CN116053017B - 一种复合磁性微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合磁性微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微纳米材料的技术领域，公开了一种复合磁性微球及其制备方法和应用。所述磁性微球的制备方法使用经过硫酸多粘菌素B处理的小球藻作为磁性微球模板，采用共沉淀法制备得到细胞磁核复合体，在细胞磁核复合体外表面上包覆二氧化硅层制备得到磁性微球。本发明采用小球藻作为磁性微球模板，在小球藻细胞内及细胞表面上通过共沉淀生成磁性颗粒，获得形态可选、粒径可选的单分散多磁核复合体，可以实现粒径单分散磁性微球的低成本及大规模工业生产。

Description

一种复合磁性微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微纳米材料的技术领域，尤其涉及一种复合磁性微球及其制备方法和应用。
背景技术
磁性微球是近年来发展起来的一种新型磁性材料，通过适当的方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性和特殊结构的复合微球。磁性微球的表面可通过共聚、表面修饰等方法赋予-COOH、-NH2、-OH、-SH、-NHS、-CHO以及-Epoxy等活性基团，使得可通过物理吸附、共价作用等将抗体、酶、核酸及寡核苷酸等生物活性物质偶联在磁性微球的表面上，制备得到的偶联有生物活性物质的磁性微球可运用于环境监测、酶的固定化、靶向给药、免疫分析、细胞分离以及核酸分离纯化等方面。
目前，磁性微球制备的研究主要围绕着如何制备出具有高磁响应性、超顺磁性、高比表面积、粒径单分散且分散较窄的磁性微球展开，常见的制备方法包括包埋法、单体聚合法以及渗透沉积法等方法。
包埋法是将磁性颗粒分散于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段，使高分子包裹在磁性颗粒四周，并利用交联剂对高分子进行交联，形成具有磁核的高分子微球；利用包埋法制备磁性微球，方法简洁，但得到的磁球粒径不易掌握且粒径分布较宽、壳层中往往夹杂乳化剂等杂质。单体聚合法指在活性单体、磁性微粒以及引发剂、稳定剂等共存的条件下，引发聚合反应而形成核一壳式磁性高分子磁球的一类方法；但由于磁性无机粒子的亲水性较强，对于油性单体而言，聚合反应难以在磁性无机粒子的表面进行，对于磁性微球的制备具有一定的限制。
上述磁性微球的制备方法中，步骤较为繁琐且条件严格，较难实现磁性微球的工业化生产；同时，制备得到的磁性微球的粒径较小且粒径分布较宽，限制了其的应用。
发明内容
为了制备得到单分散性且磁性强的磁性微球，并实现磁性微球的低成本工业化生产，本发明提供了一种复合磁性微球及其制备方法和应用。
小球藻为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径在2～8μm，且具有三层细胞壁，十分坚韧。以小球藻作为模板来制备磁性微球，首先，可克服现有技术中纳米颗粒容易团聚导致制备的磁核体粒径较小的缺陷；其次，小球藻的三层细胞壁结构，使得制备得到磁性微球相较于常规的通过物理、化学作用力团聚在一起的磁核体而言，具有更高的稳定性；再者，通过选择不同形态、大小的小球藻作为模板，来实现调控制备得到的磁性微球的形态、大小，提高了磁性微球制备的可控性，可实现特定形态、尺寸的磁性微球的大批量生产。
本发明的发明人经过深入且广泛研究之后发现，在磁性微球的制备过程中，使用硫酸多粘菌素B对小球藻进行处理，能够改变小球藻细胞膜的渗透性，使得Fe3+、Fe2+及NH3可渗透进入到小球藻细胞内，Fe3+、Fe2+与NH3在小球藻细胞内发生共沉淀生成Fe3O4，同时也可在小球藻细胞壁靠近胞外的一侧共沉淀生成Fe3O4，使得制备得到的磁性微球具有强磁力；同时，硫酸多粘菌素B并不会破坏小球藻细胞结构的完整性，减少制备过程中粒子的团聚，保证了磁性微球有较强的磁性、良好的分散性以及完整性。基于此，完成了本发明。
第一方面，本发明提供的磁性微球的制备方法采用以下的技术方案：
