CN108341861A - 一种来源于杜梨的抗病性相关基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从杜梨中分离得到的抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用。本发明公开的杜梨抗病蛋白(PbrPR1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述蛋白质的核酸分子序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因转化拟南芥，获得的转基因植株相对于野生植株的抗病害能力提高。

Description

一种来源于杜梨的抗病性相关基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种抗病相关蛋白及其编码基因与它们在调控植物抗病性中的应用。

背景技术

梨是世界上主栽的果树树种之一。梨果实的品质决定了商品价值，而果实抗病性是构成果实品质的一个重要经济性状，抗病性强的果实也更加耐储存。因此，筛选梨抗病调控相关的基因资源，有助于了解植物产生抗病相关蛋白的分子机制及植物体内对各类病原菌的防御机制，为利用基因工程手段改善果实抗病性的研究提供新的基因资源。

目前，常见的梨树防病害方法主要是化学防治和物理防治，采用栽培管理手段会大幅增加生产成本。通过喷洒农药来减少植物病害的发生是目前的主要手段，但是水源污染，农药残留和病菌抗药性等问题日益凸显，而农业生态的可持续发展逐渐成为重要考量因素。因此，解析植物抗病机理，培育植物抗病品种是从根本上减少植物病害发生的重要方法，依然是解决问题的根本途径，具有重大的科学意义和产业前景。

在植物与病原物进化及相互作用的过程中，植物逐步形成了一个抵御病原物入侵，从而保护好自己的免疫系统，主要包括了植物基础抗性(PTI)，植物抗病基因介导的抗性(ETI)及植物获得性抗性(SAR)。植物体表面的PRs可以识别病原物，进而激活PTI，构成了植物防御的第一道防线。在植物和病原物协同进化的过程中，病原物克服植物的基础免疫反应，完成对植物的侵染，病原物通过效应因子引起的植物感病的现象称为效应因子激发的感病反应(ETI)。相比植物的基础免疫，效应因子激发的免疫反应的反应强度更大，抗病效果也更加明显。病原侵染部位产生的细胞程序化死亡不但参与侵染位点的免疫反应，而且还同时激活了整个植物体系统性的广谱免疫反应，这就是系统获得性免疫(SAR)。

植物在受到病原物侵染时，会产生抗性反应，病程相关蛋白是其中参与抗病性的重要物质，能够被病原物诱导产生并在植物体内积累，对于诱导植物系统抗性，阻止病原物侵染具有重要作用。PR蛋白可分为17个家族，其中一部分蛋白的功能已经被鉴定。大量实验证据表明PR基因在抗病、激素处理、伤害、抗逆、衰老以及正常生长中都发挥着重要的作用。在烟草中超表达CABPR1基因能提高对细菌和真菌的抗性，在干旱和病菌胁迫下，拟南芥的PR1、PR2和PR5转录水平均提高。在所有的PR家族中，PR1基因经常被看做抗病反应的标志，其能被病原菌、SA、乙烯等诱导，因此其基因编码的产物PR1蛋白质已经成为近年来抗性研究的热点之一。

PR1蛋白最早从烟草中发现，随后从许多单子叶和双子叶植物中鉴定出PR1基因。PR1是一类可经病原菌和SA大量诱导表达的PR蛋白，有酸性和碱性，大多呈碱性。它属于一个多基因家族。植物PR1在结构上具有高度序列保守性，来源不同的PR1蛋白在某些结构域上具有相似性，并表现出一定程度的序列同源性，表明PR1蛋白是PR蛋白家族中独特、且保守的一类成员，它们的广泛分布及结构上的同源性也说明PR1蛋白可能具有共同的起源。PR1被证实具有抗病毒扩散、限制真菌入侵和保护植物抵御逆境胁迫等功能。PR1基因的表达水平与抗病性相关，在离体条件下表现不同程度的抗真菌活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为抗病蛋白(PbrPR1)的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其包含561bp的开放阅读框，编码186个氨基酸，等电点为4.21，计算的分子量为45KDa。

本发明还包括将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、且与植物抗病性相关的蛋白质；以及为了使本发明的蛋白质便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上标签，得到的融合蛋白质。

