CN113061171A - 抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明公开的抗稻瘟病蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该抗稻瘟病蛋白和其基因具有稻瘟病抗性，转化该蛋白和其基因的植物体具有稻瘟病抗性，该蛋白和其基因可以用于培育抗稻瘟病植物品种。

Description

抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用。

背景技术

水稻是我国的主要口粮作物，水稻高产是我国粮食安全的重要保障。目前，水稻产量和抗性间的矛盾非常突出，稻瘟病已经成为影响水稻产量的首要病害，流行年份使水稻减产10％～20％，严重时可减产40％以上，甚至绝收。目前，防治农作物病害的主要手段是培育抗病品种和施用化学农药。传统方法培育抗病品种存在育种周期长，抗性丧失快等特性，而化学农药则严重污染环境。因此，利用分子生物学方法挖掘水稻自身的抗病基因，通过分子育种方法培育抗病品种成为控制稻瘟病害最经济、有效和环保的方法。

水稻在与稻瘟病菌协同进化的过程中产生了与稻瘟病菌生理小种相对应的稻瘟病抗性基因。到目前为止，有超过80个抗稻瘟病基因被鉴定，其中又有不少抗病基因通过分子标记手段被初步定位在不同染色体上。大部分抗稻瘟病基因都以基因簇的形式存在，这些稻瘟病抗病基因簇主要分布在水稻的第6、11和12号染色体上(数据来源于国家水稻数据中心：http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。截止到2018年，有近36个稻瘟病抗病基因被分离和克隆。这些抗稻瘟病基因除了2006年克隆的水稻抗稻瘟病基因Pid2和2009年克隆的水稻抗稻瘟病基因Pi21之外，其他抗稻瘟病基因均属于NBS-LRR类抗病基因。已克隆的抗病基因中，水稻抗稻瘟病基因Pi21和水稻抗稻瘟病基因Pb1还表现为数量性状，属于数量性状座位(Quantitative Trait Loci，QTL)。

另外，在已经克隆的NBS-LRR类抗病基因中也存在类似于水稻抗稻瘟病基因Pikm和Pi5这样的基因，这两个基因各自的基因座位上含有两个独立的并且紧密连锁的NBS-LRR类基因，只有当两个NBS-LRR基因同时存在的情况下才表现出对稻瘟病菌的抗性，这为多个NBS-LRR类抗病基因同时参与稻瘟病抗性反应提供新的证据。随着越来越多NBS-LRR类抗病基因的克隆，人们还发现有些水稻抗稻瘟病基因之间存在着等位关系，例如来源于不同的水稻品种的抗稻瘟病基因Pi9、Pi2和Piz-t互为等位基因，均位于水稻的6号染色体上一个抗病基因簇中。除此之外，水稻抗稻瘟病基因Pid3和Pi25之间，以及Pik-m、Pik-h和Pik-p之间也分属于两组等位基因。水稻抗稻瘟病基因的等位基因的发现暗示了参与水稻稻瘟病抗病反应的NBS-LRR类基因数量是有限的，而NBS-LRR类基因在进化的过程中存在着比较高的变异性，同一个基因可衍生出对不同稻瘟病菌小种产生特异性抗性的等位基因。

研究者们还发现有活性的启动子插入抗病基因上游区域能够激活抗病基因的抗病功能，如对稻瘟病菌表现出小种特异性抗性的Pit，以及表现出数量性状且对稻瘟菌穗瘟有抗性的Pb1均是有活性的启动子插入抗病基因上游区域获得稻瘟病抗性的。水稻抗稻瘟病基因Pit在进化过程中出现了功能性等位基因PitK59和非功能性等位基因PitNpb，这两个等位基因虽然存在4个氨基酸的替换，但上游插入的一个长的末端重复反转录转座子使水稻抗稻瘟病基因Pit获得新的稻瘟病(小种特异性)抗性；水稻抗稻瘟病基因Pb1编码一个非典型的CC-NBS-LRR类蛋白，主要表现在NBS区域不具备P-loop结构，并伴随有其它基序的退化，但该基因位于一个串联重复序列(60kb)中，通过分析(诱导型)启动子发现可能正是通过这种基因组局部复制出现的串联重复序列，使水稻抗稻瘟病基因Pb1获得了一个有活性的启动子进而激活该基因的抗病功能。

基因芯片是随着人类基因组计划的实施而迅速发展起来的生命科学领域里的前沿生物技术。其原理是将大量特定的寡聚核苷酸序列或基因序列作为探针通过原位合成(in situ synthesis)与合成点样的方式有序地排列并固化在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等芯片上，根据碱基互补原理，将其与标记处理后的实验组或对照样品进行杂交，借助激光共聚焦显微扫描技术对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析，最后获得标记样品中基因组或转录组的表达信息。基因芯片技术因其具有高通量，高度平行性、多样性、自动化和微型化的特性被广泛应用到包括突变检测、基因组多态性分析、基因表达差异分析和杂交测序以及基因文库作图等方面的研究。在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于人类和动物的疾病诊断和治疗以及药物筛选、农作物的优选优育等许多领域。

水稻分子抗病机理研究的深入和生物技术的发展，为水稻抗病育种打下的坚实的基础，目前已经有多个抗稻瘟病基因在抗病育种实践中得以应用并在农业生产上取得成功。水稻材料地谷是一份广泛应用于我国西南地区抗病育种实践并对稻瘟病菌具有广谱高抗的重要抗源材料。从抗源材料地谷中发掘新的抗稻瘟病基因对我们利用稻瘟病抗性的分子机制开展分子抗病育种，缩短选育时间，提高水稻抗稻瘟病育种的效率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗稻瘟病蛋白，该蛋白具有稻瘟病抗性。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸分子，其编码上述的抗稻瘟病蛋白，转化该分离的核酸分子的植物体，能够赋予该植物体稻瘟病抗性。

本发明的再一目的在于提供一种抗稻瘟病基因，该基因具有稻瘟病抗性。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种重组细胞或重组菌。

本发明的另一目的在于提供上述抗稻瘟病蛋白、分离的核酸分子、抗稻瘟病基因、载体、重组细胞或重组菌的应用。

本发明是这样实现的：

本发明的发明人利用基因芯片技术，分析比较地谷(Oryza sativa indica Digu)和丽江(Oryza sativa japonica Lijiangxintuanheigu)两种水稻材料经稻瘟病菌侵染处理后的基因表达情况，从地谷中筛选出一个抗稻瘟病候选基因NBS-DEG7，将其命名为Pid5基因，其编码的蛋白命名为PID5蛋白，并经实验验证，转化该Pid5基因的植株具有稻瘟病抗性。

基于此，一方面，本发明提供了一种抗稻瘟病蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

该抗稻瘟病蛋白(PID5蛋白)是一个含1459个氨基酸的CC-NBS-LRR蛋白，该蛋白包含两个主要的结构域：NBS和LRR区域，其N端具有明显的CC结构域，C-末端为23个LRR重复序列(图5)。

PID5蛋白的NBS和LRR结构域可能具有独立的功能，因此，将编码PID5蛋白的核酸序列中的编码不同结构域的核酸片段与其它核酸片段重组，可构成嵌合基因，使之具有新的功能，其也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码如上所述的抗稻瘟病蛋白。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸分子的核酸序列SEQ IDNO:3所示。SEQ ID NO:3为SEQ ID NO:2所示抗稻瘟病蛋白的编码序列。

