CN110922462B

CN110922462B - 一种人工改造的水稻抗病基因rga5-hma2

Info

Publication number: CN110922462B
Application number: CN201911323142.0A
Authority: CN
Inventors: 刘俊峰; 刘洋; 马梦琪; 郭力维
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN110922462A

Abstract

本发明公开了一种人工改造的水稻抗病基因RGA5‑HMA2。本发明以RGA5基因为基础，将RGA5所编码蛋白质碳末端的重金属(HMA)结构域进行点突变，获得了RGA5基因突变体RGA5‑HMA2。实验表明RGA5‑HMA2所编码的蛋白质能够特异性识别稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib，以解除其对RGA4基因的抑制作用，激活水稻体内的免疫反应，改变了其识别从而使含有该抗病基因的水稻获得了对含有AvrPib效应蛋白的稻瘟菌抗性。本发明对于水稻抗稻瘟病遗传改良及抗病品种选育具有重要意义。

Description

一种人工改造的水稻抗病基因RGA5-HMA2

技术领域

本发明涉及一种人工改造的水稻抗病基因RGA5-HMA2。

背景技术

水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，为全球50％以上人口提供食物来源。但水稻的生产常受到多种病害的威胁，其中由稻瘟病菌引发的水稻稻瘟病是影响水稻产量的最主要病害之一。每年因稻瘟病造成水稻减产量约为总产量的20-30％。植物具有高效的内源免疫系统以抵御各种病原菌侵染，该免疫方式依赖于抗病蛋白特异性识别病原菌分泌的效应蛋白。这种识别往往会引起局部细胞程序性死亡，也称为过敏反应(HR)。通常，含有核酸结合及亮氨酸重复结构域的NB-LRR型抗病蛋白能够特异性识别效应蛋白。NB-LRR家族蛋白所介导的无毒蛋白识别机制是水稻抗稻瘟病的主要方式之一。其中，有些水稻稻瘟病抗性基因在基因组上是以成簇串联的形式存在的。例如，RGA4与RGA5以成对的形式发挥其功能。在正常生长条件下，RGA4编码蛋白具有激活水稻病害抗性及诱导细胞死亡的功能，而RGA5能够抑制RGA4的活性以保证水稻植株正常生长发育。在稻瘟病菌侵染水稻的条件下，稻瘟病菌分泌的无毒蛋白AVR1-CO39或AVR-Pia能够特异性的与RGA5蛋白的重金属(HMA)结构域结合，进而解除RGA5对RGA4的抑制作用，激活水稻免疫反应，表现为抗病。

近年来，利用生物多样性持续控制作物病害，是国内外的研究热点之一。实践表明，应用生物多样性与生态平衡原理，进行农作物遗传多样性、物种多样性的优化布局和种植的相关研究已成为国际农业研究的热点和农作物病害防治的发展趋势。通过物种多样性种植方法增加了农田的物种多样性和农田生态系统的稳定性，减轻了植物病害的危害及因化学农药的施用而造成的环境污染，提高了农产品品质和产量。前期表明通过多个水稻品种田间混种的方法有效地控制了稻瘟病发生，水稻稻瘟病发病率平均控制在5％以下，与净载优质稻相比，对稻瘟病的防效达81.1％-98.6％，减少农药施用量60％以上，抗倒伏率100％，每公顷增产优质稻630-1040Kg。Twng等人发现将杂交水稻品种与传统糯性水稻品种间种能够有效降低稻瘟病发病率，相较于单一品种地块，糯性水稻品种稻瘟病发病率降低约94％。尽管通过不同水稻品种田间混种的方式可以有效防治稻瘟病的发生，但是该策略在农业生产的广泛应用上仍然具有一定的局限性。例如，不同品种混合栽种时，品种的混合比例随生长季的改变而变化，农民在新的生长季需重新进行混种，既费时又费力。另外，不同农艺特性品种水稻混种时，往往会造成收获困难，如早熟品种与晚熟品种混合栽种将使收获期延长，增加人力物力消耗。不同品种混种也不利于田间管理，在调整田间种植密度、施肥、除草等方面存在困难。不同品种混种使得收获的农产品质量良莠不齐，从而影响销售。基于此，如果可以开发一系列只是在抗性识别上有差异，其他遗传背景的相同的新近等基因系水稻抗病品种，进而打破上述局限性，从而将通过田间混种的方式生态防治稻瘟病的策略更为广泛地应用于农业生产，有效减少农药的使用，获得环境和经济效益的双丰收。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工改造的水稻抗病基因RGA5-HMA2。

本发明首先保护蛋白质(命名为RGA5-HMA2蛋白)，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明还保护编码所述蛋白质的基因(命名为RGA5-HMA2基因)。

所述基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

本发明还保护含有所述RGA5-HMA2基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2自5’端第2944位至第3348位所示的DNA分子替代pGADT7载体的NdeⅠ位点和XhoⅠ位点之间的片段得到的重组表达载体。

所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2所示的DNA分子替代PC1305载体的Kpn1位点和HindⅢ位点之间的片段得到的重组表达载体。

本发明还保护所述RGA5-HMA2蛋白的应用，为如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)：

(A1)结合稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib；

(A2)与水稻RGA4蛋白和稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib共同激活植物免疫反应；

(A3)调控水稻对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的免疫反应；

(A4)调控水稻对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的抗性。

所述稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib为如下(A)或(B)所述的蛋白质：

(A)氨基酸序列为序列表的序列8的蛋白质；

(B)与(A)中所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

所述水稻RGA4蛋白为如下(C)或(D)所述的蛋白质：

(C)氨基酸序列为序列表的序列9的蛋白质；

(D)来源于水稻且与(C)中所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

本发明还保护一种激活植物免疫反应的方法，包括如下步骤：将RGA5-HMA2基因、水稻RGA4蛋白的编码基因和稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib的编码基因共同导入目的植物，激活目的植物的免疫反应。

所述水稻RGA4蛋白的编码基因具体可为如下(E)或(F)所述的DNA分子：

(E)序列表中序列5所示的DNA分子；

(F)与(E)中所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的DNA分子。

所述稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib的编码基因具体可为如下(G)或(H)所述的DNA分子：

(G)序列表中序列4所示的DNA分子；

(H)与(G)中所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的DNA分子。

所述RGA5-HMA2基因具体可通过含有RGA5-HMA2基因的重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2所示的DNA分子替代PC1305载体的Kpn1位点和HindⅢ位点之间的片段得到的重组表达载体。

所述水稻RGA4蛋白的编码基因具体可通过含有水稻RGA4蛋白的编码基因的重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列5所示的DNA分子替代PC1305载体的KpnⅠ位点和HindⅢ位点之间的片段得到的重组表达载体。

所述稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib的编码基因具体可通过含有效应蛋白AvrPib的编码基因的重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列4所示的DNA分子替代PC1305载体的KpnⅠ位点和HindⅢ位点之间的片段得到的重组表达载体。

在上述方法中，将所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述目的植物可为烟草或水稻。

本发明还保护一种加强水稻对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌产生免疫反应的方法，包括如下步骤：将所述RGA5-HMA2基因导入目的水稻，使目的水稻加强对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的免疫反应。

所述目的水稻表达RGA4蛋白。

在上述方法中，将所述重组表达载体导入所述目的水稻，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化水稻细胞或组织，并将转化的水稻组织培育成植株。

本发明还保护所述RGA5-HMA2蛋白或RGA5-HMA2基因或所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或以上任一所述方法在水稻育种中的应用。

所述育种的目的是为了选育对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌具有抗性的水稻。

本发明还保护所述RGA5-HMA2蛋白或RGA5-HMA2基因或所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或以上任一所述方法在水稻抗稻瘟病遗传改良中的应用。

