CN104004776A - 对l-抗坏血酸进行微生物生产的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对L-抗坏血酸进行微生物生产的方法。本发明公开了一种经过分离的多核苷酸分子,其是从编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的多核苷酸获得的,所述多核苷酸分子包含SEQ ID NO:1的至少20个连续核苷酸的部分核苷酸序列。本发明还涉及以高产量生产L-抗坏血酸的方法,特别是,使用能将给定碳源转化为维生素C的微生物的静止细胞的方法。可通过纯化和/或分离步骤对由此得到的维生素C进行进一步的加工。
Description
本发明是申请日为2004年8月16日、申请号为200480023361.2、题为“对L-抗坏血酸进行微生物生产的方法”的申请的分案申请。
本发明涉及从编码能将L-山梨糖酮(L-sorbosone)直接转化为L-抗坏血酸的酶的多核苷酸获得的(derived)多核苷酸。L-山梨糖酮脱氢酶(下文中:SNDHai)能从L-山梨糖酮直接生产L-抗坏血酸(维生素C)。L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)是从属于Gluconobacter属和Acetobacter属的细菌获得的。本发明还涉及以高产量生产L-抗坏血酸的方法。L-抗坏血酸广泛用于制药、食品和化妆品工业。
在过去的70年中,已通过公知的Reichstain方法从D-葡萄糖对L抗坏血酸(维生素C)进行了工业生产。该方法中的所有步骤都是通过化学方式进行的,只除了其中一个(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化),其通过微生物转化来进行。自从对L-抗坏血酸的工业生产的最初开始,就已将多种化学方法和技术修饰用于提高Reichstain方法的效率。对维生素C生产的最新进展被概括于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,5th Edition,Vol.A27(1996),pp.547ff。近来,已在微生物或从中分离出的酶的协助下,来进行生产维生素C的不同步骤。
目前用于生产L-抗坏血酸的方法具有一些人们不想要的特征,例如高能耗以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此,在过去数十年中,人们已在研究用微生物转化来制造L-抗坏血酸的其它方法,所述方法将是更加经济以及环保的。已报道了在多种微生物中直接对L-抗坏血酸的生产。
令人惊奇地,现在已发现,可用分离自G.oxydans N44-1的L-山梨糖酮脱氢酶(下文中:SNDHai),或来自属于Gluconobacter属和Acetobacter属的乙酸细菌的其直向同源体(ortholog),来进行L-山梨糖酮向L-抗坏血酸的直接转化。用于该反应的基因被分离出,对其进行测序。通过该基因编码的山梨糖酮脱氢酶能将L-山梨糖酮转化为L-抗坏血酸。该酶与已知的SNDH酶不同。
术语“L-抗坏血酸”和“维生素C”在本文中可以互换使用,其可以是水溶液中发现的L-抗坏血酸的任何化学形式,例如未离解的、以其游离酸形式存在的或离解为阴离子的。L-抗坏血酸的溶解的盐的形式为阴离子,同时存在通常发现于发酵上清液中的任何种类的阳离子,例如,钾、钠、铵或钙。还包括在内的可以有L-抗坏血酸的游离酸形式的经过分离的晶体。另一方面,用其相应的盐的名称来命名L-抗坏血酸的盐形式的经过分离的晶体,即抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸钙等。
L-山梨糖酮向维生素C的转化表示:导致维生素C产生的对底物的转化是通过SNDHai来进行的,即,底物被直接转化为维生素C。
克隆载体可以例如是任何质粒或噬菌体DNA或能在宿主细胞中自主复制的其它DNA序列,所述序列有如下特征:其具有一个或少量的限制性内切酶识别位点,可在这些位点以可确定的方式对此类DNA序列进行切割,而不会导致载体的基本生物学功能的损失,还可向这些位点接合进DNa片段,以使得复制发生。克隆载体还可含有,例如,适用于对经过克隆载体转化的细胞进行标识的标记。此类标记可以提供,例如,对抗生素的抗性,例如,对四环素或氨苄青霉素的抗性。
表达载体可以是能增强被克隆进来的基因的表达的任何载体,例如在转化进宿主之后。被克隆的基因通常处于某些控制序列的控制之下(即,与其可操作地连接),例如启动子序列。启动子序列可以是组成型的或诱导型的。
核酸分子可以包括DNA和RNA。任何形式的,例如双链的、单链的核酸以及其核苷可被用作为核酸分子。还包括在内的有杂交体,例如,DNA-RNA杂交体、DNA-RNA-蛋白质杂交体、RNA-蛋白质杂交体和DNA-蛋白质杂交体。多核苷酸可由若干碱基组成,通常至少20个核苷酸碱基。
术语“同源性(homology)”指两条多核苷酸序列间的相似性。为确定同源性,将多核苷酸序列以使相似的区域能被比较的方式排列起来。如果需要的话,某些位置上的核苷酸可被空位置代替,以提高相似性。同源性比较可以例如通过手工或通过使用商业可获得的计算机程序来进行。优选地,所述程序在标准条件下运行,以获得最大的同源性。两条核苷酸序列之间同源性或相似性的程度被表示为“%同源性”。
突变可以例如是:目标核苷酸序列中单个碱基对的变化、插入或缺失,或者遗传事件,例如遗传元件(例如,转座子)的插入。
将突变引入到DNA中,即,诱变可以以不同方式来进行,例如,随机地,即,随机诱变,其中,突变的精确位置不可预计,其可发生于微生物染色体上的任何地方,或发生于内源质粒上。突变还可作为例如放射、化学处理或遗传元件的插入等因素导致的物质损伤的结果被产生。
作为启动子使用的可以是下述任何DNA序列,所述DNA序列定位于接近某基因的起始密码子的地方,能启动一种或多种相邻基因的转录。通常,启动子可以定位于某基因的5’区域。启动子可以是诱导型的或组成型的启动子。在诱导型启动子的情况下,转录速率会应答于诱导剂增加。在组成型启动子的情况下,转录速率不会被例如诱导剂所调节。
术语“相同性”和“%相同性”指用序列分析程序(例如下文中示出的)对两条氨基酸序列进行的比较。“%相同”表示对象氨基酸序列与被比较的氨基酸序列的相同氨基酸匹配的氨基酸的百分比。如果被比较的两条氨基酸序列的任何氨基酸都没有区别,它们就是相同的或具有100%相同性。
在一种实施方式中,本发明涉及一种经过分离的多核苷酸分子,其可从编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的多核苷酸分子获得(derivable),并且包含SEQ ID NO:1的至少20个连续核苷酸的部分核苷酸序列。因此,本发明提供了一种经过分离的多核苷酸分子,其是从编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的多核苷酸获得的,并且包含SEQID NO:1的至少20个连续核苷酸的部分核苷酸序列。优选地,经过分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的至少50个或更优选地,至少100个连续核苷酸的部分核苷酸序列。最优选的是包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的经过分离的多核苷酸。进一步最优选的实施方式是包含选自由SEQ IDNOs:11、13、15、17、19、21和26所构成的组的核苷酸序列的经过分离的多核苷酸。经过分离的多核苷酸可以从编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的多核苷酸获得。SEQ ID NO:1代表了从微生物Gluconobacteroxydans N44-1中分离出的SNDHai的完整核苷酸序列。这样的序列各部分可被用于不同的目的。例如,短的多核苷酸可被用作为引物,用于,例如对从其它生物中分离出的合适的多核苷酸进行扩增。短的多核苷酸可在大约10至大约100个碱基对(bp)的范围内,通常为大约14至大约50,优选在大约17至30bp。此类短的多核苷酸序列的例子可被SEQ ID NOs:5、6、7、8、9、10、23或24所表示。较长的多核苷酸可编码具有酶活性的多肽。例如,SNDHai具有跨膜结构域,其可能不用于酶活性。如果编码蛋白质的酶活性区域的多核苷酸的部分在没有跨膜结构域的情况下表达,此种多肽可能具有充分的酶活性。
经过分离的多核苷酸分子通常从也编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的较长的多核苷酸序列获得。此类多核苷酸可以例如分离自细菌。优选地,它们是从属于Gluconobacter属和Acetobacter属的细菌中分离出来的,所述细菌包括但不限于G.oxydans、G.frateurii、G.cerinus和A.aceti。当此类多核苷酸从较长的多核苷酸序列获得时,确定此类多核苷酸序列与SEQ ID NO:1之间的同源性是可能的。在此种情况下,优选地,选择具有至少100个连续核苷酸的区域,将来自其它多核苷酸的相应的片断(stretch)与其进行比较。当多核苷酸序列与可从SEQ ID NO:1获得的相应片断具有例如60个相同的核苷酸时(通过对100个连续的核苷酸进行比较),那么同源性就是60%。因此,在一种实施方式中,本发明涉及根据本发明的经过分离的多核苷酸,其中,所述部分核苷酸序列获得自:对至少100个连续核苷酸进行比较时,与SEQ ID NO:1具有至少60%同源性的多核苷酸序列。优选地,本发明的部分多核苷酸序列与SEQID NO:1具有至少80%的同源性,更优选地,至少90%的同源性。为确定同源性,使用例如至少100个连续核苷酸的片断,优选地,至少300个连续核苷酸的片断,更优选地,至少500个连续核苷酸的片断。
本发明提供了新颖的多核苷酸序列,所述序列编码属于乙酸细菌的微生物的L-山梨糖酮脱氢酶,所述细菌包括Gluconobacter属和Acetobacter属,所述的酶用于从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸。所述的多核苷酸优选编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽,或者,从所述多肽获得的(derived)或可从所述多肽获得的(derivable)多肽,例如,通过在SEQID NO:2的序列中取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸获得的,所述多肽保留有从L山梨糖酮生产L-抗坏血酸的L-山梨糖酮脱氢酶活性。还包括在内的有:编码保留有从L山梨糖酮生产L-抗坏血酸的L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的部分多肽序列的多核苷酸序列,例如,由SEQID NOs:12、14、16、18、20、22或27所示。
优选地,本发明的多肽包含选自本申请公开的多肽的氨基酸序列的、具有至少25个连续氨基酸的部分氨基酸序列。本领域技术人员了解下述事实:多肽中的某些片断是生物学功能所必需的。但是,存在有其它区域,其中氨基酸可被插入、缺失或被其它氨基酸取代,优选是与被代替的氨基酸相似的那些氨基酸取代。
本发明还涉及包含本发明多核苷酸的重组DNA分子和/或表达载体,尤其是能在合适的宿主细胞中发挥功能的。
任何可作为外源核苷酸分子受体的细胞都可被用作为宿主细胞,例如携带有可复制表达载体或克隆载体的细胞,或通过公知技术对其进行过遗传改造从而在其染色体或基因组中含有想要的基因的细胞。宿主细胞可以是原核或真核来源的,例如,细菌细胞、动物细胞(包括人的细胞)、真菌细胞(包括酵母细胞)和植物细胞。优选地,宿主细胞属于能在体内将L-山梨糖酮脱氢酶作为活性形式表达的细菌,更优选地,Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas(例如P.putida)或Escherichia属(例如E.coli)的细菌。
因此,本发明的一个方面是提供如上所述的宿主细胞,其中包含具有整合到其染色体DNA上的多核苷酸的此类表达载体或此类核苷酸。此类宿主细胞然后被称为重组宿主细胞或重组生物。
本发明还涉及制造由本发明的多核苷酸编码的重组L-山梨糖酮脱氢酶多肽的方法。此类方法包括:例如,对如上文特别描述的本发明的任何重组生物进行培养。因此,本发明的一部分是通过该方法制造的重组L-山梨糖酮脱氢酶多肽。此类重组L-山梨糖酮脱氢酶,例如,可作为可溶的酶,在技术人员已知的、用于酶反应的任何标准程序中使用,通过用膜模块或膜反应器等设备对其进行回收,或在用于固相酶反应的固体载体上对其进行固定。
本发明的另一方面是生产L-抗坏血酸的方法,所述方法包括:在本发明的多核苷酸编码的重组L-山梨糖酮脱氢酶多肽的协助下,将底物转化为L-抗坏血酸。从能天然(即,非重组地)生产此类酶的微生物中分离出来的L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)的使用(其中,分离出的SNDHai是由本发明的多核苷酸编码的)也包括在本发明中。
能通过本发明的多核苷酸编码的SNDHai转化为L-抗坏血酸的碳源可以作为底物使用。优选的底物选自L-山梨糖、D-山梨糖醇和L-山梨糖酮。
在本发明的一种实施方式中,用于生产L-抗坏血酸的方法包括将L-山梨糖或D-山梨糖醇转化为L-抗坏血酸,该过程在能将L-山梨糖转化为L-山梨糖酮或能将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖酮的宿主细胞中进行。
在另一种实施方式中,用于生产L-抗坏血酸的方法包括:在由本发明的多核苷酸编码的重组SNDHai的协助下,将L-山梨糖酮转化为L-抗坏血酸。从能天然(即,非重组地)生产此类酶的微生物中分离出来的L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)的使用(其中,分离出的SNDHai是由本发明的多核苷酸编码的)也可用于此类方法。
本发明提供了编码酶(L-山梨糖酮脱氢酶SNDHai或其部分)的经过分离的核酸分子。对经过分离的核酸分子进行操作的方法和技术是本领域内公知的。用于分离、纯化和克隆核酸分子的方法,以及描述了对真核和原核宿主的使用及其中核酸和蛋白质表达的方法和技术是技术人员已知的。
