CN108707574B - 一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用 - Google Patents

一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2‑km‑Papra‑lipAB，采用Red/ET直接克隆技术将B.glumae PG1基因组中的脂肪酶操纵子lipAB直接克隆至载体p15A‑cm上，通过亚克隆技术替换克隆载体上的复制子和选择性标记基因，并将lipA基因的ATG前面200bp的序列替换为apra+rbs(921bp)，使脂肪酶操纵子lipAB位于Papra的调控下，最终获得脂肪酶表达载体pRK2‑km‑Papra‑lipAB；将脂肪酶表达载体转化入B.glumae PG1中得到。其对脂肪酶底物三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯显示出较高的水解能力。

Description

一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一株产脂肪酶工程菌，具体涉及一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用。 属于生物技术领域。
背景技术
荚壳伯克氏菌Burholderia glumae(原名为Pseudomonas glumae)为革兰氏阴性菌，属于β- 变形杆菌亚门内的伯克氏菌属，是温和的水稻病原菌，是富有运动性、好氧性、棒状的土 壤细菌，它产生的毒黄素能减弱水稻幼苗根和叶的生长，能感染水稻穗从而引起穗枯病， 导致水稻减产。Burholderia glumae PG1它是重要的脂肪酶生产菌，分泌的脂肪酶能真正应 用于工业生产，它产生的脂肪酶属于I.2家族的α/β水解酶，它的活性催化三联体是由 Ser-Asp-His氨基酸残基构成。B.glumae PG1脂肪酶操纵子lipAB(GenBankaccession number: AJK49931.1and AJK49932.1))，全长2138bp，编码711个氨基酸残基。胞外脂肪酶LipA 是通过II型分泌系统分泌至培养基质中，LipB是脂肪酶特异性折叠酶，lipA与lipB基因同 编码在lipAB操纵子中，成熟的LipA由319个氨基酸组成，大小为33.1kDa，LipB由353 个氨基酸组成，大小为36.8kDa。B.glumae PG1脂肪酶LipA分泌至培养基质的过程具体如 下：首先，lipA经转录翻译后，脂肪酶LipA前体的N端含有由39个氨基酸残基组成的N 端信号肽序列，细胞内膜上的多亚基复合体Sec机制识别N端信号肽，将脂肪酶LipA前体 从细胞质转运到周质空间，之后蛋白酶将N端信号肽切除下来，无活性的脂肪酶LipA前体 在LipB以及二硫键形成蛋白Dsb的作用下装配、折叠成成熟的有活性的LipA。然后，在 周质空间中，GSP蛋白识别脂肪酶LipA，被外膜上的GSP分泌素定向运至胞外，LipA从 而被释放至培养基质中，其中GSP由一组复杂的蛋白组成，由至少12个分泌蛋白组成。
近年来发展的基于大肠杆菌的Red/ET同源重组技术，它是指在E.coli中通过诱导来源 于λ噬菌体的α、β蛋白表达从而介导同源重组的Red重组系统，以及通过诱导来源于Rac 噬菌体的RecE、RecT蛋白表达从而介导同源重组的ET重组系统。在Red/ET重组的介导下，通过两端带有同源臂的线性载体可以从基因组DNA中将大片段的基因簇直接克隆下来。直接克隆(direct cloning)的步骤为：首先，制备含有质粒的复制起点(ori)，选择性标记基因(sm)，两端带有相关同源臂的线性载体片段，同时，用合适的核酸内切酶对基因 组DNA进行酶切，然后，将线性载体片段和酶切消化过的基因组转化到诱导表达了 RecE/RecT重组酶的E.coli细胞中，带同源臂的线性载体与基因组片段上的目的DNA发生 同源重组，从而在E.coli细胞中形成能自主复制的质粒，最后通过抗性筛选获得带有目的 DNA的重组质粒。
发明内容
本发明的目的为构建一株新的脂肪酶同源表达菌株，对脂肪酶底物三丁酸甘油酯和对 硝基苯酚棕榈酸酯显示出较高的水解能力。
本发明提供一株Papra启动子型的脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB。采 用Red/ET直接克隆技术将B.glumae PG1基因组中的脂肪酶操纵子lipAB直接克隆至载体 p15A-cm上，获得带脂肪酶操纵子lipAB的克隆载体p15A-cm-lipAB；通过亚克隆技术替换 克隆载体上的复制子和选择性标记基因，获得脂肪酶表达载体pRK2-km-lipAB；再通过 Red/ET DNA同源重组技术将lipA基因的起始密码子ATG前面200bp的序列替换为apra+rbs(921bp)，使脂肪酶操纵子lipAB位于增强型启动子Papra的调控下，获得脂肪酶表达 载体pRK2-km-Papra-lipAB；通过常温电转化的方法将构建的这个脂肪酶表达载体转入B. glumae PG1中，获得脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB。
分类命名：Burkholderia glumae；荚壳伯克氏菌Burholderia glumae PG1，突变菌株 PG1/pRK2-km-Papra-lipAB，其保藏编号分别为CGMCC NO.14100(保藏单位：中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年5月5日)。
工程菌PG1/pRK2-km-Papra–lipAB主要生物学特征如下：在LB培养基上，30℃培养8h 后产生单菌落，菌落黄色、圆形、中央凸起、表面光滑。细菌为需氧型的革兰氏阴性菌，菌体细胞为直杆状。
本发明还提供一株Papra启动子型的脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的 构建方法，包括以下步骤：