本发明还保护方法A和方法B。

所述方法A为一种获得对含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌具有抗性的水稻的方法，包括如下步骤：将RGA5-HMA2基因导入目的水稻，使目的水稻获得对含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的抗性。所述目的水稻表达RGA4蛋白。

所述将RGA5-HMA2基因导入目的水稻的方法如前文所述。

所述方法B为水稻育种方法，包括如下步骤：将方法A获得的水稻作为育种材料用于水稻育种。

以上任一所述水稻具体可为日本晴水稻。

本发明以RGA5基因为基础，将RGA5所编码蛋白质碳末端的重金属(HMA)结构域进行点突变，获得了RGA5基因突变体RGA5-HMA2。实验表明RGA5-HMA2所编码的蛋白质能够特异性识别稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib，以解除其对RGA4基因的抑制作用，激活水稻体内的免疫反应，改变了其识别从而使含有该抗病基因的水稻获得了对含有AvrPib效应蛋白的稻瘟菌抗性。将RGA5-HMA2基因应用到水稻抗病品种改良可获得抗稻瘟病水稻品种。利用该思路可创制一系列遗传背景相同，但对不同稻瘟菌小种具有抗性的近等基因系水稻品种。通过将不同抗稻瘟病水稻品种进行田间混久抗性。同时，通过近等基因系水稻品种田间混合种植将有效提高种植效率，便于田间水肥管理。综上所述，该发明对于水稻抗稻瘟病遗传改良及抗病品种选育具有重要意义。

附图说明

图1为酵母双杂交实验结果。

图2为烟草瞬时转化实验结果。

图3为水稻原生质体荧光报告基因检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pGADT7载体：Takara公司，货号：Cat.Nos.630442。

pGBKT7载体：Takara公司，货号：Cat.No.630489。

酵母AH109菌株：北京庄盟国际生物基因科技有限公司，货号：ZK214。

农杆菌菌株GV3101：北京庄盟国际生物基因科技有限公司，货号：ZC141。

PC1305载体：参考文献：Foley,Sophie.Analysis of theReplication Functionsand Incompatibility Properties of the Lactococcus Lactis Subsp.LactisUC317Plasmid PC1305.Diss.NUI,1995.；公众可以从中国农业大学获得。

日本晴：参考文献：水稻品种日本晴[J]；农业科技通讯；1973年02期；公众可以从中国农业大学获得。

PC1305-LUC载体：采用序列表的序列11所示的DNA分子替代PC1305载体的KpnⅠ及HindⅢ位点之间的片段，得到PC1305-LUC载体。

稻瘟病菌的效应蛋白AvrPia如序列表的序列7所示，其编码基因如序列表的序列3所示。

稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib如序列表的序列8所示，其编码基因如序列表的序列4所示。

水稻RGA4蛋白如序列表的序列9所示，其编码基因如序列表的序列5所示。

野生型RGA5蛋白如序列表的序列10所示，其编码基因如序列表的序列6所示。

实施例1、突变蛋白及其编码基因的获得

对野生型RGA5蛋白及其编码序列进行大量序列分析、突变和功能验证，得到一个突变蛋白(命名为RGA5-HMA2蛋白)，如序列表的序列1所示；将其编码基因命名为RGA5-HMA2基因，如序列表的序列2所示。

实施例2、酵母双杂交验证RGA5-HMA2与AvrPib互作

一、重组表达载体的构建

1、重组表达载体pGADT7-RGA5-HMA2：采用序列表的序列2自5’端第2944位至第3348位所示的DNA分子替代pGADT7载体的NdeⅠ位点和XhoⅠ位点之间的片段，得到重组表达载体pGADT7-RGA5-HMA2(已经测序验证)。

2、重组表达载体pGBKT7-AVR-Pia：采用序列表的序列3自5’端第4至204位所示的DNA分子替代pGBKT7载体的NdeⅠ位点和XhoⅠ位点之间的片段，得到重组表达载体pGBKT7-AVR-Pia(已经测序验证)。

3、重组表达载体pGBKT7-AvrPib：采用序列表的序列4自5’端第4至162位所示的DNA分子替代pGBKT7载体的NdeⅠ位点和XhoⅠ位点之间，得到重组表达载体pGBKT7-AvrPib(已经测序验证)。

4、重组表达载体pGADT7-RGA5：采用序列表的序列6自5’端第2944位至第3348位所示的DNA分子替代pGADT7载体NdeⅠ位点和XhoⅠ位点之间的片段，得到重组表达载体pGADT7-RGA5(已经测序验证)。

二、酵母双杂交实验

将步骤一制备的重组表达载体按照如下分组共转化酵母AH109菌株后，进行双杂交(具体方法参照文献：Causier B,Davies B.Analysing protein-protein interactionswith the yeast two-hybrid system[J].Plant Molecular Biology,2002,50(6):855-870.)。

组1：pGADT7载体+重组表达载体pGBKT7-AvrPib；

组2：重组表达载体pGADT7-RGA5-HMA2+重组表达载体pGBKT7-AvrPia；

组3：重组表达载体pGADT7-RGA5-HMA2+重组表达载体pGBKT7-AvrPib；

组4：重组表达载体pGADT7-RGA5-HMA2+pGBKT7载体。

组5：重组表达载体pGADT7-RGA5+重组表达载体pGBKT7-AvrPib。

结果如图1所示。结果表明，RGA5-HMA2与效应蛋白AvrPib互作，而不与AVR-Pia互作,RGA5不与AvrPib互作。

实施例3、烟草叶片瞬时表达

一、重组表达载体构建

1、重组表达载体PC1305-RGA4：采用序列表的序列5所示的DNA分子替代PC1305载体的KpnⅠ位点和HindⅢ位点之间的片段，得到重组表达载体PC1305-RGA4(已经测序验证)。

2、重组表达载体PC1305-RGA5：采用序列表的序列6所示的DNA分子替代PC1305载体的KpnⅠ位点和HindⅢ位点之间的片段，得到重组表达载体PC1305-RGA5(已经测序验证)。

3、重组表达载体PC1305-AVR-Pia：采用序列表的序列3所示的DNA分子替代PC1305载体的Kpn1位点和HindⅢ位点之间的片段，得到重组表达载体PC1305-AVR-Pia(已经测序验证)。

4、重组表达载体PC1305-AvrPib：采用序列表的序列4所示的DNA分子替代PC1305载体的Kpn1位点和HindⅢ位点之间的片段，得到重组表达载体PC1305-AvrPib(已经测序验证)。

5、重组表达载体PC1305-RGA5-HMA2：采用序列表的序列2所示的DNA分子替代PC1305载体的Kpn1位点和HindⅢ位点之间的片段，得到重组表达载体PC1305-RGA5-HMA2(已经测序验证)。

二、重组农杆菌的制备

1、将步骤一得到的5种重组表达载体分别转化农杆菌菌株GV3101，得到5种重组农杆菌。

2、将步骤1得到的5种重组农杆菌分别经28℃，220rpm过夜培养。随后，将菌液置于离心机中5000rpm,15min收集菌体，并用悬菌缓冲液(10mM 2—(N—吗啉代)乙磺酸,150μM乙酰丁香酮,10mM氯化镁,pH＝5.7)悬浮菌体至OD600≈0.3，得到5种重组农杆菌菌液。

