CN109666661A - 去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂 - Google Patents

去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂 Download PDF

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陈详
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    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明提供了去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂，具体地在野生型脂肪酶基因序列的基础上，通过基因改造获得了能够在65℃高温条件下具有较高脂肪酶活性的脂肪酶突变体，在此基础上对耐高温脂肪酶突变体的胶黏物去除效果进行了测试，最终获得了在高温条件下具有显著胶黏物去除效果的含有耐高温脂肪酶突变体的酶制剂。

Description

去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂
技术领域
本发明属于造纸制浆领域，具体地说，本发明涉及一种去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂。
背景技术
目前造纸制浆中常采用国废、美废、欧废、日废等废纸作为原料，废纸中含有大量的胶粘物杂质，如压敏胶、热熔胶、涂布胶粘物、蜡、油墨粘合剂等。胶粘物在进入与废纸循环处理系统后，胶粘物经常沉积到造纸设备上，增加了造纸机的清洗次数，缩短了成型网毛布的使用寿命，且沉积到纸页上容易出现纸页斑点和断纸，极大的影响了生产效率，并会降低产品品质。
目前对胶粘物的去除主要依靠压力筛、浮选槽、热分散等设备，其中压力筛对胶粘物控制效果最为明显，一般大的胶粘物均可通过孔筛或缝筛去除通过排渣将胶粘物带走。
生物酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大部分为蛋白质，也有极少部分为RNA。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。
由于造纸胶粘物中很多成分为脂类物质，因此脂肪酶对造纸胶粘物的去除具有良好的效果。但是，天然脂肪酶的最适温度一般在30-50℃，而具有热分散设备的纸机系统中温度能够达到65℃以上，因此在纸机高温环境中，天然脂肪酶难以发挥应有的活性，导致应用效率低下。
因此，本领域技术人员致力于开发能够耐受纸机高温环境的脂肪酶，以便有效去除纸机中的胶黏物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种去除纸浆中胶粘物的酶制剂。
在本发明的第一方面，提供了一种用于去除纸浆中胶粘物的酶制剂，所述酶制剂包含耐高温脂肪酶，所述耐高温脂肪酶选自下组：
(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽的第293位为T、第343位为G；
(C)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽，并且所述衍生多肽的第293位为T、第343位为G；
其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:2的编号。
在另一优选例中，所述酶制剂为液体酶制剂。
在另一优选例中，所述耐高温脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述酶制剂的使用温度为45℃-75℃；优选地，为60℃-70℃；更优选地为62℃-68℃。
在另一优选例中，所述酶制剂的使用pH为6-9；优选地pH为7-8。
在另一优选例中，所述酶制剂的用量为50-300克酶制剂/吨绝干浆。
在另一优选例中，所述酶制剂中还包括选自下组的一种或多种酶：
角质酶、纤维素酶、半纤维素酶、和漆酶。
在另一优选例中，所述酶制剂中还包括角质酶。
在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述的酶制剂的用途，用于降低废纸纸浆中的胶黏物含量。
在另一优选例中，所述废纸纸浆为箱板纸废纸纸浆。
在另一优选例中，所述废纸原料来源为中国。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，在野生型脂肪酶基因序列的基础上，进行随机突变和高通量筛选，最终获得了能够在高温(65℃)条件下具有较高脂肪酶活性的突变体，在此基础上对耐高温脂肪酶突变体的胶黏物去除效果进行了测试，最终获得了在高温条件下具有显著胶黏物去除效果的耐高温脂肪酶突变体。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
脂肪酶
本发明人选用Burkholderia glumae PG1来源的磷脂/羧酸酯酶(phospholipase/carboxyl esterase)作为野生型脂肪酶，其氨基酸序列如下：
本发明在SEQ ID NO.:1所示的野生型序列基础上进行突变筛选，获得了具有耐高温活性的突变型脂肪酶。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述耐高温突变型脂肪酶具有选自下组的一个或多个突变位点：
N201L、F293E、V298K、T212A、V298G、L338G、A207V、L211Q、F293T、A343G、D332T、R353F、G255Q、L211V、F293D、A345P。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供的耐高温突变型脂肪酶在SEQ IDNO.:1所示的野生型脂肪酶基础上进行突变，并且突变的位点为：
(1)N201L、F293E、V298K；
(2)T212A、V298G；
(3)L338G；
(4)A207V、L211Q；
(5)F293T、A343G；
(6)D332T；
(7)R353F；
(8)G255Q；
(9)L211V、F293D；或者
(10)A345P。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供的耐高温突变型脂肪酶的氨基酸序列如下：
本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的脂肪酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明的脂肪酶可以通过常规的重组DNA技术进行表达或生产，包括步骤：
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得脂肪酶。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明脂肪酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。
本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。
工程菌的培养和目的蛋白发酵生产
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：
(a)就温度而言，脂肪酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；
(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；
(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；
(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；
(e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓度控制在0.1-1.5mM；
(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。
本发明的目的蛋白脂肪酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。
层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：
1.阴离子交换层析：
阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。
2.疏水层析：
疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH4)2SO4等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
3.凝胶过滤层析
疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
4.亲和层析
亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrapTMHeparinHPColumns。
5.膜过滤
超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。
本发明的主要优点在于：
(1)提供了在高温条件下，具有较高酶活的耐高温脂肪酶突变体；
(2)本发明提供的耐高温脂肪酶突变体，在高温条件下，酶活能够达到野生型的2倍以上。
(3)本发明提供的耐高温脂肪酶突变体适合在高温条件下，降解去除纸机中的胶黏物，胶黏物去除效果显著优于野生型脂肪酶。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：耐高温脂肪酶突变体的高通量筛选
用突变发生率约为0.3％的低保真度PCR(Error-PCR)扩增全合成的野生型脂肪酶的DNA序列(SEQ ID NO.:1)，克隆至pET28a原核表达载体(购自Novagen公司)中，得到脂肪酶随机突变质粒。PCR产物用DNA胶回收试剂盒纯化回收，用NdeI及XhoI酶切，连接到pET28a载体，测序确认序列，得到的质粒命名为E-pET28。
PCR反应程序为95℃3分钟,(95℃30秒,60℃30秒，68℃2分钟，25次循环，68℃5分钟，4℃保存。
PCR产物用BsmBI及XhoI酶切，然后连接经BsmBI及XhoI酶切的E-pET28质粒，连接产物转化BL21感受态细胞。脂肪酶突变质粒转化BL21感受态细胞后，诱导表达出脂肪酶突变库。将含有脂肪酶突变库的BL21诱导表达菌用乳液PCR体系分散包裹，进行PCR扩增反应，扩增获得含有脂肪酶突变位点的DNA。然后把乳液PCR扩增出来的DNA用脂肪酶特异引物进行二次高保真PCR扩增。将二次高保真PCR扩增的DNA产物重新克隆至pET28a表达载体中，进行初步筛选。
从得到的突变库中随机挑取230个单克隆，接种LB培养基于37℃下，200rpm摇床，待OD600至0.8左右时，取菌液加入终浓度为25％的无菌甘油编号后，置于-80℃低温冰箱保藏备用。
LB液体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，用无菌水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将含有突变脂肪酶基因的工程菌在平板活化后，挑选单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，按2％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，降温至30℃，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，诱导培养16h，培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。
将菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mL pH8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到含重组脂肪酶的粗酶液，对粗酶液的酶活进行检测。
酶活检测方法：
脂肪酶酶活定义：65℃，pH7.5条件下，1mL反应体系内，1min内催化水解乙酸对硝基苯酯(PNPA)产生1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。
取980μl 50mM磷酸盐缓冲液加入到比色皿中，并加入10μl PNPA底物(10mM)，OD400处校正归零；加10μl稀释过脂肪酶酶液至比色皿中，充分混匀；在波长400nm处记录吸光值的变化，记录1min的反应动力学过程；每0.2min读取OD400值，记录数据，制作时间与AOD400吸光值的变化曲线，取反应动力学斜率，计算酶活。
检测结果表明，野生型酶活为42U/mL，突变体中有4株突变体酶活达到了野生型的3倍以上，有6株突变体的酶活达到了野生型的2倍-3倍，另外有13株突变体的酶活与野生型相比高出了50％-100％，其余突变体酶活较低，部分突变体没有显示出酶活。部分酶活较高的突变体酶活检测结果如表2所示。
表1酶活检测
注：“+”表示突变体酶活是野生型酶活的1-2倍；“++”表示突变体酶活是野生型酶活的2-3倍；“+++”表示突变体酶活是野生型酶活的3-4倍；“++++”表示突变体酶活是野生型酶活的4倍以上。
对筛选出的10株具有较高酶活的耐高温脂肪酶突变体进行DNA测序，确定其氨基酸序列的突变信息，突变位点结果如下表所示：
表2各突变体的突变信息
突变体 突变位点
突变体1 N201L、F293E、V298K
突变体3 T212A、V298G
突变体4 L338G
突变体5 A207V、L211Q
突变体11 F293T、A343G
突变体12 D332T
突变体14 R353F
突变体18 G255Q
突变体19 L211V、F293D
突变体22 A345P
实施例2高温条件下降解纸浆中胶黏物
对野生型菌株和突变型菌株进行高密度发酵，将1L发酵液离心，收集菌体；菌体用20mM磷酸钠缓冲液(pH5.5)重悬。用高压均质机破碎(压力800-1000bar)后4000rpm离心收集上清液。将清液用超滤膜浓缩10倍，获得脂肪酶酶液待用。
取废纸浆，配成浆浓为2％的浆液，加入野生型脂肪酶和突变体脂肪酶(添加量为300g酶液/吨绝干浆)，在65℃下搅拌反应120min，然后采用GB/T21557-2008(废纸中胶粘物的测定)的方法，检测胶黏物的去除效果，其中胶黏物去除率＝(1-实验组胶黏物含量/空白对照组胶黏物含量)×100％。
胶黏物的去除效果如下表所示：
表2各突变体的突变信息
实验结果表明，与野生型相比，本发明获得耐高温脂肪酶突变体在高温条件下具有更好的胶黏物去除效果，因此本发明的耐高温脂肪酶突变体更适合在具有热分散系统(纸浆温度通常在65℃以上)的纸机中应用，以分解去除纸机中的胶黏物。效果最好的突变体11其胶黏物去除率达到了野生型的3倍多，在实际使用过程中，配合其它具有去除胶黏物效果的生物酶，比如角质酶，胶黏物去除效果会更好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 苏州埃斯腾特生物科技有限公司
<120> 去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂
<130> 000000
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 364
<212> PRT
<213> 葡糖伯克霍尔德菌PG1(Burkholderia glumae PG1)
<400> 1
Met Ala Arg Ser Met Arg Ser Arg Val Val Ala Gly Ala Val Ala Cys
1 5 10 15
Ala Met Ser Val Ala Pro Phe Ala Gly Met Thr Ala Ala Met Thr Leu
20 25 30
Ala Thr Thr His Ala Ala Met Ala Ala Ser Ala Pro Val Asp Asn Tyr
35 40 45
Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly Leu Thr Gly Thr
50 55 60
Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp Tyr Gly Ile Gln Glu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Gln His Gly Ala Thr Val Tyr Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe
85 90 95
Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr
100 105 110
Val Lys Thr Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val
115 120 125
Gly His Ser Gln Gly Gly Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala
130 135 140
Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly
145 150 155 160
Ser Glu Phe Ala Asp Phe Val Gln Gly Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr
165 170 175
Gly Leu Ser Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile
180 185 190
Leu Thr Ser Ser Ser Asn Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu
195 200 205
Lys Thr Leu Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro
210 215 220
Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro Thr
225 230 235 240
Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala Gly Thr
245 250 255
Ala Ile Gln Pro Thr Ile Ser Val Phe Gly Val Thr Gly Ala Thr Asp
260 265 270
Thr Ser Thr Ile Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ser
275 280 285
Thr Leu Ala Leu Phe Gly Thr Gly Thr Val Met Ile Asn Arg Gly Ser
290 295 300
Gly Gln Asn Asp Gly Val Val Ser Lys Cys Ser Ala Leu Tyr Gly Gln
305 310 315 320
Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn His Leu Asp Glu Ile Asn Gln
325 330 335
Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Asn Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile
340 345 350
Arg Thr His Ala Asn Arg Leu Lys Leu Ala Gly Val
355 360
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Ala Arg Ser Met Arg Ser Arg Val Val Ala Gly Ala Val Ala Cys
1 5 10 15
Ala Met Ser Val Ala Pro Phe Ala Gly Met Thr Ala Ala Met Thr Leu
20 25 30
Ala Thr Thr His Ala Ala Met Ala Ala Ser Ala Pro Val Asp Asn Tyr
35 40 45
Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly Leu Thr Gly Thr
50 55 60
Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp Tyr Gly Ile Gln Glu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Gln His Gly Ala Thr Val Tyr Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe
85 90 95
Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr
100 105 110
Val Lys Thr Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val
115 120 125
Gly His Ser Gln Gly Gly Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala
130 135 140
Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly
145 150 155 160
Ser Glu Phe Ala Asp Phe Val Gln Gly Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr
165 170 175
Gly Leu Ser Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile
180 185 190
Leu Thr Ser Ser Ser Asn Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu
195 200 205
Lys Thr Leu Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro
210 215 220
Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro Thr
225 230 235 240
Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala Gly Thr
245 250 255
Ala Ile Gln Pro Thr Ile Ser Val Phe Gly Val Thr Gly Ala Thr Asp
260 265 270
Thr Ser Thr Ile Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ser
275 280 285
Thr Leu Ala Leu Thr Gly Thr Gly Thr Val Met Ile Asn Arg Gly Ser
290 295 300
Gly Gln Asn Asp Gly Val Val Ser Lys Cys Ser Ala Leu Tyr Gly Gln
305 310 315 320
Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn His Leu Asp Glu Ile Asn Gln
325 330 335
Leu Leu Gly Val Arg Gly Gly Asn Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile
340 345 350
Arg Thr His Ala Asn Arg Leu Lys Leu Ala Gly Val
355 360

Claims (10)

1.一种用于去除纸浆中胶粘物的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含耐高温脂肪酶，所述耐高温脂肪酶选自下组：
(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽的第293位为T、第343位为G；
(C)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽，并且所述衍生多肽的第293位为T、第343位为G；
其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:2的编号。
2.如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂为液体酶制剂。
3.如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述耐高温脂肪酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.:2所示。
4.如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂的使用温度为45℃-75℃。
5.如权利要求4所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂的使用温度为为60℃-70℃；更优选地为62℃-68℃。
6.如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂的使用pH为6-9；优选地pH为7-8。
7.如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂的用量为50-300克酶制剂/吨绝干浆。
8.如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂中还包括角质酶。
9.如权利要求1所述的酶制剂的用途，其特征在于，用于降低废纸纸浆中的胶黏物含量。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述废纸纸浆为箱板纸废纸纸浆。
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