1)利用Red/ET直接克隆技术对B.glumae PG1基因组上的脂肪酶操纵子lipAB进行直 接克隆，构建了载体p15A-cm-lipAB；
2)利用Red/ET同源重组技术对含有lipAB操纵子的克隆载体p15A-cm-lipAB进行亚 克隆，构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB；
3)利用Red/ET同源重组技术将脂肪酶操纵子lipAB的原始启动子PlipAB替换为增强型 启动子Papra，构建并筛选出重组载体GB05-dir/pRK2-km-Papra-lipAB；
4)常温条件下，利用电穿孔法将来源于大肠杆菌GB05-dir中的质粒 pRK2-km-Papra-lipAB转化至B.glumae PG1中，筛选出PG1/pRK2-km-Papra-lipAB工程菌。
优选的，步骤1)所述构建克隆载体p15A-cm-lipAB的具体方法为：
a)制备线性化的B.glumae PG1基因组DNA：用限制性内切酶EcoR V和EcoR I对PG1的基因组DNA进行双酶切，对含有lipAB操纵子的DNA片段在跑胶验证后进行沉淀回收；
b)制备p15A-cm线性载体片段：以p15A-cm-tetO-hyg为模板，PG1-lipase-A/S为引物， 通过PCR扩增1866bp大小的线性载体p15A-cm，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行沉淀回收；
所述引物的核苷酸序列为：
PG1-lipase-A：
tcgacatgacacggcgcgagacgtattgcggcgcagcgcgAAGGCCGCGCTGTCGGTGAACGCTCTCTACTA，如SEQ ID NO.1所示；
PG1-lipase-S：
gtatccgcaggtggccgatatcgtctggcggatggcgctgTGCGGGGCGGTGAGACGTTGATCGGCACGTA，如SEQ ID NO.2所示；
其中小写字母为同源臂，下同)，
c)Red/ET DNA线性—线性同源重组(Linear-linear homologousrecombination,LLHR)： 平板上挑选GB05-dir单菌落到1mL LB培养基中，于30℃、900rpm过夜培养；取40μl过 夜菌于1.3mL LB中(OD600约为0.4)，于30℃、900rpm培养1.5h后加入20μl10％阿拉伯 糖溶液，于37℃、900rpm诱导培养40min(OD600约为0.4)；室温9000rpm离心60s，倒 去上清，用1mL ddH2O重新悬浮菌体，第二次室温9500rpm离心60s，倒去上清，用1mLddH2O重新悬浮菌体，第三次室温10000rpm离心60s，倒去上清(约留20～30μL ddH2O)。 向上述菌体中分别加入线性化的PG1基因组DNA(2μg)和p15A-cm线性载体片段(1μg)， 用枪头打匀加入到1mm电转杯中，在1250V电击后，立刻向电转杯中加入850μL LB培养 基洗出电击物并转移至1.5mL打孔灭菌的Ep管中，于30℃、900rpm复苏1h。室温9000rpm 离心30s，倒去上清(约留20～30μl液体)，用枪头打匀后涂于LB平板(含cm 15μg/mL)， 置于37℃过夜培养；
d)克隆载体p15A-cm-lipAB的鉴定：对LB平板(含cm 15μg/mL)上长出的单克隆随机挑取进行质粒提取，并对酶切验证正确的单克隆进行分管冻存。
优选的，步骤2)所述构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB的具体方法为：
a)制备线性化载体pRK2-kan:
以pRK2-kan-apra为模板，以RK2-kan-A/S为引物通过PCR扩增3194bp的线性载体
pRK2-km，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行切胶回收；
所述引物的核苷酸序列为：
RK2-km-A：atgctgcggcgcgcaagcgggcgcgatcgatccggtgaatCACTGAGCGTCTAGCGTTTG，
如SEQ ID NO.3所示；
RK2-km-S：gccgcgagcgagcaagaatcacgacgctctgcaacaatgcGCTCGCCAGTCGATTGGCTGA，
如SEQ ID NO.4所示；
b)制备线性化载体p15A-cm-lipAB：提取质粒p15A-cm-lipAB，并以EcoR V对质粒进 行单酶切和跑胶验证，对大小约为4.9kb的酶切条带进行切胶回收；
c)Red/ET同源重组:将制备的pRK2-km线性载体片段(1μg)和线性化的p15A-cm-lipAB 片段(2μg)进行线性片段重组，37℃、900rpm复苏1h，涂于LB平板(含kan 10μg/mL)37℃ 过夜培养；
d)表达载体pRK2-km-lipAB的鉴定：随机挑取LB平板(含kan 10μg/mL)上长出的单克隆进行质粒提取，并对酶切验证正确的单克隆进行分管冻存。
优选的，步骤3)所示构建并筛选出重组载体GB05 dir/pRK2-km-Papra-lipAB的具体方 法为：
a)制备线性化片段Papra：以载体p15A-cm-apra为模板，以Papra-A/S为引物，通过PCR扩增1011bp的线性片段Papra，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行切胶回收；
所述引物的核苷酸序列如下所示：
Papra-A：ccgccctcgccgccaccctggaacgcatcgatctgaccatAATCTGTACCTCCTTAAGTCAG，如
SEQ ID NO.5所示；
Papra-S：gatcgcgcccgcttgcgcgccgcagcatccgcgccgtcatACGCTCAGTGGAACGAGGTT；如
SEQ ID NO.6所示；