三、烟草转化

将步骤二得到的含有不同表达载体的重组农杆菌按照如下组合混合后注射本氏烟烟草(中国农业大学植物保护学院分子植物病理学实验室)叶片(接种量为0.3ml/cm³)。

组1：PC1305-RGA4+PC1305-RGA5-HMA2+PC1305-AvrPib；

组2：PC1305-RGA4+PC1305-RGA5-HMA2；

组3：PC1305-RGA4+PC1305-RGA5；

组4：PC1305-RGA4+PC1305-RGA5+PC1305-AVR-Pia；

组5：PC1305-RGA4+PC1305-RGA5+PC1035-AvrPib；

组6：PC1305-AvrPib；

组7：PC1305-RGA5-HMA2；

组8：PC1305-RGA5；

组9：PC1305-RGA4。

以上各组中，重组农杆菌以1：1混合，并用PC1305空载体农杆菌补至OD600＝2。

待接种3-5天时观察烟草叶片表型，并使用Typhoon FLA9000荧光扫描仪(GEHealthcare)以635nm波长光对接种叶片进行扫描记录结果。

结果如图2所示。其中A-B图中RGA4、RGA5、AVR-Pia的组合(组4)为阳性对照，RGA4和RGA5的组合(组3)为阴性对照。A-B图表明RGA4、RGA5-HMA2、AvrPib的组合(组1)诱导烟草细胞死亡。C-D图中RGA4组合(组9)为阳性对照，RGA5组合(组8)为阴性对照，C-D图表明RGA5-HMA2组合(组7)、AvrPib组合(组6)或RGA4、RGA5、AvrPib组合(组5)均不能诱导烟草细胞死亡。

实施例4、水稻原生质体转化实验

本部分的溶液方法引自Wang,Kun,Ying Liu,and Shaoqing Li."Bimolecularfluorescence complementation(BIFC)protocol for rice protoplasttransformation."NewPhytologist(2013).稍作修改。

1、将日本晴水稻种子浸入无菌水中28℃，光照条件下培养12-14天待水稻幼苗生长至10-15cm。

2、完成步骤1后，取150-200棵水稻幼苗去除根部及叶部，切成0.5mm的小段放入40ml酶解液中，将含有水稻茎段的酶解液置于真空泵中抽真空30min,并于

28℃，30rpm避光培养3.5h。

3、完成步骤2后，取出酶解产物，加入3倍体积的缓冲溶液稀释，并用40μm的细胞过滤网过滤去掉残渣。取过滤后的上清液于水平转子离心机中以100g离心力，离心3-4min,去掉上清液获得水稻原生质体细胞。

缓冲溶液的配制：

4、完成步骤3后，利用适量重悬溶液重悬水稻原生质体并置于冰上放置30min。

重悬溶液的配制：

氯化镁(15mM) 1.5ml(100mM储存液)

2—(N—吗啉代)乙磺酸(4mM) 0.4ml(100mM储存液)

D-甘露醇(0.6M) 1.093g

补水至10ml，并以氢氧化钾调pH为5.8待用。

5、完成步骤4后，将实施例2中的载体与PC1305-LUC载体按照如下组合进行混合，并向载体混合物中加入400μl步骤4获得的原生质体以及440μl转化缓冲液，轻柔颠倒混匀后室温静置20min，100g离心力离心2min。

组合1：PC1305-RGA5-HMA2+PC1305-LUC；

组合2：PC1305-RGA4+PC1305-LUC；

组合3：PC1305-RGA5-HMA2+PC1305-RGA4+PC1305-LUC；

组合4：PC1305-RGA4+PC1305-RGA5+PC1305-AvrPib+PC1305-LUC；

组合5：PC1305-RGA4+PC1305-RGA5-HMA2+PC1305-AvrPib+PC1305-LUC；

组合6：PC1305-LUC。

上述组合中，每种载体用量为10μg，以PC1305空载体补充至每组载体总质量一致，并加入无菌水补充至40μl体积，转化于400μl水稻原生质体细胞，细胞浓度为3×10⁵/ml。

转化缓冲液的配制：

D-甘露醇(0.6M) 1.093g

无水氯化钙(100mM) 0.111g

聚乙二醇4000(40％) 4g

补水至10ml，以1M氢氧化钾调整pH至7.5-8.0。

6、完成步骤5后，去掉转化产物上清液，加入2×880μl缓冲溶液轻柔混匀，于28℃条件下培养12-16h。

7、完成步骤6后，将培养物100g离心2min，去掉上清加入100μl 1×Lysis Buffer(来自promega公司Luciferase Assay System E1500)，旋涡10s,于冰上放置15min。

8、完成步骤7后，12000rpm离心4min，吸取上清液35μl,加入35μl荧光素酶底物(来自promega公司Lciferase Assay System E1500)于酶标仪中检测自发荧光信号。

结果如图3所示。其中RGA4组合(组合2)为阳性对照，RGA5-HMA2组合(组合1)、LUC组合(组合6)为阴性对照。结果表明RGA4、RGA5-HMA2、AvrPib组合(组合5)能够诱导水稻细胞死亡，此时水稻细胞中荧光素酶表达量减少，荧光素酶活性降低。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种人工改造的水稻抗病基因RGA5-HMA2

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Ala Pro Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala Met Gly Pro Leu Leu

1 5 10 15

Arg Lys Leu Asp Ser Leu Leu Val Ala Pro Glu Ile Arg Leu Pro Lys

20 25 30

Pro Leu Lys Glu Gly Ile Glu Leu Leu Lys Glu Asp Leu Glu Glu Ile

35 40 45

Gly Val Ser Leu Val Glu His Ser Val Val Asp Ser Pro Thr His Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Trp Met Asp Glu Val Arg Asp Leu Ser Tyr His Ile Glu

65 70 75 80

Asp Cys Ile Asp Thr Met Phe Ser Met Arg Ser Gly Gly Asp Asp Gly

85 90 95

Lys Pro Arg Ser Glu Arg Arg His Lys Val Gly Arg Ala Lys Ile Asp

100 105 110

Gly Phe Ser Lys Lys Pro Lys Pro Cys Thr Arg Met Ala Arg Ile Ala

115 120 125

Glu Leu Arg Ala Leu Val Arg Glu Ala Ser Glu Arg Leu Glu Arg Tyr

130 135 140

Gln Leu Gly Asp Val Cys Gly Ser Ser Ser Pro Val Val Phe Thr Ala

145 150 155 160

Asp Gly Arg Ala Arg Pro Leu His His Gly Val Ser Ala Asn Leu Val

165 170 175

Gly Val Asp Glu Phe Lys Thr Lys Leu Asn Arg Trp Leu Ser Asp Glu

180 185 190

Glu Gly Pro His Leu Lys Val Ala Ala Ile Val Gly Pro Ala Gly Ile

195 200 205

Gly Lys Thr Ala Leu Ala Thr Glu Leu Tyr Arg Asp His Arg Trp Gln

210 215 220

Phe Glu Cys Arg Ala Phe Val Arg Ala Ser Arg Lys Pro Asp Met Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Gly Gly Ile Leu Ser Gln Val Gln Arg Arg Gln Arg Ser

245 250 255

Ser Asp Ala Tyr Ala Asp Ser Thr Val Gln Ser Leu Ile Asp Asn Leu

260 265 270

Arg Glu His Leu Gln Asp Arg Arg Tyr Leu Ile Ile Ile Asp Gly Leu

275 280 285

Trp Glu Thr Ala Val Trp Asn Ile Ala Asn Ser Ala Phe Pro Asp Val

290 295 300

Asn Ser Phe Ser Arg Ile Leu Ile Thr Ala Asp Ile Glu Gln Val Ala

305 310 315 320

Leu Glu Cys Cys Gly Tyr Lys Tyr Asp Tyr Ile Met Arg Met Glu Pro

325 330 335

Leu Gly Ser Leu Asp Ser Lys Lys Val Phe Phe Asn Lys Val Phe Gly

340 345 350

Ser Glu Asp Gln Cys Pro Pro Glu Leu Lys Glu Val Ser Asn Thr Ile

355 360 365

Leu Glu Lys Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Ile Ile Ser Ile Ala Gly