本发明上述PbrPR1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明上述PbrPR1蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与PbrPR1相关的生物材料，该生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码上述蛋白质PbrPR1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物或转基因植物细胞系；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物或转基因植物细胞系；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物或转基因植物细胞系；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物或转基因植物细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

B1)所述核酸分子还可以为以下任意一种核酸分子：

b1)、与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PbrPR1的cDNA分子或基因组DNA分子；

b2)、在严格条件下与SEQ ID NO.2或b1)所限定的核苷酸序列杂交，且编码PbrPR1的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)、为与SEQ ID NO.2所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PbrPR1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PbrPR1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PbrPR1且具有PbrPR1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码PbrPR1的核酸分子的表达盒(PbrPR1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PbrPR1的DNA，该DNA不但可包括启动PbrPR1基因转录的启动子，还可包括终止PbrPR1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。

可用现有的表达载体构建含有所述PbrPR1基因表达盒的重组载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pMD18-T或pAHC25，也可为将pAHC25改造后得到的载体。所述病毒载体具体可为BSMV病毒的载体，如γ载体。

B3)所述重组载体可含有SEQ ID NO.2所示的用于编码PbrPR1的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pAHC25-cMYC-PbrPR1或pMD-18T-PbrPR1。所述pAHC25-cMYC-PbrPR1为将pAHC25-cMYC载体的Spe I和EcoICRI识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID NO.2所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达SEQ ID NO.1所示的PbrPR1的重组载体。所述pMD-18T-PbrPR1为将pMD18-T的Spe I和EcoICR I识别位点间的DNA序列替换为SEQ IDNO.2所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)，黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述细菌具体可为大肠杆菌。

为解决上述技术问题，本发明还提供了PbrPR1、或所述生物材料在下述1)-3)中任一种中的应用：

1)调控植物抗病性；

2)制备提高植物抗病性产品；

3)培育抗病性植物。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，所述双子叶植物具体可为拟南芥。

上述应用中，所述抗病性可为抗黑斑病。

为解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗病剂。所述植物抗病剂含有PbrPR1、或所述生物材料。

上述植物抗病剂中，所述植物抗病剂可以以所述PbrPR1作为活性成分，还可以将PbrPR1和其它抗病性物质进行组合得到的组合物作为活性成分。

上述植物抗病剂中，所述抗病性可为抗黑斑病。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病性转基因植物的方法，该方法包括向受体植物中导入PbrPR1的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物。

在本发明的实施例中，所述PbrPR1的编码基因(即SEQ ID NO.2所示的DNA分子)通过含有PbrPR1基因表达盒的PbrPR1基因重组表达载体导入目的植物中。所述表达载体为双元表达载体PMV。

上述培育抗病性转基因植物的方法中，其中所述PbrPR1基因可先进行如下修饰中的任意一种，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述PbrPR1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

所述PbrPR1基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述方法还包括从导入SEQ ID NO.1所示的PbrPR1的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因植物。

上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述受体植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，所述双子叶植物具体可为拟南芥。

上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述抗病性可为抗黑斑病。

上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述PbrPR1的编码基因的编码序列可为序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子。

本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述PbrPR1基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过农杆菌介导遗传转化的方法将PbrPR1转化拟南芥，获得的转基因植株，经生物学功能验证，本发明的PbrPR1基因可以调节并提高植物的抗病性：1、转基因系相较于野生型具有更好的抗黑斑能力；2、转基因拟南芥中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢(CAT)活性均要比野生型要高，而MDA含量则显著低于野生型，细胞受到的损伤更小；3、转基因的叶绿素含量比野生型高，表明病菌对其叶绿素合成的影响更小，光合作用能够维持正常，植物生长受到的影响更小；4、转基因株系在病害胁迫下较野生型有更高的免受过氧化氢毒害的能力。