b)制备线性化载体pRK2-km-lipAB：提取质粒pRK2-km-lipAB，并以BamH I对质粒进行单酶切和跑胶验证，对大小约为5.7kb的酶切条带进行切胶回收；
c)LLHR:将制备的pRK2-km-lipAB线性载体片段(1μg)和线性片段Papra(2μg)进行LLHR，37℃、900rpm复苏1h，涂于LB平板(含km 10μg/mL和apra 15μg/mL)30℃过 夜培养；
d)表达载体pRK2-km-Papra-lipAB的鉴定，随机挑取LB平板(含km 10μg/mL和apra15μg/mL)上长出的单克隆进行质粒提取，并对酶切验证正确的质粒pRK2-km-Papra-lipAB中Papra片段进行PCR扩增，引物为Ppara-F/R；
所述引物的核苷酸序列为：
Ppara-F：AGTGATTCACCGGATCGATC，如SEQ ID NO.7所示；
Ppara-R：TGGAACGCATC GATCTGACC，如SEQ ID NO.8所示。
优选的，步骤4)所述PG1/pRK2-km-Papra-lipAB工程菌的筛选方法为：
a)从平板上挑选单菌落B.glumae PG1到1mL LB培养基中，于30℃、900rpm过夜培养；
b)取40μl过夜菌于1.3mL LB中，于35℃、900rpm培养3.5h(OD600约为0.6)；
c)室温9400rpm离心30s，倒去上清，用1mL ddH2O悬浮菌体；
d)第二次室温9400rpm离心30s，倒去上清，用1mL ddH2O重新悬浮菌体；
d)第三次室温9000rpm离心30s，倒去上清(约留20μL ddH2O)；
e)向上述菌体中分别加入约10μg质粒pRK2-kan-lipAB和pRK2-km-Papra-lipAB，用 枪头打匀加入到1mm电转杯中；
f)在1250V电击后，立刻向电转杯中加入850μL LB培养基洗出电击物并转移至1.5mL 打孔灭菌的Ep管中，于32℃、900rpm复苏2h；
g)室温7000rpm离心30s，倒去上清(约留30～40μL液体)，用枪头打匀后分别涂于含 km 30μg/mL(PG1/pRK2-kan-lipAB)和含km 30μg/mL、apra30μg/mL(PG1/pRK2-kan-Papra -lipAB)的LB平板上，置于30℃培养2d，随机挑取转化子进行酶切验证，并对验证正确 的转化子进行分管冻存。
本发明还提供了上述Papra启动子型的脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB 在水解三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供一株Papra启动子型的脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB，三 丁酸甘油酯平板显示其胞外脂肪酶对三丁酸甘油酯有较好的水解能力，对硝基苯酚法测定 显示，在以0.5％的葡萄糖为碳源的PG培养基培养时，发酵至48h时，其胞外脂肪酶活力 为74.48U/mL，相比PlipAB原始启动子型工程菌PG1/pRK2-km-lipAB的胞外脂肪酶活力有 6.71倍的提高。
本研究选用组成型的启动子Papra替换脂肪酶启动子PlipAB，使脂肪酶操纵子lipAB处于 Papra控制下，相比于诱导型启动子，结构基因lipAB的表达水平能在一定水平上是稳定的， 细胞的不同组织、部位表达水平不存在过大差异。而且，之前对伯克氏菌属脂肪酶同源表 达时，研究者们多选用pBBR1载体作为脂肪酶同源表达载体，少见以pRK2载体作为脂肪 酶的表达载体，本研究中，选用广宿主质粒pRK2作为质粒型同源表达载体，是广宿主载体pRK2在B.glumae PG1中的成功应用。
附图说明
图1a为本发明中通过Red/ET直接克隆技术构建的克隆载体p15A-cm-lipAB的限制性内 切酶BamH I和Xho I的酶切验证图。
图1b为本发明中克隆载体p15A-cm-lipAB在GCK软件中的酶切图。
图2a为本发明中通过亚克隆构建的表达载体pRK2-km-lipAB的限制性内切酶BamHI 和Xho I的酶切验证图。
图2b为本发明中表达载体pRK2-km-lipAB在GCK软件中的酶切图。
图3a为本发明中通过亚克隆技术构建的表达载体pRK2-km-Papra-lipAB的限制性内切酶 BamH I和Sac I的酶切验证图。
图3b为本发明中表达载体pRK2-km-Papra-lipAB在GCK软件中的酶切图。
图4为本发明中表达载体pRK2-km-Papra-lipAB中Papra片段的PCR扩增验证图。
图5a为本发明中产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-lipAB中表达载体pRK2-kan-lipAB的 限制性内切酶Xho I和BamH I的酶切验证图；
图5b为本发明中产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB中表达载体 pRK2-km-Papra-lipAB的限制性内切酶Sac I和BamH I的酶切验证图。
图6为本发明中产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-lipAB和PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构 建流程图。
图7为本发明中产脂肪酶野生型菌株B.glumae PG1、工程菌株PG1/pRK2-km-lipAB和 PG1/pRK2-km-Papra-lipAB在三丁酸甘油酯平板上的脂肪酶酶活比较图。
图8为本发明中产脂肪酶野生型菌株B.glumae PG1、工程菌株PG1/pRK2-km-lipAB和 PG1/pRK2-km-Papra-lipAB在发酵48h后的脂肪酶相对活性比较图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为 了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