一种复合磁性微球的制备方法，使用经过硫酸多粘菌素B处理的小球藻作为所述磁性微球模板，采用共沉淀法制备得到细胞磁核复合体，在所述细胞磁核复合体外表面上包覆二氧化硅层制备得到所述磁性微球。
进一步地，所述磁性微球的制备方法具体包括以下步骤：
S1、将小球藻溶液、硫酸多粘菌素B以及磁制备液按一定比例混匀溶解，持续搅拌，制得混合液；
S2、往所述混合液中加入氨水并加热反应，磁分离去上清，制备得到所述细胞磁核复合体；
S3、往所述细胞磁核复合体中依次加入有机溶剂、氨水以及硅烷试剂进行偶联反应，磁分离去上清，制备得到所述磁性微球。
进一步地，所述磁制备液包括Fe3+和Fe2+。
进一步地，所述混合液中，小球藻的浓度为1.0×109～1.2×109个/mL，硫酸多粘菌素B的浓度为0.080～0.090g/L。
进一步地，所述硅烷试剂选自硅酸四乙酯、甲基三甲氧基硅烷、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、二乙基二甲氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷或γ-巯基丙基甲基二甲氧基硅烷中的一种或多种。
进一步地，所述S1中，所述持续搅拌的时间为20～40min。当将小球藻溶液、硫酸多粘菌素B以及磁制备液持续搅拌的时间控制在以上范围内时，能够使得硫酸多粘菌素B充分与小球藻细胞作用，保证进入至小球藻细胞内Fe3+和Fe2+的量，并且小球藻的细胞膜能够达到较好的通透状态，有利于后续NH3进入至细胞内发生共沉淀反应。
进一步地，所述S2中，所述加热反应在搅拌状态下进行，且加热反应的条件包括反应温度为45～55℃，反应时间为0.8～1.5h。
进一步地，所述偶联反应的方式为往所述细胞磁核复合体中加入有机溶剂，再边搅拌边加入氨水，最后加入硅烷试剂，并反应2.5～3.5h。
第二方面，本发明提供的磁性微球采用以下的技术方案：
一种磁性微球，通过上述磁性微球的制备方法制备得到。
进一步地，所述磁性微球包括细胞磁核复合体和包覆在所述细胞磁核复合体外表面的SiO2层；所述细胞磁核复合体包括小球藻微球骨架和Fe3O4粒子，所述Fe3O4粒子沉积在小球藻的细胞内和/或细胞壁靠近胞外的一侧上。
进一步地，所述磁性微球的平均粒径为2～5μm，所述磁性微球中粒径为2～5μm的磁性微球占比93～97％。
第三方面，本发明提供了通过上述磁性微球的制备方法制备得到的磁性微球和/或上述磁性微球在生物分子分离、纯化及检测中的应用。
有益效果：
(1)本发明可挑选不同形态、大小的小球藻作为现成的微球模板，仅需通过共沉淀法，不需要复杂的化学试剂及苛刻的化学物理条件就可实现对磁性微球粒径的调控，满足磁性微球制备的简易型、产能放大以及成本低控等产业化要求；
(2)本发明使用的小球藻具有三层细胞壁，以其作为磁性微球的模板，制备得到的磁性微球结构稳定且具有良好的生物相容性，具有更高的应用范围；
(3)本发明中使用硫酸多粘菌素B对小球藻进行处理，在提高小球藻细胞膜通透性的同时保持小球藻细胞形态的完整性，制备得到的磁性微球具有较强的磁性、分散性以及完整性。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的磁性微球的SEM图。
具体实施方式
本申请提供了一种磁性微球的制备方法，使用经过硫酸多粘菌素B处理的小球藻作为所述磁性微球模板，采用共沉淀法制备得到细胞磁核复合体，在所述细胞磁核复合体外表面上包覆二氧化硅层制备得到所述磁性微球。
本发明中磁性微球的制备具体包括以下步骤：
S1、将小球藻溶液、硫酸多粘菌素B以及磁制备液按一定比例混匀溶解，持续搅拌，制得混合液；
S2、往所述混合液中加入氨水并加热反应，磁分离去上清，制备得到所述细胞磁核复合体；
S3、往所述细胞磁核复合体中依次加入有机溶剂、氨水以及硅烷试剂进行反应，磁分离去上清，制备得到所述磁性微球。
本发明中，S1中将小球藻溶液、硫酸多粘菌素B以及磁制备液混合持续搅拌一段时间，优选持续搅拌的时间为20～40min，如此能够在使硫酸多粘菌素B与小球藻细胞实现充分作用的同时，使得部分的Fe3+、Fe2+进入到小球藻细胞中，可在小球藻细胞内发生共沉淀反应生成数量较多的Fe3O4磁性颗粒。
