CN110541000A - 一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法 - Google Patents

一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，包括如下步骤：(1)构建抗菌肽表达载体；(2)小球藻对G418敏感性筛选；(3)磁性纳米颗粒介导小球藻转化，包括小球藻细胞作为受体预处理、磁性纳米颗粒‑基因构建和小球藻细胞磁转化和转化小球藻筛选继代，转化后获得转基因小球藻。本发明磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法转染速度快，效率高，且操作便捷。

Description

一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法
技术领域
本发明涉及转基因领域，特别是涉及一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法。
背景技术
抗菌肽作为一种自然界生物体来源的短肽类物质，广泛存在于动物体，植物体以及微生物体内。目前已发现上千余种抗菌肽。经过不断深入的研究发现，多种抗菌肽通常具有肽链短小，热稳定性好，等特点。抗菌肽具有与传统抗生素不同的代谢与作用机制，对细菌，真菌，病毒等呈现出广谱的抑菌性能，几乎不产生耐药性。作为当前有望代替抗生素的最具潜力的活性物质，且具有抗生素并未具有的特点，多种抗菌肽的结构，作用机理以及安全性被深入研究应用，并且研究者通过对抗菌肽进行结构预测、分子改造设计等扩充其作用范围。
小球藻作为单细胞真核微藻，是一种重要的微藻资源，具有高营养价值，培养条件简单，光合效率高等多重优点，可作为一种环境友好型生物反应器生产活性物质。随着小球藻转基因技术研究不断深入，通过基因枪法、农杆菌侵染法、电击转化法、PEG介导法等方法，已经出现许多关于成功转化小球藻的报道，研究者们成功将报告基因或具有功能性的外源基因转化小球藻中，实现了表达，但以上方法均存在一定限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法。
一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，包括如下步骤：
(1)构建抗菌肽表达载体；
(2)小球藻对G418敏感性筛选；
(3)磁性纳米颗粒介导小球藻转化，包括小球藻细胞作为受体预处理、磁性纳米颗粒-基因构建、小球藻细胞磁转化和转化小球藻筛选继代，获得转基因小球藻。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，在步骤(1)之前还包括藻种的培养：藻种均经过固体平板划线在温度25℃，光照强度4000Lx、光照周期光/暗＝16h/8h的条件下培养，液体摇瓶以10％的比例接种后在温度25℃，转速140rpm/min的光照摇床中培养，所述藻种为椭圆小球藻。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，步骤(1)具体包括如下步骤：
选择来源于烟芽夜蛾的抗菌肽Heliomicin，前端加上分泌到细胞间隙的Cht1信号肽，对密码子优化，加上5’和3’非翻译区，并加上合适的酶切位点，合成基因序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
由Sal I和Sac I酶切，目的基因连接到pBAC818载体上，构建以35S为启动子，以Nos为终止子的基因表达框，抗菌肽基因的表达框用Hind III和EcoR I酶切后插入到pGreen0029载体上，命名为抗菌肽表达载体pGCP4，将产物转化至大肠杆菌感受态，挑单克隆筛选阳性克隆，酶切验证，保菌于50％甘油，-80℃贮存。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，步骤(2)具体包括如下步骤：
配制G418母液加入小球藻SE+固体培养基中，分别配制G418终浓度为0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的SE+固体培养基，每个浓度梯度设置3个重复；收集在液体培养基中培养至对数生长期的小球藻于离心管，8000rpm，3min离心获得藻体，吸取300μL108浓度藻体均匀涂布于以上培养基，置恒温光照培养箱中培养，观察生长情况。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，步骤(3)中小球藻细胞作为受体预处理具体包括如下步骤：