该分离的核酸分子可作为外源DNA片段，通过插入到表达载体上后，再转化植物，可提高或赋予植物的稻瘟病抗性，培育出具有稻瘟病抗性的植物品种。

其中，被转化的植物可以是单子叶植物和双子叶植物。

例如，单子叶植物可以是：玉米、水稻、小麦、甘蔗、芦苇、高粱、姜、沙姜、草果、砂仁、郁金、莪术、益智、艳山姜、姜花、豆蔻等。

双子叶植物可以是：大豆、花生、向日葵、马铃薯、蕃茄等。

另一方面，本发明还提供了一种抗稻瘟病基因，其核酸序列SEQ ID NO:1所示。

其中，SEQ ID NO:1所示的为抗稻瘟病的结构基因，SEQ ID NO:3为SEQ ID NO:1的CDS序列。

该抗稻瘟病基因命名为Pid5基因。Pid5基因序列连接到任何一种植物转化载体，用转化方法将Pid5抗病基因导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。

本发明所述的Pid5基因构建到植物转化载体中时，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽或者增强植物对病原菌的抗性。

该抗稻瘟病基因可作为外源基因转化植物，提高或赋予植物的稻瘟病抗性，培育出具有稻瘟病抗性的植物品种。

其中，其他植物细胞可以是单子叶植物细胞和双子叶植物细胞。

例如，单子叶植物可以是：玉米、小麦、甘蔗、芦苇、高粱、姜、沙姜、草果、砂仁、郁金、莪术、益智、艳山姜、姜花、豆蔻等。

双子叶植物可以是：大豆、花生、向日葵、马铃薯、蕃茄等。

另一方面，本发明提供了一种载体，其含有如上所述的分离的核酸分子，或者如上所述的抗稻瘟病基因。

该载体可以是克隆载体例如T载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、粘粒载体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、pGEM-T、pUC18，也可以是表达载体例如腺病毒载体、反转录病毒载体或质粒载体；质粒载体可以是植物表达载体例如表达载体选自植物表达载体pBIN19、pBI121、pBI221，pCambia1300，pGreen等，载体的类型可以根据实际需求选择。无论载体，只要含有如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因均落入本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供了含有如上所述的分离的核酸分子、如上所述的抗稻瘟病基因、或者如上所述的载体的重组细胞或重组菌。

例如，重组细胞可以是水稻细胞或其他植物细胞，其他植物细胞可以是单子叶植物细胞和双子叶植物细胞。

例如，单子叶植物可以是：玉米、小麦、甘蔗、芦苇、高粱、姜、沙姜、草果、砂仁、郁金、莪术、益智、艳山姜、姜花、豆蔻等。

双子叶植物可以是：大豆、花生、向日葵、马铃薯、蕃茄等。

例如，重组菌可以是大肠杆菌、农杆菌等。

另一方面，本发明还提供了如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌在培育抗稻瘟病水稻品种或提高水稻抗稻瘟病抗性中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述稻瘟病抗性是指稻瘟病菌抗性。

基于本发明的研究结果，本领域技术人员容易理解到，可以将如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌不仅可以用于培育抗稻瘟病水稻品种，或用于提高水稻抗稻瘟病抗性，也可以将其用于培育其他抗稻瘟病植物品种，提高其稻瘟病抗性。

例如，其他抗稻瘟病植物品种可以是单子叶植物品种，也可以是双子叶植物品种。

例如，单子叶植物可以是：玉米、小麦、甘蔗、芦苇、高粱、姜、沙姜、草果、砂仁、郁金、莪术、益智、艳山姜、姜花、豆蔻等。

双子叶植物可以是：大豆、花生、向日葵、马铃薯、蕃茄等。

只要将如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌用于培育抗稻瘟病植物品种提高其稻瘟病抗性即落入本发明的保护范围。

例如可以通过农杆菌介导法，或基因枪法等将本发明提供的如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因转化受体植物细胞，并使其分化形成完整植株获得稻瘟病抗性。

当然，也可以通过采用基因编辑技术例如锌指蛋白核酸酶技术(Zinc Finge rNuclease,ZFN)、TALEN技术(Transcription activator-like effector nucleases)、CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeat Sequences)技术等，以如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因为模板，修改受体植物基因组的基因组序列使其含有上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因，进而使其获得稻瘟病抗性。

无论通过何种方式使植物体获得稻瘟病抗性，只要其应用了本发明提供的如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌来使植物体获得稻瘟病抗性即落入本发明的保护范围。

再一方面，本发明还提供了如上所述的分离的核酸分子，或如上所述的抗稻瘟病基因作为分子标记在辅助育种中的应用。

本发明提供的如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因的序列可以有效地与其他同类稻瘟病抗性基因区别。因此，可将如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因作为分子标记，检测待鉴定水稻品种或其他植物品种的基因组序列是否存在如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因，如果存在，则预示该待鉴定水稻品种或其他植物品种有稻瘟病抗性，可以作为亲本进行繁殖。

此外，也可以通过检测待鉴定水稻品种或其他植物品种的RNA是否表达出了如上所述的分离的核酸分子，如果存在，则预示该待鉴定水稻品种或其他植物品种有稻瘟病抗性。

相较于在田间观察的选育稻瘟病抗性的方法，以如上所述的分离的核酸分子，或如上所述的抗稻瘟病基因作为分子标记来辅助育种，可以大大地缩短育种时间和工作量。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述应用包括：用SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的引物扩增来自待鉴定水稻品种的基因组DNA，如果扩增条带大小为293bp，则预示该待鉴定水稻品种具有稻瘟病抗性。

用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物是根据SEQ ID NO:1所示的抗稻瘟病基因Pid5的特异性序列进行设计的，含有该Pid5基因的核酸材料，能够被扩增出来，不含有SEQ ID NO:1所示的核酸材料，不能扩增出符合预期长度的片段。据此，可以通过扩增的结果，来判断待鉴定水稻品种是否具有稻瘟病抗性，进而辅助育种，缩短育种周期。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明筛选Pid5基因及对其分析的流程示意图。

图2-1为实施例3中水稻材料地谷中接种稻瘟病菌后(5h、10h、20h)8个差异表达NBS-LRR基因的表达模式分析；图中所示为从微阵列芯片(microarray)数据中筛出的8个差异表达基因在地谷和丽江中分别接种稻瘟病菌和水处理后5h，10h和20h的表达水平。表达量受稻瘟病菌诱导上调(或下调)0.5倍及以上的基因即为差异表达基因。其中，基因表达量的上调(或下调)需通过3次生物学重复试验的验证。"Mi"代表稻瘟病菌处理，"mock"代表空白处理。"ND"代表探针信号值没有达到检出下限。

图2-2为实施例3中水稻材料丽江中接种稻瘟病菌后(5h、10h、20h)8个差异表达NBS-LRR基因的表达模式分析；图中所示为从微阵列芯片(microarray)数据中筛出的8个差异表达基因在地谷和丽江中分别接种稻瘟病菌和水处理后5h，10h和20h的表达水平。表达量受稻瘟病菌诱导上调(或下调)0.5倍及以上的基因即为差异表达基因。其中，基因表达量的上调(或下调)需通过3次生物学重复试验的验证。"Mi"代表稻瘟病菌处理，"mock"代表空白处理。"ND"代表探针信号值没有达到检出下限。

图3为实施例3中验证水稻材料地谷和丽江中NBS-DEG7的表达模式结果；图中所示为抗稻瘟病候选基因NBS-DEG7在籼稻材料地谷和粳稻材料丽江接菌后5h、10h、20h、48h、72h和96h的表达模式分析，水稻材料地谷中NBS-DEG7本底表达量较高且受稻瘟病菌诱导特异上调，水稻材料丽江中NBS-DEG7趋于不表达，M.Oryzae表示接稻瘟病菌处理，Mock表示空白对照处理。

图4为实施例4中从水稻材料地谷的BAC文库中筛选到1个扩增呈阳性的BAC(DG-003I21)；对挑选的阳性克隆进行测序发现地谷中Pid5所在的基因座相比参考基因组存在大片段(13.8kb)缺失。

图5为实施例5中PID5蛋白序列和保守结构域分析。下划线标注为CC结构域；方框标注了五个位于NBS结构域的保守基序，按顺序依次为P-loop、Walker B、Kinase3a、GLPL和MHD；LRR区域由23个LRR重复序列组成。