在一个实施方式中，所述磁制备液包括Fe3+和Fe2+，优选由铁盐和亚铁盐混合配制而成，如可以由氯化铁、氯化亚铁以及超纯水配制得到。其中，Fe3+的浓度优选为0.30～0.40mol/L，Fe2+的浓度优选为0.60～0.70mol/L，此时更有利于Fe3O4磁性颗粒的形成。铁盐可以是但不限于硫酸铁、氯化铁以及硝酸盐等，亚铁盐可以是但不限于硫酸亚铁、氯化亚铁等。在一个实施方式中，所述混合液中，小球藻的浓度为1.0×109～1.2×109个/mL，硫酸多粘菌素B的浓度为0.80～0.90g/L，当将小球藻和硫酸多粘菌素B的浓度控制在以上范围内，能够更好地改变小球藻细胞膜的渗透性，从而更有利于Fe3+、Fe2+及NH3渗透进入到小球藻细胞内。
本发明步骤S2中制备的条件具体为，氨水是在持续搅拌的条件下加入混合液中，氨水与混合液中的Fe3+、Fe2+发生共沉淀反应生成黑色的四氧化三铁颗粒。加热反应的温度优选为45～55℃，如45℃、47℃、50℃、53℃或55℃；而反应时间随着反应温度的改变作出适应性的变化，优选为0.8～1.5h，如0.8h、1.0h、1.2h或1.5h。
本发明对硅烷试剂的种类没有特别的限定，可以为现有的各种能够对细胞磁核复合体实现包覆的含硅试剂，其具体实例包括但不限于：硅酸四乙酯、甲基三甲氧基硅烷、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、二乙基二甲氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷或γ-巯基丙基甲基二甲氧基硅烷中的一种或多种。
本发明中，步骤S3中硅烷试剂的投入量为0.10～0.20mL/1g细胞磁核复合体，硅烷试剂在氨水存在下发生反应，在细胞磁核复合体的表面上沉积形成二氧化硅层，优选反应时间为2.5～3.5h。往制备得到的细胞磁核复合体中加入硅烷试剂，在细胞磁核复合体外表面包覆在一层二氧化硅层来加固提高细胞核磁复合体的结构整体度，使得制备的磁性微球具有稳定的结构；同时，可在二氧化硅层上再修饰接枝上所需要的官能团，可提高磁性微球对于特定物质的选择性，使得磁性微球可适用于更加高精度的检测或高要求的分离纯化中，具有更广的适用范围。
本申请还提供了通过上述磁性微球的制备方法制备得到的磁性微球。
在一个实施方式中，磁性微球包括细胞磁核复合体和包覆在所述细胞磁核复合体外表面的SiO2层；所述细胞磁核复合体包括小球藻微球骨架和Fe3O4粒子，所述Fe3O4粒子沉积在小球藻的细胞内和/或细胞壁靠近胞外的一侧上。
在一个实施方式中，所述磁性微球的平均粒径约为3μm，所述磁性微球中粒径为2～5μm的磁性微球占比93～97％。
本申请还提供了通过上述磁性微球的制备方法制备得到的磁性微球和/或上述磁性微球在生物分子分离、纯化及检测中的应用。
本发明提供的磁性微球可通过在表面包被上特异性抗体或核酸探针，与含有相应抗原或靶序列的核酸片段特异性结合形成复合物，之后在磁场的作用下实现与其他组分的分离；可再进一步引入显色、荧光以及化学发光等信号基团，用于生物分子的检测。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.一种磁性微球及其制备方法
本实施例中提供了一种磁性微球，包括细胞磁核复合体以及包覆在细胞磁核复合体外表面的SiO2层；其中，小球藻作为骨架，在小球藻的细胞内和细胞壁靠近胞外的一侧沉积Fe3O4粒子形成了细胞磁核复合体。磁性微球的制备具体包括以下的步骤：
S1、磁制备液的配制：称取800g的FeCl3、400g的FeCl2、5L的超纯水加入至烧杯中，搅拌混合均匀，得到磁制备液；
S2、混合液的配制：往磁制备液中加入1L的浓度约为1.0×109个/mL的小球藻溶液和5g的硫酸多粘菌素B，混合均匀，将烧杯置于磁力搅拌器上进行搅拌30min，得到混合液；
S3、细胞磁核复合体的制备：(1)在搅拌的条件下，往混合液中加入300mL的氨水，溶液逐渐变成黑色，之后将烧杯置于50℃的水浴锅中加热1h；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，得到细胞磁核复合体；