370 375 380

Leu Leu Gly Ser Gln Pro Glu Asn Pro Val Leu Trp Asp Tyr Val Thr

385 390 395 400

Lys Tyr Leu Cys Ser Ser Leu Gly Thr Asn Pro Thr Leu Lys Asp Val

405 410 415

Val Lys Glu Thr Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Pro His Pro Phe

420 425 430

Lys Thr Cys Leu Leu Tyr Leu Gly Met Tyr Pro Asp Gly His Ile Met

435 440 445

Leu Lys Ala Asp Leu Met Lys Gln Trp Ser Ala Glu Gly Phe Val Ser

450 455 460

Ala Asn Glu Ala Lys Asp Thr Glu Glu Ile Val Asp Lys Tyr Phe Asp

465 470 475 480

Glu Leu Val Asn Arg Gly Ile Leu Glu Pro Val Glu Ile Asn Lys Asn

485 490 495

Gly Lys Val Leu Ser Cys Thr Leu His His Ala Val His Asp Leu Val

500 505 510

Met Pro Lys Phe Asn Asp Asp Lys Phe Thr Met Ser Val Asp Tyr Ser

515 520 525

Gln Thr Ile Thr Gly Pro Ser Thr Met Val Arg Arg Leu Ser Leu His

530 535 540

Phe Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Thr Lys Pro Ala Gly Ile Ile Leu Ser

545 550 555 560

Arg Val Arg Ser Leu Ala Phe Phe Gly Leu Leu Asn Cys Met Pro Cys

565 570 575

Ile Gly Glu Phe Lys Leu Leu Arg Val Leu Ile Leu Glu Phe Trp Gly

580 585 590

Ser His Gly Glu Gln Arg Ser Leu Asn Leu Ile Pro Val Cys Arg Leu

595 600 605

Phe Gln Leu Arg Tyr Leu Lys Thr Ser Gly Asp Val Val Val Gln Leu

610 615 620

Pro Ala Gln Ile Ser Gly Leu Gln Tyr Leu Glu Thr Leu Glu Ile Asp

625 630 635 640

Ala Arg Val Ser Ala Val Pro Phe Asp Leu Val His Leu Pro Asn Leu

645 650 655

Leu His Leu Gln Leu Gln Asp Glu Thr Lys Leu Pro Asp Gly Ile Gly

660 665 670

Cys Met Arg Ser Leu Arg Thr Leu Gln Tyr Phe Asp Leu Gly Asn Asn

675 680 685

Ser Val Asp Asn Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Thr Asn Leu Gln Asp

690 695 700

Leu His Leu Ser Tyr Ser Ala Pro Ser Ser Asn Glu Gly Leu Met Ile

705 710 715 720

Asn Leu Asn Ala Ile Thr Ser Ser Leu Ser Arg Leu Ser Asn Leu Lys

725 730 735

Ser Leu Ile Leu Ser Pro Gly Ala Ile Ser Met Val Ile Phe Phe Asp

740 745 750

Ile Ser Ser Ile Ile Ser Val Val Pro Val Phe Leu Gln Arg Leu Glu

755 760 765

Leu Leu Pro Pro Ile Cys Ile Phe Cys Arg Leu Pro Lys Ser Ile Gly

770 775 780

Gln Leu His Lys Leu Cys Ile Leu Lys Val Ser Val Arg Glu Leu Leu

785 790 795 800

Thr Thr Asp Ile Asp Asn Leu Thr Gly Leu Pro Ser Leu Thr Val Leu

805 810 815

Ser Leu Tyr Ala Gln Thr Ala Pro Glu Gly Arg Phe Ile Phe Lys Asp

820 825 830

Gly Thr Leu Pro Val Leu Lys Tyr Phe Lys Phe Gly Cys Gly Glu Leu

835 840 845

Cys Leu Ala Phe Met Ala Gly Ala Met Pro Asn Leu Gln Arg Leu Lys

850 855 860

Leu Val Phe Asn Ile Arg Lys Ser Glu Lys Tyr Arg His Thr Leu Phe

865 870 875 880

Gly Ile Glu His Leu Val Ser Leu Gln Asp Ile Ala Thr Arg Ile Gly

885 890 895

Val Asp Thr Ser Thr Gly Glu Ser Asp Arg Arg Ala Ala Glu Ser Ala

900 905 910

Phe Lys Glu Thr Val Asn Lys His Pro Arg Cys Leu Arg Ser Ser Leu

915 920 925

Gln Trp Val Val Ser Thr Glu Glu Glu Ser His Pro Leu Glu Lys Gln

930 935 940

His His Lys Arg Glu Lys Gly Ser Ser Ala Gly His Gly Val Leu Glu

945 950 955 960

Lys Glu Ser Val Glu Asp Ser Glu Lys Asn Thr Asp Arg Val Gln Thr

965 970 975

Leu Leu Ser Pro Gln Leu Ser Asn Met Glu Ser Val Val Glu Ser Ala

980 985 990

Leu Thr Gly Gln Arg Thr Lys Ile Val Val Lys Val His Met Pro Cys

995 1000 1005

Asp Lys Ser Arg Ala Lys Ala Met Ala Leu Ala Ala Ser Val Asn Gly

1010 1015 1020

Val Asp Val Val Glu Ile Thr Gly Glu Asp Lys Asp Arg Leu Val Val

1025 1030 1035 1040

Val Gly Arg Gly Ile Asp Pro Val Arg Leu Val Ala Leu Leu Arg Glu

1045 1050 1055

Lys Cys Gly Leu Ala Glu Leu Leu Met Val Glu Leu Val Glu Glu Glu

1060 1065 1070

Glu Thr Gln Leu Ala Gly Gly Glu Glu Gly Ala Tyr Glu Glu His Pro

1075 1080 1085

Thr Tyr Asn Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Val Glu Tyr Pro Pro Ser Ala

1090 1095 1100

Pro Ile Met Gln Asp Ile Asn Pro Cys Ser Thr Met

1105 1110 1115

<210> 2

<211> 3348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggatgctc cggcgagctt ttccctaggt gccatgggcc ctctcctcag gaagctcgat 60

tcgcttctgg tggctcccga aatccggctg cctaagccat tgaaggaggg aatcgagctg 120

ctcaaggaag atctagaaga gataggcgtc tccctggtgg agcactccgt ggtcgattca 180

ccaacccaca aggcaagatt ctggatggat gaggtgcgtg acctctccta ccacatcgag 240

gactgcatcg acaccatgtt ttcgatgcgc tccggcggcg acgacggcaa gcccagatcc 300

gagcgccgcc acaaggttgg ccgtgcgaag atcgacggtt tctccaagaa gcccaagccg 360

tgcacaagga tggctaggat cgcggagctc agggctctgg tgcgggaggc gagcgagcgg 420

ctcgaaaggt accagcttgg tgacgtctgc ggctcgagct ctcccgttgt gttcaccgcg 480

gatggtcggg ctcgacctct ccaccatggg gtttctgcta atcttgttgg cgtcgatgag 540

ttcaagacga agctgaacag gtggctcagc gacgaggagg ggccgcacct gaaggttgct 600

gccattgttg gacctgcagg gattggtaag acggcacttg ctacagagtt gtaccgtgac 660

catagatggc aattcgagtg ccgagctttc gtccgggcgt cgcgaaagcc tgacatgcag 720

cggcttcttg ggggtattct ctctcaagtt cagcgtcgcc aacgatcgtc tgatgcctac 780

gctgacagca cggtgcagag cctcattgat aatctccggg agcatctcca agataggagg 840

taccttatta taattgatgg tttgtgggag acggcagtat ggaatattgc taacagtgct 900

tttccagatg ttaacagttt cagtagaata ttaataactg cggatatcga acaggtagct 960

ctggaatgct gcggttacaa gtatgattat attatgagga tggaacctct tggcagcctt 1020

gattccaaaa aagttttctt caataaagtt tttggctccg aagatcaatg tcctcctgag 1080

ttgaaggagg tgtcaaacac aatcctagaa aaatgtggtg gtttgccact tgcaatcatc 1140

agcatagcag gtcttctagg aagccaaccg gaaaatccag tgctatggga ctatgtaacg 1200

aaatatctat gttccagttt gggtacaaat cctactttga aagacgtggt gaaagaaacg 1260

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atgtatcctg atgggcacat aatgttgaag gctgatttga tgaagcaatg gtcagctgaa 1380