图6为实施例6中Pid5等位基因在水稻品种间的分布和表达谱。图中(A)为利用13.8kb的缺失设计引物DPS1和DPS2，比较DG(Digu)与NIP(Nipponbare)和LTH的基因组序列。引物DPS1和DPS2以灰色表示；(B)为利用引物DPS1和DPS2扩增20个水稻品种的基因组DNA，编号1-10分别代表10个籼稻品种:地谷、谷梅4号、粤丰B、水源290、紫恢100、Khazar、R1088、冈46B、蜀恢527、谷梅2号，编号11-20分别代表10个粳稻品种LTH、TP309、Kitaake、江南香糯、绵粳1、扬粳806、台粳、武运粳7、空育131、日本晴；(C)为20个水稻品种中Pid5等位基因的表达水平，所用RNA是从这些水稻品种的叶片样品中提取的，误差棒表示3次技术重复的标准偏差(SDs)，3个独立的实验重复，得到了相似的结果。

图7为实施例7中Pid5基因(SEQ ID NO:1)转化水稻易感稻瘟病材料TP309的过程；图中(A)为TP309种子发出的愈伤，(B)为准备做转化愈伤，(C)为筛选后的愈伤分化出芽，(D)为移植培养瓶的分化苗，(E)为生根培养基上转基因苗，(F)为转基因苗。

图8为实施例7中Pid5转化水稻材料TP309后的共分离分析，图中：1～6和7～12分别代表同一株系中分离出的抗病和感病单株；Pid5-TG-TP309-2代表Pid5在TP309背景的转基因2号株系的阳性纯合单株。受试材料的基因型检测所用引物为筛选标记潮霉素的检测引物；表型鉴定和记录是在喷雾接种稻瘟病菌8天后进行的。

图9为实施例8中稻瘟病抗性基因Pid5在水稻材料地谷中的时空表达谱分析。

图10为实施例9中融合蛋白PID5-GFP在水稻原生质体中的亚细胞定位；通过共转NLS-mCherry(核定位)和PID5-GFP观察PID5-GFP在水稻原生质体中的亚细胞定位情况，从左到右分别是PID5-GFP(绿色信号)、RFP(NLS为核定位信号)、明场和荧光通道的共定位结果，图中标示为10μm。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

在本发明的实施例部分，我们阐述了抗稻瘟病基因即Pid5基因的克隆过程(图1)和该基因的一系列特征，分离的Pid5基因能够与转化载体连接，导入植物体中，赋予该植物体一定的抗性。

本发明所涉及的水稻材料地谷、丽江、谷梅4号、粤丰B、水源290、紫恢100、Khazar、冈46B、蜀恢527、谷梅2号、TP309、Kitaake、江南香糯、绵粳1、扬粳806、台粳、武运粳7、空育131、日本晴等均可通过中国农科院水稻研究所等公开渠道获取。

实施例1

水稻材料地谷(Oryza sativa indica Digu，DG)和丽江(Oryza sativa japonicaLijiangxintuanheigu，LTH)的抗性鉴定

用4种稻瘟病菌生理小种孢子悬浮液(混合接菌)以及吐温悬浮液对广谱高抗稻瘟病的籼稻材料地谷和普感稻瘟病的粳稻材料丽江的稻苗(分蘖期)进行喷雾接菌。7～15天后观察接菌的水稻材料地谷和丽江的发病情况，水稻材料地谷都表现出抗稻瘟病性状，丽江都表现出感稻瘟病性状，表明地谷和丽江能介导不同的抗、感(稻瘟病)反应。

实施例2

采用多菌株混合接种DG和LTH，在稻瘟病菌侵染细胞的5h、10h和20h进行取样，一共12个处理，每个处理设置3个生物学重复，同时每个处理都设置相同培养条件的对照处理。基因芯片的制备的相关技术由博奥生物技术有限公司生物芯片北京国家工程研究中心提供(http://cn.capitalbio.com/)。

对基因芯片数据中表达量有显著差异的基因进行了统计，水稻材料DG在接种稻瘟病菌后5h、10h和20h检测到表达量显著上调的基因有587个，361个，188个；水稻材料LTH在接种稻瘟病菌后5h、10h和20h检测到表达量显著上调的基因有487个，312个，506个；水稻材料DG在接种稻瘟病菌后5h、10h和20h检测到表达量显著下调的基因有317个，229个，55个；水稻材料LTH在接种稻瘟病菌后5h、10h和20h检测到表达量显著下调的基因有222个，72个，320个。

实施例3

Pid5在DG中特异表达

对表达量有显著差异的基因的序列进行了比对，结合生物信息学与文献分析，在500多个注释编码产物含NB-ARC保守结构域的NBS-LRR类基因中，最终筛选到8个(尚未报道的)差异表达的NBS-LRR类基因。在这8个NBS-LRR基因中，有1个(NBS-DEG7)仅在DG中受诱导表达，而另1个(NBS-DEG4)在DG和LTH中均受诱导，其余6个基因在接种稻瘟病菌后仅在LTH中诱导表达(见图2-1和图2-2)。由于LTH对所检测的稻瘟病菌株完全敏感，我们认为LTH中受诱导上调表达的NBS-LRR基因不太可能导致对稻瘟病菌的抗性。因此，优先考虑将NBS-DEG7作为抗稻瘟病的候选基因，该基因在接种稻瘟病菌的DG材料中特异性上调表达，这可能是导致水稻材料DG和LTH稻瘟病抗性差异的原因之一。

在用4种稻瘟病菌生理小种孢子悬浮液(混合接菌)以及吐温悬浮液接种水稻材料DG和LTH后，通过qRT-PCR检测NBS-DEG7基因的表达量的变化趋势，表明该基因在DG特异表达而在LTH中不表达(表达量维持在非常低的水平)。另外NBS-DEG7在DG中的表达量同样受稻瘟病菌的诱导，而LTH中的表达量未出现受诱导的趋势，一直维持在非常低的水平，基本上不表达(图3)。

因此有理由认为该NBS-DEG7基因是一个在DG中特异表达且受稻瘟病菌诱导的候选抗病基因，本文将这个新的抗稻瘟病候选基因命名为Pid5基因。

实施例4

通过查询GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)数据库和RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu)数据库获得该基因在水稻基因组的注释信息为LOC_Os06g49390，根据已公布的水稻基因组(日本晴序列信息)中该基因LOC号对应的CDS序列和基因组序列分别设计引物对该基因进行扩增但始终无法得到预期大小的扩增产物。因此，我们认为这个新的抗稻瘟病候选基因Pid5在基因组内可能存在及其复杂的结构导致其不能作为模板进行PCR扩增，或者该基因序列存在基因组内大片段缺失。利用本实验室构建的水稻地谷材料的BAC(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)文库筛出8个含LOC_Os06g49390基因区段的BAC。以此为模板分段设计引物扩增这个新的抗稻瘟病候选基因Pid5及其相邻的基因LOC_Os06g49380和LOC_Os06g49420。结果表明DG的BAC文库中这8个BAC都只能扩增出Pid5的部分序列及其相邻基因LOC_Os06g49420的部分片段，将扩增的PCR产物进行测序，结果显示DG基因组内的Pid5基因内确实存在大片段(13.8kb)缺失现象(图4)。

