CN106368035B - 一种利用高温酯酶ttest去除废纸浆中胶黏物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法，所述的酯酶TTEST的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；具体包括如下步骤：向废纸浆中加入0.1U～1.0U/g(相对于绝干浆质量)的酯酶，处理时间45～120min，处理温度40～80℃，pH6.0～9.0，搅拌速度100～150rpm，最后根据TAPPIT‑277标准法检测废纸浆中胶黏物含量。结果证实胶黏物去除率达到54.7％～69.5％，即使在高温环境下仍具有较好的去除效果。本发明利用高温酯酶TTEST对废纸浆中的胶黏物进行高效降解，操作过程简便且无需额外机械设备，胶黏物去除效果明显，生产成本低，对环境无污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用高温酯酶去除废纸浆中胶黏物的方法。
背景技术
近年来，废纸浆在全球纸浆消费总量中占比已超过60％。废纸作为我国制浆造纸工业的一种重要原料，废纸的再利用不仅可以节约大量植物纤维原料、降低生产成本，而且对于实现节能降耗、缓解环境污染有着深远的意义。然而胶黏物的形成和控制问题在实际的废纸回收利用过程中日益凸显，胶黏物是指废纸回用过程中各种来源不同且具有永久或者临时黏性并可在造纸过程中引起问题和引起产品质量下降的所有物质。胶黏物主要来源于废纸中的热熔物、压敏物、施胶剂、涂布胶黏物和油墨残留物等,这些物质主要由聚丙烯酸酯、聚醋酸乙烯酯等与其他杂质混合而成,它们通过酯键将胶黏物的基本结构组分连接在一起。由于胶黏物在浆料体系中呈现负电性，因而可以吸附各种阳离子物质，因此在制浆造纸过程中就容易造成堵塞网孔、出现纸张空洞、产生阴离子垃圾、引起断纸以及纸机停机等问题。
目前，去除和控制浆料中胶黏物的方法主要采用机械法和化学法。机械法包括筛选、净化、洗涤、浮选以及热分散等物理方法，主要用来去除废纸浆中的大胶黏物。化学法则通过添加胶黏物控制机，利用化学吸附、改性、分散、表面钝化等方法来去除微细胶黏物。这些方法为废纸造纸企业常用的胶黏物控制方法，虽然有一定的去除效果，然而存在高耗能、效率低、易产生大量工业废水等问题，而且去除效率还要受设备性能的优劣等诸多因素的影响。
生物酶具有高效、专一、稳定的催化性，而且对环境无污染，因此在制浆造纸领域的应用受到了越来越多的关注，近年来许多企业利用生物酶法处理废纸回收过程中的胶黏物问题。随着酶工程技术的发展，生物酶的催化效率，底物特异性及稳定性可进一步被提高，更适合用于实际生产。目前用于造纸工业的生物酶制剂有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、脂肪酶及酯酶等。其中脂肪酶及酯酶是一类羧酸酯水解酶，具有加快黏性物质酯键的断裂，使其黏附物体积变小及黏附效率减弱的特性，可用于控制和去除废纸中的胶黏物。酯键一旦断裂，胶黏物的基本组分很难在系统中重新聚合，而且生物酶可以自行降解，不会污染环境。万金泉等[万金泉等，脱墨纸浆中胶黏物生物酶法处理]利用脂肪酶对脱墨纸浆中胶黏物进行处理，发现不同种类的脂肪酶处理效果不同,但在通常的制浆条件下很难实现较好的处理效果。林涛等[林涛等，胶黏物控制酶在废纸处理中的应用]利用生物酶optimyze525处理废纸胶黏物，胶黏物去除率达到29.9％。
虽然普通的脂肪酶及酯酶有一定的胶黏物去除效果，但是废纸浆成分较为复杂，含有大量能够使生物酶失活的化学物质，且高温等极端环境易导致生物酶制剂在实际生产应用的效率受到抑制，因此具有耐受强酸碱、有机溶剂及高温处理条件的生物酶更能满足造纸工业的生产需求。极端微生物是一类能够在火山口、极地、深海沉积物或温泉等极端环境生长的微生物，其所产生酶类在苛刻的催化反应条件下仍可以保持良好的催化活性。例如，来源于嗜热古细菌Pyrobaculum calidifontis VA1的酯酶Est在100℃保温2小时及在含有80％有机溶剂条件下保持1小时，其催化活力没有明显的减少。从宏基因组文库中筛选获得一个高温酯酶EstE1最适合反应温度为70℃，且在80℃保温2小时催化活力保持不变。来源于古菌Archaeoglobus fulgidus的脂酶AFEST的最适反应温度为70℃，同时表现出良好的热稳定性，这些来源于极端微生物的酯酶表现出良好的催化性能及结构稳定性，可作为造纸工业应用的重要候选酶制剂。
发明内容
针对现有的废纸胶黏物去除工艺中高耗能、效率低、易产生大量工业废水以及普通生物酶在高温环境中易失活等问题。本发明提供一种高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法，本发明提供的工艺简单、效果明显、易于操作。
本发明为实现上述目的，技术方案如下：
一种利用高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法，包括如下步骤：