附图说明

图1为本发明的技术流程示意图；

图2A为本发明构建植物转化载体流程图；

图2B为本发明PMV载体图；

图3为组培梨苗经黑斑病处理后，PbrPR1的RNA相对表达量；

图4是拟南芥转化后的阳性鉴定，其中，A为RNA鉴定，B为经拟南芥内参鉴定cDNA浓度，C为经特异性引物检测PbrPR1在转基因植株中的表达量。

图5A为本发明中转PbrPR1基因株系及野生型(WT)黑斑病接种处理后，拟南芥叶片经黑斑病孢子悬浮液接种的表型。

图5B为测定转PbrPR1基因株系及野生型(WT)植株中CAT，SOD，POD的酶活性以及MDA含量；

图6A是生长至21天的拟南芥盆栽苗，经黑斑病孢子悬浮液喷施处理5天后的表型，其中WT为野生型，8-5，6-1，2-1为PbrPR1超表达系；

图6B是对应图6A中各拟南芥的叶绿素含量；

图6C是对应图6A中各拟南芥的电导率；

图7A是转PbrPR1基因拟南芥以及野生型组织化学染色定性分析；

图7B是定量分析对应图7A中各拟南芥的H₂O₂积累量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1梨PbrPR1基因全长cDNA的克隆

前期我们通过分析黑斑病相关转录组挑取抗病相关蛋白PR1，根据PbrPR1基因的序列和primerpremier 5.0设计引物，用RT-PCR方法从杜梨上扩出其全长。

PbrPR1的引物序列如下所示：

正向引物：AACAACGAGACCGTCTGGAG，(SEQ ID NO.3)；

反向引物：TGCCCACCACCTAGCATATT，(SEQ ID NO.4)。

详细步骤如下：取杜梨RNA 1μg经1U的DNase I 37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μl 50mM EDTA65℃处理10min后立即置于冰上。cDNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。所得的第一链cDNA用于PbrPR1基因的扩增。PCR按以下程序完成：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒按照使用说明提取步骤，回收特异目的条带。回收纯化的溶液与pMD19-T载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为3:1连接。反应总体积是10μl，其中5μlbuffer，4.5μl的PCR纯化的产物，0.5μl载体。16℃连接过夜，采用热击法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海英潍捷基公司完成)。

生物信息学分析cDNA序列显示，PbrPR1基因全长1635bp，它包括的编码阅读框编码561个氨基酸，等电点为4.21，预测的分子量为45KDa。

实施例2黑斑病处理下PbrPR1基因的qRT-PCR分析

为了分析拟南芥中PbrPR1基因对黑斑病的响应模式，使用Real-time PCR技术对PbrPR1基因的表达模式进行分析。采用CTAB法提取RNA，DNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。在20μl的反应体系中有：10μl 2×Mix，0.1ul cDNA，5μl引物，4.9μl水。

其中，特异性引物的核苷酸序列为：

PbrPR1正向引物：5’-AACAACGAGACCGTCTGGAG-3’；

PbrPR1反向引物：5’-TGCCCACCACCTAGCATATT-3’。

以Actin为内参引物，Actin引物核苷酸序列为：

Actin正向引物：5’-ATGATCAGATCATGTTTGAGACC-3’；

Actin反向引物：5’-TCAGTAAGGTCACGACCAGCAA-3’。

定量PCR的程序如表1所示：

表1定量PCR程序

结果如图3所示，梨苗在黑斑病处理下，PbrPR1基因的转录水平随处理时间而上升，可以看出PbrPR1基因对黑斑病有明显响应。

实施例3拟南芥的遗传转化

1.植物转化载体构建

根据植物双元表达载体PMV的多克隆位点和PbrPR1基因(以下简称PR1基因)的编码区序列，按照一般设计引物的原则用primerprimier 5.0软件设计出扩增基因整个编码区的上、下游PCR引物(序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)。以PR1基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃，PCR反应体系及扩增程序与PbrPR1基因克隆相同。在扩增过后进行双酶切，双酶切体系总体积为50μl，其中：PCR的纯化产物20μl，10×Buffer5μl，KpnI及SalI各2μl，双蒸水将该体系补充至50ul。酶切在37℃中水浴进行，酶切过夜后做胶纯化回收。PMV载体双酶切反应体积为50μl，其中：有PMV的载体质粒20μl，10×Buffer5μl，KpnI及SalI各2μl，加双蒸水至50μl。同样放置于37℃酶切过夜后纯化回收。在连接反应体系中加入PR1基因与载体PMV的摩尔比为3:1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，双酶切回收的PR1基因6ul，双酶切回收的pMV载体产物2μl，在16℃反应14-16h得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养。将筛选出的阳性克隆，调点后摇菌，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为PMV-PR1重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体PMV-PR1导入到农杆菌GV3101中。

