在所述颗粒上进行处理。喷洒在所述颗粒上的酶溶液含有不同的酶组合，包括单独的Ct_FAE或Ma_FAE或者与木聚糖酶组合。所述酶以1和200g/t之间的水平进行配给。将FAE酶的性能与单独木聚糖酶的效果比较。
每种处理具有六份重复并且观测单位是20只童子鸡的圈。在每种情况下，分析膳食中的水分、粗蛋白、粗纤维、油、灰分、钙、磷、TiO2标记物、和中性去污剂纤维(NDF)。
童子鸡的初始重量在30g和50g之间。该试验持续35和55天之间。在试验期间，在试验开始时、在15和25天之间、以及在35至55天之后再次测量体重增加、进食量和饲料转化率(FCR)。按照消耗的总饲料除以相同时间段期间的体重增加来计算FCR。
每天通过目测检查来检查动物的健康状态。分析饲料样品和每圈的混合粪便样品的干物质、TiO2标记物、氮和总能量(GE)。重组FAE蛋白效果的测定是基于FCR、饲料利用效率、表观总消化道氮、干物质和能量可消化性。利用绝热弹式量热器测定GE。表观总消化道氮(ATTDN)、干物质(ATTDDM)和能量可消化性(ATTDE)如下测定：利用Short等(1996)描述的方法检测所述饲料和排泄物物质中的二氧化钛。然后使用以下计算，其中X是目的组分(即，氮、DM、能量)：
ATTDX＝100％-[((TTD x XF)/(XD x TTF))x 100％]；
其中ATTDX＝检测成分中组分的AID(％)，TTD＝检测膳食中的TiO2浓度(g/kg DM)，XF＝排泄物中的营养物浓度(g/kg DM)，XD＝所述检测膳食中的营养物浓度(g/kg DM)和TTF＝排泄物中的标记物浓度(g/kg DM)。
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序列表
SEQ ID NO:1来自纯化Ct_FAE蛋白质的内部肽序列
SEQ ID NO:2来自纯化Ct_FAE蛋白质的内部肽序列
SEQ ID NO:3来自纯化Ct_FAE蛋白质的内部肽序列
SEQ ID NO:4来自纯化Ct_FAE蛋白质的N-端肽序列
SEQ ID NO:5用作PCR引物的简并寡核苷酸FAEF1
SEQ ID NO:6用作PCR引物的简并寡核苷酸FAEF2
SEQ ID NO:7利用引物FAEF1和FAER2从嗜热毛壳菌ALKO4265获得的PCR片段的序列
SEQ ID NO:8利用引物FAEF1和FAER2从白马兰诺菌ALKO4237获得的PCR片段的序列
SEQ ID NO:9来自嗜热毛壳菌ALKO4265的Ct_fae基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:10来自白马兰诺菌ALKO4237的Ma_fae基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:11来自嗜热毛壳菌ALKO4265的Ct_FAE蛋白的推导氨基酸序列
SEQ ID NO:12来自白马兰诺菌ALKO4237的Ma_FAE蛋白的推导氨基酸序列
保藏
1)荷兰微生物菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmel cultures)，Upsalalaan8，3508AD，Utrecht，荷兰
2)德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)，Inhoffenstrasse 7B，D-38124Braunschweig，德国

Claims (23)

1.多肽，其包含与SEQ ID NO:11具有至少76％序列同一性或与SEQ ID NO:12具有至少73％序列同一性的氨基酸序列，或其具有阿魏酸酯酶活性的片段或变体。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:11具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少98％的同一性，或与SEQ ID NO:12具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少98％的同一性，或其具有阿魏酸酯酶活性的片段或变体。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽从嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)或白马兰诺菌(Melanocarpus albomyces)获得，优选从嗜热毛壳菌CBS 132416或白马兰诺菌CBS 132099获得。
4.分离的多核苷酸，其选自下列：
a)包含如SEQ ID NO:9或10中所示的编码序列的多核苷酸；
b)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；
c)编码由a)或b)的多核苷酸所编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段具有阿魏酸酯酶活性；和
d)包含与a)或b)的多核苷酸序列的核苷酸序列简并的核苷酸序列的多核苷酸；
或这样的多核苷酸的互补链。
5.权利要求4的多核苷酸，其包含具有选自DSM 26070和DSM26071的保藏号的微生物中所包含的基因。
6.载体，其包含权利要求4或5的多核苷酸，所述多核苷酸与能够指导权利要求1的多肽的表达的调节序列可操作地连接。
7.宿主细胞，其包含权利要求6的载体。
8.大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，其具有保藏号DSM 26070或DSM 26071。
9.生产权利要求1的多肽的方法，所述方法包含以下步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能够表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收和纯化所述多肽。
10.酶制剂，其包含权利要求1至3任一项的多肽。
11.权利要求10的酶制剂，其还包含至少一种选自以下的酶：有或者没有介质的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖脱氢酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶、包括内切和外切-α-L-阿拉伯糖酶、内切和外切-半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸裂解酶和果胶酯酶、苯酚酯酶、包括木质素过氧化物酶的木质素酶、锰依赖性过氧化物酶、H2O2生成酶、昆布多糖酶、壳聚糖酶、GH61蛋白质和漆酶。
12.权利要求10或11的酶制剂，其还包含木聚糖酶。
13.处理纤维素材料或木质纤维素材料的方法，其中所述方法包括将所述纤维素材料或木质纤维素材料与权利要求1至3任一项的多肽或权利要求10至12的酶制剂反应。
14.权利要求13的方法，其中所述方法包括通过将洗碗机内部的至少部分与权利要求1至3任一项的多肽或权利要求10至12的酶制剂接触来清洁所述洗碗机的内部。
15.权利要求13的方法，其中所述纤维素材料或木质纤维素材料是纺织材料、用于动物饲料的植物、或木材衍生的浆粕或二级纤维。
16.权利要求1至3任一项的多肽或权利要求10至12的酶制剂在加工生物质以及在生物燃料、淀粉、纺织、去污剂、纸浆造纸、食品、烘焙、饲料或饮料工业中的应用。
17.权利要求16的应用，其用于清洁洗碗机的内部。
18.权利要求16的应用，其用于烘焙中以改善面团和面包特性。
19.权利要求16的应用，其用于饲料中以改善动物生长速率和饲料转化率。
20.去污剂组合物，其包含权利要求1至3任一项的多肽或权利要求10至12的酶制剂。
21.权利要求20的去污剂组合物，其中所述组合物是洗碗机清洁组合物。
22.改善去污剂组合物的织物护理性质或纺织品清洁效果的方法，所述方法包括向所述去污剂组合物添加权利要求1至3任一项的多肽或权利要求10至12的酶制剂。
23.动物饲料，其包含权利要求1至3任一项的多肽或权利要求10至12的酶制剂。
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