实施例5

Pid5基因结构分析

我们利用第三代测序技术对筛选出的这8个含Pid5基因的BAC克隆子进行全序列测序(PACBIO RSII测序系统)，结果表明抗稻瘟病候选基因Pid5位于水稻基因组6号染色体上，基因组内确实存在约13.8kb的基因片段缺失。参考已公布的水稻材料日本晴(Nipponbare)基因组，我们发现DG中抗稻瘟病候选基因Pid5缺失的基因片段位于LOC_Os06g49390和LOC_Os06g49420的基因序列之间(图4)，根据基因组序列和cDNA序列的测序结果显示，DG中Pid5是对应日本晴基因组中LOC_Os06g49420启动子启动的一个由LOC_Os06g49420部分序列和LOC_Os06g49390部分序列组成的新基因。分析比对三代测序的数据，我们在跨缺失区域在对应的LOC_Os06g49390和LOC_Os06g49420基因组序列上重新设计引物“Primer-42390DF2(该引物位于与LOC_Os06g49390相邻基因LOC_Os06g49420序列的启动子区)”以扩增Pid5，结果显示该引物能扩增与预期大小相符的目的片段并测序正确。

Pid5基因编码出的PID5蛋白序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用蛋白结构域分析数据库SMART(http://smartembl-heidelberg.de/)的在线工具和软件对抗稻瘟病候选基因Pid5测序结果中的序列对应的氨基酸序列进行了分析，结果表明抗稻瘟候选基因Pid5编码产物是一个含1459个氨基酸的CC-NBS-LRR类蛋白，其N-端具有明显的CC结构域，C-末端为23个LRR重复(图5)。

实施例6

Pid5所在位点的片段缺失在籼稻中普遍存在

通过序列比对分析开发了新的多态性检测标记DPS1和DPS2(图6A)，在10个籼稻和10粳稻亲本上检测该分子标记后发现该标记在水稻材料中有多态性(图6B)。对这20份水稻材料中Pid5基因及LOC_Os06g49390等位基因的表达量进行qRT-PCR检测(图6C)，实验结果表明Pid5是一个普遍存在于籼稻材料中的抗稻瘟病候选基因。

实施例7

Pid5的功能互补实验

利用酵母重组的手段从筛选出的水稻材料DG的BAC中克隆了抗稻瘟病候选基因Pid5的全长序列(包含了水稻材料DG中Pid5的自身启动子序列，SEQ ID NO:1)，并通过酶切连接的方法构建到双元载体pCAMBIA2300中，测序正确后，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将抗稻瘟病候选基因Pid5的互补载体转入水稻材料TP309(易于转基因操作的水稻材料)进行功能互补实验(图7、图8)。

我们选取了10个稻瘟病菌生理小种对Pid5转水稻材料TP309的纯合后的多个稳定株系进行了多次、多地(田间喷雾接菌，实验室离体叶片滴菌，温室喷雾接菌)、多个株系的接菌鉴定，实验表明DG中Pid5的转入介导了相应转基因株系对稻瘟病菌生理小种99-20-2的抗性(图8)，表明Pid5是一个从水稻材料DG中克隆出来的新的抗稻瘟病基因。

实施例8

Pid5的表达模式分析

通过对DG各个生育期(苗期、分蘖期，拔节期、孕穗期和成熟期)取样提取RNA后进行qRT-PCR检测，实验结果表明抗稻瘟病基因Pid5在DG全生育期的叶片中均有表达，其中苗期的叶片中表达量最高；而Pid5在水稻材料DG的孕穗期的不同部位(根、茎、叶片和孕穗期的穗部)表达量也有明显差异，其中在穗里的表达量最高(图9)。

实施例9

构建含有绿色荧光融合蛋白的亚细胞定位载体pCAMBIA2300-PID5-GFP并将构建成功的融合载体和空载体分别与带有红色荧光核定位信号(nuclear localizationsignal，NLS)的载体进行水稻原生质体的共转化，然后在激光共聚焦显微镜下观察PID5-GFP融合蛋白的亚细胞定位(图10)，实验结果表明该PID5-GFP融合蛋白在水稻原生质体细胞核与细胞质均有分布。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用

<141> 2021-04-06

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7735

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caatgcataa aatcgatggt tcatttctgc aattggacga ttcattacat ttttagctta 60

