CN104894115A - 一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因提高菌株的外源DNA同源重组概率，使得基因打靶技术在土曲霉中的应用效率得到大幅提高，野生型土曲霉的同源重组效率为10％，而敲除基因ku80基因或lig4后同源重组效率分别提高至94.7％和100％，这可为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供基础支持。

Description

一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
土曲霉是一种重要的丝状真菌，能够产生多种有价值的化合物，包括有机酸、酶类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产，具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展，通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目标产物的生产水平，具有非常重要的意义。
基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研究手段，通常是指含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组发生同源重组，整合至细胞受体基因组中，在特异性靶位点上增加外源DNA片段，或者删除靶位点之间DNA片段的技术。它可以实现基因敲除、目的基因定点过表达、基因替换和启动子替换等多种遗传改造策略。因此，基因打靶技术在功能基因组学以及菌株的基因工程改造研究中发挥着至关重要的作用。在生物体内DNA双链断裂修复的方式有两种，即同源重组途径和非同源末端连接途径(Non-homologous End Joining，NHEJ)。在丝状真菌中，DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径，从而导致外源DNA主要以随机插入方式整合到基因组上，同源重组效率低下，使得基因打靶技术的应用受到了严重制约。有研究显示失活同源重组途径可以提高外源DNA随机插入整合的效率，失活非同源末端连接途径则能显著提高外源DNA以同源重组方式整合到基因组上的概率。
发明内容
为解决土曲霉菌的同源重组能力低导致基因打靶技术在土曲霉遗传改造领域中应用受到限制的技术问题，本发明提供了一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用，该方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA的同源重组概率。
优选地，所述方法是扩增出ku80基因或lig4基因的上游序列U和下游序列D以及筛选标记基因，再通过融合PCR技术将筛选标记基因分别与上游序列U和下游序列D进行融合，获得融合产物A和融合产物B，再分别以融合产物A和融合产物B为模板，扩增出打靶元件A和打靶元件B，再将打靶元件转化到土曲霉原生质体中培养，最后通过筛选获得敲除ku80基因或lig4基因的土曲霉重组菌。
所述打靶元件A和打靶元件B,分别含有一段不完整且部分重叠的筛选标记基因片段，这两个不完整的筛选标记片段于重叠部分发生同源重组可以组合成一个完整的筛选标记基因，
所述出发菌，是土曲霉CICC40205。
优选地，所述方法的步骤如下：
1)以土曲霉的基因组为模板，通过PCR扩增ku80基因或lig4基因的上游序列U和下游序列D，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因ptrA；
2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因ptrA分别与上游序列U和下游序列D融合，获得融合产物A和融合产物B；
3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶元件A和打靶元件B,打靶元件A包括上游序列U和ptrA筛选标记的5’端部分序列，打靶元件B包括ptrA筛选标记的5’端部分序列和下游序列D，打靶元件A的5’端和打靶元件B的3’端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为300-800bp；
4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B转化到土曲霉原生质体中培养，获得转化子；
5)筛选步骤4)中敲除ku80基因或lig4基因的转化子，获得同源重组能力提高的土曲霉重组菌。
更优选地，所述方法的步骤如下：
1)以土曲霉NIH2624的基因组为模板，通过PCR扩增ku80基因的上游序列U-ku80和下游序列D-ku80，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因ptrA；
2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因ptrA分别与上游序列U-ku80和下游序列D-ku80融合，获得融合产物A和融合产物B；
3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B，打靶元件ku80-A包括上游序列U-ku80和ptrA筛选标记的5’端部分序列，打靶元件ku80-B包括ptrA筛选标记的5’端部分序列和下游序列D-ku80，打靶元件ku80-A的3’端和打靶元件ku80-B的5’端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为597bp；
4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B转化到土曲霉原生质体中培养，获得转化子；
5)最后通过吡啶硫胺抗性筛选步骤4)所得转化子，再通过基因组验证获得敲除ku80基因的重组菌At-Δku80。
所述方法中所述扩增，扩增U-ku80的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；扩增D-ku80的引物序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示，扩增筛选标记基因ptrA的引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；扩增打靶元件ku80-A的引物序列如SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.8所示，扩增打靶元件ku80-B的引物序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示。