本发明的多肽的功能性衍生物也可以是本发明的一部分,对它的定义基于通过本发明的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的添加、插入、缺失和/或取代产生的氨基酸序列,其中,用本领域已知的或本文中特别描述过的试验进行测量时,此类衍生物优选地仍具有L-山梨糖酮脱氢酶活性。此类功能性衍生物可以通过本领域已知的化学肽合成或基于如本文公开的DNA的重组技术、通过本领域范围内已知的方法来制造。通常不会改变此类分子活性的蛋白质和肽中的氨基酸取代是已知的。
在本发明的特定的实施方式中,目标保守取代按照如下所述发生:作为示例性的取代,Ala到Val/Leu/Ile、Arg到Lys/Gln/Asn、Asn到Gln/His/Lys/Arg、Asp到Glu、Cys到Ser、Gln到Asn、Glu到Asp、Gly到Pro/Ala、His到Asn/Gln/Lys/Arg、Ile到Leu/Val/Met/Ala/Phe/norLeu、Lys到Arg/Gln/Asn、Met到Leu/Phe/Ile、Phe到Leu/ValIle/Ala/Tyr、Pro到Ala、Ser到Thr、Thr到Ser、Trp到Tyr/Phe、Tyr到Trp/Phe/Thr/Ser和Val到Ile/Leu/Met/Phe/Ala/norLeu是合理的。作为优选的例子,Ala到Val、Arg到Lys、Asn到Gln、Asp到Glu、Cys到Ser、Gln到Asn、Glu到Asp、Gly到Ala、His到Arg、Ile到Leu、Leu到Ile、Lys到Arg、Met到Leu、Phe到Leu、Pro到Ala、Ser到Thr、Thr到Ser、Trp到Tyr、Tyr到Phe和Val到Leu是合理的。如果此类取代导致生物活性的变化,那么,被上文所述的示例性取代所命名的更多实质性的改变将被引入,产物将被筛选。
除非特别指明,本文中通过对DNA分子进行测序来确定的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪(例如Applied Biosystems PRISM310genetic analyzer的型号)测定的。因此,如本领域所已知的,对由该自动方法所测定的任何DNA序列而言,本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地,通过自动方法测出的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少大约90%同源,更典型地,至少大约95%至至少大约99.9%同源。通过其它方法,包括本领域内公知的人工DNA测序方法,可对实际序列进行更为精确的测定。也如本领域所已知的,较之实际序列,测得的核苷酸序列中的单个插入或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的框移,使得:从此类插入或缺失的点开始,通过测得的核苷酸序列编码的预计氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
在一种优选的实施方式中,本发明涉及编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性(如序列表所公开的,SEQ ID NO:2)的多肽的多核苷酸及其互补链,或包括这些序列、DNA序列或其片段的那些,以及能在标准条件下与此类序列杂交的、但是编码具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
对多核苷酸序列的相似性进行描述的另一种模式是确定此类序列是否能杂交。这取决于为杂交选用的条件。
用于杂交的标准条件在本文中指下述条件:其是本领域技术人员通常用于探测特异性杂交信号的条件,或者,优选地,本领域技术人员使用的所谓“严谨杂交条件”。因此,在本文中使用的术语“严谨杂交条件”指:如果序列之间存在大约95%以及优选地至少97%的同源性,杂交将会发生。严谨杂交条件是,例如,在有或没有100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)中,或在包含50%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02%十二烷基磺酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中,用地高辛(DIG)标记的DNA探针(通过用DIG标记系统(RocheDiagnostics GmbH,68298mannheim,Germany)来制备的)在42℃温育2小时至4天,接着在2x SSC和0.1%SDS中,于室温下,洗两次过滤器,每次5至15分钟,然后在65-68℃,于0.5x SSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗两次,每次15-30分钟。
在一个方面,可以通过下述步骤来获得用于本发明中的编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因、含有所述基因的核酸分子、表达载体和重组生物。
(1)如下文所述,对属于Gluconobacter属或Acetobacter属的、能从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸的菌株进行转座子诱变,以获得能表达由所用的转座子编码的抗生素抗性的菌落;
(2)用L-山梨糖酮作为底物进行筛选,选出L-抗坏血酸非生产突变体;
(3)从突变体中分离出染色体DNA;
(4)通过菌落、噬菌斑或Southern杂交、PCR(聚合酶链式反应)克隆等,克隆含有来自染色体的转座子的DNA片段;
(5)测定含有转座子插入的DNA片段的核苷酸序列;
(6)从能从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸的亲本菌株中克隆DNA片段;
(7)构建表达载体,其中编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因能有效表达;
(8)通过适于将DNA引入到宿主细胞中的方法,例如,转化、转导、接合转移(conjugal transfer)和/或电穿孔,构建重组微生物,其带有编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因,所述宿主细胞由此变成了本发明的重组生物。
转座子诱变作为遗传分析的有效工具是已知的(P.Gerhardt et al.,“Methods for General and Molecular Bacteriology”Chapter17,TransposonMutagenesis;American Society for Microbiology)。
多种转座子都是本领域内已知的,例如Tn3、Tn5、Tn7、Tn9、Tn10、噬菌体Mu等。它们中间,Tn5已知几乎不具有插入特异性,其尺寸相对地小。对于在本发明的实施中用于随机诱变的目的而言,Tn5是优选的。一系列的Tn5衍生物,被命名为Mini-Tn5s的,也是可用于本发明的,其由19bp的Tn5反向重复构成,这是与抗生素抗性或其它选择性标记基因结合的转座所需要的。除Tn5转座酶(tnp)之外,此类Mini-Tn5s被插入到自杀性载体中,以构建有效的自杀性Tn5诱变系统。
用转座子进行的随机诱变包括:通过,例如,转化、转导、接合交配或电穿孔,用自杀性质粒或噬菌体载体,将转座子引入到目标细菌细胞中。可在转座子携带的标记的帮助下,对得到的突变体进行筛选。所用的载体通过离析丢失之后,可探测到转座子向受体细菌基因组中的转座。
为将转座子引入到Gluconobacter属或Acetobacter属的微生物中,通常使用所谓的自杀性载体(包括,例如,噬菌体P1的衍生物)和窄宿主范围质粒(例如带有ColE1复制起点的pBR325的衍生物)。可通过感染,以及通过转化、接合交配(conjugal mating)或电穿孔,分别将噬菌体P1载体和质粒载体转移到受体细胞中,其中,优选地,这些载体缺少受体的合适起点。对将使用的自杀性载体和转座子的选择取决于如下标准,包括,例如,噬菌体敏感性、受体细胞的内源抗生素抗性、基因转移系统(包括转化、接合转移、电穿孔或感染,以将带有转座子的载体引入E.coli)的可获得性。
用于本发明的优选载体中的一种是,例如,噬菌体P1(ATCC25404),其能将其DNA注入到属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物中,但是该DNA不能复制,通过离析将会丢失。此类携带有Tn5的P1噬菌体(P1::Tn5)可以以噬菌体分解物的形式(其可根据已知方法,对携带有P1::Tn5的E.coli进行裂解来制备)使用(见,例如“Methods for General and Molecular Bacteriology”Chapter17,TransposonMutagenesis;American Society for Microbiology或美国专利5082785,1992)。
为验证缺陷型菌株真的携带有转座子,可通过标准方法来进行例如菌落杂交或Southern杂交等方法,其中使用经过标记的含有转座子的DNA片段作为探针(Molecular cloning,a laboratory manual second edition,Maniatis T.,et al.,1989)。
可根据本发明的实施例5所述来分离此类突变体。转座子突变体可被用于进一步鉴定编码L-山梨糖酮脱氢酶的目标基因,以及测定紧随转座子的区域的核苷酸序列。
通过筛选出既显示载体选择标记又显示转座子的转化子,可将含有转座子插入的DNA片段克隆进任何E.coli克隆载体,优选地,pUC18、pUC19、pBluescript II KS+(Stratagene Europe)及其相关物。可通过本领域已知的测序方法来测定与转座子相邻的核苷酸序列。
或者,当从能从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸的菌株中纯化所述所述的L-山梨糖酮脱氢酶多肽时,可通过如下示意性的方法,将想要的基因从染色体全DNA克隆到质粒或噬菌体载体中:
(i)通过例如基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)等方法,从纯化的蛋白质或其肽片段来测定部分的氨基酸序列。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)之后,可通过分离此类整个蛋白质或通过肽酶处理,从凝胶中制备此类整个蛋白质或肽片段。由此获得的蛋白质或其片段还可用于蛋白质测序仪,例如Applied Biosystems自动气相测序仪470A。该氨基酸序列可被用于用DNA合成仪(例如,Applied Biosystems自动DNA测序仪381A)来设计和制备寡核苷酸探针和/或引物。该探针可被用于:通过例如,Southern杂交、菌落杂交或噬菌斑杂交,从携带有目标基因的菌株的基因文库中分离出携带有目标基因的克隆。
(ii)或者还可以,为了从基因文库中筛选出表达目标蛋白质的克隆的目的,使用免疫方法,其中使用针对目标蛋白质制备出的抗体。
(iii)可通过,例如PCR,用一套引物(即,根据上文测定的氨基酸序列合成的两条寡核苷酸)从染色体总DNA中扩增出目标基因的DNA片段。然后,通过Southern杂交、菌落杂交或噬菌斑杂交,用上面获得的PCR产物作为探针,从例如在E.coli中构建的基因文库分离出携带有整个基因的克隆。
通过本领域内已知的方法,使用基于本文公开的DNA序列设计的引物,可通过PCR获得的DNA序列也是本发明的目的。
可以例如用,经过纯化的L-山梨糖酮脱氢酶蛋白质、经过纯化的重组L-山梨糖酮脱氢酶蛋白质(例如,E.coli中表达的加上His标签的L-山梨糖酮脱氢酶)或其肽片段作为抗原,来制备上述抗体。从L-山梨糖酮脱氢酶的核苷酸序列推断出的多肽序列可用作为抗原,以制备抗体。
一旦获得了携带有想要的基因的克隆,就可以通过公知的方法来测定目标基因的核苷酸序列了。
为有效表达想要的基因/核苷酸序列,可以使用多种启动子;例如,基因的原始启动子,抗生素抗性基因(例如,Tn5的卡纳霉素抗性基因、pBR322的氨苄青霉素抗性基因)的启动子,E.coli的beta半乳糖苷酶(lac)、trp、tac、trc启动子,lambda噬菌体启动子和可在宿主细胞中发挥功能的任何启动子。为此目的而言,宿主细胞可以选自由细菌细胞、动物细胞(包括人类细胞)、真菌细胞(包括酵母细胞)和植物细胞所构成的组。优选地,宿主细胞属于能在体内表达作为活性形式的L-山梨糖酮脱氢酶的细菌,特别是Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas和Escherichia属的细菌。
为进行表达,其它调控元件,例如,在宿主细胞中(其中将引入编码序列,以提供本发明的重组细胞)可操作的Shine-Dalgarno(SD)序列(例如,AGGAGG等,包括在宿主细胞中可操作的天然和和合成的序列)以及转录终止子(反向重复结构,包括任何天然的和合成的序列),可以与上述启动子一起使用。
在对双链DNA的克隆中,可以使用一系列宿主/克隆载体的组合。用于在E.coli中表达本发明的基因(即,SNDHai基因)的优选载体可以选自任何通常用于E.coli中的载体,例如能表达加上His标签的重组蛋白质的pQE载体(QIAGEN AG Switzerland)、pBR322或其衍生物(包括,例如pUC18和pBluescript II(Stratagene Cloining Systems,Calif.,USA))、pACYC177和pACYC184及其衍生物和来自广宿主范围质粒的载体,例如RK2和RSF1010。用于在细菌(包括Gluconobacter、Acetobacter和Pseudomonas)中表达本发明的核苷酸序列的优选载体选自可在Gluconobacter、Acetobacter和Pseudomonas以及优选的克隆生物(例如E.coli)中复制的任何载体。优选的载体是广宿主范围载体,例如,粘粒载体(例如pVK100)及其衍生物和RSF1010。为使克隆的基因稳定且有效地表达,还为了对携带有克隆基因的宿主细胞进行有效地培养,应对载体的拷贝数和稳定性进行仔细考虑。含有例如可转座元件(例如Tn5)的核酸分子也可用作为载体,以将想要的基因引入到优选宿主中,尤其是染色体上。含有从优选宿主中分离出的任何DNA和本发明的SNDHai基因的核酸分子还可用于将该基因引入优选的宿主细胞,尤其是染色体上。可通过使用本领域公知的任何传统方法,例如,转化、转导、接合交配或电穿孔,在考虑宿主细胞和核酸分子性质的情况下,将此类核酸分子转移至优选的宿主中。