gagaaatagt taatacatga ggtacaagag cgaattcctt tggtttccat accgtgacta 120

tgattctgct ttctgccatc cgcaattcag tctaggataa accgaatggc tctcatattg 180

ttctcccatg taaacatatt agctgaaata ggcactatct gaacccaatg gccattgtct 240

atcgatccca atatctttat atagatgcag ttatgattgg ctgcatggct ttaatttctc 300

attttaaact acagaatgca ttttaaggtt tctttgatgt gaattggtaa agtatttggc 360

tgcatacatc cgcgttggat gtagaggccc ggttttaccc gttttctaaa aaataaactg 420

gtaaaataga atatagaagg cggcaattaa tacacagtgt atgctcttac tattgagtgt 480

ttagtgcctt agtgatcaac tggagcatgt aaggatatag acttctgata ctcacagtat 540

ttcaaacttt ggcttataac tttttcacac ttggtttagt atcctcagga accatttagt 600

acaagtcagg caatcctcat gaaccattta gtacaagtca ggcaatgggt tgcactgact 660

aggatttagg agagacagtg agttgcaagc taatgacaat cttcttactg ttttattctt 720

gaaaacctat tttcgagtgt gtgcgtgcgt gtgtgtgtgg ttctatttct agcatatgcc 780

attatgccaa gcatgggcgc atggcacaca actaggattt ttcaggttag aagtgcccat 840

caaggttttg gaaacaggtg gagaaaatgg caaccaaaat atcagcttcg aagacttgga 900

catgcactga tgcacatctg attcttggag attatacgaa gactgtgtgg gatcattacc 960

ataagagcct ccctaaagcg ctctgtggat caagcaaatg gcagctgcta ttggtcaaga 1020

gcagagctcc tctcaaatat taaggcattg caaatgaagc caaatgctgc tggtgcaaaa 1080

ggcctactcc gtatggtgca ccagcaatca ttggggagca cctgcttaga cagcctttaa 1140

caggcacatg cctgcttgat caagaccact ggcattctgg agctgcagaa aacaatggca 1200

acctagaaaa cattattctg cacagagacc cagagcacac tgcagcctgg ttaactgtct 1260

gttggatcta tcgggctatg ttcttcttga ttgtgcaaac aagagttcta ctggatggat 1320

ggagctgtcc aatcaaacta ctacatccgt tccaaaataa gtgcaaccgt agatatccgt 1380

gcccaacgtt tgaccgtccg tcttatttga aaattttgtg aaaaaattga aaatatttag 1440

tcacacataa aatactattc atgttttatc atctaatagc aataaaaata ctaatcataa 1500

aaaaattcaa ataagacgaa cgatcaaacg ttgaacgtga atagtgcaaa actgcactta 1560

tttttgggac ggagggagta tcagttgcag acttgcagtt agatgatgca tggaatgaca 1620

cacttctgtc ggcaagcctg acaagctatt gcattctgga actggtgtcc tcaggcggta 1680

gtttcaagat tgtgcagtga cgagaggtaa attccatatc caggtaattc accgaaggaa 1740

ctgagagatc tcccagatac attacctttc cacttgcaag tagcaaccaa tggactagtt 1800

gatgctgcca tgctgggtcc tccactgcag agtagtaaca acaaacaagt tgagattgcc 1860

agcaagaact gacgagctgt tcagctagca cttgtgtact ccacttatcc actactcctc 1920

caccagtttg ctgcagcttg ctttgctcct acgcccgtgc agctcgcgcg attccggctg 1980

cggcgcacgt tgggatcgat ggagtcggtg gccgttgaag cggcgcggtg gatggtcggc 2040

aaggcgctga gcccgctgtc gggagggctc gtcgaggcgt ggctggcctg ctcggagctc 2100

ggcaccaatg tcggcgccgt caagctggag ctgctctacg cgcaggtgat gctcgacaac 2160

gcccgcggca gggagacccg cagccccgcg ctgaagcagc tgctcctgca gctgcgtggc 2220

ctcgcctacg acgccgagga cgtgctggac gagctggact acttccgcat ccaggacgag 2280

ctcgacggca ccgacgaggc cgccgacgag cacaccagag gctgcctcca tggcctcctc 2340

ctcaacaccc gccacaccgc cagaaacatt aagaagaggt acctttctgc ttgttgctcg 2400

ggcggaggtg acgagaaagc tgttgccggc agtgacctct ctttagctgg tgaacatgat 2460

gccgatgacg actgtaccga tgaagacgac aacgacaccg gctctactga tatcgaccac 2520

agctctactg caacgcacat gcctagaaaa gaaaaacagt ggggatcaca gagggaggac 2580

actatgaaaa caccaaagct gaagttcgat agggtggatc tgtccacaag aacgaagcac 2640

atctctgagc agctgaagct agtctgtgcc aaagtctcta ccattcttaa tctagagttg 2700

ccggaatcaa atcgcaccat tcgaagcagc attgctatgc atcgtcctgt gaccacttca 2760

gcgactatag agcctgaatt ttatgggagg aagggtgaga aggatagaat tattaaagac 2820

ataactcatg gtgattgctg tgtcaaggac ctgaccgtca ttccaattac tggtccagga 2880

ggaataggga agacagctct cactcagcaa atttacaaag cagtaaagaa cctttttgat 2940

gttaatgttt gggtatgtat ctctctcaat ttcaatgcgt acagattgaa acaagagatt 3000

gctgattcaa tacctaaagt tgagaatgag caactgggtg acctagatga cttgattgag 3060

cgaagattga agtcaaagaa gattttgctt gtcttggatg atatgtggaa ttgcagtaat 3120

gaggatgatt ggaaaaggct attagcaccc ctcagaaacg cacaaacaaa gggaaatgtg 3180

attctagtca ccactcgttt tccagcagtt gcagaaatag tacaaaagac ttatcgtcca 3240

atacaattgg aagggctgga atttgaagag ttatgggaat tgttccaagc atatgtgttt 3300

ggtgatgaga aatcaataaa ccatcatgct atcttacaac agactggaga aatgatagcc 3360

aaaaaactaa agggctcccc tttggcagca aaaactgtag gtcgattgtt gagaaatcac 3420

cttgatttca atcattggac aagtgtccta gaaagtaaag aatgggaatt acaaactggt 3480

gacaatgata ttatgccagc attaaagctt agctatgact atctcccttt ccatctgcaa 3540

caatgtttta tatattgtgc tttgttccct gaagattaca agtttgacag tgatgagttg 3600

attcacctat ggataggact agacatttta caatcacatc aggaccaaaa caaacgaact 3660

gaagatatag cattgagttg tttgaatcat ttggttgatt ttggattttt caaaaaaaat 3720

gtgaatgaag atgggtctcc ttattacagt atgcatgatc tactacatga gttagcattg 3780

aaggtttcat cctgtgaatg tcttgctgtc agtagttcta acgtaaggtt tgtgcaaatt 3840

ccaccatcta tacgccattt gtctattgtg atagatgaca tggatgtaaa tgatagagtg 3900

acttttgaaa gcatcaagat ggatttcagc acactaagta agagactgga tgttgaaaag 3960

ctacactctt ttatgctatt tggacgatac catggaagct ttatcagtcc tcttggtgat 4020

ttgttaagta acgcaaaatc actccgcgtc atcttgttgt ctactccatc gtatgcagtg 4080

gagaatatgt tgcacaactt ttcaaatctc gtccacttgc gctacttaag gattattagg 4140

ggatattttc cagaaataag gctacccaac accatttcaa gattttatca cttgaggatc 4200

cttgatgtac gaaaatgcaa tggtcacttt ggtttaccaa gagatataga taatcttgta 4260

aggctacgcc attttcttgt ccccgatgac aatctccact ctgacgttgc taatgtgggt 4320

aagttaaaat gtttacaaga actaaggaga tttaaagtga aaagacaaag tgagccattt 4380

gcattaagac agttaggaca gttggagctg aacggaacac taggcattta taatcttgaa 4440

aatgcagagg cggcggacga agcaaaactt ttaaacaaaa gtcatttgca caagttaata 4500

ttacattggt caacaaagga ttgttcccaa gatgaacata ttcttgaaag tcttaagcca 4560

cataacaatc ttcaggagct acaaattgaa gggcatggag gtgccacttg cccatcatgg 4620

ttgggtttta acttgtcaat caaaggcctg caatctctta gtctgcatgg tctagactgg 4680

aacaaattcc cacctatagg ggagttatgg ttggttaacc agcacagtga aaaatccttg 4740

agttgtatag aaggccaaag cttttggaat ttaaaaaggt tagagctagt tggcataccg 4800

cgactagaaa aatggaccgg aaatgatgct tcccgtgtgt tctctcagct agaagtgttc 4860

atagtaagag attgcccaga acttatagag ttgccatatt caaagatgga cagcactcaa 4920

ttccctacac taaaggagct tgagattgta aaatgcccaa cgctatcatc attgcctccc 4980

gttccttgga caaactctcc atgccgtgct ctgattgaag aagtgagatc agattttcag 5040

cacttgaagt actcaacaaa taaccaatct gaattatgct tgctagttaa gggaaaggac 5100

gacaatctag atagtgcatt ctggaggtta ttggtgttca gtaatctaac tgagctaaaa 5160

gagttgacgt tgacaaagtg ccctcctttg ccattggaac acctacagag tctgtcatca 5220

ttgaggatgc tctgtatgca agacttgagt aatgtcttgt tgcaggacaa agccgagaac 5280

actgtcagat accaatttcc tgttgagcaa cttaggatct ttaactgtag ttgtagcggg 5340

aaggaattga cactgttgtc atcccatttc cccaagctct caatgtttgt aataagggga 5400

tgtgagaata taagagggct tggtgtggcg aagcagggga tgacagcaat gtcagcatcg 5460

tcattgccgt ctgctggtag taagttggag gatgaatgtc tcggacagga gcagcaagaa 5520

ccaggagagg aggatgagaa agcagccgca gatggagggc tgctgctctt acctcagcaa 5580