2.农杆菌介导的拟南芥遗传转化步骤如下：

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平100mg/L的LB固体培养基上划线，28℃培养，挑取单克隆，加入到1ml的添加了卡那霉素50mg/L和利福平100mg/L的液体LB培养基中，28℃，250rpm振荡培养20h，按1：100扩培，28℃过夜振荡培养。

(2)转化介质：配置1/2MS粉4.74g/L，蔗糖50g/L，IBA10ug/L的液体培养基，5000g室温离心20分钟收集菌体，重悬于等同菌液体积的液体培养基中。

(3)侵染：将待转化的拟南芥(抽薹10cm高)减去角果和以开放的花，在转化介质中加入silwet-77至终浓度为0.025％，把拟南芥花序浸泡在菌液中，抽真空至380mmHg，浸泡5min。

(4)22℃暗处理过夜，取出植株，正常培养至收取种子。

3.转基因阳性苗的初步鉴定

按照上述转化方法得到拟南芥种子，重新播种至土培，提取每株拟南芥叶片的DNA，进行PCR扩增鉴定阳性苗。

3.1拟南芥叶片DNA提取

(1)取适量的幼嫩叶片放入1.5mL离心管中，加液氮，充分研磨成粉末状；然后加入700μl 65℃预热的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵(简称CTAB，配方：100mM Tris-HCl(pH8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(PH＝8.0)溶液加1％聚乙烯吡咯烷酮，2％(体积)CTAB，65℃水浴充分溶解备用，用前在65℃水浴预热后，加入1-4％(体积)巯基乙醇，混匀)，

(2)65℃温浴60-90min，隔15min取出上下轻轻颠倒混匀；10000g常温离心10min；取上清，加600μl氯仿异戊醇(氯仿：异戊醇体积比为24：1)，颠倒混匀抽提3min；

(3)10000g离心15min；取上清450μl(注意勿吸取蛋白层，导致蛋白污染)，加入900μl-20℃预冷无水乙醇，34μl 5MNaCl，颠倒混匀后，-20℃冰冻30min。

(4)10000g，离心10min；弃上清后，用1mL 75％的乙醇洗涤3次后，空管离心一分钟，放到超净工作台吹半小时，直至DNA呈无色透明状，加适量双蒸水，放置于37℃培养箱中溶解40min，做胶检测。

3.2阳性转基因植株检测

利用引物基因特异引物进行PCR扩增，反应程序及体系分别见表3、表4。釆用PbrPR1基因特异性引物(序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)进行PCR，能扩增出预期大小的片段则表明它们为阳性转基因株系，经鉴定成功获得转基因阳性植株。

表3 PCR反应程序

表4 PCR反应体系

实施例4转基因拟南芥植株的超表达分析

提取移栽成活的转基因阳性苗的RNA，通过跑胶检测其结构完整，如附图4(A)所示，利用nanodrop测定其浓度后(浓度均在200-600ng/ul)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，再用拟南芥的Actin作为内参进行扩增。Actin引物核苷酸序列为：

Actin正向引物：5’-ATGATCAGATCATGTTTGAGACC-3’

Actin反向引物：5’-TCAGTAAGGTCACGACCAGCAA-3’

如附图4(B)所示，用Actin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，后再用PbrPR1特异引物作为模板扩增目的条带，PbrPR1引物的核苷酸序列为：

PbrPR1正向引物：5’-AACAACGAGACCGTCTGGAG-3’；

PbrPR1反向引物：5’-TGCCCACCACCTAGCATATT-3’。

根据PbrPR1特异引物扩增出来的目的条带的亮度大小，可以判断出PbrPR1基因在阳性转基因拟南芥中的表达量，选择亮度高，如附图4(C)所示，即表达量高的超表达株系命名PR1-2-1，PR1-6-1和PR1-8-5，作为收种子的母本植株。