更优选地，所述方法的步骤如下：
1)以土曲霉NIH2624的基因组为模板，通过PCR扩增lig4基因的上游序列U和下游序列D，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因ptrA；
2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因ptrA分别与上游序列U-lig4和下游序列D-lig4融合，获得融合产物A和融合产物B；
3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶元件lig4-A和打靶元件lig4-B；打靶元件lig4-A包括上游序列U-lig4和ptrA筛选标记的5’端部分序列，打靶元件lig4-B包括ptrA筛选标记的5’端部分序列和下游序列D-lig4，打靶元件lig4-A的5’端和打靶元件lig4-B的3’端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为597bp；
4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B转化到土曲霉原生质体中培养，获得转化子；
5)最后通过吡啶硫胺抗性筛选步骤4)所得转化子，再通过基因组验证获得敲除lig4基因的重组菌At-Δlig4。
所述方法中所述扩增，扩增U-lig4的引物序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；扩增D-lig4的引物序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示，扩增筛选标记基因ptrA的引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；扩增打靶元件lig4-A的引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.8所示，扩增打靶元件lig4-B的引物序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.9所示。
所述任一方法用于制备土曲霉重组菌以及制备出的土曲霉重组菌都在本发明的保护范围之内。
本发明取得的有益效果：
本发明提供的土曲霉重组菌株，具有外源DNA同源重组概率高的优点，使基因打靶技术的应用效率得到提高，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供基础支持。
野生型土曲霉的同源重组概率只有10％，以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除ku80基因，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌At-Δku80，改造前土曲霉CICC 40205中外源DNA同源重组概率为10％，重组菌At-Δku80中外源DNA同源重组概率提高到94.7％；以土曲霉CICC40205为出发菌，敲除lig4基因，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌At-Δlig4，改造前土曲霉CICC 40205中外源DNA同源重组概率为10％，重组菌At-Δlig4中外源DNA同源重组概率提高到100％。
附图说明
图1为实施例1提供的土曲霉pdc基因敲除原理示意图。
图2为敲除土曲霉CICC40205菌株pdc基因所得转化子的基因组PCR验证；
(图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA)，C是CICC40205野生型菌株作为对照，1-20为所获得转化子)。
图3为敲除ku80基因的打靶元件及其发生同源重组敲除ku80基因的示意图；
(F1是引物Uku80-F，F2是引物Cku80-F，F3是引物PtrA-F，F4是引物ptrA-F171，R1是引物Dku80-R，R2是引物Cku80-R，R3是引物ptrA-R，R4是引物ptrA-R744，F5是引物ku80-probe-F，R5是引物ku80-probe-R)。
图4为敲除ku80基因所获转化子的基因组PCR验证结果图；
(图A为引物ptrA-F/ptrA-R(F3/R3)验证结果，图B为引物Uku80-F/ptrA-R(F1/R3)验证结果；图C为引物ptrA-F/Dku80-R(F3/R1)验证结果，图D为引物ku80-probe-F/ku80-probe-R(F5/R5)验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA),C是CICC40205野生型菌株作为对照，1-4为所获得转化子)。
图5为敲除lig4基因的打靶元件及其发生同源重组敲除lig4基因的示意图。
图6为敲除lig4基因工程菌株的基因组PCR验证结果；图A为引物ptrA-F/ptrA-R验证结果；图B为引物Ulig4-F/ptrA-R验证结果；图C为引物ptrA-F/Dlig4-R验证结果；图D为引物lig4-F/lig4-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA),C是CICC40205野生型菌株作为对照，Δlig4为敲除了lig4的转化子At-Δlig4；
图7为在工程菌株At-Δku80中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结果；
(其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA)，C是工程菌株At-Δku80作为对照，1-19为所获得转化子)。
图8为在工程菌株At-Δlig4中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结果；
(其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为DL2000 DNA Marker(TAKARA)，C是工程菌株At-Δlig4作为对照，1-19为所获得转化子)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01),DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01),凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。