用本领域公知的方法,本发明提供的L-山梨糖酮脱氢酶基因/核苷酸序列可被连接到合适的载体上,所述载体含有在宿主细胞中可操作的调控序列,例如,启动子、核糖体结合位点和转录终止子,以产生表达载体。
为构建携带有表达载体的重组微生物,多种基因转移方法,包括,转化、转导、接合交配或电穿孔都可以使用。用于构建重组细胞的方法可以选自分子生物学领域公知的方法。例如,传统的转化系统可用于Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas或Escherichia。转导系统也可用于E.coli。接合交配系统可广泛用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,包括,例如,E.coli、P.putida和Gluconobacter。接合交配的一个例子公开于WO89/06,668中。接合可发生于,例如,液体培养基中或固体表面上。用于SNDHai生产的受体的例子包括,例如,Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas或Escherichia的微生物。可向用于接合交配的受体中加入选择性标记;例如,通常选择对萘啶酸或利福平的抗性。天然的抗性也可使用,例如,可将对多粘菌素B的抗性用于多种Gluconobacter。
本发明提供了重组的L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)。可以通过将本发明提供的L-山梨糖酮脱氢酶基因引入到上文所述的宿主细胞中,来增加L-山梨糖酮脱氢酶的产量。在一个方面,通过使用本发明的L-山梨糖酮脱氢酶基因,在选自由Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas或Escherichia所构成的组的宿主细胞中,对L-山梨糖酮脱氢酶蛋白质进行生产。
能表达由本发明的多核苷酸序列编码的SNDHai的微生物可在有氧条件下被培养于补充有合适营养物的水性培养基中。培养可以以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。培养期可根据,例如,用于表达目标多肽的宿主、pH、温度和使用的营养培养基而变动,其优选为:以分批或补料分批模式进行大约1至大约10天。培养可在,例如,大约4.0至大约9.0的pH下进行,优选地,大约5.0至大约8.0。用于进行培养的优选的温度范围为大约13℃至大约36℃,优选地,从大约18℃至大约33℃。通常,培养既可以含有下述营养物,例如,可吸收碳源(例如,甘油、D-甘露醇、D、山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖,优选地,D-山梨糖醇、D-甘露醇和甘油);以及可消化的氮源,例如,有机物质,例如,蛋白胨、酵母提取物、烘焙酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液。多种无机物质也可被用作为氮源,例如,硝酸盐和铵盐。此外,培养基通常含有无机盐,例如,硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。
应当理解,用包含由本发明的多核苷酸编码的SNDHai的宿主,从底物来生产维生素C的方法是用生长中的细胞来进行的,即,细胞的比生长速率例如为至少0.02h-1。
本发明的一种实施方式是经过分离的本文公开的核苷酸序列编码的SNDHai用于生产维生素C的用途。为在培养之后从微生物中分离和纯化出SNDHai,可从液体培养基中收获微生物细胞,例如,通过离心或过滤。可对收获的细胞进行洗涤,例如,用水、生理盐水或具有适当pH的缓冲溶液。可将洗过的细胞悬浮于合适的缓冲溶液中,并使其裂解,这通过,例如均质机、超声波仪、French压力仪来进行,或者通过用溶菌酶等去处理,以获得破碎的细胞的溶液。可从不含细胞的提取液或破碎的细胞中对L-山梨糖酮脱氢酶进行分离和纯化,优选地,通过标准方法从膜的部分获得,所述方法例如:超离心、用合适的去垢剂进行差异溶解(differential solubilization)、通过盐或其它合适的试剂进行沉淀、透析、离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、尺寸排除色谱、亲和色谱或结晶。当重组的L-山梨糖酮脱氢酶作为加上标签(例如,His标签)的多肽被生产时,可用亲和树脂,例如Nickel亲和树脂对其进行纯化。可通过光度测量来监测L-山梨糖酮的纯化,通过使用,例如人工电子受体,例如,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和吩嗪硫酸甲酯、2,6-二氯靛酚(DCIP)、铁氰化物或细胞色素c来进行。
本发明提供了在本文所述的SNDHai的帮助下对L-抗坏血酸的生产。SNDHai的来源并不重要。该方法可利用,例如,天然就能表达活性SNDHai酶的微生物、从所述微生物中分离出来的本发明的核苷酸序列编码的SNDHai、上文所述的带有本发明的SNDHai基因的重组生物,或者通过使用以膜部分形式存在的天然的和/或重组的SNDHai、下文所述的作为生物催化剂以将L-山梨糖酮转化为L-抗坏血酸的可溶的酶或被固定的酶来进行。上述用于分离和纯化SNDHai的方法可用于天然的以及重组的SNDHai。
可按照上文所述对用于从L-山梨糖酮产生L-抗坏血酸的重组生物进行培养。优选地,所述重组生物选自由携带有本发明的L-山梨糖酮脱氢酶基因的Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas和Escherichia所构成的组。可在与上文所述相同的条件下对重组微生物进行培养。如果被用于生产L-抗坏血酸的重组生物不能将任何上述碳源转化为L-山梨糖酮,那么必须向培养基中添加L-山梨糖酮,使其被用作为生产L-抗坏血酸的前体。反应时间可随pH、温度和将使用的反应混合物而变动,其优选为大约1至大约10天,以分批或补料分批方式进行。
在一种实施方式中,重组或天然的(即,经过分离的非重组的酶)本发明的SNDHai,可纯化自上述培养基中,并可以以可溶的或被固定的酶的形式作为生物催化剂用于将L-山梨糖酮转化为L-抗坏血酸,这可以以技术人员已知的任何工艺模式来进行,例如分批、补料分批、办连续或连续模式。经过纯化的L-山梨糖酮脱氢酶可被,例如,以可溶形式,通过膜设备保留于反应容器中,或被固定于任何固体界面(例如,多孔的或聚合的基质)上的酶来使用。例如,该酶可与具有一个或多个功能基团的树脂的膜、颗粒等直接结合,或者其可通过具有一个或多个功能基团的桥联分子(例如,戊二醛)结合到树脂上。使用可溶的、保留的或固定形式的经过纯化的酶的反应可以在需氧条件下发生于,例如,含有L-山梨糖酮和其它合适营养物的水性培养基中。反应培养基可以含有,例如,无机盐,例如,硫酸镁、磷酸钾和碳酸钙。反应可在大约4.0至9.0的pH下进行,优选在大约5.0至大约8.0的pH下。用于进行反应的优选的温度范围为从大约13℃至大约36℃,优选地,从大约18℃至大约33℃。
可被用于本发明的微生物可被公众从不同来源获得,例如,DeutscheSammlund von Midroorganismen und Zellkulturen(DSMZ),Mascheroder Weg1B,D-38124Braunschweig,Germany;American Type Culture Collection(ATCC),P.O.Box1549,Manassas,VA20108USA,于2003年5月12日;或,Culture Collection Division,NITE Biological Resource Center,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan(以前:Institue forFermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku,Osaka532-8686,Japan)。保存到IFO的优选的细菌的例子例如是Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3293、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3292、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.rubiginosus)IFO3244、Gluconobacter frateurii(以前被称为G.industrius)IFO3260、Gluconobacter cerinus IFO3266、Gluconobacter oxydans IFO3284和Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259,上述这些都于1954年4月5日被保藏;1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和1977年12月8日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773。菌株Acetobacter sp.ATCC15164也是优选细菌的例子,其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)N44-1是优选细菌的另一个例子,其是菌株IFO3293的衍生物,在Sugisawa et al.,Agric,Biol.Chem.54:1201-1209,1990中有所描述。
应当理解,上述微生物还包括此类菌株的具有同样生理属性的异名(synonym)或基原异名(basonym),其如International Code ofNomenclature ofProkaryotes所定义。
在另一个方面,本发明涉及以高产量生产L-抗坏血酸(维生素C)的新颖的方法,所述方法通过使用能将给定的碳源转化为维生素C的微生物的静止细胞来实现。
使用不同的培养方法,直接对L-抗坏血酸进行的生产已被报道于多种微生物中。但是,此类方法的缺点是维生素C的低产量,因为产物具有不稳定性。例如,使用已知能生产2-酮-L-古洛酸(gulonic acid)(2-KGA)和维生素C的微生物,通过微生物对维生素C进行的生产的产量会进一步受到相对高的对2-KGA的生产的限制,2-KGA更容易被所述微生物所合成,这会导致,例如,维生素C和2-KGA的浓度比小于0.1。因此,本发明的目的是改进对维生素C的微生物生产,以获得较之现有技术中所述的方法更高的产量。
令人惊奇地,已经发现,用能进行从底物到维生素C的直接转化的微生物的静止细胞来开展的方法,能获得更高产量的维生素C。
具体而言,本发明提供了一种生产维生素C的方法,所述方法包括:在包含微生物的静止细胞的培养基中,将底物转化为维生素C。
用于上述使用微生物静止细胞的方法的底物可以是能被转化为L-抗坏血酸的碳源,其可以容易地从D-葡萄糖或D-山梨糖醇代谢途径获得,例如,D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮-L-古洛糖酸盐/酯、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮-D-葡萄糖酸盐/酯,或2,5-二酮-葡萄糖酸盐/酯。其它可能的底物可以是半乳糖。优选地,底物选自,例如,D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮,更优选地,选自D-葡萄糖、D-山梨糖醇或L-山梨糖,以及最优选地,选自D-山梨糖醇或L-山梨糖。在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,术语“底物”和“生产底物”在本文中可互换使用。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,从底物向维生素C的转化指:通过微生物来进行从底物产生维生素C的转化,即,底物可被直接转化为维生素C。在允许上文定义的从底物进行的此类转化的条件下,对所述微生物进行培养。