(1)高温酯酶TTEST的制备：
将酯酶TTEST菌种接种到种子液体培养基振荡培养，再将菌种接种到发酵培养基振荡培养，制备得到高温酯酶TTEST粗酶液，将高温酯酶TTEST粗酶液纯化，用对硝基苯酚比色法测定高温酯酶TTEST的酶活。所述的酯酶TTEST的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
(2)利用高温酯酶TTEST处理废纸浆：
向废纸浆中加入0.1U～1.0U/g(相对于绝干浆质量)的酯酶TTEST，处理时间45～120min，温度40～80℃，pH 6.0～9.0，搅拌速度100～150rpm。
(3)通过TAPPIT-277标准法检测废纸浆中胶黏物含量：
按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得胶黏物含量。
优选地，所述酯酶TTEST的酶活为130.0U/ml。
优选地，所述酯酶TTEST添加量为0.2～0.8U/g(相对于绝干浆质量)。
更为优选地，所述酯酶TTEST添加量为0.5U/g(相对于绝干浆质量)。
优选地，酯酶TTEST处理温度为45～60℃，pH6.0～8.0。
更为优选地，酯酶TTEST处理温度为60℃，pH8.0。
优选地，酯酶TTEST处理时间为45～120min，搅拌速度100～150rpm。
更为优选地，酯酶TTEST处理时间为60min，搅拌速度120rpm。
所述废纸浆的浆浓为4％～6％。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明中的高温酯酶TTEST制备容易，去除废纸胶黏物效果明显。
(2)本发明中的高温酯酶TTEST可以应对废纸回收工艺中的各种高温以及酸碱环境，在高温条件下仍能保持较好的胶黏物去除效果。
(3)本发明通过高温酯酶TTEST去除废纸胶黏物的方法直接在生产线上进行，无须增加任何机械设备，操作简单，成本低。
因此，本发明通过高温酯酶TTEST控制废纸浆中的胶黏物的方法高效、稳妥地解决了过去在废纸造纸领域严重影响产品质量胶黏物问题，具有操作简单、去除效果显著、生产成本低、无污染等优点。
具体实施方式
通过实施例更详细地介绍本发明的实施。在所述实施例中，所述加酶量相对于绝干浆质量计算，实验结果均重复三次取平均数。本发明所使用的酯酶，其蛋白序列号已被蛋白质数据库公布(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)。来源于Thermusthermophilus HB8菌种的酯酶TTEST,PDB ID:1ufo，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
酯酶TTEST的制备过程：利用全基因合成方法获取的TTEST酯酶的编码基因，并克隆到表达载体pET23a-CBD载体上获得重组表达载体。利用CaCl2转化法，将含有TTEST酯酶编码基因的表达质粒转入BL21(DE3)菌种中，获得基因工程菌。将酯酶TTEST的菌种接到含Amp(100ug/ml)的LB种子培养基中扩大培养，当OD值达到0.6～0.8时，将菌液按照1:100的比例接种到含Amp(100ug/ml)的LB发酵培养基中，摇至OD值为0.6～0.8时加入IPTG(20mmol/L)诱导剂进行诱导表达，18～24h后收菌。将菌液在12000r/min条件下离心10min后收集管壁细胞进行超声破碎，之后再以12000r/min条件离心10min后取上清液，即得到粗酶液。已有研究报道利用纤维素与酯酶进行特异性结合，之后再用3C蛋白酶进行酶切从而得到纯酶。1L菌液对应1g纤维素，常温下将粗酶液与纤维素结合30min，适时搅拌。结合后高速离心10min，弃去上清液，将吸附蛋白用PBS缓冲液洗两次。3C蛋白酶在使用前先离心、弃去上清，利用PBS缓冲液清洗2次。向吸附蛋白中加入适量PBS，按1L菌液对应1ml 3C蛋白酶的比例混匀后酶切4h或过夜。酶切后高速离心，上清液即为纯酶。之后利用对硝基苯酚比色法测定制备的高温酯酶TTEST的酶活，测得酶活为130.0U/ml。
脂肪酶CALB为商品化脂肪酶，测得酶活为150.0U/ml。
实施例1
称取100g OCC绝干浆，稀释浆浓至4％，酯酶TTEST添加量为0.2U/g(相对于绝干浆质量)，处理温度为40℃，pH为6.0，处理时间45min，搅拌转速为100rpm，实施例按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出的胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得酶处理后的胶黏物含量。在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为空白组胶黏物含量。
实施例2