CD平板的组成为：3g/L NaNO3，2g/L KCl，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L FeSO4·7H2O，10g/L葡萄糖。
IPM液体培养基：60g/L葡萄糖，2g L-1NH4NO3，20mg L-1NH4HPO4，20mg L-1FeSO4·7H2O，0.4g L-1MgSO4·7H2O，4.4mg L-1ZnSO4，0.5g/L玉米浆，pH 3.5。
实施例1分析土曲霉CICC40205野生型菌株中外源DNA同源重组整合概率
1.1构建土曲霉丙酮酸脱羧酶基因pdc(ATET_04633)打靶元件
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Updc-F(5’-agagggtggtatcattccgttg-3’)、Updc-R(5’-ctttacgcttgcgatcccgaacccctgagtgagaaggaacatg-3’)、Dpdc-F(5’-cctgggttcgcaaagataattgatccgaaacaacctcaacccg-3’)、Dpdc-R(5’-cgaggtgtgcgcaacaggcatgaatg-3’)，以土曲霉菌株CICC 40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,Catalog No.:EP0501)进行PCR扩增，用引物Updc-F/Updc-R可以扩增获得大小约为1.9kb的pdc基因的上游序列U-pdc，用引物Dpdc-F/Dpdc-R可以扩增获得大小为2.1kb的pdc基因下游序列D-pdc。以pSGF957为模板，用引物hph-F(5’-TTCGGGATCGCAAGCGTAAAG-3’)和hph-R(5’-CAATTATCTTTGCGAACCCAGG-3’)进行PCR扩增，获得大小约为2.2kb的潮霉素抗性筛选标记hph。将所有PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-pdc片段、D-pdc片段和hph片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以Cpdc-F(5’-tcgcttccaacaacactcattcc-3’)和Cpdc-R(5’-tgtcgttggccgtccatcctag-3’)作为引物扩增获得大小约为6.1kb的pdc基因打靶元件pdc-KO片段(如图1，其中hph是筛选标记潮霉素抗性基因，pdc为待敲除基因，Up是上游同源臂U-pdc，Down是下游同源臂D-pdc；箭头为引物设计位点)。
1.2原生质体制备
将土曲霉CICC 40205的孢子接种至50mL液体IPM培养基中，使孢子浓度约为107个/mL，在200rmp、32℃培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO4溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取1g菌丝，加入10ml酶解液，在30℃、60rpm处理1-3h。酶解液成分为：0.8％纤维素酶(Sigma，Catalog No.：C1184)、0.8％裂解酶(Sigma，Catalog NO.：L1412)、0.4％蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO4，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。将上述酶解后的混合液先用8层擦镜纸过滤，收集滤液。4℃下4000rpm离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC为1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH 8.0，50mMCaCl2)洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×107个/mL，得到原生质体悬液。
1.3原生质体转化及筛选验证
向150μl上述原生质体悬液中同时加入10μl的pdc-KO(约3μg)，再加入50μlPSTC(PSTC为40％PEG4000，1.2M山梨醇，50mM Tris-HCl-pH8.0，50mM CaCl2)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与15mL上层琼脂(PDB+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDA-SH上(PDA+1.2M山梨醇+100mg/L潮霉素B)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上(PDA+100mg/L潮霉素B)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取20个转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图2中所示引物进行基因组PCR验证。如图2A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标记hph；如图2B、2C所示，只有10#和17#转化子中pdc-LKO元件是通过同源重组方式整合到了pdc基因位点上。如图2D所示，除10#和17#之外的其他转化子都和对照菌株土曲霉CICC40205一样扩增出了1.5kb的pdc基因内部片段，这说明这些转化子的pdc基因未被敲除。由此可知只有10#和17#转化子是外源DNA发生了同源重组，土曲霉CICC40205菌株中外源DNA的同源重组概率为2/20，即10％。由此可知，参照此条件进行基因敲除的成功率为10％。
实施例2构建敲除ku80基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At-Δku80
2.1构建用split-marker方法敲除ku80的打靶元件