针对使用微生物静止细胞进行的上述方法,本文中使用的培养基可以是任何合适的用于生产维生素C的培养基。典型地,该培养基是包含:例如,盐、底物和某个pH的水性培养基。其中底物被转化为维生素C的培养基还被称为生产培养基。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,任何能进行从底物向维生素C的转化的微生物都可使用,例如,酵母、藻类或细菌,它们可以作为野生型菌株、通过经典诱变和选择方法获得的突变体菌株或者作为重组菌株存在。此类酵母的例子可以是,例如,Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Scyzosaccharomyces或Kluyveromyces。此类藻类的例子可以是,例如,Chlorella。此类细菌的例子可以是,例如,Gluconobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Cryptococcus、Pseudomonas(例如,Pseudomonas putida)和Escherichia,例如Escherichia coil。优选的是Gluconobacter或Acetobacteraceti,例如,G.oxydans、G.cerinus、G.frateurii、A.aceti subsp.xylinum或A.aceti subsp.orleanus。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,可被用于本发明的微生物可被公众从不同来源获得,例如,Deutsche Sammlund vonMidroorganismen und Zellkulturen(DSMZ),Mascheroder Weg1B,D-38124Braunschweig,Germany;American Type Culture Collection(ATCC),P.O.Box1549,Manassas,VA20108USA,于2003年5月12日;或,CultureCollection Division,NITE Biological Resource Center,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan(以前:Institue for Fermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku,Osaka532-8686,Japan)。保存到IFO的优选的细菌的例子例如是Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3293、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3292、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.rubiginosus)IFO3244、Gluconobacter frateurii(以前被称为G.industrius)IFO3260、Gluconobacter cerinus IFO3266、Gluconobacter oxydans IFO3287和Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259,上述这些都于1954年4月5日被保藏;1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和1977年12月8日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773。菌株Acetobacter sp.ATCC15164也是优选细菌的例子,其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)N44-1是优选细菌的另一个例子,其是菌株IFO3293的衍生物,在Sugisawa et al.,Agric,Biol.Chem.54:1201-1209,1990中有所描述。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,应当理解,上述微生物还包括此类菌株的具有同样生理属性的异名(synonym)或基原异名(basonym),其如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定义。本文中使用的对微生物的命名是International Committee on systematicsof Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of theInternational Union of Microbiological Societies官方接受的(在优先权申请的提交日期时),并被其官方出版物International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(IJSEM)所公开。具体的参考文献是Urbance etal.,IJSEM(2001)vol51:1059-1070,以及IJSEM(2001)vol51:1231-1233上的修订通知,其中描述了对作为Ketogulonicigenium vulgare的G.oxydansDSM4025的分类学上的重新归类。
本文中使用的静止细胞指下述微生物的细胞,所述微生物例如是存活但不能活跃生长的,或者以低的比生长速率[μ]生长的,例如,低于0.02h- 1的生长速率,优选地,低于0.01h-1。显示出上述生长速率的细胞被称为“静止细胞模式”。
如上所述使用微生物静止细胞来进行的本发明的方法可以以不同的步骤或阶段来进行:优选地,在第一个步骤(也被称为步骤(a)或生长阶段)中,于能够生长的条件下对微生物进行培养。该阶段由条件的改变终止,其中,所述条件改变使得微生物的生长速率降低至静止细胞产生,这也被称为步骤(b),接着是用(b)的静止细胞从底物来生产维生素C,这也被称为生产阶段。
使用微生物静止细胞的上述方法中进行的生长和生产阶段可在同样的容器中进行,即,仅有一个容器,或在两个或更多的不同容器中进行,在两个阶段之间具有可选的分离步骤。可通过任何合适的手段从细胞中回收得到产生的维生素C。回收意味着,例如,产生的维生素C可从生产培养基中分离出来。可选地,由此产生的维生素C可被进一步加工。
就使用微生物静止细胞进行上述方法的本发明的目的而言,术语“生长阶段”、“生长(growing)步骤”、“生长(growth)步骤”和“生长时期”在本文中可互换使用。这同样适用于“生产阶段”、“生产步骤”、“生产时期”。
进行本发明的使用微生物静止细胞的上述方法的一种途径可以是下述方法,其中:微生物生长于第一种容器(所谓的生长容器)中,它们作为静止细胞的来源,细胞中的至少一部分被转移到第二种容器(所谓的生产容器)中。生产容器中的条件可以是:使得从生长容器中转移出的细胞变为上文定义的静止细胞的条件。维生素C在第二种容器中产生,并从其中被回收。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,在一个方面,生长步骤可在水性培养基中进行,即,补充有用于在需氧条件下生长的合适营养物的生长培养基。培养可以以,例如,分批、补料分批、半连续或连续模式来进行。培养时间可以随所用的细胞种类、pH、温度、营养培养基而变化,其可以为例如:以分批或补料分批模式进行时,10小时至大约10天之间,优选为大约1天至大约10天之间,更优选地,大约1至大约5天,取决于所述微生物。如果细胞以连续模式被培养,驻留时间可以例如为大约2至大约100小时,优选地,大约2至大约50小时,取决于所述微生物。如果微生物选自细菌,培养可进行于大约3.0至大约9.0的pH下,优选为大约4.0至大约9.0,更优选地,大约4.0至大约8.0,进一步更优选地,大约5.0至大约8.0。如果使用了藻类或酵母,培养可进行于低于大约7.0的pH下,优选低于大约6.0,更优选低于大约5.5,最优选地,低于大约5.0。使用细菌进行培养的合适的温度范围为,例如,从大约13℃至大约40℃,优选地,从大约18℃至大约37℃,更优选地,从大约13℃至大约36℃,最优选地,从大约18℃至大约33℃。如果使用藻类或酵母,用于进行培养的合适的温度范围可以例如,大约15℃至大约40℃,优选地,大约20℃至大约45℃,更优选地,大约25℃至大约40℃,进一步更优选地,大约25℃至大约38℃,最优选地,大约30℃至大约38℃。用于进行培养的培养基通常可以含有下述营养物,例如,可被吸收的碳源,例如,甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖,优选地,L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇和甘油;以及可消化的氮源,例如,有机物质,例如,蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。所述培养基可以具有或不具有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。多种无机物质也可被用作为氮源,例如,硝酸盐和铵盐。此外,培养基通常含有无机盐,例如,硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,在生长阶段中,比生长速率例如为至少0.02h-1。对于以分批、补料分批或半连续模式生长的细胞而言,生长速率取决于,例如,生长培养基的组成、pH、温度等。通常,生长速率可以例如在大约0.05至大约0.2h-1的范围内,优选地,在大约0.06至大约0.15h-1的范围内,最优选地,在大约0.07至大约0.13h-1的范围内。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的另一个方面,静止细胞可通过对个别微生物在作为生长容器的琼脂平板上进行培养来提供,其中使用了基本上相同的条件,例如,如上所述的培养时间、pH、温度、营养培养基,并添加有琼脂。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,如果生长和生产阶段进行于两种分离的容器中,那么来自生长阶段的细胞可被收获或浓缩,并转移至第二种容器(所谓的生产容器)中。该容器可以含有补充有任何适用的生产底物(可通过细胞被转化为L-抗坏血酸)的水性培养基。来自生长容器的细胞可通过任何合适的操作被收获或浓缩,例如,离心、膜横流(membrane crossflow)超滤或微滤、过滤、倾析、絮凝。由此获得的细胞还可以以原始培养液的形式从生长容器转移至生产容器中,而不用被收获、浓缩或洗涤,即,以细胞悬浮液的形式被转移。在一种优选的实施方式中,细胞以细胞悬浮液的形式从生长容器被转移至生产容器,在它们之间没有任何洗涤或分离步骤。
因此,本适用微生物静止细胞进行的上述方法的一种优选的实施方式中,上文所述的本发明方法的步骤(a)和(c)不被任何洗涤和/或分离步骤分开。
在使用微生物静止细胞进行的上述方法的方面,如果生长和生产阶段进行于同样的容器中,细胞可以生长于适当的条件下,达到理想的细胞密度,接着用含有生产底物的生产培养基来替换生长培养基。此类替换可以例如是,在从容器中收回或收获上清液的同时,以与之相同的速度,将生产培养基补入到容器中。为将静止细胞保留于容器中,可以使用用于细胞回收或驻留的操作,例如,细胞回收步骤。此类回收步骤,例如包括但不限于使用如下的方法:离心机、过滤器、超滤步骤的膜横流微滤、膜反应器、絮凝或在合适的多孔、非多孔或聚合基质上的细胞固定。在转移阶段之后,容器被用于下述加工条件,在此条件下,细胞以如上定义的静止细胞模式存在,生产底物能有效地转化为维生素C。
在使用微生物的静止细胞的上述方法的方面,用于生产步骤中的生产容器中水性培养基在下文中被称为生产培养基,其可以仅含有将被转化为L-抗坏血酸的生产底物,或可以含有,例如,额外的无机盐,例如,氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾、磷酸钙和碳酸钙。生产培养基还可以含有可消化的氮源,例如有机物质,例如,蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉米浸出液;以及无机物质,例如,氨、硫酸铵和硝酸钠,其浓度为使得细胞被保持为上文定义的静止细胞模式的浓度。培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生产步骤可以,例如以批次、补料分批、半连续或连续模式进行。在补料分批、半连续或连续模式下,来自生长容器和生产培养基的两种细胞都可以以合适的补料速率被连续或间歇地补入到生产容器中。或者,仅有生产培养基可被连续或间歇补入到生产容器中,而来自生长容器的细胞可被立刻转移至生产容器。来自生长容器的细胞可被用作为生产容器中的细胞悬浮液,或者可被用作为:例如,在任何固相(例如,多孔或聚合基质)上絮凝或固定的物质。生长时期(被定义为从底物进入到生产容器中开始,到收获含有维生素C的上清液,所谓的收获流(harvest stream)之间的时期),可根据,例如,使用的细胞的浓度和种类、pH、温度和营养培养基而变动,其优选在大约2至大约100小时之间。pH和温度可与生长步骤中的pH和温度不同,但应与生长步骤中的基本上相同。
在使用微生物的静止细胞的上述方法的一种优选的实施方式中,生产步骤可以以连续模式进行,这意味着,含有来自生长容器的细胞的第一种补料流和含有底物的第二种补料流被连续或间歇补入到生产容器中。第一种流可以仅含有从生长培养基中分离/分开的细胞,或直接来自生长步骤的细胞悬浮液,即,悬浮于生长培养基中的细胞,而没有任何中间的细胞分离、洗涤和/或分离步骤。在本文中定义的第二种补料流可以包括生产步骤的操作所需要的所有其它补料流,例如,以一种或多种不同的流的形式存在的包含底物的生产培养基、用于稀释的水以及用于控制pH的碱。
在使用微生物的静止细胞的上述方法的方面,当两种流都连续补料时,第一种流的补料速率与第二种流的补料速率之比可在大约0.01至大约10之间变动,优选地,在大约0.01至大约5之间变动,优选地,在大约0.02至大约2之间变动。该比例取决于第一种和第二种流中各自的细胞和底物地浓度。
进行本发明的使用微生物静止细胞的上述方法的另一种方式可以是:在生长容器中使用一定细胞密度的静止细胞的方法。通过技术人员已知的方法,于600nm处,细胞密度可作为吸收单位(光学密度)被测得。在一种优选的实施方式中,生产步骤中的细胞密度为至少大约10,更优选地,大约10至大约200之间,进一步更优选地,大约15至大约200之间,进一步更优选地,大约15至大约120之间,最优选地,大约20至大约120之间。
在使用微生物的静止细胞的上述方法的方面,为在生产阶段期间(例如,以连续或半连续模式进行的),以想要的细胞密度将细胞保持于生产容器中,本领域内已知的任何手段都可以使用,例如,通过离心、过滤、微滤的膜横流超滤、倾析、絮凝进行的细胞再循环,通过膜设备进行的细胞驻留或细胞固定。此外,在生产步骤以连续或半连续模式进行的情况下,从生长容器中连续或间歇补入细胞,生产容器中的细胞密度可被保持于恒定的水平,例如,通过从生产容器中收获一定量的细胞来进行,所述的量相应于从生长容器中补入的细胞的量。
在使用微生物静止细胞的上述方法的方面,从生产容器中回收/收获在所谓的收获流中含有的产生出的维生素C。收获流可以包括,例如,来自生产容器的不含细胞的或含有细胞的水溶液,其中含有通过生产容器中的静止细胞从生产底物转化得到的维生素C。可通过本领域内已知的任何操作,将仍处于收获流中的细胞与维生素C分开,例如,过滤、离心、倾析、膜横流超滤或微滤、切线流超滤或微滤或端点(dead end)过滤。在该细胞分离操作之后,收获流中基本不含细胞。
在使用微生物静止细胞的上述方法的方面,在一个方面,本发明的方法使得维生素C的产量为至少大约1.8g/l,优选为至少大约2.5g/l,更优选为至少大约4.0g/l,最优选为至少大约5.7g/l。在一种实施方式中,由本发明的方法产生的维生素C的产量在大约1.8至大约600g/l的范围内。维生素C的产量指直接从生产容器中获得的收获流中(即包含维生素C的不含细胞的上清液中)的维生素C浓度。