挑取固体平板上单藻落接种至10mL SE+培养基中，培养7天后，以10％的接种量转接至200ml培养基中，无菌培养至对数生长期。8000rpm，3min条件下离心，弃去培养基；用无菌水在同样条件下清洗藻沉淀3次后，向沉淀中加入25ml细胞酶解液，使藻细胞充分悬浮于酶解液中，140rpm，30℃避光条件下酶解30h后，藻液离心弃上清，用含0.3M甘露醇的0.025MPBS在8000rpm，3min条件下清洗三次，并将藻细胞浓度调整约108～109个/mL，在显微镜下观察小球藻原生质体情况。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，步骤(3)中所述磁性纳米颗粒-基因构建具体包括如下步骤：
将磁性纳米颗粒和浓度1μg/μL的质粒pGCP4按照2:4，2:10，2:20的质量比混合，磁性纳米颗粒质量固定为2μg，吹打混匀，在室温条件下孵育半小时以上，制备磁性纳米颗粒-质粒复合物。所述磁性纳米颗粒polyMAG200为直径为100nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，步骤(3)中所述小球藻细胞磁转化具体包括如下步骤：
在无菌操作台内将24孔板置于磁板上，每孔体系中加入300μL酶解后的小球藻液，不同质量比例的磁性纳米颗粒-质粒复合物，充分混合均匀，磁转染2h，撤去磁场，取150μL混合液涂布于筛选培养基进行培养。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，步骤(3)中所述转化小球藻筛选继代具体包括如下步骤：
转化后的小球藻经G418筛选平板生长2-3周后，固体培养基中生长出藻落，挑取长出的藻落继续在含有G418的筛选培养基中划线继代，并在G418浓度减半的液体培养基中扩大培养，获得转基因小球藻。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，在步骤(3)之后还包括转基因小球藻分子鉴定和转基因小球藻抑菌活性检测；
转基因小球藻分子鉴定中使用了抗菌肽表达载体pGCP4的引物pGCP4HF和pGCP4HR，抗菌肽中间载体CP4引物CP4HF和CP4HR；其中，pGCP4HF的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，pGCP4HR的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，CP4HF的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，CP4HR的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。
本发明所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其中，所述转基因小球藻具有抑制金黄色葡萄球菌生长的能力。
本发明磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法与现有技术不同之处在于：
本发明磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法转染速度快，效率高，且操作便捷。同时磁性纳米基因载体具有目的基因高效稳定表达、安全无害、靶向性高等优点。因此本发明利用直径100nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒作为小球藻与外源基因之间的载体工具，利用磁性纳米颗粒转化技术实现抗菌肽基因在小球藻中的转化与表达。
下面结合附图对本发明的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中小球藻对G418敏感性筛选试验结果图，其中，A：G418浓度0mg/L；B：G418浓度10mg/L；C：G418浓度20mg/L；D:G418浓度30mg/L；E：G418浓度40mg/L；
图2为本发明中抗菌肽表达载体pGCP4结构图；
图3为小球藻原生质体/半原生质体形成情况图；
图4为本发明磁性纳米颗粒转化小球藻阳性克隆筛选继代结果图；
图5为本发明中转基因小球藻PCR扩增鉴定结果；
图6为本发明中转基因小球藻RT-PCR鉴定结果；
图7为本发明中小球藻相同超声波条件下的破碎液；
图8为本发明中转基因小球藻的抑菌能力检测结果图。
具体实施方式
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1藻种与菌种
椭圆小球藻Cholorella Ellipsoidea于中科院水生所淡水藻种库购买并纯化；菌种为大肠杆菌(Escherichia Coli)DH5α菌株。
1.1.2试剂与仪器
磁性纳米颗粒polyMAG200(所述磁性纳米颗粒polyMAG200为直径为100nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒)，磁板购自Chemicell公司，培养基及溶液配制所用试剂购自国药集团，抗生素购自上海百赛生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，纤维素酶，半纤维素，果胶酶购自索莱宝科技有限公司，其他化学纯试剂均为国产分析纯。