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Uku80-F(5’-gtcgtagctcttcttgccatc-3’)、Uku80-R(5’-aatgggatcccgtaatcaattgccctcaatcaccatctcccttatc-3’)、Dku80-F(5’-caagagcggctcatcgtcaccccattccggcctcgatgtggatgc-3’)、Dku80-R(5’-tccacgcggccatcaccgagc-3’)，以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,Catalog No.:EP0501)进行PCR扩增，用引物Uku80-F/Uku80-R可以扩增获得大小约为1.5kb的ku80的上游序列U-ku80，用引物Dku80-F/Dku80-R可以扩增获得大小为1.5kb的ku80的下游序列D-ku80。以质粒pPTR II(TAKARA,Catalog No.:3621)为模板，以ptrA-F(5’-gggcaattgattacgggatc-3’)和ptrA-R(5’-atggggtgacgatgagccgc-3’)作为引物扩增获得大小约为2.0kb的ptrA片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-ku80片段、D-ku80与ptrA片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以Cku80-F(5’-gggtttctagaagtcacatc-3’)和ptrA-R744(5’-atggcccatcgtgaccagtggtac-3’)作为引物扩增获得大小约为3.0kb的ku80打靶元件ku80-A，以Cku80-R(5’-atcaccgaccctacgctgtg-3’)和ptrA-F171(5’-ggtctctcgtgccatgaccagacg-3’)作为引物扩增获得大小约为2.6kb的ku80打靶元件ku80-B，如图3。
2.2原生质体转化
将土曲霉CICC40205的孢子接种至50mL IPM液体培养基中，如实施例1中描述制备原生质体溶液，向150μl上述原生质体悬液中同时加入5μl的ku80-A片段(约2μg)和5μl的ku80-B片段(约1.5μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与15mL上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板CDSP上(CD平板+1.2M山梨醇+0.1mg/L吡啶硫胺)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
2.3转化子的筛选验证
从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板CDP上(CD平板+0.1mg/L吡啶硫胺)，在32℃培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。随机挑取4株转化子于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图3所示引物位点进行了基因组PCR验证。如图4A所示，以F3/R3为引物对进行PCR检测，转化子都扩增出了大小约2kb的ptrA目的条带，而出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明这4个转化子中整合了完整的ptrA筛选标记。如图4B、4C所示，用引物对F1/R3和引物对F3/R1分别进行PCR检测，结果2#、3#转化子都分别扩增出了大小约为3.5kb的目的条带，其他转化子则无条带，这说明2#、3#转化子是打靶元件在ku80位点上发生了同源重组。如图4D所示，用设计在ku80基因内部的引物对ku80-probe-F(5’-gcactctcgaacaggcagtgtc-3’)和ku80-probe-R(5’-atcagtcgtgtcgatgtgaactgc-3’)进行PCR验证，2#、3#转化子未能和野生型菌株WT一样扩增出600bp大小的条带，这说明2#、3#转化子的ku80基因被成功敲除，这说明本发明所用方法进行基因敲除的成功率为50％。将该3#转化子定义为NHEJ途径缺失的土曲霉基因工程菌株At-Δku80。
实施例3构建敲除lig4基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At-Δlig4
3.1构建构建用split-marker方法敲除lig4的打靶元件
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Ulig4-F(5’-cggctattctcacgcagctc-3’)、Ulig4-R(5’-aatgggatcccgtaatcaattgccc atacagggtcatcctcggtc-3’)、Dlig4-F(5’-caagagcggctcatcgtcaccccat AtataatgatagctttgctC-3’)、Dlig4-R(5’-cgtttgactgtcgcgacgtttcg-3’)，以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,Catalog No.:EP0501)进行PCR扩增，用引物Ulig4-F/Ulig4-R可以扩增获得大小约为1.5kb的lig4的上游序列U-lig4，用引物Dlig4-F/Dlig4-R可以扩增获得大小为1.5kb的lig4的下游序列D-lig4，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-lig4片段、D-lig4与ptrA片段(实施例2中所述)进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以Clig4-F(5’-gaggtcacagccgagactgc-3’)和ptrA-R744(5’-atggcccatcgtgaccagtggtac-3’)作为引物扩增获得大小约为3.0kb的lig4打靶元件lig4-A，以Clig4-R(5’-ctttccttggcttcctttcg-3’)和ptrA-F171(5’-ggtctctcgtgccatgaccagacg-3’)作为引物扩增获得大小约为2.6kb的lig4打靶元件lig4-B。
3.2原生质体转化及筛选