在使用微生物静止细胞的上述方法的方面,在本发明的一种实施方式中,使用重组微生物的静止细胞,例如重组细菌,通过上述方法来生产维生素C。优选地,重组细菌选自能在体内表达作为活性形式的L-山梨糖酮脱氢酶的细菌,特别是Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas和Escherichia属的细菌,最优选地,来自Gluconobacter、Acetobacter或E.coli的细菌。进一步更优选地是,例如,G.oxydans和E.coli,最优选地,选自由G.oxydans N44-1、G.oxydans IFO3293和G.oxydans IFO3244所构成的组。重组微生物可以是下述任何微生物:已用公知技术对其进行了遗传改造,以在其染色体上或在质粒上含有一种或多种想要的引入到所述微生物中的基因,使得(例如)所述基因过量表达。引入到所述微生物中的想要的基因可以编码,例如,从底物到维生素C的转化中涉及到的酶。在一种优选的实施方式中,想要的基因编码L-山梨糖酮脱氢酶,其催化L-山梨糖酮向维生素C的转化。一种用于本发明的优选的L-山梨糖酮脱氢酶是,例如,SEQ ID NO:2所示的G.oxydans N44-1的L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)(Sugisawa et al.,Agric.Biol.Chem.54:1201-1209,1990),编码所述SNDHai的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述SNDHai的功能性衍生物可被用于本发明的目的。应当理解,较之SEQ ID NO:1,具有至少80%,优选至少90%同源性,并编码能催化L-山梨糖酮向维生素C的转化的酶的核苷酸序列也是本发明的一部分。
重组微生物,例如G.oxydans N44-1,可以包含克隆于合适的质粒上或整合进其染色体的SNDHai的若干拷贝。适合用于本发明的质粒拷贝例如在每个被转化的微生物中大约2个至大约15个的范围内,优选在大约5个至大约10个的范围内。可通过,例如,将SDS-PAGE上可见的各条条带的亮度相比较来确定质粒拷贝数。
在使用微生物静止细胞的上述方法的方面,当使用用于本发明方法的重组微生物时,生长和生产步骤可与上文所述基本相同。如果使用了包含SNDHai的重组微生物,例如,具有增加的SNDHai剂量的重组G.oxydansN44-1,生长培养基可以含有,例如,单独的D-山梨糖醇、L-山梨糖、甘油或D-葡萄糖或它们的混合物,一种或多种合适的氮源和盐。生长培养基可以含有,例如,D-山梨糖醇和/或L-山梨糖和盐。可基本按照本文所述来进行维生素C的收获。
在另一个方面,本发明的方法可与下述其它步骤组合,所述步骤用于将维生素C与收获流中含有的其它组分进行进一步分离和/或纯化,即,所谓的下游加工步骤。这些步骤可以包括技术人员已知的任何手段,例如,浓缩、结晶、沉淀、吸附、离子交换、电渗析、两极膜电渗析和/或反渗透。维生素C可作为游离酸形式或其已知的任何盐的形式被进一步纯化,这是通过下述操作手段来进行的,例如,用活性炭进行处理、离子交换、吸附和洗脱、浓缩、结晶、过滤和干燥。特别地,将维生素C与收获流中其它组分的第一次分离可通过下述方法地任何合适的组合或重复来进行,所述方法为:两区室或三区室电渗析(two-or three-compartmentelectrodialysis),两极膜电渗析,反渗透或吸附,其进行于,例如,离子交换树脂或非离子树脂上。如果获得的维生素C的形式为L-抗坏血酸的盐,将该盐形式转化为游离酸形式可通过,例如,两极膜电渗析、离子交换、模拟移动床色谱技术等来进行。上述步骤的组合,例如,将电渗析和两极膜电渗析组合为一个步骤也可使用,上述步骤,例如,多个使用模拟移动床色谱方法的离子交换步骤的组合也可以使用。上述流程中的任何一种单独或互相的组合就构成了用于分离和纯化产物,即维生素C的方便的手段。由此获得的产物还可被进一步分离(通过下述方法,例如,通过浓缩、结晶、沉淀、对晶体的洗涤和干燥来进行)和/或进一步纯化(用活性炭处理,离子交换和/或重结晶)。
在一种优选的实施方式中,通过上述一系列下游加工步骤来从收获流中纯化维生素C,而不必要在该过程中的任何时刻将其转移到非水性溶液中,即,所有步骤都在水性环境中进行。此类优选的下游加工流程可以包括,例如,通过两区室或三区室电渗析对来自生产容器的收获流进行浓缩,通过两极膜电渗析和/或离子交换将浓缩溶液中以其盐的形式存在的维生素C转化为其酸的形式,通过用活性炭进行处理、离子交换或非离子树脂来进行纯化,接着进行进一步的浓缩步骤和结晶。这些晶体可被分离、洗涤和干燥。如果必要的话,晶体还可被重新溶解于水中,用活性炭和/或离子交换树脂对其进行处理,并对其进行重结晶。然后可对上述晶体进行分离、洗涤和干燥。
下述实施例进一步地阐述了本发明,但其并不欲以任何方式对本发明加以限制。
实施例1用纯化的SNDHai来生产L-抗坏血酸
1.纯化SNDHai
将通过补料分批培养(关于培养,见实施例3)的能生产SNDHai的微生物细胞悬浮于25ml磷酸缓冲液(20mM,pH7.0)中,所述缓冲液中含有2mM的MgCl2、1mM二硫苏糖醇(DTT)和2-3片不含EDTA的蛋白酶抑制剂药片(Roche Diagnostics GmbH)。用French Pressure cell对细胞悬浮液进行三次处理。随后,加入25ml磷酸缓冲液(20mM,pH7.0,其中含有2mM的MgCl2、1M NaCl),对悬浮液进行超离心(30,000rpm,60分钟,4℃)。用磷酸缓冲液(20mM,pH7.0,其中含有2mM的MgCl2、500mM NaCl)对含有膜部分的沉淀进行洗涤,然后将其悬浮于适当量的磷酸缓冲液(20mM,pH7.0,其中含有2mM的MgCl2)中。然后加入N-辛基葡糖苷(Fluka),至终浓度为2%(w/v),在冰上轻微搅拌下将悬浮液培养90分钟。离心(20,000rpm,60分钟,4℃)后,收集澄清的、略带红色的上清液,加入终浓度为15%(w/v)的聚乙二醇6000(Fluka)。在4℃轻微振荡下培养60分钟后,接着进行离心(10,000rpm,30分钟,4℃),将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液(20mM,pH7.6,含有2mM的MgCl2和0.5%(w/v)月桂基磺基甜菜碱)中。在4℃轻微振荡下过夜后,对溶液进行离心(20,000rpm,30分钟,4℃)。收集上清液,按照下述方法对其进行进一步纯化。
下述纯化步骤进行于4℃,其在Explorer10S-系统(AmershamBiosciences)上进行,其中使用软件UNICORN3.1。用于离子交换色谱的典型流速在1-2ml/分钟的范围内。在280nm处对蛋白质洗脱进行监测,用标准的光度检测,在纯化的所有阶段(见下文)对SNDHai活性部分进行测定,或对纯化部分进行产物检测。
用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6,含有2mM的MgCl2和0.5%(w/v)月桂基磺基甜菜碱),在Sephadex G25-凝胶过滤柱(空体积:2.5ml)上,对澄清的上清液IV进行脱盐,所述上清液以2.5ml为一份。
收集SNDHai阳性部分,将其中一份(大约10ml)置于强阴离子交换柱(例如,Mono-Q HR,Amersham Biosciences,柱体积:8ml)上,所述柱在使用之前已用缓冲液A1(10mM Tris、10mM BisTris、10mMMES、2mM MgCl2、0.5%月桂基磺基甜菜碱,pH7.6)平衡过。用100%的缓冲液A1来洗脱未结合的蛋白质,四份柱体积之后,应用在6份柱体积内变化到100%缓冲液B1(Tris,10mM;BisTris,10mM;MES,10mM;MgCl2,2mM和月桂基磺基甜菜碱,0.5%,pH4.7)的线性pH梯度,接着是8份柱体积的100%缓冲液B1。在大约6.5的pH值(其非常接近于从氨基酸序列计算出的6.52的pI值)洗脱出了SNDHai。收集活性部分,用等量的HEPES-缓冲液(50mM,pH8.0,其中含有2mM MgCl2和0.5%月桂基磺基甜菜碱,终体积为15-20ml)进行稀释,将其用于另一强阴离子交换柱(例如,Mono-Q HR,Amersham Biosciences,柱体积:1ml),其已经过了缓冲液A2(15mM HEPES,2mM MgCl2,0.5%月桂基磺基甜菜碱,pH7.6)的平衡。用100%的缓冲液A2来洗脱未结合的蛋白质,四份柱体积之后,应用在20份柱体积内变化到40%缓冲液B2(HEPES,15mM;MgCl2,2mM;LiCl,1M和月桂基磺基甜菜碱,0.5%,pH7.6)的线性盐梯度,接着是至100%缓冲液B2的阶梯度(stepgradient)。SNDHai在大约150mM LiCl处洗脱出。活性部分在SDS凝胶电泳上显示为大约85kDa的单条带。
2.用于SNDHai的光度检测
用于对SNDHai活性进行光度测量的反应混合物由0.196mM氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、0.137mM吩嗪硫酸甲酯(PMS)、20.4mM L-山梨糖酮和处于终体积为1.0ml的0.1M的磷酸钠缓冲液(pH7.5)中的酶溶液构成。所述反应从加入酶开始,在具有1-cm光路的比色皿中,于570nm处,对作为NBT还原速率的酶活性进行测量(T=25℃)。酶活性的一个单位被定义为:每分钟催化1μM NBT还原的酶的量。pH7.5处NBT的的消光系数被取为100mM-1cm-1。两种参照比色皿被用于活性测定:其中一种含有除了L-山梨糖酮之外的上述成分,另一种含有除了酶溶液之外的所有成分。
3.用于SNDHai的产物检测
用下述组合物(0.5ml的总体积)的检测,针对从L-山梨糖酮对L-抗坏血酸的生产,直接对含有纯的SNDHai的部分(见上)进行分析,所述组合物包括:0.14mg/ml的纯化并脱盐的SNDHai、50mM磷酸缓冲液(pH6.5)、8mg/ml牛血清清蛋白(BSA)、100mM L-山梨糖酮、1mMPMS、5mM CaCl2、50μM PQQ-K2。检测于25℃,充分振荡下(台上振荡器上,900rpm),没有光的情况下,在合适的反应试管中进行。
用具有与Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad,Reinach,Switzerland)相连的LiChrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck,Darmstadt,Germany)的Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies,Wilmington,USA),通过高效液相色谱(HPLC)对样品进行分析。流动相为0.004M硫酸,流速为0.6ml/分钟。用UV探测器(波长254nm)结合折射率探测器来记录两种信号。此外,用氨基柱(YMC-PackPolyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan)和254nm处的UV探测来进行对L-抗坏血酸的鉴定。流动相为50mM NH4H2PO4和乙腈(40∶60)。在这些条件下,典型的初始定体积L-抗坏血酸产率为0.5-1.0g/l/h。因此,1小时的反应时间之后,上清液中L-抗坏血酸的浓度为300至930mg/l。
实施例2在试管和瓶中发酵从L-山梨糖和D-山梨糖醇来生产L-抗坏血
酸
将G.oxydans N44-1的细胞用于接种4ml No.3BD液体培养基,并在220rpm振荡下,于30℃在试管(18mm直径)中对其进行培养3天。在培养时期的末尾,收集到20mg/l的L-抗坏血酸。
在200rpm振荡下,30℃时,在500ml带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基中,对菌株N44-1的细胞(重复三份)进行培养,所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/lMgSO4·7H2O和15g/L的CaCO3。72小时的培养后,在三个瓶中通过HPLC检测到的L-抗坏血酸的量为400、500和680mg/l。
实施例3在补料分批发酵中从D-山梨糖醇来生产L-抗坏血酸
在180rpm振荡下,30℃时,在2-l带挡板摇瓶中的200ml No.5培养基中,对G.oxydans N44-1的细胞进行培养,所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/l MgSO4·7H2O和15g/L的CaCO3。48小时后,用150ml该培养物去接种10l的生物反应器(B.Braun ED10,Melsungen,Germany),所述反应器中已装有5.3l的培养基(含有20g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland)和2.5g/l MgSO4·7H2O),并装备有温度、pH和溶解氧传感器和控制线圈。温度被控制为30℃,通过加入28%氨溶液将pH控制为6.0,气流为4.5l/分钟,通过搅拌速度(最小300rpm)级联将溶解氧控制为30%。6小时的反应时间后,以25g/h的速率,在44小时的时段内,补加入500g/l的山梨糖醇溶液。96小时的反应时间后,上清液中留有1%的底物,并已产生了950mg/l的L-抗坏血酸。
实施例4在细胞膜部分中从L-山梨糖酮或L-山梨糖来生产L-抗坏血酸
在500ml带挡板瓶中100ml No.3BD液体培养基中,220rpm的振荡下,于30℃对G.oxydans N44-1的细胞进行3天的培养。在500rpm对得到的培养物进行离心,以去除CaCO3。然后在5,000rpm对来自该步骤的上清液进行离心,以使细胞沉淀。将收集的细胞悬浮于3ml的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中,通过在900psi.两次经过French Pressure cell(SIM-AMINCO Spetronic Instruments,USA)来使细胞破碎。先在5,000rpm下对得到的均匀混合物进行离心,以去除细胞残骸。然后,将上清液稀释为最终的蛋白质浓度为3mg蛋白质/ml。将该经过稀释的样品称为不含细胞的提取物(CFE)。在100,000xg对CFE进行60分钟的离心。弃去上清液,收集沉淀,作为膜部分。