ggttttgtct ctgccaatga agcaaaagac acagaagaaa ttgtagataa atactttgat 1440

gagcttgtca acaggggaat tctagaacct gttgagatta acaagaatgg caaggtgttg 1500

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tttactatgt cagtagatta ctctcagact attacaggac cttctaccat ggttcgtcgt 1620

ttgtcccttc atttcagcag taccagatac gcgacaaaac ctgcaggaat aatattgtca 1680

cgagttcgat cacttgcctt ttttggcctc ctcaattgta tgccttgtat tggggaattt 1740

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aacctaatac cagtatgtag attatttcag ctgagatatt tgaaaacttc aggtgatgta 1860

gttgttcagt taccagctca gataagtggg ctacagtact tggaaacact ggaaatagac 1920

gcaagagtgt cagctgttcc atttgatctt gttcatctcc cgaacctact gcatctccaa 1980

cttcaagatg agacaaaatt acctgatggg attggctgca tgagatcttt gcgtacacta 2040

cagtactttg accttggtaa caactctgta gacaacttac ggggtcttgg agagctgaca 2100

aacctgcagg atcttcatct cagctattct gcaccgtcat ctaatgaggg tttgatgata 2160

aatctgaatg ctataacctc ttcacttagc agacttagta acctcaaatc tctgattcta 2220

tcaccaggtg ctataagcat ggttattttc tttgatatat caagcatcat atctgtggtt 2280

cctgtatttc ttcagagact tgagctgttg ccacccatct gcatcttttg cagacttccc 2340

aagtcgattg gacaacttca caaactctgc attttgaaag tttccgttag agaacttctg 2400

acaactgata ttgataacct cacaggatta ccttccctca cagttctctc attatatgct 2460

cagacagctc cagagggaag gtttatcttc aaagacggga ctctcccagt tctcaagtat 2520

ttcaaatttg gatgtggtga actctgcctt gcttttatgg ctggagcaat gcccaatctc 2580

cagaggctca aattagtttt caacatccgt aaaagtgaga agtaccgcca tacgcttttt 2640

gggattgagc accttgtaag cctccaggat attgccacac gaattggggt tgacaccagc 2700

accggcgaat ctgatagaag ggctgcagag tcagcattca aggaaactgt caacaagcat 2760

ccaaggtgtc ttaggtccag cttgcagtgg gtggtttcca ctgaggaaga aagtcatcct 2820

ttggagaaac aacatcataa gagagaaaaa ggctcatcag ctggacatgg ggttttagag 2880

aaagaatcag tggaagatag cgagaagaac actgatagag tgcaaacatt attgtcaccc 2940

caactgtcta acatggaatc tgtagtagag tctgcgctga ccggccagcg tactaagatc 3000

gtggttaagg tacacatgcc gtgtgataaa agccgcgcta aagctatggc gctggcagca 3060

agcgtgaacg gtgtggacgt ggtagaaatt accggcgaag acaaagatcg cctggtagtt 3120

gtaggccgtg gcatcgatcc ggttcgtctg gtggcgctgc tgcgtgaaaa atgcggcctg 3180

gcggaactgc tgatggtaga actggttgaa gaagaagaaa cccagctggc tggcggcgaa 3240

gaaggcgcgt acgaagaaca cccgacctac aacctgagcc cgttcgatta cgttgaatac 3300

ccgccgtccg ctccgattat gcaggacatt aacccgtgca gcactatg 3348

<210> 3

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcaccgg cacgtttttg tgtttattat gatggtcatc tgcctgcaac ccgtgttctg 60

ctgatgtatg ttcgtattgg caccaccgcc accattaccg cacgtggtca tgaatttgaa 120

gttgaagcaa aagaccagaa ctgcaaagtg attctgacca atggtaaaca ggcaccggat 180

tggctggcag cagaaccgta ttag 204

<210> 4

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacccagg ttaccatttt aaaaaaaggc gaacgtatta cctgggtgga ggtgccgaag 60

ggtgaaagcc gtgaatttaa cattcgcggc aaatatttta ccgtgtctgt tagcgatgac 120

ggcaccccga gcatcagcgg tagcaaatac accgtggaat aa 162

<210> 5

<211> 2991

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggaggccg cgcttttgag cggattcatc aaggccatcc tgccgaggct cttctccctc 60

gtcgacgata agcataagct ccacaagggc gtcaagggcg acatcgattt cctcatcaag 120

gagctccgca tgatcgtcgg cgccatcgac gacgacctct ccctcgacca ccccgccgcc 180

gccgccgtac agacgctatg catggaggac ctacgcgagc tcgcccacgg catcgaggac 240

tgcatcgacg gcgtcctgta ccgcgccgcc agggaccagc agcagtcacc ggtccgccgc 300

gccgtccagg cccccaagaa gctccagaga aacctgcagc ttgcccagca gctgcagcgg 360

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cgggaggagc tcctggagca gctggcggag cggcagccgg agcagctcaa ggtgatcgcc 600

atcgtcgggt tctgcgggct ggggaagacc gccctcgccg cggaggcgta caaccgagag 660

accggcggcg ggagattcga gaggcacgcg tgggtttgcg ccgggcaccg gagtgcacgg 720

gaggtgctcg gcgaattgct ccgcaggctt gacgccgacg gccgttcttt ccatggggac 780

tccgatgctg gtcagctgtg tgtagatatc agacagcagt tggagaagaa caggtacttc 840

attgttatcg atgacattca aacagaagat cagtggaaaa gcatcaaatc ggcttttccg 900

actgataagg atattggcag cagaatagtg gtcacgacga ccatccagtc agtagctaat 960

gcctgctgtt ctgcgaatgg gtatttgcac aaaatgagca ggcttgataa gaactgctca 1020

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ttcctgcaag ctaatggctg gccaacgggg cctaactgtg aagatctctg caaccggcta 1200