称取100g OCC绝干浆，稀释浆浓至5％，酯酶TTEST添加量为0.5U/g(相对于绝干浆质量)，处理温度为60℃，pH为8.0，处理时间60min，搅拌转速为120rpm，实施例按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出的胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得酶处理后的胶黏物含量。在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为空白组胶黏物含量。
实施例3
称取100g OCC绝干浆，稀释浆浓至6％，酯酶TTEST添加量为1.0U/g(相对于绝干浆质量)，处理温度为80℃，pH为9.0，处理时间60min，搅拌转速为150rpm，实施例按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出的胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得酶处理后的胶黏物含量。在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为空白组胶黏物含量。
对比实施例1
加入脂肪酶CALB代替酯酶TTEST处理废纸浆，其他条件与实施例1相同，对比实施例按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出的胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得酶处理后的胶黏物含量。在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为空白组胶黏物含量。
对比实施例2
加入脂肪酶CALB代替酯酶TTEST处理废纸浆，其他条件与实施例2相同，对比实施例按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出的胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得酶处理后的胶黏物含量。在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为空白组胶黏物含量。
对比实施例3
加入脂肪酶CALB代替酯酶TTEST处理废纸浆，其他条件与实施例3相同，对比实施例按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出的胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得酶处理后的胶黏物含量。在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为空白组胶黏物含量。
表1
由表1可知，在40～60℃条件下，加入高温酯酶TTEST处理后的废纸浆中胶黏物含量明显减少，胶黏物去除率可达59.8％～69.5％，要明显优于脂肪酶CALB的去除效果。即使在80℃高温条件下，加入酯酶TTEST后的处理效果也较为理想，废纸浆中的胶黏物去除率达到54.7％，而脂肪酶CALB在此条件下基本失活，难以去除胶黏物。考虑到废纸造纸过程中不同工段的温度不尽相同，酯酶TTEST在废纸回收不同工段中去除胶黏物的效果都较为理想。
Claims (1)
1.一种利用高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法，其特征在于包括如下步骤：
酯酶TTEST的制备过程：利用全基因合成方法获取的TTEST酯酶的编码基因，并克隆到表达载体pET23a-CBD载体上获得重组表达载体，利用CaCl2转化法，将含有TTEST酯酶编码基因的表达质粒转入BL21（DE3）菌种中，获得基因工程菌，将酯酶TTEST的菌种接到含Amp100ug/ml的LB种子培养基中扩大培养，当OD值达到0.6～0.8时加入20mmol/L的IPTG诱导剂进行诱导表达，18～24h后收菌，将菌液在12000r/min条件下离心10min后收集管壁细胞进行超声破碎，之后再以12000r/min条件离心10min后取上清液，即得到粗酶液；1L菌液对应1g纤维素，常温下将粗酶液与纤维素结合30min，适时搅拌；结合后高速离心10min，弃去上清液，将吸附蛋白用PBS缓冲液洗两次；3C蛋白酶在使用前先离心、弃去上清，利用PBS缓冲液清洗2次；向吸附蛋白中加入适量PBS，按1L菌液对应1ml 3C蛋白酶的比例混匀后酶切4h或过夜；酶切后高速离心，上清液即为纯酶；酯酶TTEST的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
称取100gOCC绝干浆，稀释浆浓至6％，酯酶TTEST添加量为相对于绝干浆质量1.0U/g，处理温度为80℃，pH为9.0，处理时间60min，搅拌转速为150rpm。
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