cttcagtatt tgactatcgg ggaaatgtca gagctggcat tagtatttga cacggcagga 5640

ggcctcagag gcgtaggaga aggattacaa ggtctgcact ccataaaaaa tttgaatata 5700

tggaattgcc ccaatttctt gtcctcctac tcgtcctcct cgcatcattc cccatttccg 5760

tcctccctgc aagaactgtt tcttagttat atgagtggga tgaatactct gtcacccctc 5820

tctaacctca attctcttgc taagttagcc atatgggact ttggggattt aagagctgat 5880

ggcttgggtt ctctcatcgc ccatggccaa ctcaaagagc tagatgtccg gaggtccccc 5940

aacttctttg tcggatccga cctctcgcta ttattgcaac taaaaacgga tgacatcaca 6000

tggctccttg ttgcccctgt ctgcaacatt ctcgcttcct cactcaccga gctgaccatt 6060

ggctggaacg acgaggtgga gcacttcacc aaggggcaaa acgcggccct tctgctcctc 6120

tcctctctcc aggacctccg attttggtgt tactcgaagc tgcgattcct cccagcaggg 6180

ctacacaggc tcacccgcct caagagatta gagatcgcct tgtgtccagc catccgtttg 6240

ctgcccaagg gcggtcttcc gagatcacta aaagtattaa aagtattaga tgtcagtgag 6300

agcaaaaacg aggagctcaa aagacagtgc cgtaagctaa gaggaaccat tccgatcatc 6360

caagacagaa agtactaata atccaaggta caggtaacaa acatgcccct tttcaactca 6420

tacccgatta atttctgttt ggtaaaatgc acgcactgct tgactcatcg atctgatcaa 6480

ccttgtaacc tgctgtgcag gtttcatctt ggattgatat gggccttatt ctagcgcctc 6540

tgcataatct tttgcatcct acacagtttt gtgttgataa gtgtgaagac gtcaacttgt 6600

tccgcttcca gcgtctacac taacatctca tataagttct tcgctgtcgc tcctttattt 6660

ggttatatac ttattttgtc actgttctct tttttaatct ttcagctgtt ctgtcagtga 6720

gagaattgtt tgctttcacg gaaattaatg atctgttagt tcagttcctt gtcaaatttg 6780

atgtctgaga ctcagtgttc caagtagtta tctgatgaac taaaacttat gcaaaatgtt 6840

aatgacacgg tttgagagat tgtattgttt taaggaagac aagtcaatgt gtcattgaca 6900

agtcatgtac tcttgttgat ctttcatatt cttctactat tcgtaacact tgtttcagtt 6960

attaattctt aacagttcat aattggaaca catattcttc ttaaatcata tgaaatgcaa 7020

gcttcatttt tgccctcagc ctctgagagc aaatagctat tacttgttga tcaggaagag 7080

gttcttaact ttgcgatagt ttttctttac cttttcaggc gcatgatatg acgatatcag 7140

ctcactcaat agtatgttta ctctccgctc cacttcactt cactagtgag attattagtt 7200

tttaaattta aagattattg gcaaagtggt tttgaagatg attggatttt tagatgatga 7260

acggggattg cttataaatt aggtatcgaa aaacataaac atacttttct agagataaaa 7320

gaaaactaac atactattct taattaatag atatacttgt catgccacat cctccttgaa 7380

ctcggactct tttgaataaa ttttctttaa ttgatccgac tccatataaa acacaattgc 7440

tggcgacttg acaactccca tcggccgatt ccaagactct gaagccgata gtgactctat 7500

gccgatgatg acttcgggct taccaaattt tggtgttaat agcacgtcgc tccattcccg 7560

ccctgtcgct ggaggagaca aggagctagg cgtcggtggg ggcgacggag atgacctcga 7620

ctgcgttctc gccatgggca gggctcccac cctatcccct cgcatctcct ctgccttttt 7680

ggtgtgttgt cgtcgatagc ggcactgcct cggtgaagag attgaggaga tagag 7735

<210> 2

<211> 1459

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Ser Val Ala Val Glu Ala Ala Arg Trp Met Val Gly Lys Ala

1 5 10 15

Leu Ser Pro Leu Ser Gly Gly Leu Val Glu Ala Trp Leu Ala Cys Ser

20 25 30

Glu Leu Gly Thr Asn Val Gly Ala Val Lys Leu Glu Leu Leu Tyr Ala

35 40 45

Gln Val Met Leu Asp Asn Ala Arg Gly Arg Glu Thr Arg Ser Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Gln Leu Leu Leu Gln Leu Arg Gly Leu Ala Tyr Asp Ala Glu

65 70 75 80

Asp Val Leu Asp Glu Leu Asp Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Glu Leu Asp

85 90 95

Gly Thr Asp Glu Ala Ala Asp Glu His Thr Arg Gly Cys Leu His Gly

100 105 110

Leu Leu Leu Asn Thr Arg His Thr Ala Arg Asn Ile Lys Lys Arg Tyr

115 120 125

Leu Ser Ala Cys Cys Ser Gly Gly Gly Asp Glu Lys Ala Val Ala Gly

130 135 140

Ser Asp Leu Ser Leu Ala Gly Glu His Asp Ala Asp Asp Asp Cys Thr

145 150 155 160

Asp Glu Asp Asp Asn Asp Thr Gly Ser Thr Asp Ile Asp His Ser Ser

165 170 175

Thr Ala Thr His Met Pro Arg Lys Glu Lys Gln Trp Gly Ser Gln Arg

180 185 190

Glu Asp Thr Met Lys Thr Pro Lys Leu Lys Phe Asp Arg Val Asp Leu

195 200 205

Ser Thr Arg Thr Lys His Ile Ser Glu Gln Leu Lys Leu Val Cys Ala

210 215 220

Lys Val Ser Thr Ile Leu Asn Leu Glu Leu Pro Glu Ser Asn Arg Thr

225 230 235 240

Ile Arg Ser Ser Ile Ala Met His Arg Pro Val Thr Thr Ser Ala Thr

245 250 255

Ile Glu Pro Glu Phe Tyr Gly Arg Lys Gly Glu Lys Asp Arg Ile Ile

260 265 270

Lys Asp Ile Thr His Gly Asp Cys Cys Val Lys Asp Leu Thr Val Ile

275 280 285

Pro Ile Thr Gly Pro Gly Gly Ile Gly Lys Thr Ala Leu Thr Gln Gln

290 295 300

Ile Tyr Lys Ala Val Lys Asn Leu Phe Asp Val Asn Val Trp Val Cys

305 310 315 320

Ile Ser Leu Asn Phe Asn Ala Tyr Arg Leu Lys Gln Glu Ile Ala Asp

325 330 335

Ser Ile Pro Lys Val Glu Asn Glu Gln Leu Gly Asp Leu Asp Asp Leu

340 345 350

Ile Glu Arg Arg Leu Lys Ser Lys Lys Ile Leu Leu Val Leu Asp Asp

355 360 365

Met Trp Asn Cys Ser Asn Glu Asp Asp Trp Lys Arg Leu Leu Ala Pro

370 375 380

Leu Arg Asn Ala Gln Thr Lys Gly Asn Val Ile Leu Val Thr Thr Arg

385 390 395 400

Phe Pro Ala Val Ala Glu Ile Val Gln Lys Thr Tyr Arg Pro Ile Gln

405 410 415

Leu Glu Gly Leu Glu Phe Glu Glu Leu Trp Glu Leu Phe Gln Ala Tyr

420 425 430

Val Phe Gly Asp Glu Lys Ser Ile Asn His His Ala Ile Leu Gln Gln

435 440 445

Thr Gly Glu Met Ile Ala Lys Lys Leu Lys Gly Ser Pro Leu Ala Ala

450 455 460

Lys Thr Val Gly Arg Leu Leu Arg Asn His Leu Asp Phe Asn His Trp

465 470 475 480

Thr Ser Val Leu Glu Ser Lys Glu Trp Glu Leu Gln Thr Gly Asp Asn

485 490 495

Asp Ile Met Pro Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Asp Tyr Leu Pro Phe His

500 505 510

Leu Gln Gln Cys Phe Ile Tyr Cys Ala Leu Phe Pro Glu Asp Tyr Lys

515 520 525

Phe Asp Ser Asp Glu Leu Ile His Leu Trp Ile Gly Leu Asp Ile Leu

530 535 540

Gln Ser His Gln Asp Gln Asn Lys Arg Thr Glu Asp Ile Ala Leu Ser

545 550 555 560

Cys Leu Asn His Leu Val Asp Phe Gly Phe Phe Lys Lys Asn Val Asn

565 570 575

Glu Asp Gly Ser Pro Tyr Tyr Ser Met His Asp Leu Leu His Glu Leu

580 585 590

Ala Leu Lys Val Ser Ser Cys Glu Cys Leu Ala Val Ser Ser Ser Asn

595 600 605

Val Arg Phe Val Gln Ile Pro Pro Ser Ile Arg His Leu Ser Ile Val

610 615 620

Ile Asp Asp Met Asp Val Asn Asp Arg Val Thr Phe Glu Ser Ile Lys

625 630 635 640

Met Asp Phe Ser Thr Leu Ser Lys Arg Leu Asp Val Glu Lys Leu His

645 650 655

Ser Phe Met Leu Phe Gly Arg Tyr His Gly Ser Phe Ile Ser Pro Leu

660 665 670

Gly Asp Leu Leu Ser Asn Ala Lys Ser Leu Arg Val Ile Leu Leu Ser

675 680 685

Thr Pro Ser Tyr Ala Val Glu Asn Met Leu His Asn Phe Ser Asn Leu

690 695 700

Val His Leu Arg Tyr Leu Arg Ile Ile Arg Gly Tyr Phe Pro Glu Ile

705 710 715 720

Arg Leu Pro Asn Thr Ile Ser Arg Phe Tyr His Leu Arg Ile Leu Asp

725 730 735

Val Arg Lys Cys Asn Gly His Phe Gly Leu Pro Arg Asp Ile Asp Asn

740 745 750

Leu Val Arg Leu Arg His Phe Leu Val Pro Asp Asp Asn Leu His Ser

755 760 765

Asp Val Ala Asn Val Gly Lys Leu Lys Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg

770 775 780

Phe Lys Val Lys Arg Gln Ser Glu Pro Phe Ala Leu Arg Gln Leu Gly

785 790 795 800

Gln Leu Glu Leu Asn Gly Thr Leu Gly Ile Tyr Asn Leu Glu Asn Ala

805 810 815

Glu Ala Ala Asp Glu Ala Lys Leu Leu Asn Lys Ser His Leu His Lys

820 825 830

Leu Ile Leu His Trp Ser Thr Lys Asp Cys Ser Gln Asp Glu His Ile

835 840 845

Leu Glu Ser Leu Lys Pro His Asn Asn Leu Gln Glu Leu Gln Ile Glu

850 855 860

Gly His Gly Gly Ala Thr Cys Pro Ser Trp Leu Gly Phe Asn Leu Ser

865 870 875 880

Ile Lys Gly Leu Gln Ser Leu Ser Leu His Gly Leu Asp Trp Asn Lys

885 890 895

Phe Pro Pro Ile Gly Glu Leu Trp Leu Val Asn Gln His Ser Glu Lys

900 905 910

Ser Leu Ser Cys Ile Glu Gly Gln Ser Phe Trp Asn Leu Lys Arg Leu

915 920 925

Glu Leu Val Gly Ile Pro Arg Leu Glu Lys Trp Thr Gly Asn Asp Ala

930 935 940

Ser Arg Val Phe Ser Gln Leu Glu Val Phe Ile Val Arg Asp Cys Pro

945 950 955 960

Glu Leu Ile Glu Leu Pro Tyr Ser Lys Met Asp Ser Thr Gln Phe Pro

965 970 975

Thr Leu Lys Glu Leu Glu Ile Val Lys Cys Pro Thr Leu Ser Ser Leu

980 985 990

Pro Pro Val Pro Trp Thr Asn Ser Pro Cys Arg Ala Leu Ile Glu Glu

995 1000 1005

Val Arg Ser Asp Phe Gln His Leu Lys Tyr Ser Thr Asn Asn Gln Ser

1010 1015 1020

Glu Leu Cys Leu Leu Val Lys Gly Lys Asp Asp Asn Leu Asp Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Phe Trp Arg Leu Leu Val Phe Ser Asn Leu Thr Glu Leu Lys Glu Leu

1045 1050 1055

Thr Leu Thr Lys Cys Pro Pro Leu Pro Leu Glu His Leu Gln Ser Leu

1060 1065 1070

Ser Ser Leu Arg Met Leu Cys Met Gln Asp Leu Ser Asn Val Leu Leu

1075 1080 1085

Gln Asp Lys Ala Glu Asn Thr Val Arg Tyr Gln Phe Pro Val Glu Gln

1090 1095 1100

Leu Arg Ile Phe Asn Cys Ser Cys Ser Gly Lys Glu Leu Thr Leu Leu

1105 1110 1115 1120

Ser Ser His Phe Pro Lys Leu Ser Met Phe Val Ile Arg Gly Cys Glu

1125 1130 1135

Asn Ile Arg Gly Leu Gly Val Ala Lys Gln Gly Met Thr Ala Met Ser

1140 1145 1150

Ala Ser Ser Leu Pro Ser Ala Gly Ser Lys Leu Glu Asp Glu Cys Leu

1155 1160 1165

Gly Gln Glu Gln Gln Glu Pro Gly Glu Glu Asp Glu Lys Ala Ala Ala

1170 1175 1180

Asp Gly Gly Leu Leu Leu Leu Pro Gln Gln Leu Gln Tyr Leu Thr Ile

1185 1190 1195 1200

Gly Glu Met Ser Glu Leu Ala Leu Val Phe Asp Thr Ala Gly Gly Leu

1205 1210 1215

Arg Gly Val Gly Glu Gly Leu Gln Gly Leu His Ser Ile Lys Asn Leu

1220 1225 1230

Asn Ile Trp Asn Cys Pro Asn Phe Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Ser

1235 1240 1245

His His Ser Pro Phe Pro Ser Ser Leu Gln Glu Leu Phe Leu Ser Tyr

1250 1255 1260

Met Ser Gly Met Asn Thr Leu Ser Pro Leu Ser Asn Leu Asn Ser Leu

1265 1270 1275 1280

Ala Lys Leu Ala Ile Trp Asp Phe Gly Asp Leu Arg Ala Asp Gly Leu

1285 1290 1295

Gly Ser Leu Ile Ala His Gly Gln Leu Lys Glu Leu Asp Val Arg Arg

1300 1305 1310

Ser Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Asp Leu Ser Leu Leu Leu Gln Leu

1315 1320 1325

Lys Thr Asp Asp Ile Thr Trp Leu Leu Val Ala Pro Val Cys Asn Ile

1330 1335 1340

Leu Ala Ser Ser Leu Thr Glu Leu Thr Ile Gly Trp Asn Asp Glu Val

1345 1350 1355 1360

Glu His Phe Thr Lys Gly Gln Asn Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ser

1365 1370 1375

Leu Gln Asp Leu Arg Phe Trp Cys Tyr Ser Lys Leu Arg Phe Leu Pro

1380 1385 1390

Ala Gly Leu His Arg Leu Thr Arg Leu Lys Arg Leu Glu Ile Ala Leu

1395 1400 1405

Cys Pro Ala Ile Arg Leu Leu Pro Lys Gly Gly Leu Pro Arg Ser Leu

1410 1415 1420

Lys Val Leu Lys Val Leu Asp Val Ser Glu Ser Lys Asn Glu Glu Leu

1425 1430 1435 1440

Lys Arg Gln Cys Arg Lys Leu Arg Gly Thr Ile Pro Ile Ile Gln Asp

1445 1450 1455

Arg Lys Tyr

<210> 3

<211> 4380

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagtcgg tggccgttga agcggcgcgg tggatggtcg gcaaggcgct gagcccgctg 60