cattatcacc tagagaatga taaaacactt gaaaggatgt ggcgagtgct ggtccgcaac 1260

tacaccagtc tacctggcca tgctctcaag gcctgcttac tatattttgg catgttccca 1320

tctgatcatc caatcaggag gaaaagtctg ctgaggcgat ggttggccga gggatttgta 1380

gaaccactgt cttcatcgag taacatagat tccacggctg ctttcaatgt gctaatggac 1440

cggaacatca ttgagcccat caatgtaagc aataatgata aagtcaagac atgccaaacg 1500

tacggtatga tgcgtgaatt catatcgcat atgtcaatct ctcagaactt tgtcaccttt 1560

ttctgtgatg acaagttcgt gcccaaatat gttcgtcggc tttctctcca tggtgacact 1620

gttgtgaatg gtgataactt caacggtatt gatttatcac ttgtacggtc tctggcagtc 1680

tttggggagg caggtacaac cgtattagac ttcagcaagt atcaattgct gcgagtttta 1740

gatcttgaaa aatgtgatga tttgaaggat gatcatctca aagaaatatg caatctggtg 1800

cttctgaaat atctgagcct tgggggtaat atctccaaac ttccaaagga tattgccaaa 1860

ttgaaagatt tggaggcact cgatgtaagg agatcgaaag taaagataat gccggtagaa 1920

gtcttcgggt tgccatgcct aattcatctg cttggaaaat ttaagctctc agataaagtc 1980

aagcagaaga ctgaagtgca agagtttctc ttgaaaggaa aaagcaactt gcagacgcta 2040

gcaggatttg ctagcaacgg aagcgaaggg tttctgcatc ttatgaggta catgaataag 2100

ttgagaaagt tgaagatttg gtgtacgtcg tctgcaggta gcaccgattg gactgatctt 2160

agggaggcca ttcaacagtt cattctggat gaaaaggaag caaatattgg tacccgttct 2220

ttatcgcttc atttcagtgg atgctctgaa gatgcgataa attccttaaa agaaccctgc 2280

tacctcagct cgttgaaatt acatggcaac ttcccccaat tgcctcagtt tgttacatca 2340

cttcgtggtc tcaaggagct ttgcctttca tctactaaat ttacaacagg ccttcttgaa 2400

gccttgagta atttgagcta cttgcagtat ctcaaactgg ttgccgatga acttgagaag 2460

ttcatcataa aagttcaggg gttccccagg ctgctacgcc tttgtattgt gctacaatat 2520

ccaacattcc cagtaattga agaaggagct ctgccatttc ttgtcacact tcagctgcta 2580

tgcaaagatc tacatggcct ttctgacatc caaattgaat gttttaaaca tcttcaggag 2640

gtaactcttc attctggagt cactccagct acaagacagg aatgggtaaa ggctgctaag 2700

gagcatccga ataggccaaa agtattgctt ctcaaatctg ttgatacagc agaaagtgaa 2760

catacagacg ttgatagtgt aatggaggca gtcaaaagtg agactacaga atattctatt 2820

gcaccagagg gaccagaaca agtgaacaac aaaatgcaac ttgaccatgg attggaatcc 2880

tcttctgtgc tgaacaaaca aaacaacttt gcagaccaat caagctcaaa agatcaactg 2940

cattattctt tcaacaatat ggggctttca gatgtctcct gctgtgagtg a 2991

<210> 6

<211> 3351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggatgctc cggcgagctt ttccctaggt gccatgggcc ctctcctcag gaagctcgat 60

tcgcttctgg tggctcccga aatccggctg cctaagccat tgaaggaggg aatcgagctg 120

ctcaaggaag atctagaaga gataggcgtc tccctggtgg agcactccgt ggtcgattca 180

ccaacccaca aggcaagatt ctggatggat gaggtgcgtg acctctccta ccacatcgag 240

gactgcatcg acaccatgtt ttcgatgcgc tccggcggcg acgacggcaa gcccagatcc 300

gagcgccgcc acaaggttgg ccgtgcgaag atcgacggtt tctccaagaa gcccaagccg 360

tgcacaagga tggctaggat cgcggagctc agggctctgg tgcgggaggc gagcgagcgg 420

ctcgaaaggt accagcttgg tgacgtctgc ggctcgagct ctcccgttgt gttcaccgcg 480

gatggtcggg ctcgacctct ccaccatggg gtttctgcta atcttgttgg cgtcgatgag 540

ttcaagacga agctgaacag gtggctcagc gacgaggagg ggccgcacct gaaggttgct 600

gccattgttg gacctgcagg gattggtaag acggcacttg ctacagagtt gtaccgtgac 660

catagatggc aattcgagtg ccgagctttc gtccgggcgt cgcgaaagcc tgacatgcag 720

cggcttcttg ggggtattct ctctcaagtt cagcgtcgcc aacgatcgtc tgatgcctac 780

gctgacagca cggtgcagag cctcattgat aatctccggg agcatctcca agataggagg 840

taccttatta taattgatgg tttgtgggag acggcagtat ggaatattgc taacagtgct 900

tttccagatg ttaacagttt cagtagaata ttaataactg cggatatcga acaggtagct 960

ctggaatgct gcggttacaa gtatgattat attatgagga tggaacctct tggcagcctt 1020

gattccaaaa aagttttctt caataaagtt tttggctccg aagatcaatg tcctcctgag 1080

ttgaaggagg tgtcaaacac aatcctagaa aaatgtggtg gtttgccact tgcaatcatc 1140

agcatagcag gtcttctagg aagccaaccg gaaaatccag tgctatggga ctatgtaacg 1200

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atgtatcctg atgggcacat aatgttgaag gctgatttga tgaagcaatg gtcagctgaa 1380

ggttttgtct ctgccaatga agcaaaagac acagaagaaa ttgtagataa atactttgat 1440

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cgagttcgat cacttgcctt ttttggcctc ctcaattgta tgccttgtat tggggaattt 1740

aagttactgc gagttctaat cctagaattt tggggcagtc atggtgagca aaggagttta 1800

aacctaatac cagtatgtag attatttcag ctgagatatt tgaaaacttc aggtgatgta 1860

gttgttcagt taccagctca gataagtggg ctacagtact tggaaacact ggaaatagac 1920

gcaagagtgt cagctgttcc atttgatctt gttcatctcc cgaacctact gcatctccaa 1980

cttcaagatg agacaaaatt acctgatggg attggctgca tgagatcttt gcgtacacta 2040

cagtactttg accttggtaa caactctgta gacaacttac ggggtcttgg agagctgaca 2100

aacctgcagg atcttcatct cagctattct gcaccgtcat ctaatgaggg tttgatgata 2160

aatctgaatg ctataacctc ttcacttagc agacttagta acctcaaatc tctgattcta 2220

tcaccaggtg ctataagcat ggttattttc tttgatatat caagcatcat atctgtggtt 2280

cctgtatttc ttcagagact tgagctgttg ccacccatct gcatcttttg cagacttccc 2340

aagtcgattg gacaacttca caaactctgc attttgaaag tttccgttag agaacttctg 2400

acaactgata ttgataacct cacaggatta ccttccctca cagttctctc attatatgct 2460

cagacagctc cagagggaag gtttatcttc aaagacggga ctctcccagt tctcaagtat 2520

ttcaaatttg gatgtggtga actctgcctt gcttttatgg ctggagcaat gcccaatctc 2580

cagaggctca aattagtttt caacatccgt aaaagtgaga agtaccgcca tacgcttttt 2640

gggattgagc accttgtaag cctccaggat attgccacac gaattggggt tgacaccagc 2700

accggcgaat ctgatagaag ggctgcagag tcagcattca aggaaactgt caacaagcat 2760

ccaaggtgtc ttaggtccag cttgcagtgg gtggtttcca ctgaggaaga aagtcatcct 2820

ttggagaaac aacatcataa gagagaaaaa ggctcatcag ctggacatgg ggttttagag 2880

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caactgtcaa acatggagag tgtggtggaa agtgcattaa cggggcaacg aactaagata 3000

gttgttaagg tgcacatgcc atgcggaaaa tcccgagcaa aagccatggc gctggctgcg 3060

tcagtgaacg gggtggacag cgtggagata acgggggagg acaaagaccg gctggtggtg 3120

gtcggccgtg gcattgaccc tgttcgcctg gtggctctcc tgcgcgagaa atgtggcctc 3180

gccgagctct tgatggtgga gttagttgag aaagagaaga cacagctggc tggaggaaag 3240

aaaggtgcat acaagaagca ccctacctac aatttatcgc cgtttgacta tgtagagtat 3300

ccaccttcag caccaataat gcaagatatt aacccttgct caaccatgtg a 3351

<210> 7

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Pro Ala Arg Phe Cys Val Tyr Tyr Asp Gly His Leu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Arg Val Leu Leu Met Tyr Val Arg Ile Gly Thr Thr Ala Thr Ile