实施例5PbrPR1转基因植株的抗性鉴定

1.转基因拟南芥植株的抗黑斑病分析

为了鉴定PbrPR1转基因拟南芥是否和抗病胁迫有关，将对照系和转基因系进行接种黑斑病孢子悬浮液处理。同一批次收到的PR1转基因系(2-1，6-1，

8-5)拟南芥种子和野生型(WT)种子灭菌处理后，分别播于1/2MS筛选培养基和常用的1/2MS无抗培养基上，挑取经过筛选后的拟南芥移栽至基质中，于人工培养室中长日照培养。

盆栽苗生长15d后，在生长状态一致的植株中，选取大小接近的叶片，用孢子悬浮液(方法参照陈晓峰)对叶片进行损伤接种。结果如附图6(A)所示，进行损伤接种40h后开始出现表型，野生型(WT)的叶片从叶脉开始明显黄化，叶片边缘出现萎蔫，而转基因系的叶片状态良好。

2.抗氧化酶(SOD，POD，CAT)活性分析及MDA含量测定

因为活性氧的生成与积累和植物体内的抗氧化酶活性有很大的关系，因此我们对黑斑病接种后的转基因株系和非转基因株系的三种重要抗氧化酶：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢(CAT)的活性进行分析。结果如附图5(B)所示，黑斑病接种处理后，所有转基因拟南芥的CAT酶活性均高于未转化株系，已转化株系的POD酶活性显著高于未转化株系，转PbrPR1拟南芥的SOD酶活性也显著高于野生型叶片，以上结果显示，植株在进行接种处理后酶活均有上升，其中转基因株系要比野生型活性高。

MDA的产生能加剧细胞膜的损伤，是植物衰老生理和抗性研究中的常用指标，通过MDA的含量可以了解膜脂过氧化的程度，以间接检测植物膜系统受损程度从而了解植物的抗逆性。转基因拟南芥在黑斑病接种之后，转基因株系的MDA含量低于未转化株系，说明转基因株系在黑斑病处理的情况下，细胞受损程度更低，PbrPR1能够有效提高植株的抗病能力。

综合分析表明，将该基因转入拟南芥中后鉴定其功能，发现转基因超表达株系与对照野生型相比抗病能力有了很大提升。转基因拟南芥中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢(CAT)活性均要比野生型要高，植株体内活性氧残留更低，而MDA含量则显著低于野生型，细胞受到的损伤更小。结果表明，过表达的PbrPR1基因能够有效增强转基因植株的活性氧清除能力，能更好的保护细胞膜，从而提高了植株的抗病性。

3.叶绿素含量及电导率测定

叶绿素的提取和分析：大约0.1g叶片组织的样品，加入95％酒精研磨均匀，室温避光15min后，室温离心10000g，20min，取上清液(叶绿素提取液)用分光光度计在波长665，649和470nm测其吸光度值，记为A665，A649，A470。叶绿素的计算公式为：C(叶绿素a)＝13.95*A665-6.88*A649，C(叶绿素b)＝24.96*A649-7.32*A665，C叶绿素＝(Ca+Cb)*V(提取液总体积)/(样品质量*1000)。计算结果如附图6(B)所示，转基因的叶绿素含量比野生型高，表明病菌对其叶绿素合成的影响更小，光合作用能够维持正常，植物生长受到的影响更小。

电导率测定：采集经过处理后的转基因株系和野生型新鲜叶片样品用去离子水洗净，用滤纸吸干。每个样品称取0.5g放入50mL的离心管中，加入30mL去离子水，将其置于旋转摇床上室温摇2h，后测得电导率为C₁。将样品放于100℃沸水中煮10min，后自然冷却至室温，使叶片细胞内离子渗透达到最大，测得电导率为C₂。电导率的计算公式为C₁/C₂×100％。结果如附图6(C)所示，病菌接种后，野生型的电导率明显高于转基因株系，说明处理后的野生型叶片细胞内含物流失更多，未转化植物受病菌危害更重。