tcgggagggc tcgtcgaggc gtggctggcc tgctcggagc tcggcaccaa tgtcggcgcc 120

gtcaagctgg agctgctcta cgcgcaggtg atgctcgaca acgcccgcgg cagggagacc 180

cgcagccccg cgctgaagca gctgctcctg cagctgcgtg gcctcgccta cgacgccgag 240

gacgtgctgg acgagctgga ctacttccgc atccaggacg agctcgacgg caccgacgag 300

gccgccgacg agcacaccag aggctgcctc catggcctcc tcctcaacac ccgccacacc 360

gccagaaaca ttaagaagag gtacctttct gcttgttgct cgggcggagg tgacgagaaa 420

gctgttgccg gcagtgacct ctctttagct ggtgaacatg atgccgatga cgactgtacc 480

gatgaagacg acaacgacac cggctctact gatatcgacc acagctctac tgcaacgcac 540

atgcctagaa aagaaaaaca gtggggatca cagagggagg acactatgaa aacaccaaag 600

ctgaagttcg atagggtgga tctgtccaca agaacgaagc acatctctga gcagctgaag 660

ctagtctgtg ccaaagtctc taccattctt aatctagagt tgccggaatc aaatcgcacc 720

attcgaagca gcattgctat gcatcgtcct gtgaccactt cagcgactat agagcctgaa 780

ttttatggga ggaagggtga gaaggataga attattaaag acataactca tggtgattgc 840

tgtgtcaagg acctgaccgt cattccaatt actggtccag gaggaatagg gaagacagct 900

ctcactcagc aaatttacaa agcagtaaag aacctttttg atgttaatgt ttgggtatgt 960

atctctctca atttcaatgc gtacagattg aaacaagaga ttgctgattc aatacctaaa 1020

gttgagaatg agcaactggg tgacctagat gacttgattg agcgaagatt gaagtcaaag 1080

aagattttgc ttgtcttgga tgatatgtgg aattgcagta atgaggatga ttggaaaagg 1140

ctattagcac ccctcagaaa cgcacaaaca aagggaaatg tgattctagt caccactcgt 1200

tttccagcag ttgcagaaat agtacaaaag acttatcgtc caatacaatt ggaagggctg 1260

gaatttgaag agttatggga attgttccaa gcatatgtgt ttggtgatga gaaatcaata 1320

aaccatcatg ctatcttaca acagactgga gaaatgatag ccaaaaaact aaagggctcc 1380

cctttggcag caaaaactgt aggtcgattg ttgagaaatc accttgattt caatcattgg 1440

acaagtgtcc tagaaagtaa agaatgggaa ttacaaactg gtgacaatga tattatgcca 1500

gcattaaagc ttagctatga ctatctccct ttccatctgc aacaatgttt tatatattgt 1560

gctttgttcc ctgaagatta caagtttgac agtgatgagt tgattcacct atggatagga 1620

ctagacattt tacaatcaca tcaggaccaa aacaaacgaa ctgaagatat agcattgagt 1680

tgtttgaatc atttggttga ttttggattt ttcaaaaaaa atgtgaatga agatgggtct 1740

ccttattaca gtatgcatga tctactacat gagttagcat tgaaggtttc atcctgtgaa 1800

tgtcttgctg tcagtagttc taacgtaagg tttgtgcaaa ttccaccatc tatacgccat 1860

ttgtctattg tgatagatga catggatgta aatgatagag tgacttttga aagcatcaag 1920

atggatttca gcacactaag taagagactg gatgttgaaa agctacactc ttttatgcta 1980

tttggacgat accatggaag ctttatcagt cctcttggtg atttgttaag taacgcaaaa 2040

tcactccgcg tcatcttgtt gtctactcca tcgtatgcag tggagaatat gttgcacaac 2100

ttttcaaatc tcgtccactt gcgctactta aggattatta ggggatattt tccagaaata 2160

aggctaccca acaccatttc aagattttat cacttgagga tccttgatgt acgaaaatgc 2220

aatggtcact ttggtttacc aagagatata gataatcttg taaggctacg ccattttctt 2280

gtccccgatg acaatctcca ctctgacgtt gctaatgtgg gtaagttaaa atgtttacaa 2340

gaactaagga gatttaaagt gaaaagacaa agtgagccat ttgcattaag acagttagga 2400

cagttggagc tgaacggaac actaggcatt tataatcttg aaaatgcaga ggcggcggac 2460

gaagcaaaac ttttaaacaa aagtcatttg cacaagttaa tattacattg gtcaacaaag 2520

gattgttccc aagatgaaca tattcttgaa agtcttaagc cacataacaa tcttcaggag 2580

ctacaaattg aagggcatgg aggtgccact tgcccatcat ggttgggttt taacttgtca 2640

atcaaaggcc tgcaatctct tagtctgcat ggtctagact ggaacaaatt cccacctata 2700

ggggagttat ggttggttaa ccagcacagt gaaaaatcct tgagttgtat agaaggccaa 2760

agcttttgga atttaaaaag gttagagcta gttggcatac cgcgactaga aaaatggacc 2820

ggaaatgatg cttcccgtgt gttctctcag ctagaagtgt tcatagtaag agattgccca 2880

gaacttatag agttgccata ttcaaagatg gacagcactc aattccctac actaaaggag 2940

cttgagattg taaaatgccc aacgctatca tcattgcctc ccgttccttg gacaaactct 3000

ccatgccgtg ctctgattga agaagtgaga tcagattttc agcacttgaa gtactcaaca 3060

aataaccaat ctgaattatg cttgctagtt aagggaaagg acgacaatct agatagtgca 3120

ttctggaggt tattggtgtt cagtaatcta actgagctaa aagagttgac gttgacaaag 3180

tgccctcctt tgccattgga acacctacag agtctgtcat cattgaggat gctctgtatg 3240

caagacttga gtaatgtctt gttgcaggac aaagccgaga acactgtcag ataccaattt 3300

cctgttgagc aacttaggat ctttaactgt agttgtagcg ggaaggaatt gacactgttg 3360

tcatcccatt tccccaagct ctcaatgttt gtaataaggg gatgtgagaa tataagaggg 3420

cttggtgtgg cgaagcaggg gatgacagca atgtcagcat cgtcattgcc gtctgctggt 3480

agtaagttgg aggatgaatg tctcggacag gagcagcaag aaccaggaga ggaggatgag 3540

aaagcagccg cagatggagg gctgctgctc ttacctcagc aacttcagta tttgactatc 3600

ggggaaatgt cagagctggc attagtattt gacacggcag gaggcctcag aggcgtagga 3660

gaaggattac aaggtctgca ctccataaaa aatttgaata tatggaattg ccccaatttc 3720

ttgtcctcct actcgtcctc ctcgcatcat tccccatttc cgtcctccct gcaagaactg 3780

tttcttagtt atatgagtgg gatgaatact ctgtcacccc tctctaacct caattctctt 3840

gctaagttag ccatatggga ctttggggat ttaagagctg atggcttggg ttctctcatc 3900

gcccatggcc aactcaaaga gctagatgtc cggaggtccc ccaacttctt tgtcggatcc 3960

gacctctcgc tattattgca actaaaaacg gatgacatca catggctcct tgttgcccct 4020

gtctgcaaca ttctcgcttc ctcactcacc gagctgacca ttggctggaa cgacgaggtg 4080

gagcacttca ccaaggggca aaacgcggcc cttctgctcc tctcctctct ccaggacctc 4140

cgattttggt gttactcgaa gctgcgattc ctcccagcag ggctacacag gctcacccgc 4200

ctcaagagat tagagatcgc cttgtgtcca gccatccgtt tgctgcccaa gggcggtctt 4260

ccgagatcac taaaagtatt aaaagtatta gatgtcagtg agagcaaaaa cgaggagctc 4320

aaaagacagt gccgtaagct aagaggaacc attccgatca tccaagacag aaagtactaa 4380

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagatggaca gcactcaatt ccc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatggcaaag gagggcactt 20

Claims (10)

1.一种抗稻瘟病蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的水稻抗稻瘟病蛋白。

3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，其核酸序列SEQ ID NO:3所示。

4.一种抗稻瘟病基因，其特征在于，其核酸序列SEQ ID NO:1所示。

5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的分离的核酸分子，或者权利要求4所述的抗稻瘟病基因。

6.含有权利要求2或3所述的分离的核酸分子、权利要求4所述的抗稻瘟病基因、或者权利要求5所述的载体的重组细胞或重组菌。

7.权利要求1所述的抗稻瘟病蛋白、权利要求2或3所述的分离的核酸分子，权利要求4所述的抗稻瘟病基因、权利要求5所述的载体、或者权利要求6所述的重组细胞或重组菌在培育抗稻瘟病水稻品种或提高水稻抗稻瘟病抗性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述稻瘟病抗性为稻瘟病菌抗性。

9.权利要求3所述的分离的核酸分子或权利要求4所述的抗稻瘟病基因的特异序列作为分子标记在辅助育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其包括：用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物扩增来自待鉴定水稻品种的基因组DNA，如果扩增条带大小为293bp，则预示该待鉴定水稻品种可能具有稻瘟病抗性。

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