20 25 30

Thr Ala Arg Gly His Glu Phe Glu Val Glu Ala Lys Asp Gln Asn Cys

35 40 45

Lys Val Ile Leu Thr Asn Gly Lys Gln Ala Pro Asp Trp Leu Ala Ala

50 55 60

Glu Pro Tyr

65

<210> 8

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Thr Gln Val Thr Ile Leu Lys Lys Gly Glu Arg Ile Thr Trp Val

1 5 10 15

Glu Val Pro Lys Gly Glu Ser Arg Glu Phe Asn Ile Arg Gly Lys Tyr

20 25 30

Phe Thr Val Ser Val Ser Asp Asp Gly Thr Pro Ser Ile Ser Gly Ser

35 40 45

Lys Tyr Thr Val Glu

50

<210> 9

<211> 996

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Glu Ala Ala Leu Leu Ser Gly Phe Ile Lys Ala Ile Leu Pro Arg

1 5 10 15

Leu Phe Ser Leu Val Asp Asp Lys His Lys Leu His Lys Gly Val Lys

20 25 30

Gly Asp Ile Asp Phe Leu Ile Lys Glu Leu Arg Met Ile Val Gly Ala

35 40 45

Ile Asp Asp Asp Leu Ser Leu Asp His Pro Ala Ala Ala Ala Val Gln

50 55 60

Thr Leu Cys Met Glu Asp Leu Arg Glu Leu Ala His Gly Ile Glu Asp

65 70 75 80

Cys Ile Asp Gly Val Leu Tyr Arg Ala Ala Arg Asp Gln Gln Gln Ser

85 90 95

Pro Val Arg Arg Ala Val Gln Ala Pro Lys Lys Leu Gln Arg Asn Leu

100 105 110

Gln Leu Ala Gln Gln Leu Gln Arg Leu Lys Arg Met Ala Ala Glu Ala

115 120 125

Asn Gln Arg Lys Gln Arg Tyr Thr Ala Ala Ala Pro Gly Gln His Gly

130 135 140

Gln Val Tyr Ser Ser Ala Ala Ala Gln Val Asp Glu Pro Trp Pro Ser

145 150 155 160

Cys Ser Ser Ala Ser Asp Pro Arg Ile His Glu Ala Asp Leu Val Gly

165 170 175

Val Asp Ala Asp Arg Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Ala Glu Arg Gln

180 185 190

Pro Glu Gln Leu Lys Val Ile Ala Ile Val Gly Phe Cys Gly Leu Gly

195 200 205

Lys Thr Ala Leu Ala Ala Glu Ala Tyr Asn Arg Glu Thr Gly Gly Gly

210 215 220

Arg Phe Glu Arg His Ala Trp Val Cys Ala Gly His Arg Ser Ala Arg

225 230 235 240

Glu Val Leu Gly Glu Leu Leu Arg Arg Leu Asp Ala Asp Gly Arg Ser

245 250 255

Phe His Gly Asp Ser Asp Ala Gly Gln Leu Cys Val Asp Ile Arg Gln

260 265 270

Gln Leu Glu Lys Asn Arg Tyr Phe Ile Val Ile Asp Asp Ile Gln Thr

275 280 285

Glu Asp Gln Trp Lys Ser Ile Lys Ser Ala Phe Pro Thr Asp Lys Asp

290 295 300

Ile Gly Ser Arg Ile Val Val Thr Thr Thr Ile Gln Ser Val Ala Asn

305 310 315 320

Ala Cys Cys Ser Ala Asn Gly Tyr Leu His Lys Met Ser Arg Leu Asp

325 330 335

Lys Asn Cys Ser Lys Gln Leu Leu Ser Lys Lys Ala Cys Pro Glu Arg

340 345 350

Tyr Ser His Tyr Lys Gln Pro Asp Ser Ala Ala Ile Leu Lys Lys Cys

355 360 365

Asp Gly Gln Pro Leu Ala Leu Val Thr Ile Gly Glu Phe Leu Gln Ala

370 375 380

Asn Gly Trp Pro Thr Gly Pro Asn Cys Glu Asp Leu Cys Asn Arg Leu

385 390 395 400

His Tyr His Leu Glu Asn Asp Lys Thr Leu Glu Arg Met Trp Arg Val

405 410 415

Leu Val Arg Asn Tyr Thr Ser Leu Pro Gly His Ala Leu Lys Ala Cys

420 425 430

Leu Leu Tyr Phe Gly Met Phe Pro Ser Asp His Pro Ile Arg Arg Lys

435 440 445

Ser Leu Leu Arg Arg Trp Leu Ala Glu Gly Phe Val Glu Pro Leu Ser

450 455 460

Ser Ser Ser Asn Ile Asp Ser Thr Ala Ala Phe Asn Val Leu Met Asp

465 470 475 480

Arg Asn Ile Ile Glu Pro Ile Asn Val Ser Asn Asn Asp Lys Val Lys

485 490 495

Thr Cys Gln Thr Tyr Gly Met Met Arg Glu Phe Ile Ser His Met Ser

500 505 510

Ile Ser Gln Asn Phe Val Thr Phe Phe Cys Asp Asp Lys Phe Val Pro

515 520 525

Lys Tyr Val Arg Arg Leu Ser Leu His Gly Asp Thr Val Val Asn Gly

530 535 540

Asp Asn Phe Asn Gly Ile Asp Leu Ser Leu Val Arg Ser Leu Ala Val

545 550 555 560

Phe Gly Glu Ala Gly Thr Thr Val Leu Asp Phe Ser Lys Tyr Gln Leu

565 570 575

Leu Arg Val Leu Asp Leu Glu Lys Cys Asp Asp Leu Lys Asp Asp His

580 585 590

Leu Lys Glu Ile Cys Asn Leu Val Leu Leu Lys Tyr Leu Ser Leu Gly

595 600 605

Gly Asn Ile Ser Lys Leu Pro Lys Asp Ile Ala Lys Leu Lys Asp Leu

610 615 620

Glu Ala Leu Asp Val Arg Arg Ser Lys Val Lys Ile Met Pro Val Glu

625 630 635 640

Val Phe Gly Leu Pro Cys Leu Ile His Leu Leu Gly Lys Phe Lys Leu

645 650 655

Ser Asp Lys Val Lys Gln Lys Thr Glu Val Gln Glu Phe Leu Leu Lys

660 665 670

Gly Lys Ser Asn Leu Gln Thr Leu Ala Gly Phe Ala Ser Asn Gly Ser

675 680 685

Glu Gly Phe Leu His Leu Met Arg Tyr Met Asn Lys Leu Arg Lys Leu

690 695 700

Lys Ile Trp Cys Thr Ser Ser Ala Gly Ser Thr Asp Trp Thr Asp Leu

705 710 715 720

Arg Glu Ala Ile Gln Gln Phe Ile Leu Asp Glu Lys Glu Ala Asn Ile

725 730 735

Gly Thr Arg Ser Leu Ser Leu His Phe Ser Gly Cys Ser Glu Asp Ala

740 745 750

Ile Asn Ser Leu Lys Glu Pro Cys Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Leu His