大肠杆菌工程菌株GB05-dir/pRK2-kan-lipAB的筛选，具体操作步骤如下：
1)利用Red/ET同源重组技术对B.glumae PG1基因组上的脂肪酶操纵子lipAB进行直 接克隆，构建克隆载体p15A-cm-lipAB，具体步骤为：
a)制备线性化的B.glumae PG1基因组DNA：用限制性内切酶EcoR V和EcoR I对PG1的基因组DNA进行双酶切，对含有lipAB操纵子的DNA片段在跑胶验证后进行沉淀回收；
b)制备p15A-cm线性载体片段：以p15A-cm-tetO-hyg为模板，PG1-lipase-A/S为引物， 通过PCR扩增1866bp大小的线性载体p15A-cm，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行沉淀回收；
所述引物的核苷酸序列为：
PG1-lipase-A：
tcgacatgacacggcgcgagacgtattgcggcgcagcgcgAAGGCCGCGCTGTCGGTGAACGCTCTCTACTA，如SEQ ID NO.1所示；
PG1-lipase-S：
gtatccgcaggtggccgatatcgtctggcggatggcgctgTGCGGGGCGGTGAGACGTTGATCGGCACGTA，如SEQ ID NO.2所示；
其中小写字母为同源臂，下同)，
c)LLHR:从平板上挑选GB05-dir单菌落到1mL LB培养基中，于30℃、900rpm过夜培养。取40μl过夜菌于1.3mL LB中(OD600约为0.4)，于30℃、900rpm培养1.5h后加 入20μl10％阿拉伯糖溶液，于37℃、900rpm诱导培养40min(OD600约为0.4)。室温9000rpm 离心60s，倒去上清，用1mL ddH2O重新悬浮菌体，第二次室温9500rpm离心60s，倒去上 清，用1mLddH2O重新悬浮菌体，第三次室温10000rpm离心60s，倒去上清(约留20～30μL ddH2O)。向上述菌体中分别加入线性化的PG1基因组DNA(2μg)和p15A-cm线性载体片 段(1μg)，用枪头打匀加入到1mm电转杯中，在1250V电击后，立刻向电转杯中加入850μL LB培养基洗出电击物并转移至1.5mL打孔灭菌的Ep管中，于30℃、900rpm复苏1h。室 温9000rpm离心30s，倒去上清(约留20～30μl液体)，用枪头打匀后涂于LB平板(含cm 15μg/mL)，置于37℃过夜培养。
d)克隆载体p15A-cm-lipAB的鉴定：对LB平板(含cm 15μg/mL)上长出的单克隆随机挑取进行质粒提取，并对酶切验证正确的单克隆进行分管冻存。
图1显示，M为DL5000的DNA Marker,1号为GB05-dir中质粒p15A-cm-lipAB的BamHI和Xho I酶切产物。
2)利用Red/ET同源重组技术对lipAB操纵子进行亚克隆，构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB，具体步骤如下：
a)制备线性化载体pRK2-kan:以pRK2-kan-apra为模板，以RK2-kan-A/S为引物，通过PCR扩增3194bp的线性载体pRK2-km，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行切胶回收；
所述引物的核苷酸序列为：
RK2-km-A：atgctgcggcgcgcaagcgggcgcgatcgatccggtgaatCACTGAGCGTCTAGCGTTTG，
如SEQ ID NO.3所示；
RK2-km-S：gccgcgagcgagcaagaatcacgacgctctgcaacaatgcGCTCGCCAGTCGATTGGCTGA，
如SEQ ID NO.4所示；
b)制备线性化载体p15A-cm-lipAB：提取质粒p15A-cm-lipAB，并以EcoR V对质粒进 行单酶切和跑胶验证，对大小约为4.9kb的酶切条带进行切胶回收。
c)LLHR:将制备的pRK2-km线性载体片段(1μg)和线性化的p15A-cm-lipAB片段(2μg) 进行LLHR，37℃、900rpm复苏1h，涂于LB平板(含kan 10μg/mL)37℃过夜培养。
d)表达载体pRK2-km-lipAB的鉴定：随机挑取LB平板(含kan 10μg/mL)上长出的单克隆进行质粒提取，并对酶切验证正确的单克隆进行分管冻存。
图2显示，M为DL5000的DNA Marker,1号为GB05-dir中pRK2-km-lipAB的BamH I 和Xho I酶切产物。结果显示，酶切条带大小与预期相符，将载体送往测序，测序结果表明 载体pRK2-km-lipAB构建成功。
3)利用Red/ET同源重组技术将脂肪酶操纵子lipAB的启动子PlipAB替换为Papra，构建 重组载体GB05dir/pRK2-km-Papra-lipAB，具体步骤如下：
a)制备线性化片段Papra:以载体p15A-cm-apra为模板，以Papra-A/S为引物，通过PCR扩增1011bp的线性片段Papra，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行切胶回收；
所述引物的核苷酸序列如下所示：
Papra-A：ccgccctcgccgccaccctggaacgcatcgatctgaccatAATCTGTACCTCCTTAAGTCAG，如
SEQ ID NO.5所示；
Papra-S：gatcgcgcccgcttgcgcgccgcagcatccgcgccgtcatACGCTCAGTGGAACGAGGTT；如
SEQ ID NO.6所示；
b)制备线性化载体pRK2-km-lipAB：提取质粒pRK2-km-lipAB，并以BamH I对质粒进行单酶切和跑胶验证，对大小约为5.7kb的酶切条带进行切胶回收。