在220rpm振荡下,于30℃,在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中,用膜部分(100μl)来进行15小时的反应(200μl)。待测底物为L-山梨糖酮(1%终浓度)和L-山梨糖(2%终浓度)。用于反应的最终蛋白质浓度为1.5mg/ml。在培养时期的末尾,从1%L-山梨糖酮和2%L-山梨糖分别产生了680mg/l和10mg/l的L-抗坏血酸。
实施例5从Gluconobacter oxydans N44-1中分离SNDHai基因
1.Tn5诱变
通过下述接合交配方法,将质粒pSUP2021(含有Tn5的“自杀性”载体(Simon R.et al.1983.BIO/TECHNOLOGY1:784-791))从E.coliHB101中转移至G.oxydans N44-1中。于30℃在含有5ml MB液体培养基的试管中对G.oxydans N44-1进行过夜的培养。于37℃,在含有5mlLB培养基(具有50μg/ml卡纳霉素)的试管中,对携带有助手质粒(helper plasmid)pRK2013(D.H.Figurski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,1648-1652,1979)的E.coli HB101和携带有质粒pSUP2021的E.coliHB101进行过夜培养。通过离心,从过夜培养物中分别收集G.oxydansN44-1、E.coli HB101(pRK2013)和E.coli HB101(pSUP2021)的细胞,并将它们悬浮于原始体积的MB培养基中。然后将这些细胞悬浮液等体积混合,将混合物涂布到置于MB琼脂平板顶端的0.45μm硝酸纤维素膜上。在27℃培养一天之后,从膜上刮下细胞,在MB培养基中制备稀释液。然后将经过稀释的细胞涂布于含有10μg/ml多粘菌素B和50μg/ml卡纳霉素的MB琼脂培养基(MPK培养基)上。多粘菌素B针对E.coli供体和助手菌株进行选择,而卡纳霉素则选出已经经过质粒pSUP2021转化的那些G.oxydans细胞(即,转化接合子)。获得了大约30,000个转化接合子。
2.筛选L-抗坏血酸非生产者
用灭菌牙签将总共3,760个转化接合子转移到MPK格网平板(gridplate)上,并在27℃培养3天。为对从L-山梨糖酮到L-抗坏血酸的生产进行检测,用灭菌牙签从格网平板上挑出每个转化接合子的细胞,将其悬浮于96孔微滴定板中的50μl静止细胞反应混合物(含有0.5%L-山梨糖酮、0.3%NaCl和1%CaCO3)中。在30℃,没有振荡的情况下,对微滴定板进行一天的培养。得到的反应混合物中每种取1微升,用抗坏血酸试验条带(test strip)和RQFlex2仪器(Merck KGaA,64271Darmstadt,Germany)针对L-抗坏血酸的形成对其进行分析。阳性对照菌株是在相同条件下生长的G.oxydans N44-1。通过该方法,鉴定出了L-抗坏血酸非生产突变体N44-1-6A9。然后进行Southern印记杂交分析,以验证突变体N44-1-6A9的染色体DNA中Tn5的存在。用ApaI、ClaI、EcoRI、EcoRV、KpnI、StuI、BamHI、SalI或HindIII对2μg从突变体中分离出的染色体DNA进行消化,并对其进行琼脂糖凝胶电泳(0.8%琼脂糖)。然后用0.25N HCl对凝胶进行15分钟的处理,接着中0.5N NaOH处理30分钟。用快速向下转移系统TurboBlotter(Schleicher&Schuell GmbH,Germany)将DNA转移至尼龙膜上。用质粒pSUP2021作为模板,使用引物Tn2419(SEQ ID NO:3)和Tn3125R(SEQ ID NO:4),用PCR-DIG标记试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,68298Mannheim,Germany)来制备探针。获得了707bp的PCR产物。
所用的杂交条件如下所示:杂交在严谨杂交条件下进行,例如,在具有100μg/ml鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics)中,用地高辛(DIG)标记过的DNA探针(使用DIG标记系统制备的;RocheDiagnostics GmbH,68298Mannheim,Germany)于42℃进行2小时至4天的培养,接着在室温下2xSSC和0.1%SDS中对过滤器进行15分钟的洗涤(进行两次),然后在65℃,于0.5xSSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中再洗15分钟(进行两次)。
杂交步骤之后,用STORM仪器(Amersham Biosciences),用抗DIG-AP接合物(conjugate)(Roche Diagnostics GmbH,68298Mannheim,Germany)和ECF底物(Amersham Biocsiences Uppsala,Sweden)来进行对杂交的探测。所有操作都按照厂商说明书来进行。
用上述方法,验证了突变体N44-1-6A9染色体中Tn5的存在。
3.克隆被Tn5打断的DNA片段,并对邻近区域进行测序
基于上节2中所述的限制性酶消化的结果,选用ApaI、ClaI、EcoRI和EcoRV作为能产生下述DNA片段的酶,所述DNA片段具有超过1kb的、在Tn5插入两端的侧翼染色体DNA。用SalI(其在Tn5的大约中间处进行切割)和ApaI对突变体N44-1-6A9的DNA进行双消化,给出了两条能与上述707bp的探针进行杂交的片段(6.2和3.8kb)。
制备Tn5突变体G.oxydans N44-1-6A9的染色体DNA,用ApaI进行消化。从琼脂糖凝胶中分离出大小为9至12kb的DNA片段,将其与预先用ApaI消化过的克隆载体pBluescript II KS+(Stratagene,Switzerland)连接。然后将连接混合物用于转化感受态E.coli细胞,在含有50μg/ml卡纳霉素和100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上进行选择。从一个转化子中提取出质粒,对侧翼于Tn5插入的克隆区域进行测序。移去9bp的重复(已知在Tn5转座事件期间发生)后,组合出了单个开放读码框(被Tn5插入打断)的核苷酸序列。完整开放读码框的核苷酸序列,在下文中被称为Gluconobacter oxydans N44-1的SNDHai基因,其由2367bp构成,被示为SEQ ID NO:1。从SEQ ID NO:1的核苷酸序列推断出的相应的氨基酸序列在本文中被示为SEQ ID NO:2。
在数据库PRO SW-SwissProt(完整释放版本,加上了增加的更新)上,对SNDHai基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)进行Blast2搜索(来自National Center for Biotechnology Information[NCBI]的BLAST的版本2,在Altschul et al.(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中有所描述)。所使用的条件为:带缺口比对,以及对于低复杂度区域过滤掉查询序列。
用程序MOTIFS,很容易鉴定出细菌的醌蛋白脱氢酶特征序列,这表明,SNDHai具有PQQ依赖型酶的特征。
实施例6对能从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸的细菌进行Southern印记分
析
从Gluconobacter oxydans IFO3293、IFO3292、IFO3244、IFO3287,Gluconobacter frateurii IFO3260和IFO3265,Gluconobacter cerinusIFO3266和IFO3269,Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259,Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和IFO13773,Acetobacter sp.ATCC15164和Escherichia coli K-12的细胞来制备染色体DNA。在含有5g/l细菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/L葡萄糖、5g/L甘露醇、1g/L MgSO4·7H2O、5ml/L乙醇和15g/L琼脂的No.350培养基上,于27℃对菌株IFO13693和IFO13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露醇、5g/l酵母提取物(Difco Laboratories,Detroit,Mich.,USA)、3g/l细菌蛋白胨(Difco)和18g/l琼脂(Difco)的甘露醇培养基(MB)琼脂培养基上,于27℃对所有其它的Acetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。E.coli K-12被培养于Luria Broth琼脂培养基上。染色体DNA制备物被用于在实施例5所述的严谨条件下进行Southern印记杂交。用ClaI(当分析N-结构域区域时)或EcoRI(当分析C-结构域区域时)对染色体DNA制备物进行消化,通过琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂糖)分离出1μg的DNA片段。用0.25N的HCl对凝胶进行15分钟的处理,然后用0.5N NaOH进行30分钟的处理,然后将其按照厂商说明书用Vacuum Blotter Model785(BIO-RAD Laboratories AG,Switzerland)印到尼龙膜上。使用表2中所述的引物组,用PCR-DIG标记试剂盒(Roche Diagnostics)来制备探针。PCR产物P1对应于SNDHai的被称为N-结构域的区域(可能的跨膜区域),而PCR产物P2则对应于SNDHai的被称为C-结构域的区域(可能的主要脱氢酶区域)。
表2.用于PCR以产生用于Southern杂交的经过标记的探针的引物
表2显示了Southern印记杂交实验的结果。在用P1(N-结构域)探针进行的杂交中,观察到了关于G.oxydans IFO3293、IFO3293、IFO3244、IFO3287和A.sp.ATCC15164的清楚的阳性条带。在用P2(C-结构域)探针进行的杂交中,观察到了关于菌株IFO3293、IFO3292、IFO3244、IFO3287和A.sp.ATCC15164的清楚的阳性条带,而对菌株IFO3260、IFO3265、IFO3266、IFO3269和IFO13773只观察到了模糊的条带。对照菌株E.coli K-12对于这两种结构域都没有显示出可被探测到的信号。
表3.对用用于SNDHai的N-和C-结构域的探针(探针P1和P2)进行Southern印记杂交在不同菌株中获得的杂交信号的探测
菌株 | P1 | P2 |
G.oxydans IFO3293 | + | + |
G.oxydans IFO3292 | + | + |
G.oxydans IFO3244 | + | + |
G.frateurii IFO3260 | nd | tr |
G.frateurii IFO3265 | nd | tr |
G.cerinus IFO3266 | nd | tr |
G.oxydans IFO3269 | nd | tr |
G.oxydans IFO3287 | + | + |
A.aceti subsp.orleanus IFO3259 | nd | nd |
A.aceti subsp.orleanus IFO13693 | nd | nd |
A.aceti subsp.orleanus IFO13773 | nd | tr |
Acetobacter sp.ATCC15164 | + | + |
E.coli K-12 | nd | nd |
tr,痕量;nd,未探测到。探针P1和P2是用表2中列出的引物组来合成的(作为DIG标记的PCR产物)。
实施例7对Gluconobacter oxydans N44-1SNDHai基因的直向同源体的
PCR扩增和测序
染色体DNA制备物(按照实施例6中所示来制备)被用作为PCR的模板,其中使用表2中所示的四对引物组。每份反应(总体积,50μl)中使用5至100ng的染色体DNA。除非另有指明,使用Expand HighFidelity PCR系统(Roche Diagnostics)。PCR条件如下所示:
在94℃温育2分钟;30个如下循环:(i)94℃变性步骤,15秒,(ii)60℃退火步骤,30秒,(iii)72℃合成步骤,45至120秒(对引物组P1、P2、P3和P4而言,用于合成步骤的时间分别为45秒、120秒、90秒和90秒);在72℃延伸7分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分离出PCR反应的样品,用溴化乙啶染色后,用透照器(transilluminator)来观察条带。PCR反应的结果被概括于表4中。
表4.对用表2的引物组在不同菌株中获得的PCR产物P1、P2、P3和P4的探测(通过琼脂糖凝胶电泳来观察产物)
+,探测到;nd,未探测到;nt,未检测。*用跟Expand High FidelityPCR系统相同的反应循环,用GC-rich PCR系统(Roche Diagnostics)来进行该PCR。
当在琼脂糖凝胶上观察到清楚的PCR条带时(表4),PCR产物被直接用于使用标准方法的核苷酸测序。将针对不同PCR产物获得的核苷酸序列及其所编码的肽的相应的氨基酸序列,与来自G.oxydans N44-1的SNDHai基因和蛋白质的全长序列进行比较。
Gluconobacter oxydans IFO3292SNDHai直向同源体