如实施例1中所述制备土曲霉CICC40205的原生质体溶液，向150μl该原生质体悬液中同时加入5μl的lig4-A片段(约2μg)和5μl的lig4-B片段(约1.5μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与15mL上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板CDSP上(CD平板+1.2M山梨醇+0.1mg/L吡啶硫胺)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
3.3lig4基因缺失菌株的验证
从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板CDP上(CD平板+0.1mg/L吡啶硫胺)，在32℃培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。提取基因组进行PCR验证后，参照图5(箭头代表引物设计位点)所示引物位点进行了基因组PCR验证，获得lig4被完全敲除的工程菌株At-Δlig4。如图6A所示，以ptrA-F/ptrA-R为引物对进行PCR检测，工程菌株At-Δlig4扩增出了大小约2kb的ptrA目的条带，而作为对照的出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明该菌株中整合了完整的ptrA筛选标记。如图6B、6C所示，用引物对Ulig4-F/ptrA-R和引物对ptrA-F/Dlig4-R分别进行PCR检测，工程菌株At-Δlig4分别扩增出了大小约为3.5kb的目的条带，而作为对照的出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明该菌株是打靶元件在lig4位点上发生了同源重组。如图6D所示，用设计在lig4基因内部的引物对lig4-F(5’-tgcaactccacatgcagtctgac-3’)和lig4-R(5’-cggacacaatcaaggatccacg-3’)进行PCR验证，工程菌株At-Δlig4未能和野生型菌株WT一样扩增出大小约为1.5kb的条带，这说明工程菌株At-Δlig4的lig4基因被成功敲除。
实施例4分析NHEJ途径缺失基因工程菌株中外源DNA同源重组概率
4.1分析ku80缺失菌株At-Δku80中外源DNA同源重组概率
接种上述基因工程菌株At-Δku80的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝培养，参照上述实施例1.2所描述的方法制备原生质体，向150μl原生质体悬液中同时加入10μl打靶元件pdc-KO片段(约3μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂(PDB+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上(PDA平板+1.2M山梨醇+100mg/L潮霉素)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上(PDA平板+100mg/L潮霉素)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图1中所示引物进行基因组PCR验证。如图7A所示19个转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标记hph；如图7B、7C所示,除8#转化子外其他转化子都分别扩增到了大小为4.1kb和4.3kb的条带，这说明这些转化子中pdc-KO元件是通过同源重组方式整合到了pdc基因位点上。如图7D所示,只有8#转化子和对照菌株土曲霉CICC40205一样扩增出了1.5kb的pdc基因内部片段，这说明除8#转化子之外其他18个转化子中pdc基因都被敲除，由此可知只有8#转化子中的外源DNA没有发生同源重组。ku80缺失菌株At-Δku80中外源DNA的同源重组概率为18/19，即94.7％。这说明敲除土曲霉CICC40205的ku80基因使外源DNA的同源重组概率从10％提高到了94.7％。
4.2分析lig4缺失菌株At-Δlig4中外源DNA同源重组概率
接种上述基因工程菌株At-Δlig4的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝培养，参照上述实施例1.2所描述的方法制备原生质体，向150μl原生质体悬液中同时加入10μl打靶元件pdc-KO片段(约3μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂(PDB+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上(PDA+1.2M山梨醇+100mg/L潮霉素B)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上(PDA+100mg/L潮霉素B)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图1中所示引物进行基因组PCR验证。如图8A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标记hph；如图8B、8C所示,所有19个转化子都分别扩增到了大小约为4.1kb和4.3kb的条带，这说明所有转化子中pdc-LKO元件都是通过同源重组方式整合到了pdc基因位点上。如图8D所示,没有转化子和对照菌株土曲霉CICC40205一样扩增出了1.5kb的pdc基因内部片段，这说明19个转化子中pdc基因都被敲除。由此可知19个转化子中的外源DNA都发生了同源重组，lig4缺失菌株At-Δlig4中外源DNA的同源重组概率为19/19，即100％。这说明敲除lig4使土曲霉CICC40205中外源DNA的同源重组概率从10％提高到了100％。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，其特征在于，是以土曲霉(Aspergillusterreus)为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA同源重组概率。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除ku80基因或lig4基因，是扩增出ku80基因或lig4基因的上游序列U和下游序列D，再通过融合PCR技术将筛选标记基因分别与上游序列U和下游序列D进行融合，获得融合产物A和融合产物B，再分别以融合产物A和融合产物B为模板，扩增出打靶元件A和打靶元件B，打靶元件A包括上游序列U和筛选标记的5’端部分序列，打靶元件B包括筛选标记的3’端部分序列和下游序列D，打靶元件A的3’端和打靶元件B的5’端序列有重叠部分，该重叠部分长度为300-800bp，经由重叠部分发生同源重组后可获得完整的筛选标记基因，再将两种打靶元件同时转化到土曲霉原生质体中，最后通过筛选获得敲除ku80基因或lig4基因的土曲霉重组菌。