c)LLHR:将制备的pRK2-km-lipAB线性载体片段(1μg)和线性片段Papra(2μg)进行LLHR，37℃、900rpm复苏1h，涂于LB平板(含km 10μg/mL和apra 15μg/mL)30℃过夜 培养。
d)表达载体pRK2-km-Papra-lipAB的鉴定，随机挑取LB平板(含km 10μg/mL和apra15μg/mL)上长出的单克隆进行质粒提取，并对酶切验证正确的质粒pRK2-km-Papra-lipAB中Papra片段进行PCR扩增，引物为Ppara-F/R；
所述引物的核苷酸序列为：
Ppara-F：AGTGATTCACCGGATCGATC，如SEQ ID NO.7所示；
Ppara-R：TGGAACGCATC GATCTGACC，如SEQ ID NO.8所示。
图3显示，M为DL5000的DNA Marker,1号为GB05-dir中pRK2-km-Papra-lipAB的BamHI和Sac I的酶切产物。结果显示，酶切条带大小与预期相符。
图4显示，M为DL5000的DNA Marker,1，2号为质粒pRK2-km-Papra-lipAB中Papra片段的扩增产物。结果显示，扩增条带大小与预期相符，质粒pRK2-km-Papra-lipAB构建成 功。
实施例2
荚壳伯克氏工程菌PG1/pRK2-km-lipAB和PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的筛选，具体操作 步骤如下：
1)利用电穿孔法将来源于大肠杆菌GB05-dir中的质粒pRK2-kan-lipAB和 pRK2-km-Papra-lipAB分别转化至B.glumae PG1中，具体操作如下：
a)从平板上挑选单菌落B.glumae PG1到1mL LB培养基中，于30℃、900rpm过夜培养；
b)取40μl过夜菌于1.3mL LB中，于35℃、900rpm培养3.5h(OD600约为0.6)；
c)室温9400rpm离心30s，倒去上清，用1mL ddH2O悬浮菌体；
d)第二次室温9400rpm离心30s，倒去上清，用1mL ddH2O重新悬浮菌体；
d)第三次室温9000rpm离心30s，倒去上清(约留20μL ddH2O)；
e)向上述菌体中分别加入约10μg质粒pRK2-kan-lipAB和pRK2-km-Papra-lipAB，用枪 头打匀加入到1mm电转杯中；
f)在1250V电击后，立刻向电转杯中加入850μL LB培养基洗出电击物并转移至1.5mL 打孔灭菌的Ep管中，于32℃、900rpm复苏2h；
g)室温7000rpm离心30s，倒去上清(约留30～40μL液体)，用枪头打匀后分别涂于含 km 30μg/mL(PG1/pRK2-kan-lipAB)和含km 30μg/mL、apra30μg/mL (PG1/pRK2-kan-Papra-lipAB)的LB平板上，置于30℃培养2d，随机挑取转化子进行酶切 验证，并对验证正确的转化子进行分管冻存。
图5.a显示，M为DL5000的DNA Marker，1,2号为B.glumae PG1中质粒pRK2-km-lipAB 的BamH I和Xho I双酶切产物。结果显示，酶切条带大小与预期相符，工程菌 PG1/pRK2-km-lipAB构建成功。
图5.b显示，M为DL5000的DNA Marker，1号为B.glumae PG1中质粒 pRK2-km-Papra-lipAB的BamH I和Sac I双酶切产物。结果显示，酶切条带大小与预期相符， 工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB构建成功。
实施例3
本发明得到的几种荚壳伯克氏菌PG1的相关信息，如表1所示：
表1本发明得到的几种荚壳伯克氏菌PG1的相关信息
实施例4
本发明中伯克氏工程菌株PG1/pRK2-km-lipAB和PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的胞外脂肪 酶酶活检测，具体操作步骤如下：
1)利用三丁酸甘油酯平板法定性检测伯克氏工程菌株PG1/pRK2-km-lipAB和PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的胞外脂肪酶酶活，具体操作如下：
a)从平板上分别挑取单菌落PG1/pRK2-km-lipAB和PG1/pRK2-km-Papra-lipAB于装有 1mL PG(PG1/pRK2-km-lipAB为含km 30μg/mL，PG1/pRK2-km-Papra-lipAB为含km 30μg/mL、apra 30μg/mL)培养基的1.5mL扎孔的Ep管中，于30℃、900rpm过夜培养；
b)按1％接种量，将上述菌液接种于装有50mL含0.5％葡萄糖的PG培养基中((NH4)25O46g/L，KH2PO43.5g/L，K2HPO43.5g/L，CaCl20.02g/L，MgSO4.7H20g/L，yeastextract 2g/L，调PH至6.5)，于30℃、200rpm培养48h。
c)分别取24h，48h的发酵液于4℃、10000rpm离心10min，收集上清液作胞外样品。
d)制备三丁酸甘油酯平板(三丁酸甘油酯乳化液10％，琼脂1.2％)，待平板吹干后在平板上打孔(5mm)，向孔内分别加入20uL胞外样品，放入37℃培养箱中孵育72h，观 察平板上透明圈的大小。
图7显示，野生型B.glumae PG1与工程菌PG1/pRK2-km-lipAB、 PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的胞外样品在三丁酸甘油酯平板上均产生透明圈，说明两株工程 菌均有胞外脂肪酶酶活。且工程菌PG1/pRK2-km-lipAB、PG1/pRK2-km-Papra-lipAB和野生 菌PG1的发酵上清在三丁酸甘油酯平板上所产生透明圈有如下特点：野生菌PG1最小， PG1/pRK2-km-lipAB次之，PG1/pRK2-km-Papra-lipAB最大。因此，脂肪酶表达工程菌 PG1/pRK2-km-lipAB、PG1/pRK2-km-Papra-lipAB构建成功，可用于后续试验。