用来自G.oxydans IFO3292的染色体DNA作为模板,用引物SNDH1391F(SEQ ID NO:10)和SNDH2364R(SEQ ID NO:8)进行扩增,获得了PCR产物(大约1kb),将其用于用SNDH1391F(SEQ IDNO:10)进行的测序。测得的771bp的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)显示出了与来自G.oxydans N44-1的SNDHai的序列(SEQ ID NO:1)的1431-2201位核苷酸的98.7%(761/771)的同源性。推断出的256个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)显示出:与来自G.oxydans N44-1的SNDH的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的478-733位具有100%的相同性。
Gluconobacter oxydans IFO3287SNDHai直向同源体
用来自G.oxydans IFO3287的染色体DNA作为模板,用引物SNDH1F(SEQ ID NO:5)和SNDH420R(SEQ ID NO:6)进行扩增,获得了PCR产物(大约0.4kb),将其用于用SNDH420R(SEQ ID NO:6)进行的测序。测得的350bp的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)显示出了与SEQ ID NO:1的31-380位核苷酸的97.4%(341/350)的同源性。推断出的116个残基的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)显示出了与SEQ IDNO:2的11-126位氨基酸的100%的相同性。
用引物SNDH501F(SEQ ID NO:7)和SNDH2364R(SEQ ID NO:8)扩增获得的PCR产物(大约1.9kb)被用于用SNDH501F(SEQ IDNO:7)进行的测序。测得的808bp的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)显示出了与SEQ ID NO:1的578-1385位核苷酸的98.0%(745/808)的同源性。推断出的268个残基的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)显示出了与SEQ ID NO:2的194-461位氨基酸的100%的相同性。
用引物SNDH1391F(SEQ ID NO:10)和SNDH2364R(SEQ IDNO:8)扩增获得的PCR产物(大约1kb)被用于用SNDH1391F(SEQID NO:10)进行的测序。测得的800bp的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)显示出了与SEQ ID NO:1的1469-2268位核苷酸的98.8%(790/800)的同源性。推断出的266个残基的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)显示出了与SEQ ID NO:2的491-756位氨基酸的100%的相同性。
Acetobacter sp.ATCC15164SNDHai直向同源体
用来自A.sp.ATCC15164的染色体DNA作为模板,用引物SNDH1F(SEQ ID NO:5)和SNDH420R(SEQ ID NO:6)进行扩增,获得了PCR产物(大约0.4kb),将其用于用SNDH420R(SEQ ID NO:6)进行的测序。测得的360bp的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)显示出了与SEQID NO:1的31-390位核苷酸的97.8%(352/360)的同源性。推断出的120个残基的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)显示出了与SEQ ID NO:2的11-130位氨基酸的100%的相同性。
用引物SNDH501F(SEQ ID NO:7)和SNDH2364R(SEQ ID NO:8)扩增获得的PCR产物(大约1.9kb)被用于用SNDH501F(SEQ IDNO:7)进行的测序。测得的760bp的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)显示出了与SEQ ID NO:1的563-1322位核苷酸的98.0%(745/760)的同源性。推断出的252个残基的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)显示出了与SEQ ID NO:2的189-440位氨基酸的100%的相同性。
Gluconobacter oxydans IFO3244SNDHai直向同源体
通过使用用G.oxydans IFO3244的染色体作为模板和下述引物组获得的PCR产物,来测定G.oxydans IFO3244的SNDHai直向同源体基因的完全核苷酸序列,所述引物组为:SNDH1F(SEQ ID NO:5)和SNDH420R(SEQ ID NO:6);SNDH501F(SEQ ID NO:7)和SNDH1530R(SEQID NO:9);SNDH1391F(SEQ ID NO:10)和SNDH2364R(SEQ IDNO:8);SNDH382(SEQ ID NO:23)和SNDH1530R(SEQ ID NO:9);SNDH1F(SEQ ID NO:5)和SNDH689R(SEQ ID NQ:24)。用BglII和BamHI消化过并被连接的染色体DNA被用于使用下述引物组的另外两种PCR:SNDH420R(SEQ ID NO:6)和SNDH501F(SEQ ID NO:7)和SNDH1530R(SEQ ID NO:9)和IS-50.3(SEQ ID NO:25)。完整的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)显示出:与来自G.oxydans N44-1的SNDHai的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)具有98.4%的同源性。推断出的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)显示出了与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的100%的相同性。
实施例8通过增加SNDHai基因剂量增加从L-山梨糖酮到L-抗坏血酸的
生产
用菌株N44-1的染色体DNA作为模版,用引物组N1(SEQ ID NO:28)和N2(SEQ ID NO:29)来进行PCR,扩增出了具有上游和下游侧翼序列的SNDHai基因。
按照厂商说明书,用GC-rich的PCR系统(Roche Diagnostics)来进行PCR。将扩增得到的DNA片段插入到载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。然后用HindIII和XhoI去消化得到的质粒。将包括有SNDHai基因的HindIII-XhoI片段连接到预先用HindIII和XhoI处理过的载体pVK100(可从American Type Culture Collection获得,目录号ATCC37156)上。连接混合物被用于转化E.coli TG1。想要的质粒被命名为pVK-P-SNDHai-T,将其从E.coli中分离出来,并使用标准方法进行电穿孔(Electrocell manipulator ECM600,BTX Inc.,San Diego,CA,USA)将其引入到G.oxydans菌株N44-1中。
在200rpm的振荡下,于30℃,在500ml带挡板摇瓶中的50mlNo.5培养基中,对G.oxydans菌株N44-1和携带有质粒pVK-P-SNDHai-T的N44-1的细胞进行培养,所述培养基含有100g/l山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/l MgSO4·7H2O和15g/L CaCO3。48小时的培养之后,通过HPLC对两只瓶中的上清液进行测量,其中L-抗坏血酸的含量分别为110mg/l和200mg/l。
实施例9用在甘露糖醇培养基琼脂培养基上培养的静止细胞从L-山梨糖
酮来生产L-抗坏血酸
IFO菌株3293、3292、3244、3260、3266、3287、3259、13693和13773以及Acetobacter sp.ATCC15164和Gluconobacter oxydans N44-1,菌株IFO3293的衍生物,被用于从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸。
在含有5g/l细菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l葡萄糖、5g/l甘露糖醇、1g/l MgSO4·7H2O、5ml/l乙醇和15g/l琼脂的No.350培养基上,于27℃,对菌株IFO13693和IFO13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco Laboratories,Detroit,Mich.,USA)、3g/l细菌蛋白胨(Difco)和18g/l琼脂(Difco)的甘露糖醇培养基(MB)琼脂培养基上,于27℃,对所有其它Acetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。
从琼脂平板上刮下细胞,将其悬浮于蒸馏水中,用于静止细胞反应,所述反应进行于30℃,230rpm振荡下,5ml试管中,进行20小时。反应混合物(0.5ml)含有1%的L-山梨糖酮、0.3%NaCl、1%CaCO3和终浓度为600纳米下(OD600)10个吸光率单位的细胞。在培养阶段的最后,用具有与Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad,Reinach,Switzerland)相连的Lichrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck,Darmstadt,Germany)的Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies,Wilmington,USA),通过高效液相色谱(HPLC)来对反应混合物进行分析。流动相为0.004M硫酸,流速为0.6ml/分钟。用UV探测器(波长254nm)结合折射系数探测器,记录下两个信号。此外,用具有UV探测的氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan)在254nm处来进行对L-抗坏血酸的鉴定。流动相为50mM NH4H2PO4和乙腈(40∶60)。
Agilent Series1100HPLC-质谱(MS)系统被用于鉴定L-抗坏血酸。用电喷雾界面在阳离子模式下来操作MS。用LUNA0C8(2)柱(100x4.6mm)(Phenomenex,Torrance,USA)来进行分离。流动相为0.1%蚁酸和甲醇(96∶4)的混合物。L-抗坏血酸在驻留时间为3.1分钟时被洗脱出来。通过驻留时间和该化合物的分子量来确认L-抗坏血酸的身份。
为排除D-异抗坏血酸的存在,用具有UV探测的氨基柱(YMC-PackPolyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan)在254nm处通过驻留时间对L-抗坏血酸进行额外的鉴定。流动相为50mM NH4H2PO4和乙腈(40∶60)。
如表5所示,Gluconobacter和Acetobacter菌株能从L-山梨糖酮产生L-抗坏血酸。
表5.从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸
菌株 | L-抗坏血酸(mg/L) |
G.oxydans IFO3293 | 1740 |
G.oxydans N44-1 | 570 |
G.oxydans IFO3292 | 410 |
G.oxydans IFO3244 | 1280 |
G.frateurii IFO3260 | 50 |
G.cerinus IFO3266 | 140 |
G.oxydans IFO3287 | 60 |
A.aceti subsp.Orleanus IFO3259 | 30 |
A.aceti subsp.Xylinum IFO13693 | 40 |
A.aceti subsp.Xylinum IFO13693 | 120 |
Acetobacter sp.ATCC15164 | 310 |
空白对照 | 未探测到 |
空白对照:反应在没有细胞的反应混合物中进行。
实施例10用生长于3BD琼脂培养基上的静止细胞,从D-山梨糖醇、L-
山梨糖或L-山梨糖酮来生产L-抗坏血酸
在含有70g/l L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/l MgSO4·7H2O、10g/l CaCO3和18g/l琼脂(Difco)的No.3BD琼脂培养基上,于27℃对G.oxydans N44-1的细胞进行3天的培养。如实施例9所述,用2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或1%L-山梨糖酮于30℃来进行24小时静止细胞反应(10ml试管中,1ml反应混合物)。菌株N44-1分别从D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮生产出了280、400和1780mg/l的L-抗坏血酸。
如实施例9所述,在含有2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或2%L-山梨糖酮的反应混合物中,用No.3BD琼脂培养基上生长的N44-1细胞来进行其它反应(10ml试管中,0.5ml反应混合物),进行2天。菌株N44-1分别从D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮生产出了1.8、2.0和5.1g/l的L-抗坏血酸。