1.1.3培养基配制与溶液配制
超级肉汤培养基：32g/L胰化蛋白胨，20g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，5mL 1mol/L氢氧化钠，加水至900mL并高压灭菌，再加入100mL灭菌的0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/LK2HPO4,固体培养基为液体培养基加入1.8％的琼脂。
小球藻固体继代培养基为克氏培养基：每升培养基加入Ca(No3)2 1.0g，K2PHO40.2g，MGSO4·7H2O 0.2g，KCL 0.12g，FeCL3 10mg，酵母提取物(yeast extract)0.1％，葡萄糖0.4％，pH 6.0-8.0，固体培养基为液体培养基加入1.8％的琼脂。
小球藻培养基为SE+培养基：每升培养基加入1mL 2.9mMNaNO3，1mL 0.3mMKH2PO4·3H2O，1mL 0.3mMMgSO4·7H2O，1mL 0.17mL 2.9MmCaCl2·2H2O，1mL 1.2mM KH2PO4，1mL 0.4mMNaCl，1mL 0.09mMFeCl3·6H2O，1mL EDTA-Fe*，1mL A5溶液，5g葡萄糖，1g酵母提取物，pH 7.0，固体培养基为液体培养基加入1.8％的琼脂。
SE+筛选培养基：SE+培养基灭菌后温度降低至40-50℃后加入相应浓度抗生素。
EDTA-Fe*：取4.1mL浓盐酸用蒸馏水稀释至50mL，配制成1N HCl；称取0.9306g溶解至50ml配制成0.1N EDTA-Na2；称取FeCl3·6H2O 0.901g溶于10ml以上步骤已经配制完成的1N HCl中，然后与10ml已经配制完成的0.1N EDTA-Na2混合，加入蒸馏水稀释至1L。
A5溶液：每升溶液中加入2.86g H3BO3，1.86g MnCl2·4H2O，0.22g ZnSO4·7H2O，0.39g Na2MoO4·2H2O，0.08g CuSO4·5H2O，0.05g Co(NO3)·6H2O混匀。
细胞酶解液：纤维素酶2％，果胶酶2％，半纤维素酶2％，0.01M PBS，0.12M甘露醇，0.22μm滤膜无菌过滤，现配现用。
1.2实验方法
藻种均经过固体平板划线在温度25℃，光照强度4000Lx、光照周期光/暗＝16h/8h的条件下培养，液体摇瓶以10％的比例接种后在温度25℃，转速140rpm的光照摇床中培养。
1.2.1构建抗菌肽表达载体
选择来源于烟芽夜蛾的抗菌肽Heliomicin，前端加上分泌到细胞间隙的Cht1信号肽，对密码子优化，加上5’和3’非翻译区，并加上合适的酶切位点，合成基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
合成的基因序列如下：
其他相关序列如下：
Cht1：MRALAVVVVATAFAVVAVRG
Heliomicin：DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECLLRGYKGGHCGSFANVNCWCET
5’UTR(含ATG)
1 aaataacaaa tctcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc
61 tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt
121 ttcaccattt acgaacgata gcaatg3’UTR of TEV(含终止子)
1TGATAGTTTC TGCGTGTCTT TGCTTTCCGC TTTTAAGCTT ATTGTAATAT ATATGAATAG
61CTATTCACAG TGGGACTTGG TCTTGTGTTG AATAGTATCT TATATATTTT AATATGTCTT
121ATTAGTCTCA TTACTTAGGC GAACGACAAA GTGAGGTCAC CTCGGTCTAA TTCTCCTATG
181TAGTGCGAG
由Sal I和Sac I酶切，目的基因连接到pBAC818载体上，构建以35S为启动子，以Nos为终止子的基因表达框。抗菌肽基因的表达框用Hind III和EcoR I酶切后插入到pGreen0029载体上，命名为抗菌肽表达载体pGCP4，将产物转化至大肠杆菌感受态，挑单克隆筛选阳性克隆，酶切验证，保菌于50％甘油，-80℃贮存。
1.2.2小球藻对G418敏感性筛选