S4、磁性微球的制备：(1)往盛装有细胞磁核复合体的烧杯中加入5L的75％乙醇，并置于磁力搅拌器上进行搅拌，边搅拌边加入50mL的25wt％氨水，接着加入100mL的99wt％的硅酸四乙酯，反应3h；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，并用5L超纯水清洗3遍，得到磁性微球。
图1为通过以上步骤制备得到的磁性微球的SEM图，由图1可知，制备得到的磁性微球呈球形，平均粒径约为3μm，且磁性微球中粒径为2μm～5μm的磁性微球占95％，粒径分散较窄。本实施例提供的制备方法的操作步骤以及所使用到的试剂较为简单，反应条件温和，且制备得到的磁性微球粒径分散较窄，可实现磁性微球的工业化生产；同时，磁性微球是采用含有三层细胞壁的小球藻作为模板，在磁性微球具有更好结构稳定性的同时，也提高了磁性微球的生物相容性，可扩大其的应用范围。
实施例2.一种磁性微球及其制备方法
本实施例中提供了一种磁性微球，包括细胞磁核复合体以及包覆在细胞磁核复合体外表面的SiO2层；其中，小球藻作为骨架，在小球藻的细胞内和细胞壁靠近胞外的一侧沉积Fe3O4粒子形成了细胞磁核复合体。磁性微球的制备具体包括以下的步骤：
S1、磁制备液的配制：称取800g的FeCl3、400g的FeCl2、5L的超纯水加入至烧杯中，搅拌混合均匀，得到磁制备液；
S2、混合液的配制：往磁制备液中加入1L的浓度约为1.1×109个/mL的小球藻溶液和4.8g的硫酸多粘菌素B，混合均匀，将烧杯置于磁力搅拌器上进行搅拌20min，得到混合液；
S3、细胞磁核复合体的制备：(1)在搅拌的条件下，往混合液中加入300mL的氨水，溶液逐渐变成黑色，之后将烧杯置于45℃的水浴锅中加热1.5h；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，得到细胞磁核复合体；
S4、磁性微球的制备：(1)往盛装有细胞磁核复合体的烧杯中加入5L的75％乙醇，并置于磁力搅拌器上进行搅拌，边搅拌边加入50mL的25wt％氨水，接着加入100mL的50wt％的甲基三甲氧基硅烷，反应2.5h；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，并用5L超纯水清洗3遍，得到磁性微球。
制备得到的磁性微球的平均粒径约为5μm，且磁性微球中粒径为2～5μm的磁性微球占97％。本实施例提供的制备方法的操作步骤以及所使用到的试剂较为简单，反应条件温和，且制备得到的磁性微球粒径分散较窄，可实现磁性微球的工业化生产；同时，磁性微球是采用含有三层细胞壁的小球藻作为模板，在磁性微球具有更好结构稳定性的同时，也提高了磁性微球的生物相容性，可扩大其的应用范围。
实施例3.一种磁性微球及其制备方法
本实施例中提供了一种磁性微球，包括细胞磁核复合体以及包覆在细胞磁核复合体外表面的SiO2层；其中，小球藻作为骨架，在小球藻的细胞内和细胞壁靠近胞外的一侧沉积Fe3O4粒子形成了细胞磁核复合体。磁性微球的制备具体包括以下的步骤：
S1、磁制备液的配制：称取800g的FeCl3、400g的FeCl2、5L的超纯水加入至烧杯中，搅拌混合均匀，得到磁制备液；
S2、混合液的配制：往磁制备液中加入1L的浓度约为1.2×109个/mL的小球藻溶液和5.4g的硫酸多粘菌素B，混合均匀，将烧杯置于磁力搅拌器上进行搅拌40min，得到混合液；
S3、细胞磁核复合体的制备：(1)在搅拌的条件下，往混合液中加入300mL的氨水，溶液逐渐变成黑色，之后将烧杯置于55℃的水浴锅中加热0.8h；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，得到细胞磁核复合体；
S4、磁性微球的制备：(1)往盛装有细胞磁核复合体的烧杯中加入5L的75％乙醇，并置于磁力搅拌器上进行搅拌，边搅拌边加入50mL的25wt％氨水，接着加入50mL的50wt％的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷以及50mL的50wt％的乙烯基三甲氧基硅烷，反应3.5h；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，并用5L超纯水清洗3遍，得到磁性微球。