755 760 765

Gly Asn Phe Pro Gln Leu Pro Gln Phe Val Thr Ser Leu Arg Gly Leu

770 775 780

Lys Glu Leu Cys Leu Ser Ser Thr Lys Phe Thr Thr Gly Leu Leu Glu

785 790 795 800

Ala Leu Ser Asn Leu Ser Tyr Leu Gln Tyr Leu Lys Leu Val Ala Asp

805 810 815

Glu Leu Glu Lys Phe Ile Ile Lys Val Gln Gly Phe Pro Arg Leu Leu

820 825 830

Arg Leu Cys Ile Val Leu Gln Tyr Pro Thr Phe Pro Val Ile Glu Glu

835 840 845

Gly Ala Leu Pro Phe Leu Val Thr Leu Gln Leu Leu Cys Lys Asp Leu

850 855 860

His Gly Leu Ser Asp Ile Gln Ile Glu Cys Phe Lys His Leu Gln Glu

865 870 875 880

Val Thr Leu His Ser Gly Val Thr Pro Ala Thr Arg Gln Glu Trp Val

885 890 895

Lys Ala Ala Lys Glu His Pro Asn Arg Pro Lys Val Leu Leu Leu Lys

900 905 910

Ser Val Asp Thr Ala Glu Ser Glu His Thr Asp Val Asp Ser Val Met

915 920 925

Glu Ala Val Lys Ser Glu Thr Thr Glu Tyr Ser Ile Ala Pro Glu Gly

930 935 940

Pro Glu Gln Val Asn Asn Lys Met Gln Leu Asp His Gly Leu Glu Ser

945 950 955 960

Ser Ser Val Leu Asn Lys Gln Asn Asn Phe Ala Asp Gln Ser Ser Ser

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Lys Asp Gln Leu His Tyr Ser Phe Asn Asn Met Gly Leu Ser Asp Val

980 985 990

Ser Cys Cys Glu

995

<210> 10

<211> 1116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Asp Ala Pro Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala Met Gly Pro Leu Leu

1 5 10 15

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20 25 30

Pro Leu Lys Glu Gly Ile Glu Leu Leu Lys Glu Asp Leu Glu Glu Ile

35 40 45

Gly Val Ser Leu Val Glu His Ser Val Val Asp Ser Pro Thr His Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Trp Met Asp Glu Val Arg Asp Leu Ser Tyr His Ile Glu

65 70 75 80

Asp Cys Ile Asp Thr Met Phe Ser Met Arg Ser Gly Gly Asp Asp Gly

85 90 95

Lys Pro Arg Ser Glu Arg Arg His Lys Val Gly Arg Ala Lys Ile Asp

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180 185 190

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225 230 235 240

Arg Leu Leu Gly Gly Ile Leu Ser Gln Val Gln Arg Arg Gln Arg Ser

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275 280 285

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Asn Ser Phe Ser Arg Ile Leu Ile Thr Ala Asp Ile Glu Gln Val Ala

305 310 315 320

Leu Glu Cys Cys Gly Tyr Lys Tyr Asp Tyr Ile Met Arg Met Glu Pro

325 330 335

Leu Gly Ser Leu Asp Ser Lys Lys Val Phe Phe Asn Lys Val Phe Gly

340 345 350

Ser Glu Asp Gln Cys Pro Pro Glu Leu Lys Glu Val Ser Asn Thr Ile

355 360 365

Leu Glu Lys Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Ile Ile Ser Ile Ala Gly

370 375 380

Leu Leu Gly Ser Gln Pro Glu Asn Pro Val Leu Trp Asp Tyr Val Thr

385 390 395 400

Lys Tyr Leu Cys Ser Ser Leu Gly Thr Asn Pro Thr Leu Lys Asp Val

405 410 415

Val Lys Glu Thr Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Pro His Pro Phe

420 425 430

Lys Thr Cys Leu Leu Tyr Leu Gly Met Tyr Pro Asp Gly His Ile Met

435 440 445

Leu Lys Ala Asp Leu Met Lys Gln Trp Ser Ala Glu Gly Phe Val Ser

450 455 460

Ala Asn Glu Ala Lys Asp Thr Glu Glu Ile Val Asp Lys Tyr Phe Asp

465 470 475 480

Glu Leu Val Asn Arg Gly Ile Leu Glu Pro Val Glu Ile Asn Lys Asn

485 490 495

Gly Lys Val Leu Ser Cys Thr Leu His His Ala Val His Asp Leu Val

500 505 510

Met Pro Lys Phe Asn Asp Asp Lys Phe Thr Met Ser Val Asp Tyr Ser

515 520 525

Gln Thr Ile Thr Gly Pro Ser Thr Met Val Arg Arg Leu Ser Leu His

530 535 540

Phe Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Thr Lys Pro Ala Gly Ile Ile Leu Ser

545 550 555 560

Arg Val Arg Ser Leu Ala Phe Phe Gly Leu Leu Asn Cys Met Pro Cys

565 570 575

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580 585 590

Ser His Gly Glu Gln Arg Ser Leu Asn Leu Ile Pro Val Cys Arg Leu

595 600 605

Phe Gln Leu Arg Tyr Leu Lys Thr Ser Gly Asp Val Val Val Gln Leu

610 615 620

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625 630 635 640

Ala Arg Val Ser Ala Val Pro Phe Asp Leu Val His Leu Pro Asn Leu

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Leu His Leu Gln Leu Gln Asp Glu Thr Lys Leu Pro Asp Gly Ile Gly

660 665 670

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675 680 685

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705 710 715 720

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725 730 735

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740 745 750

Ile Ser Ser Ile Ile Ser Val Val Pro Val Phe Leu Gln Arg Leu Glu

755 760 765

Leu Leu Pro Pro Ile Cys Ile Phe Cys Arg Leu Pro Lys Ser Ile Gly

770 775 780

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785 790 795 800

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820 825 830

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835 840 845

Cys Leu Ala Phe Met Ala Gly Ala Met Pro Asn Leu Gln Arg Leu Lys

850 855 860

Leu Val Phe Asn Ile Arg Lys Ser Glu Lys Tyr Arg His Thr Leu Phe

865 870 875 880

Gly Ile Glu His Leu Val Ser Leu Gln Asp Ile Ala Thr Arg Ile Gly

885 890 895

Val Asp Thr Ser Thr Gly Glu Ser Asp Arg Arg Ala Ala Glu Ser Ala

900 905 910

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915 920 925

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930 935 940

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945 950 955 960

Lys Glu Ser Val Glu Asp Ser Glu Lys Asn Thr Asp Arg Val Gln Thr

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980 985 990

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995 1000 1005

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1010 1015 1020

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1090 1095 1100

Pro Ile Met Gln Asp Ile Asn Pro Cys Ser Thr Met

1105 1110 1115

<210> 11

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60

accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120

gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180

gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240

tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300

gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360

tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420

aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480

tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540

tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600

tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660

catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720

gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780

cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840

aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900

attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960

aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020

gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080

gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140

acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200

tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260

ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320

ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380

caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440

cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500

tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560

gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620

aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa 1653

Claims

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)：

(A1)结合稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib；

(A3)调控水稻对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的免疫反应；

(A4)调控水稻对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的抗性；

所述效应蛋白AvrPib的氨基酸序列如序列表的序列8所示。

6.一种激活植物免疫反应的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的基因、水稻RGA4蛋白的编码基因和稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib的编码基因共同导入目的植物，激活目的植物的免疫反应；所述效应蛋白AvrPib的氨基酸序列如序列表的序列8所示。

7.一种加强水稻对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌产生免疫反应的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的基因导入目的水稻，使目的水稻加强对于含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的免疫反应；所述效应蛋白AvrPib的氨基酸序列如序列表的序列8所示。

8.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组表达载体、表达盒或重组菌或权利要求6或7所述的方法在水稻育种或水稻抗稻瘟病遗传改良中的应用；

所述效应蛋白AvrPib的氨基酸序列如序列表的序列8所示；

9.方法A或方法B；

所述方法A为一种获得对含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌具有抗性的水稻的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的基因导入目的水稻，使目的水稻获得对含有效应蛋白AvrPib的稻瘟病菌的抗性；所述效应蛋白AvrPib的氨基酸序列如序列表的序列8所示；