配制不同浓度G418母液加入小球藻SE+固体培养基中，分别配制G418终浓度为0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的SE+固体培养基，每个浓度梯度设置3个重复。收集在液体培养基中培养至对数生长期的小球藻于离心管，8000rpm，3min离心获得藻体，吸取300μL108浓度藻体均匀涂布于以上培养基，置恒温光照培养箱中培养，观察生长情况。
1.2.3磁性纳米颗粒介导小球藻转化
(1)小球藻受体细胞的预处理
挑取固体平板上单藻落接种至10mL SE+培养基中，培养7天后，以10％的接种量转接至200ml培养基中，无菌培养至对数生长期。8000rpm，3min条件下离心，弃去培养基。用无菌水在同样条件下清洗藻沉淀3次后，向沉淀中加入25ml细胞酶解液，使藻细胞充分悬浮于酶解液中，140rpm，30℃避光条件下酶解30h后，藻液离心弃上清，用0.025M PBS(含0.3M甘露醇)在8000rpm，3min条件下清洗三次，并将藻细胞浓度调整约108～109个/mL，在显微镜下观察小球藻原生质体情况。
(2)磁性纳米颗粒-质粒复合体的构建
将磁性纳米颗粒和质粒pGCP4(质粒浓度1μg/μL)按照2:4，2:10，2:20的质量比混合，磁性纳米颗粒质量固定为2μg，吹打混匀，在室温条件下孵育半小时以上，制备磁性纳米颗粒-质粒复合物。
(3)小球藻细胞磁转化
在无菌操作台内将24孔板置于磁板上，每孔体系中加入300μL酶解后的小球藻液，不同质量比例的磁性纳米颗粒-质粒复合物，充分混合均匀，磁转染2h。撤去磁场，取150μL混合液涂布于筛选培养基进行培养。
(4)转化小球藻筛选继代
转化后的小球藻经G418筛选平板生长2-3周后，固体培养基中生长出藻落。挑取长出的藻落继续在含有G418的筛选培养基中划线继代，并在G418浓度减半的液体培养基中扩大培养。
1.2.4转基因小球藻分子鉴定
设计抗菌肽表达载体pGCP4的引物，pGCP4HF：5’-AAGACCAAAGGGCTATTGAG-3’，pGCP4HR：5’-TTCGCACCAACAGTTCAC-3’。以野生型小球藻为对照，用CTAB法提取转基因小球藻的基因组DNA，.以pGCP4HF和pGCP4HR为引物进行PCR鉴定。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后取2μL产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测。
设计抗菌肽中间载体CP4引物，CP4HF:5’-CGTGGTAGCAACAGCCTTT-3’，CP4HR:5’-ACCTCACTTTGTCGTTCGC-3’。以野生型小球藻为对照，利用Trizol RNA提取方法提取小球藻RNA，使用DNase对DNA进行消化，反转录cDNA，以cp4HF和cp4HR为引物利用P CR扩增目的基因。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行40个循环后，72℃延伸10min。反应结束后取2μL产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5转基因小球藻抑菌活性检测
(1)转基因小球藻粗蛋白提取
收集至对数生长期的小球藻细胞，用0.025M PBS(含0.3M甘露醇)缓冲液清洗三边后，加入10ml 0.025M PBS(0.3M甘露醇)缓冲液，充分混匀后，在超声波条件：变幅杆Φ6mm，功率比65％，超声5s，间隙8s，共超声工作10min，收集破碎液，冰上放置10-20min，8000rpm离心2min后，收集上清液。
(2)抑菌活性检测
挑取金黄色葡萄球菌于LB培养基，37℃，150rpm培养3-5h，用紫外分光光度计测OD600至1.0左右，取100μL菌液涂布于LB固体平板，待表面菌液晾干消失后，用无菌打孔器在培养基上打孔，孔径为1cm，吸取150μL小球藻破碎上清液加入孔中，以野生型小球藻在相同破碎条件下破碎上清液为对照，至30℃培养箱过夜培养，观察抑菌情况。
2结果分析
2.1小球藻对G418敏感性筛选
不同小球藻生长对抗生素的敏感性不同，本研究中使用椭圆小球藻对G418敏感性较强，如图1所示，在固体培养基中，10mg/L G418含量的培养基，无法抑制生长，20mg/L的培养基中,有零星藻落生长，终浓度含量30mg/L的G418对小球藻生长有明显抑制作用，培养两周后仍无藻落出现，可见G418含量30mg/L即可完全抑制小球藻的生长，可作为转化筛选研究的致死浓度。
2.2抗菌肽植物表达载体构建
基因序列合成后构建以35S为启动子，以Nos为终止子的基因表达模块，抗菌肽基因表达模块经过Hind III和EcoR I酶切后插入到pGreen0029载体上，构建表达载体(图2)。经过酶切得到预期长度的抗菌肽基因表达模块片段,证明含有抗菌肽基因的载体pGCP4构建成功。
2.3磁性纳米颗粒介导小球藻转化