2)利用对硝基苯酚法定量检测荚壳伯克氏工程菌PG1/pRK2-km-lipAB、PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的脂肪酶酶活，具体操作如下：
a)从平板上挑选单菌落PG1/pRK2-km-lipAB、PG1/pRK2-km-Papra-lipAB到装有20mL LB(PG1/pRK2-km-lipAB为含km 30μg/mL，PG1/pRK2-km-Papra-lipAB为含km 30μg/mL、apra 30μg/mL)液体培养基的100mL锥形瓶中，于30℃、200rpm过夜培养；
b)将上述菌液(发酵初始OD600调节至0.033)接种于50mL含0.5％葡萄糖的PG培养基(含相应浓度的抗生素)中，于30℃、200rpm培养。
c)取培养48h的发酵液于4℃、10000rpm离心10min，收集上清保存于-80℃作酶活定 量检测的胞外样品。
d)制作对硝基苯酚的标准曲线
取对硝基苯酚(1mg/mL)先用乙腈稀释浓度至6.6mmol/L。按照表2分别加入不同体积的 对硝基苯酚溶液和50mM的Tris-HCl缓冲液(PH8.0)，然后向每管中加300μL10％三氯乙 酸，摇匀后再加入300μL10％NaCO3溶液，摇匀后每管取200μL样品于酶标仪上测定溶液OD410光密度(每组样品作3个平行)，然后以光密度作横坐标，对硝基苯酚溶液浓度作纵 坐标绘制标准曲线。
表2对硝基苯酚溶液和Tris-HC1缓冲液的加入体积
e)样品检测
检测中每个样品均做3个平行实验，结果取其平均值：
取90mg对硝基苯酚棕榈酸酯溶解于30mL乙睛溶液中，以其作为底物溶液置于-20℃ 备用。取上述底物溶液100μL于900μL 50mM的Tris-HCl缓冲液(PH8.0)中，摇匀后在37℃保温5min，然后向其加入50μL适当稀释的脂肪酶样品(空白对照加入相应体积的灭 活酶液)，在37℃反应5min，反应期间震荡摇匀。反应结束后，立即加入300μL10％三氯 乙酸终止反应，摇匀静置5min后再加入300μL10％Na2CO3溶液，摇匀后每管取200μL样品 于酶标仪上测定溶液OD410光密度。脂肪酶1个酶活单位定义为：在37℃条件下，每分钟 释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
图8为野生型荚壳伯克氏菌PG1和工程菌PG1/pRK2-km-lipAB、 PG1/pRK2-km-Papra-lipAB发酵至48h时的胞外脂肪酶活力检测。结果显示，在发酵至48h 时，野生型PG1(简写为：wt PG1)和工程菌PG1/pRK2-km-lipAB(简写为：PG1/Rl)、 PG1/pRK2-km-Ptet-lipAB(简写为：PG1/Rt)的脂肪酶活力分别为0.37U/mL，11.10U/mL， 19.93U/mL,其中，工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB(简写为：PG1/Ra)的胞外脂肪酶活力 最高，随机挑选6株工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB对其胞外脂肪酶测定，发现PG1/Ra 4# 酶活力最高，是PG1/pRK2-km-lipAB的6.71倍(74.48U/mL比11.10U/mL)，而这两株工 程菌的区别在于表达载体上脂肪酶操纵子的启动子是不同的，在PG1/pRK2-km-Papra-lipAB 的脂肪酶表达载体上，其脂肪酶操纵子位于组成型启动子Papra的调控下，而在PG1/pRK2-km -lipAB的脂肪酶表达载体上，其脂肪酶操纵子是位于脂肪酶原始启动子PlipAB的调控下。虽 然，优化启动子后的工程菌PG1/pRK2-km-Ptet-lipAB相比PG1/pRK2-km-lipAB的脂肪酶活 力也有小幅度提高，但是其脂肪酶活力约为PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的0.27倍(19.93U/mL 比74.48U/mL)。结果表明，以0.5％葡萄糖为碳源的PG培养基培养时，组成型启动子Papra的效率比脂肪酶原始启动子PlipAB及诱导型启动子Ptet的效率都更高。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的 限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的 各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 山东大学苏州研究院，山东大学，德州迈科生物技术有限公司
<120> 一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用
<130> 20180504
<141> 2018-05-15
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 1
tcgacatgac acggcgcgag acgtattgcg gcgcagcgcg aaggccgcgc tgtcggtgaa 60
cgctctctac ta 72
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 2
gtatccgcag gtggccgata tcgtctggcg gatggcgctg tgcggggcgg tgagacgttg 60
atcggcacgt a 71
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 3
atgctgcggc gcgcaagcgg gcgcgatcga tccggtgaat cactgagcgt ctagcgtttg 60