3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)以土曲霉的基因组为模板，通过PCR扩增ku80基因或lig4基因的上游序列U和下游序列D，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因ptrA；
2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因ptrA分别与上游序列U和下游序列D融合，获得融合产物A和融合产物B；
3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶元件A和打靶元件B，打靶元件A包括上游序列U和ptrA筛选标记的5’端部分序列，打靶元件B包括ptrA筛选标记的3’端部分序列和下游序列D，打靶元件A的3’端和打靶元件B的5’端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为300-800bp；
4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B同时转化到土曲霉原生质体中培养，获得转化子；
5)筛选步骤4)中敲除ku80基因或lig4基因的转化子，获得同源重组能力提高的土曲霉重组菌。
4.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，通过PCR扩增ku80基因的上游序列U-ku80和下游序列D-ku80，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因ptrA；
2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因ptrA分别与上游序列U-ku80和下游序列D-ku80融合，获得融合产物A和融合产物B；
3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B；打靶元件ku80-A包括上游序列U-ku80和ptrA筛选标记的5’端部分序列，打靶元件ku80-B包括ptrA筛选标记的3’端部分序列和下游序列D-ku80，打靶元件ku80-A的3’端和打靶元件ku80-B的5’端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长度597bp；
4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B同时转化到土曲霉原生质体中培养，获得转化子；
5)最后通过吡啶硫胺抗性筛选步骤4)所得转化子，再通过基因组验证获得敲除ku80基因的重组菌At-Δku80。
5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述扩增，扩增U-ku80的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示；扩增D-ku80的引物序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示，扩增筛选标记基因ptrA的引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；扩增打靶元件ku80-A的引物序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示，扩增打靶元件ku80-B的引物序列如SEQ ID NO.9-SEQID NO.10所示。
6.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，通过PCR扩增lig4基因的上游序列U和下游序列D，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因ptrA；
2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因ptrA分别与上游序列U-lig4和下游序列D-lig4融合，获得融合产物A和融合产物B；
3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶元件lig4-A和打靶元件lig4-B；打靶元件lig4-A包括上游序列U-lig4和ptrA筛选标记的5’端部分序列，打靶元件lig4-B包括ptrA筛选标记的5’端部分序列和下游序列D-lig4，打靶元件lig4-A的3’端和打靶元件lig4-B的5’端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为597bp；
4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B同时转化到土曲霉原生质体中培养，获得转化子；
5)最后通过吡啶硫胺抗性筛选步骤4)所得转化子，再通过基因组验证获得敲除lig4基因的重组菌At-Δlig4。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述扩增，扩增U-lig4的引物序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；扩增D-lig4的引物序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示，扩增筛选标记基因ptrA的引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；扩增打靶元件lig4-A的引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.8所示，扩增打靶元件lig4-B的引物序列如SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.9所示。
8.权利要求1-7所述任一方法，其特征在于，用于制备土曲霉重组菌。
9.利用权利要求1-7所述任一方法制备的土曲霉重组菌。
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