经过酶解液处理的小球藻细胞与磁性纳米颗粒-质粒复合物在磁板上共同反应后，涂布于G418浓度为30mg/L的SE+固体筛选培养基后自然晾干，25℃恒温光照培养箱培养2-3周后，筛选培养基表面长出若干单藻落，未经过转化处理的对照组无藻细胞生长。经过10次以上继代后，转基因藻落依然可以在抗生素筛选压力下稳定生长。图3为小球藻原生质体/半原生质体形成情况，图4为本发明磁性纳米颗粒转化小球藻阳性克隆筛选继代结果图。
2.4转基因小球藻分子鉴定
通过继代得到稳定转基因小球藻后，利用CTAB法提取转基因小球藻和对照小球藻的基因组DNA，并以此为模板，以pGCP4HF/pGCP4HR为引物扩增，水为空白对照，未转化小球藻为阴性对照，转化过程使用质粒为阳性对照，如图5所示，转化子均能扩增出抗菌肽基因，而对照不能扩增出条带，说明目的基因已经插入小球藻中。
利用Trizol RNA提取方法提取小球藻RNA，使用DNase对DNA进行消化，反转录cDNA，以cDNA为模板，设计CP4HF/CP4HR为引物进行扩增，水位空白对照，未转化小球藻为阴性对照，转化过程使用质粒为阳性对照，如图6所示，转化子扩增出目的条带，说明目的基因已经在小球藻内进行整合。
2.5转基因小球藻抑菌活性检测
图7为转基因小球藻与野生型小球藻在相同超声波条件下所得破碎液，即为蛋白粗提液，将粗提液离心，上清液与金黄色葡萄球菌进行拮抗实验后，如图8所示，转基因小球藻粗提液周围出现明显抑菌圈，而野生型小球藻粗提液并未出现抑菌圈。表明抗菌肽基因已经整合进入小球藻并表达，赋予了小球藻抑制病原菌的能力。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 北京农业生物技术研究中心
<120> 一种纳米磁珠法介导的转抗菌肽小球藻的获得方法
<130> 191-905
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgacaaat aacaaatctc aacacaacat atacaaaaca aacgaatctc aagcaatcaa 60
gcattctact tctattgcag caatttaaat catttctttt aaagcaaaag caattttctg 120
aaaattttca ccatttacga acgatagcaa tgagagcact ggccgttgtc gtggtagcaa 180
cagcctttgc tgttgtggcc gtccgtggag ataagttgat tggatcttgt gtgtggggtg 240
cagttaacta tacctccgac tgcaatggag aatgtcttct gagaggttac aaaggaggtc 300
actgcggttc ctttgctaat gtgaactgtt ggtgcgaaac ataatagttt ctgcgtgtct 360
ttgctttccg cttttaagca tattgtaata tatatgaata gctattcaca gtgggacttg 420
gtcttgtgtt gaatagtatc ttatatattt taatatgtct tattagtctc attacttagg 480
cgaacgacaa agtgaggtca cctcggtcta attctcctat gtagtgcgag gagctc 536
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagaccaaag ggctattgag 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcgcaccaa cagttcac 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtggtagca acagccttt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acctcacttt gtcgttcgc 19

Claims (10)

1.一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建抗菌肽表达载体；
(2)小球藻对G418敏感性筛选；
(3)磁性纳米颗粒介导小球藻转化，包括小球藻细胞作为受体预处理、磁性纳米颗粒-基因构建、小球藻细胞磁转化和转化小球藻筛选继代，转化后获得转基因小球藻。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：在步骤(1)之前还包括藻种的培养：藻种均经过固体平板划线在温度25℃，光照强度4000Lx、光照周期光/暗＝16h/8h的条件下培养，液体摇瓶以10％的比例接种后在温度25℃，转速140rpm/min的光照摇床中培养，所述藻种为椭圆小球藻。
3.根据权利要求2所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：步骤(1)具体包括如下步骤：