4.组织化学染色分析H₂O₂积累

在转基因株系中，叶绿素含量高表明他们可能具有比WT有更强的抗病能力。那么通过鉴定植株中H₂O₂积累量便成为必要。从定性角度分析，用DAB组织化学染色法对植株叶片进行染色，用来检测过氧化氢(H₂O₂)含量。如附图7(A)所示，叶片经DAB染色后，野生株系型出现褐色的叶面积明显比转基因株系要大，且颜色更深。从定量角度，采用南京建成公司的试剂盒测定H₂O₂含量，如附图7(B)转基因株系的含量明显低于野生型株系。以上结果表明，转基因株系在病害胁迫下较野生型有更低的H₂O₂积累，而野生型植物则受到过氧化氢的毒害。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种来源于杜梨的抗病性相关基因及其编码蛋白与应用

<130> GW2018I1107

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 186

<212> PRT

<213> Pyrus betulifolia Bunge

<400> 1

Met Lys Ala Gln Phe Leu Phe Ile Leu Phe Ala Leu Tyr Leu Thr Asp

1 5 10 15

Val Gly Ser Ala Thr Ser Ala His Glu Gln Lys Pro Asn Asn Glu Thr

20 25 30

Val Trp Arg Val Ser Lys Gln Leu Cys Trp Gly Cys Ile Gly Glu Ser

35 40 45

Leu Glu Phe Leu Phe Gln Asn Asn Leu Val Arg Ala Ala Lys Trp Glu

50 55 60

Met Pro Leu Met Trp Asp Phe Gln Leu Glu Lys Tyr Ala Arg Trp Trp

65 70 75 80

Ala Gly Gln Arg Lys Ser Asp Cys Lys Leu Gln His Ser Phe Pro Glu

85 90 95

Asp Gly Phe Lys Leu Gly Glu Asn Ile Tyr Trp Gly Ser Gly Ser Thr

100 105 110

Trp Thr Pro Ser Asp Ala Val Lys Thr Trp Ala Ala Glu Glu Lys Tyr

115 120 125

Tyr Ser Tyr Met Thr Asn Thr Cys Glu Ala Gly Gln Met Cys Gly His

130 135 140

Tyr Thr Gln Ile Val Trp Lys Thr Thr Thr Arg Leu Gly Cys Ala Arg

145 150 155 160

Val Val Cys Asp Asp Gly Asp Val Phe Met Thr Cys Asn Tyr Asp Pro

165 170 175

Pro Gly Asn Tyr Ile Gly Glu Arg Pro Tyr

180 185

<210> 2

<211> 561

<212> DNA

<213> Pyrus betulifolia Bunge

<400> 2

atgaaggcac aattcctctt tatcctcttt gctctctacc ttactgacgt cggctcagct 60

acttctgcac atgaacaaaa gccgaacaac gagaccgtct ggagggtctc aaaacaacta 120

tgctggggtt gcataggaga gtccttagaa tttttgttcc aaaacaattt ggtgagggca 180

gcaaagtggg agatgccatt gatgtgggac tttcaactcg agaaatatgc taggtggtgg 240

gcaggccaga gaaaatccga ttgcaaattg cagcattcgt tcccggaaga cgggttcaga 300

ctaggagaaa acatatactg gggcagcggc tcgacatgga ctccaagcga cgcagtgaag 360

acatgggctg ctgaagagaa gtactacagt tacatgacga acacgtgcga ggctggtcaa 420

atgtgcggac attatactca aattgtgtgg aagactacga cgagactcgg gtgtgctagg 480

gttgtgtgtg acgatggaga tgtgtttatg aattgtaatt atgatcctcc ggggaattat 540

attggtgaga ggccatacta g 561

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aacaacgaga ccgtctggag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tgcccaccac ctagcatatt 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgatcagat catgtttgag acc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tcagtaaggt cacgaccagc aa 22

Claims (8)

1.一种植物抗病蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.与权利要求1所述抗病蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物或转基因植物细胞系；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物或转基因植物细胞系；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物或转基因植物细胞系；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物或转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在下述1)-3)中任一种中的应用：

1)调控植物抗病性；

2)制备提高植物抗病性产品；

3)培育抗病性植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗病性为抗黑斑病。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

7.一种植物抗病剂，其特征在于，所述植物抗病剂含有权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料。

8.一种培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物。