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 4
gccgcgagcg agcaagaatc acgacgctct gcaacaatgc gctcgccagt cgattggctg 60
a 61
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 5
ccgccctcgc cgccaccctg gaacgcatcg atctgaccat aatctgtacc tccttaagtc 60
ag 62
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 6
gatcgcgccc gcttgcgcgc cgcagcatcc gcgccgtcat acgctcagtg gaacgaggtt 60
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 7
agtgattcac cggatcgatc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 8
tggaacgcat cgatctgacc 20

Claims (7)

1.一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB，是以菌种编号为CBS 322.89的B.glumae PG1为宿主菌，通过以下构建方法得到的：
1)利用Red/ET同源重组技术对B.glumae PG1基因组上的脂肪酶操纵子lipAB进行直接克隆，构建克隆载体p15A-cm-lipAB；
该步中所用到的引物的核苷酸序列为：
PG1-lipase-A：
tcgacatgacacggcgcgagacgtattgcggcgcagcgcgAAGGCCGCGCTGTCGGTGAACGCTCTCTACTA，如SEQ ID NO.1所示；
PG1-lipase-S：
gtatccgcaggtggccgatatcgtctggcggatggcgctgTGCGGGGCGGTGAGACGTTGATCGGCACGTA，如SEQ ID NO.2所示；
2)利用Red/ET同源重组技术对lipAB操纵子进行亚克隆，构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB；
该步中所用到的引物的核苷酸序列为：
RK2-km-A：
atgctgcggcgcgcaagcgggcgcgatcgatccggtgaatCACTGAGCGTCTAGCGTTTG，如SEQ IDNO.3所示；
RK2-km-S：
gccgcgagcgagcaagaatcacgacgctctgcaacaatgcGCTCGCCAGTCGATTGGCTGA，如SEQ IDNO.4所示；
3)利用Red/ET同源重组技术将脂肪酶操纵子lipAB的启动子PlipAB替换为Papra，该步中所用到的引物的核苷酸序列为：
Papra-A：
ccgccctcgccgccaccctggaacgcatcgatctgaccatAATCTGTACCTCCTTAAGTCAG，如SEQ IDNO.5所示；
Papra-S：
gatcgcgcccgcttgcgcgccgcagcatccgcgccgtcatACGCTCAGTGGAACGAGGTT；如SEQ IDNO.6所示；
构建并筛选出重组载体GB05 dir/pRK2-km-Papra–lipAB，该步中所用到的引物的核苷酸序列为：
Papra-F：AGTGATTCACCGGATCGATC，如SEQ ID NO.7所示；
Papra-R：TGGAACGCATC GATCTGACC，如SEQ ID NO.8所示；
4)利用电穿孔法将来源于大肠杆菌GB05-dir中的质粒pRK2-km-Papra-lipAB转化至B.glumae PG1中，筛选出PG1/pRK2-km-Papra-lipAB工程菌。
2.权利要求1所述一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用Red/ET同源重组技术对B.glumae PG1基因组上的脂肪酶操纵子lipAB进行直接克隆，构建克隆载体p15A-cm-lipAB；
2)利用Red/ET同源重组技术对lipAB操纵子进行亚克隆，构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB；
3)利用Red/ET同源重组技术将脂肪酶操纵子lipAB的启动子PlipAB替换为Papra，构建并筛选出重组载体GB05 dir/pRK2-km-Papra-lipAB；
4)利用电穿孔法将来源于大肠杆菌GB05-dir中的质粒pRK2-km-Papra-lipAB转化至B.glumae PG1中。
3.根据权利要求2所述的一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，步骤1)所述构建克隆载体p15A-cm-lipAB的具体方法为：
a)制备线性化的B.glumae PG1基因组DNA：用限制性内切酶EcoR V和EcoR I对PG1的基因组DNA进行双酶切，对含有lipAB操纵子的DNA片段在跑胶验证后进行沉淀回收；
b)制备p15A-cm线性载体片段：以p15A-cm-tetO-hyg为模板，PG1-lipase-A/S为引物，通过PCR扩增1866bp大小的线性载体p15A-cm，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行沉淀回收；
所述引物的核苷酸序列为：
PG1-lipase-A：
tcgacatgacacggcgcgagacgtattgcggcgcagcgcgAAGGCCGCGCTGTCGGTGAACGCTCTCTACTA，如SEQ ID NO.1所示；
PG1-lipase-S：