选择来源于烟芽夜蛾的抗菌肽Heliomicin，前端加上分泌到细胞间隙的Cht1信号肽，对密码子优化，加上5’和3’非翻译区，并加上合适的酶切位点，合成基因序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
由Sal I和Sac I酶切，目的基因连接到pBAC818载体上，构建以35S为启动子，以Nos为终止子的基因表达框，抗菌肽基因的表达框用Hind III和EcoR I酶切后插入到pGreen0029载体上，命名为抗菌肽表达载体pGCP4，将产物转化至大肠杆菌感受态，挑单克隆筛选阳性克隆，酶切验证，保菌于50％甘油，-80℃贮存。
4.根据权利要求3所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：步骤(2)具体包括如下步骤：
配制G418母液加入小球藻SE+固体培养基中，分别配制G418终浓度为0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的SE+固体培养基，每个浓度梯度设置3个重复；收集在液体培养基中培养至对数生长期的小球藻于离心管，8000rpm，3min离心获得藻体，吸取300μL108浓度藻体均匀涂布于以上培养基，置恒温光照培养箱中培养，观察生长情况。
5.根据权利要求4所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：步骤(3)中小球藻细胞作为受体预处理具体包括如下步骤：
挑取固体平板上单藻落接种至10mL SE+培养基中，培养7天后，以10％的接种量转接至200ml培养基中，无菌培养至对数生长期，8000rpm，3min条件下离心，弃去培养基；用无菌水在同样条件下清洗藻沉淀3次后，向沉淀中加入25ml细胞酶解液，使藻细胞充分悬浮于酶解液中，140rpm，30℃避光条件下酶解30h后，藻液离心弃上清，用含0.3M甘露醇的0.025M PBS在8000rpm，3min条件下清洗三次，并将藻细胞浓度调整约108～109个/mL，在显微镜下观察小球藻原生质体情况。
6.根据权利要求5所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：步骤(3)中所述磁性纳米颗粒-基因构建具体包括如下步骤：
将磁性纳米颗粒polyMAG200和浓度1μg/μL的质粒pGCP4按照2:4，2:10，2:20的质量比混合，磁性纳米颗粒质量固定为2μg，吹打混匀，在室温条件下孵育半小时以上，制备磁性纳米颗粒-质粒复合物；
所述磁性纳米颗粒polyMAG200为直径为100m的四氧化三铁磁性纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：步骤(3)中所述小球藻细胞磁转化具体包括如下步骤：
在无菌操作台内将24孔板置于磁板上，每孔体系中加入300μL酶解后的小球藻液，不同质量比例的磁性纳米颗粒-质粒复合物，充分混合均匀，磁转染2h，撤去磁场，取150μL混合液涂布于筛选培养基进行培养。
8.根据权利要求7所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：步骤(3)中所述转化小球藻筛选继代具体包括如下步骤：
转化后的小球藻经G418筛选平板生长2-3周后，固体培养基中生长出藻落，挑取长出的藻落继续在含有G418的筛选培养基中划线继代，并在G418浓度减半的液体培养基中扩大培养，获得转基因小球藻。
9.根据权利要求8所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：在步骤(3)之后还包括转基因小球藻分子鉴定和转基因小球藻抑菌活性检测；
转基因小球藻分子鉴定中使用了抗菌肽表达载体pGCP4的引物pGCP4HF和pGCP4HR，抗菌肽中间载体CP4引物CP4HF和CP4HR；其中，pGCP4HF的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，pGCP4HR的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，CP4HF的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，CP4HR的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。
10.根据权利要求9所述的磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法，其特征在于：所述转基因小球藻具有抑制金黄色葡萄球菌生长的能力。
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