制备得到的磁性微球的平均粒径约为2μm，且磁性微球中粒径为2～5μm的磁性微球占93％。本实施例提供的制备方法的操作步骤以及所使用到的试剂较为简单，反应条件温和，且制备得到的磁性微球粒径分散较窄，可实现磁性微球的工业化生产；同时，磁性微球是采用含有三层细胞壁的小球藻作为模板，在磁性微球具有更好结构稳定性的同时，也提高了磁性微球的生物相容性，可扩大其的应用范围。
实施例4.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中硫酸多粘菌素B的投入量为10.8g，即混合液中硫酸多粘菌素B在混合液中的浓度为1.80g/L，其余条件与实施例1相同，得到磁性微球。
实施例5.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中硫酸多粘菌素B的投入量为2.4g，即混合液中硫酸多粘菌素B在混合液中的浓度为0.4g/L，其余条件与实施例1相同，得到磁性微球。
实施例6.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中磁制备液、小球藻溶液以及硫酸多粘菌素B磁力搅拌混合的时间为50min，其余条件与实施例1相同，得到磁性微球。
实施例7.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中磁制备液、小球藻溶液以及硫酸多粘菌素B磁力搅拌混合的时间为10min，其余条件与实施例1相同，得到磁性微球。
对比例1.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1提供的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中使用曲拉通X-100代替硫酸多粘菌素B与小球藻溶液混合，其余条件与实施例1相同，得到磁性微球。
对比例2.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1提供的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中使用吐温20代替硫酸多粘菌素B与小球藻溶液混合，其余条件与实施例1相同，得到磁性微球。
对比例3.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1提供的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中使用四甲基氢氧化铵代替硫酸多粘菌素B与小球藻溶液混合。
对比例4.一种磁性微球及其制备方法
按照实施例1提供的方法制备磁性微球，不同之处在于，步骤S2中使用溴代十六烷基三甲胺代替硫酸多粘菌素B与小球藻溶液混合，其余条件与实施例1相同，得到磁性微球。
对比例5.一种磁性微球及其制备方法
本对比例中提供了一种磁性微球，直接通过化学共沉淀法获得Fe3O4粒子，并直接在Fe3O4粒子表面包裹二氧化硅层。磁性微球的制备具体包括以下的步骤：
S1、磁核Fe3O4粒子的配制：称取800g的FeCl3、400g的FeCl2、5L的超纯水加入至烧杯中，搅拌混合均匀，得到磁制备液；在搅拌的条件下，往混合液中加入300mL的氨水，溶液逐渐变成黑色，之后将烧杯置于55℃的水浴锅中加热0.8h；接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，得到磁核Fe3O4粒子；
S2、磁性微球的制备：(1)往盛装有磁核Fe3O4粒子的烧杯中加入5L的75％乙醇，边搅拌边加入50mL的25wt％氨水，接着加入100mL的99wt％的硅酸四乙酯，反应3h；；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，并用5L超纯水清洗3遍，得到磁性微球。
对比例6.