gtatccgcaggtggccgatatcgtctggcggatggcgctgTGCGGGGCGGTGAGACGTTGATCGGCACGTA，如SEQ ID NO.2所示；
c)LLHR:挑选GB05-dir单菌落，分别加入2μg线性化的PG1基因组DNA和p15A-cm线性载体片段1μg，于30℃、900rpm复苏1h；室温9000rpm离心30s，倒去上清，用枪头打匀后涂于LB平板，置于37℃过夜培养；
d)克隆载体p15A-cm-lipAB的鉴定：对LB平板上长出的单克隆随机挑取进行质粒提取，并对酶切验证正确的单克隆进行分管冻存。
4.根据权利要求3所述的一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，步骤2)所述构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB的具体方法为：
a)制备线性化载体pRK2-kan：以pRK2-kan-apra为模板，以RK2-kan-A/S为引物通过PCR扩增3194bp的线性载体pRK2-km，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行切胶回收；
所述引物的核苷酸序列为：
RK2-km-A：
atgctgcggcgcgcaagcgggcgcgatcgatccggtgaatCACTGAGCGTCTAGCGTTTG，如SEQ IDNO.3所示；
RK2-km-S：
gccgcgagcgagcaagaatcacgacgctctgcaacaatgcGCTCGCCAGTCGATTGGCTGA，如SEQ IDNO.4所示；
b)制备线性化载体p15A-cm-lipAB：提取质粒p15A-cm-lipAB，并以EcoRV对质粒进行单酶切和跑胶验证，对大小为4.9kb的酶切条带进行切胶回收；
c)LLHR：将制备的pRK2-km线性载体片段和线性化的p15A-cm-lipAB片段进行LLHR，37℃、900rpm复苏1h，涂于LB平板37℃过夜培养；
d)表达载体pRK2-km-lipAB的鉴定：随机挑取LB平板上长出的单克隆进行质粒提取，并对酶切验证正确的单克隆进行分管冻存。
5.根据权利要求4所述的一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，步骤3)所述构建并筛选出重组载体GB05dir/pRK2-km-Papra-lipAB的具体方法为：
a)制备线性化片段Papra：以载体p15A-cm-apra为模板，以Papra-A/S为引物，通过PCR扩增1011bp的线性片段Papra，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行切胶回收；
所述引物的核苷酸序列如下所示：
Papra-A：
ccgccctcgccgccaccctggaacgcatcgatctgaccatAATCTGTACCTCCTTAAGTCAG，如SEQ IDNO.5所示；
Papra-S：
gatcgcgcccgcttgcgcgccgcagcatccgcgccgtcatACGCTCAGTGGAACGAGGTT；如SEQ IDNO.6所示；
b)制备线性化载体pRK2-km-lipAB：提取质粒pRK2-km-lipAB，并以BamHI对质粒进行单酶切和跑胶验证，对大小为5.7kb的酶切条带进行切胶回收；
c)LLHR：将制备的pRK2-km-lipAB线性载体片段和线性片段Papra进行LLHR，37℃、900rpm复苏1h，涂于LB平板30℃过夜培养；
d)表达载体pRK2-km-Papra-lipAB的鉴定，随机挑取含km10μg/mL和apra15μg/mL的LB平板上长出的单克隆进行质粒提取，并对酶切验证正确的质粒pRK2-km-Papra-lipAB中Papra片段进行PCR扩增，引物为Papra-F/R；
所述引物的核苷酸序列为：
Papra-F：AGTGATTCACCGGATCGATC，如SEQ ID NO.7所示；
Papra-R：TGGAACGCATC GATCTGACC，如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求5所述的一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，步骤4)所述PG1/pRK2-km-Papra-lipAB工程菌的筛选方法为：
a)从平板上挑选单菌落B.glumae PG1到1mL LB培养基中，于30℃、900rpm过夜培养；
b)取40μl过夜菌于1.3mL LB中，于35℃、900rpm培养3.5h；
c)室温9400rpm离心30s，倒去上清，用1mL ddH2O悬浮菌体；
d)第二次室温9400rpm离心30s，倒去上清，用1mL ddH2O重新悬浮菌体；
e)第三次室温9000rpm离心30s，倒去上清；
f)向上述菌体中分别加入10μg质粒pRK2-kan-lipAB和pRK2-km-Papra-lipAB，用枪头打匀加入到1mm电转杯中；
g)在1250V电击后，立刻向电转杯中加入850μL LB培养基洗出电击物并转移至1.5mL打孔灭菌的Ep管中，于32℃、900rpm复苏2h；
h)室温7000rpm离心30s，倒去上清，用枪头打匀后，含质粒PG1/pRK2-kan-lipAB的涂于含km30g/mL的LB平板上，含质粒PG1/pRK2-kan-Papra-lipAB的涂于含km30μg/mL、apra30μg/mL的LB平板上，置于30℃培养2d，随机挑取转化子进行酶切验证，并对验证正确的转化子进行分管冻存。
7.权利要求1所述产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB在水解三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯中的应用。
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