本对比例中提供了一种磁性微球，直接通过化学共沉淀法获得Fe3O4粒子，并直接在超声分散环境下在Fe3O4粒子表面包裹二氧化硅层。磁性微球的制备具体包括以下的步骤：
S1、磁核Fe3O4粒子的配制：称取800g的FeCl3、400g的FeCl2、5L的超纯水加入至烧杯中，搅拌混合均匀，得到磁制备液；在搅拌的条件下，往混合液中加入300mL的氨水，溶液逐渐变成黑色，之后将烧杯置于55℃的水浴锅中加热0.8h；接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，得到磁核Fe3O4粒子；
S2、磁性微球的制备：(1)往盛装有磁核Fe3O4粒子的烧杯中加入5L的75％乙醇，边搅拌边加入50mL的25wt％氨水及5ml曲拉通X-100，接着加入100mL的99wt％的硅酸四乙酯，在超声波环境中反应8h；；
(2)接着将烧杯置于铷铁硼磁块上进行磁分离，去除上清反应液，并用5L超纯水清洗3遍，得到磁性微球。
测试例1.
在实施例1和对比例1～4制备的过程中，使用显微镜对细胞磁核复合体的磁性和分散性以及小球藻的破坏度进行观察统计，得到的结果如表1所示。
表1.细胞表面活性剂对于细胞磁核复合体制备的影响
组别 表面活性剂 小球藻破坏度 磁性强弱 分散性
实施例1 硫酸多粘菌素B 完整 强 单分散
对比例1 曲拉通X-100 破裂 弱 聚集
对比例2 吐温20 破裂 弱 聚集
对比例3 四甲基氢氧化铵 完整 弱 单分散
对比例4 溴代十六烷基三甲胺 破裂 弱 聚集
由表1可知，相较于对比例1～4提供的表面活性剂，实施例1中使用可影响细胞膜渗透性的抗生素硫酸多粘菌素B作为表面活性剂对小球藻细胞进行处理，使得Fe3+、Fe2+以及NH3可进入至小球藻细胞内，实现小球藻细胞内及细胞表面的Fe3O4共沉淀反应，最终制备得到的磁性微球具有较强的磁性。同时，相较于曲拉通X-100、吐温20、四甲基氢氧化铵以及溴代十六烷基三甲胺等表面活性剂，硫酸多粘菌素B不会破坏小球藻的细胞结构，制备得到的细胞磁核复合体中，小球藻仍保持良好的细胞形态，且制备得到的磁性微球单分散。
测试例2.
使用实施例1-7、对比例5和6制备得到的磁性微球对咽拭子样本及血液样本中的流感病毒核酸进行提取。磁性微球提取流感病毒核酸具体包括以下步骤：
(1)向两只样品管中分别加入600μL裂解/结合液和0.04mL的浓度为500mg/mL的磁性微球溶液；
(2)接着取200μL的咽拭子样本、200μL的血液样本分别加入两支样品管中，混匀30s，在60℃下孵育10min；
(3)将样品管放在磁分离装置上保持20s，使磁性微球与溶液分离，移去上清液；
(4)再往样品管中加入600μL洗涤液，振荡混匀至磁性颗粒悬浮于样品管内，室温下孵育60s；
(5)将样品管放回磁分离装置上保持20s，移去上清；
(6)样品管中的磁珠在室温下晾干1min，去除残余的乙醇；
(7)向两只样品管中分别添加50～100μL的洗脱液，振荡混匀，在60℃下孵育3min；
(8)将样品管放回磁分离装置上保持20s，吸取上清液即为纯化的核酸溶液，将纯化的核酸溶液转移至新的容器待评估检测。
实施例1-7、对比例5和6制备得到的磁性微球提取流感病毒的检测结果如表2所示：
表2.磁性颗粒提取流感病毒核酸
由表2可知，相较对比例5和6提供的磁性微球磁珠，实施例1-3提供的磁性微球在咽拭子样品核酸提取中，提取效率提高了一倍左右，信号检出ct值提前了0.41～0.58ct；而在血清样本核酸提取中，提取效率也显著提高，信号检出ct值提前了0.41～0.55ct，说明实施例1-3提供的磁性微球具有良好的吸附能力，能够有效分离样品中的流感病毒核酸，且提取效率高，进而实现对于核酸等生物分子物质的快速有效分离、纯化，具有巨大的应用潜力。
此外，实施例1相较于实施例4和5而言，在咽拭子样品和血清样本核酸的提取中，提取效率更高且信号检出ct值提前，说明当硫酸多粘菌素投入量对于制备得到的磁性微球结构具有较大的影响，当硫酸多粘菌素的投入量过多或过少，对小球藻细胞壁的处理效果差，导致制备的磁性微球结构不理想，进而影响磁性微球对于核酸等生物分子物质的吸附能力，磁性微球的性能也都较差。
与此同时，实施例1相较于实施例6和7而言，三者制备得到的磁性微球在咽拭子样品和血清样本核酸的提取中的提取效率差别不大，说明磁制备液、小球藻溶液以及硫酸多粘菌素B三者搅拌混合的时间对于磁性微球的制备产生的影响不大，在实际生产制备的过程中，可以根据生产的需要对搅拌混合时间进行调整，具有更高的灵活性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种磁性微球的制备方法，其特征在于：使用经过硫酸多粘菌素B处理的小球藻作为所述磁性微球模板，采用共沉淀法制备得到细胞磁核复合体，在所述细胞磁核复合体外表面上包覆二氧化硅层制备得到所述磁性微球；
所述共沉淀法为：在所述磁性微球的制备过程中，使用硫酸多粘菌素B对小球藻进行处理，能够改变小球藻细胞膜的渗透性，使得Fe3+、Fe2+及NH3可渗透进入到小球藻细胞内，Fe3 +、Fe2+与NH3在小球藻细胞内发生共沉淀生成Fe3O4，同时也可在小球藻细胞壁靠近胞外的一侧共沉淀生成Fe3O4，使得制备得到的所述磁性微球具有强磁力。
2.根据权利要求1所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、将小球藻溶液、硫酸多粘菌素B以及磁制备液按一定比例混匀溶解，持续搅拌，制得混合液；
S2、往所述混合液中加入氨水并加热反应，磁分离去上清，制备得到所述细胞磁核复合体；
S3、往所述细胞磁核复合体中依次加入有机溶剂、氨水以及硅烷试剂进行偶联反应，磁分离去上清，制备得到所述磁性微球。
3.根据权利要求2所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述磁制备液包括Fe3+和Fe2+。
4.根据权利要求2所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述混合液中，小球藻的浓度为1.0×109～1.2×109个/mL，硫酸多粘菌素B的浓度为0.80～0.90g/L。
5.根据权利要求2所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述硅烷试剂选自硅酸四乙酯、甲基三甲氧基硅烷、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、二乙基二甲氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷或γ-巯基丙基甲基二甲氧基硅烷中的一种或多种。
6.根据权利要求3～5任一所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述S1中，所述持续搅拌的时间为20～40min。
7.根据权利要求3～5任一所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述S2中，所述加热反应在搅拌状态下进行，且加热反应的条件包括反应温度为45～55℃，反应时间为0.8～1.5h。
8.根据权利要求3～5任一所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述S3中，所述偶联反应的方式为往所述细胞磁核复合体中加入有机溶剂，再边搅拌边加入氨水，最后加入硅烷试剂并反应2.5～3.5h。
9.一种磁性微球，其特征在于：通过权利要求1～8任一所述的磁性微球的制备方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的磁性微球，其特征在于：包括细胞磁核复合体和包覆在所述细胞磁核复合体外表面的SiO2层；所述细胞磁核复合体包括小球藻微球骨架和Fe3O4粒子，所述Fe3O4粒子沉积在小球藻的细胞内和/或细胞壁靠近胞外的一侧上。
11.根据权利要求9或10所述的磁性微球，其特征在于：所述磁性微球的平均粒径为2～5μm，所述磁性微球中粒径为2～5μm的磁性微球占比93～97％。
12.权利要求9或10所述的磁性微球在生物分子分离、纯化及检测中的应用。
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