按照上文所述,用2%L-山梨糖酮,用G.oxydans IFO3293的细胞来进行反应。菌株IFO3293在2天内生产出了5.7g/l的L-抗坏血酸。
实施例11用生长于液体培养基中的静止细胞来从D-山梨糖醇生产L-抗
坏血酸
G.oxydans N44-1的细胞被培养于200ml No.5培养基上,所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/l MgSO4·7H2O和15g/l CaCO3,培养在2-1带挡板摇瓶中,于30℃下在180rpm的振荡下进行。24小时后,在3220g下对培养物进行离心(Eppendorf5810R,Hamburg,Germany),并将细胞重新悬浮于0.9%NaCl溶液中,再在3220g下离心,细胞沉淀被用于接种一只含有50ml完全生长培养基(100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物、2.5g/l MgSO4·7H2O、15g/lCaCO3)的带挡板500ml摇瓶以及另一只含有50ml生产培养基(100g/lD-山梨糖醇、3g/l NaCl、10g/l CaCO3)的带挡板500ml摇瓶。作为600nm处测量的光密度(OD600)的初始细胞密度在两只瓶中均为10。在180rpm振荡下,于30℃对两只瓶进行培养。48小时后,生长培养基和生产培养基中的细胞悬浮液分别已经积累了1.06和1.18g/l的L-抗坏血酸。培养期间在完全培养基中没有观察到额外的生长。
实施例12通过具有增加的SNDHai基因剂量的重组微生物静止细胞,从
L-山梨糖酮或D-山梨糖醇来生产L-抗坏血酸
通过用菌株N44-1的染色体DNA作为模板,用引物组N1(SEQ IDNO:28)和N2(SEQ ID NO:29)进行PCR,来扩增具有上游和下游侧翼序列的G.oxydans N44-1(SEQ ID NO:1)的SNDHai基因。
按照厂商说明书,用GC-rich的PCR系统(Roche DiagnosticsGmbH)来进行PCR。扩增出的片段被插入到载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。然后用HindIII和XhoI来消化得到的质粒。包括有SNDHai基因的HindIII-XhoI片段被连接到之前用HindIII和XhoI处理过的载体pVK100(可从American Type Culture Collection获得,目录号为ATCC37156)上。连接混合物被用于转化E.coli TG1。想要的质粒被命名为pVK-P-SNDHai-T,将其从E.coli中分离出来,并使用标准方法进行电穿孔(Electrocell manipulator ECM600,BTX Inc.,San Diego,CA,USA)将其引入到G.oxydans菌株N44-1中。
三种独立的转化子,被命名为N44-1(pVK-P-SNDHai-T)克隆1号、2号和3号,它们与亲本菌株G.oxydans N44-1一起,每种都被培养于No.3BD琼脂和MB琼脂培养基上。从平板上刮下细胞,将其用于静止细胞反应(1%L-山梨糖酮作为底物),如实施例9所述。在No.3BD琼脂上培养之后,在静止细胞测试中,菌株N44-1产生出了2.5g/l的L-抗坏血酸,而菌株N44-1(pVK-P-SNDHai-T)克隆1、2和3则分别产生出了4.2、4.1和4.2g/l的L-抗坏血酸。在MB琼脂上培养之后,在静止细胞测试中,菌株N44-1产生出了0.12g/l的L-抗坏血酸,而菌株N44-1(pVK-P-SNDHai-T)克隆1、2和3则分别产生出了1.8、2.5和0.94g/l的L-抗坏血酸。
用G.oxydans N44-1和克隆2(见上)的细胞来进行另一项反应,所述细胞在220rpm振荡下于30℃,在双份500ml带挡板摇瓶中的50mlNo.5培养基(100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物、2.5g/lMgSO4·7H2O、15g/l CaCO3)中培养了3天。对每种菌株而言,在500rpm对一瓶中得到的培养物进行离心,以去除CaCO3。然后再在5,000rpm下对来自该步的上清液进行离心,以沉淀细胞。将收集到的细胞重新悬浮于10ml0.9%的NaCl溶液中,再在5,000rpm下进行离心以沉淀细胞。再将收集到的细胞重新悬浮于水中,并用于接种1ml生产培养基(20g/l D-山梨糖醇、3g/l NaCl、10g/l CaCO3),所述培养基处于10ml反应试管中,最终的静止细胞密度相当于600nm处的5OD单位。在30℃和220rpm下,20小时反应时间后,对菌株N44-1和过量表达SNDHai的N44-1而言,从生产瓶中收获的上清液中分别含有360和760mg/l的L-抗坏血酸。相反,72小时后,从剩下的生长培养基中收获的上清液分别含有0和440mg/l的L-抗坏血酸。
实施例13在E.coli的静止细胞中从L-山梨糖酮来生产L-抗坏血酸
没有终止密码子的SNDHai基因被命名为SNDHai-1,其对应于SEQID NO:1的1-2364位核苷酸,用引物组SNDHai-Nde(SEQ ID NO:30)和SNDHaiHis-X(SEQ ID NO:31),通过PCR(Roche High Fidelity试剂盒)从菌株N44-1的染色体DNA对其进行了扩增。
扩增出的DNA被克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),以获得pCR2.1-TOPO-SNDHai-1,其SNDHai序列通过核苷酸测序被验证为是正确的。然后用NdeI和XhoI切出来SNDHai-1基因,将其连接到pET-21b(+)(Novagen,Madison,WI,USA)的NdeI和XhoI位点之间,以产生出pET21b-SNDHaiHis;6xHis被加到SNDHai的C-末端。pET21b-SNDHaiHis被引入到E.coli BL21(DE3)中。
从在添加有50μg/ml羧苄青霉素的LB中培养的E.coli BL21(DE3)/pET21b-SNDHaiHis的过夜培养物中取5ml,接种到200ml同样的培养基中。在230rpm下于37℃对细胞进行2小时的培养,然后用1mM IPTG诱导,继续在230rpm下于25℃培养3小时。对得到的培养物进行离心,然后用盐水洗两次,将细胞沉淀悬浮于2ml水中。细胞被用于静止细胞反应,其中使用的反应混合物(5ml试管中,500μl)含有OD600=10的细胞,1%的单水合山梨糖酮、5μM PQQ、5mM MgCl2、0.3%NaCl和1%CaCO3,反应在30℃下进行15小时。在温育15小时后,生产出了0.14g/L的L-抗坏血酸。当用1μM PQQ来进行静止细胞反应时(其它条件都与上文所述相同),在温育3小时后生产出了0.05g/L的L-抗坏血酸。
实施例14通过具有增加的SNDHai基因剂量的重组微生物的静止细胞
从D-山梨糖醇来生产L-抗坏血酸
在180rpm的振荡下,于30℃,在500ml带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基中,对过量表达SNDHai的G.oxydans N44-1细胞进行培养,所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(FlukaBioChemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/l MgSO4·7H2O和15g/l CaCO3,培养48小时。得到的细胞悬浮液被用于接种2L的生物反应器,所述反应器被称为生长容器(Biostat-MD,B.Braun Melsungen,Melsungen,Germany),其中含有1.25l的培养基,所述培养基由100g/l D-山梨糖醇、15g/l酵母提取物(Fluka BioChemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/lMgSO4·7H2O、0.3g/l KH2PO4和0.12g/l CaSO4组成。细胞被培养于30℃,1l/分钟通气速率下,用25%的Na2CO3溶液将pH控制为5.7,通过改变搅拌速率将溶解氧控制为10%的饱和度。24小时后,作为600nm处吸光率单位测得的细胞密度为20。在该时间点,将含有100g/l D-山梨糖醇、15g/l酵母提取物(Fluka BioChemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/lMgSO4·7H2O、0.3g/l KH2PO4和0.12g/l CaSO4的补料溶液以125ml/小时的补料速率补入到生长容器中,以125ml/小时的收获速率连续收获培养物。通过该方法,生长容器中的体积被保持恒定为1.25l。按照上文所述对其它工艺参数进行连续控制。
该培养物以125ml/小时的速率被连续补入到第二反应器中,该反应器被称为生产容器,其中装有5l生产培养基,其中含有100g/l D-山梨糖醇、0.3g/l NaCl和0.12g/l CaSO4,温度被保持为30℃,通过20%的NaOH溶液将pH控制为7.0。通气速率被保持恒定为10l/分钟,通过变化搅拌器速率将溶解氧控制为20%。具有相同组成的生产培养基还被连续补入到生产容器中,补料速率为375ml/小时。通过以500ml/小时的速率持续收获上清液,使容器体积保持5l恒定,得到来自具有500kDa孔径的横流超滤模块(UFP-500-E-9A,Amersham Biosciences)的过滤流,用Masterflex泵,以50l/小时,通过其从生产容器中收获细胞悬浮液。渗余物被泵回到容器中。一旦生产容器中的细胞密度达到600nm下的吸光率为100,就开始以25ml/小时的速率从流回到生产容器中的经过浓缩的细胞流中收获细胞,以保持生产容器中的细胞密度恒定。
不含细胞的上清液的收获流含有4g/l的L-抗坏血酸,其被以500ml/小时的速率持续补入到具有双夹套(double jacket)的收集容器中,这在30℃下进行(Ecoline Re112,Lauda,Lauda-Koenigshofen,Germany)。该容器持续将上清液以180l/小时的速率补入到两区室电渗析单元(含有具有阳离子交换膜CMX-S和阴离子交换膜ASM的10个单元对的堆叠(stack),膜的总面积为0.2m2,来自Eurodia Industries,Wissous,France)的稀释区室中,持续的流被泵出容器以保持其体积恒定为21。另一具有双夹套(含有最初去离子的水,30℃)容器被持续补入新鲜的去离子水,速率为62.5ml/小时,其以200l/小时地速率向电渗析单元的浓缩区室中持续泵入水性溶液,持续的收获流被从容器中泵出。用蠕动泵(7518-00,Masterflex,USA)将补料溶液泵到电渗析堆叠中,在旋转式泵(MD-20,IWAK,Tokyo,Japan)的协助下,使通过每个电渗析区室的溶液流通。在整个过程中,对电渗析堆叠应用14V电压(电源FuMATech TS001/5,St.Ingbert,Germany)。收获流中L-抗坏血酸的浓度为16g/L。
实施例15通过下游加工步骤对用静止细胞反应生产的L-抗坏血酸进行
纯化
将实施例14中含有16g/l L-抗坏血酸的收获流补入到螯合树脂(Amberlite IRC748,Rohm and Haas,Philadelphia,PA,USA)中,以从流中除去二价阳离子。然后在经过冷却的容器(补料容器)中对其进行收集,当收集到10升时,通过两极膜电渗析单元(含有7Neosepta BP1/CMB膜的堆叠,膜的总面积为0.14m2,来自Eurodia Industries,Wissous,France)以分批模式对它们进行加工处理。以200l/小时将该溶液泵过电渗析单元的补料区室,并回收到补料容器中。含有最初为5l的2g/l NaOH溶液的另一经过冷却的容器(浓缩容器)被以100l/小时泵过两极膜电渗析单元的浓缩区室。通过应用25V的最大电压,以及20A的最大电流,将来自补料区室的钠离子转移到浓缩区室中,因此在补料流中存在的L-抗坏血酸的钠盐形式被转化为相应的游离酸形式。达到90%的转化产率后,该过程被终止。在浓缩容器中,6l含有7.5g/l NaOH的溶液被收集于稀释容器中,9l含有大约16g/l游离酸形式L-抗坏血酸和1.6g/l钠盐形式的L-抗坏血酸的溶液被通过阳离子交换树脂(Amberlite FPC21H,Rohm andHass,Philadelphia,PA,USA)进行进一步的加工处理,以将从钠盐到游离酸形式的转化产率提高到大约99%。或者,通过阳离子交换树脂,对来自电渗析步骤的10l含有16g/l钠盐形式的L-抗坏血酸的溶液进行直接地处理,将其以99%的产率转化为游离酸形式。然后通过下述一系列步骤,对通过上述任何方法获得的、以游离酸形式存在的L-抗坏血酸的流进行加工处理,所述步骤为:阴离子交换、活性炭处理、浓缩、结晶、晶体过滤和干燥。获得的晶体的终纯度为98%,用组合下游加工步骤获得的产率为80%。
Claims (38)
1.一种经过分离的多核苷酸分子,所述多核苷酸分子是可从编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的多核苷酸获得的,所述多核苷酸分子包含SEQ ID NO:1的至少20个连续核苷酸的部分核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的经过分离的多核苷酸分子,其中,SEQ IDNO:1的部分核苷酸序列具有至少50个连续核苷酸。
3.如权利要求1所述的经过分离的多核苷酸分子,其中,SEQ IDNO:1的部分核苷酸序列具有至少100个连续核苷酸。
4.如权利要求3所述的经过分离的多核苷酸分子,其中,所述部分核苷酸序列可从下述多核苷酸序列获得,当对至少100个连续核苷酸进行比较时,所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少60%的同源性。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的经过分离的多核苷酸分子,所述部分核苷酸序列可从与SEQ ID NO:1具有至少80%的同源性的多核苷酸序列获得。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的经过分离的多核苷酸分子,所述部分核苷酸序列可从与SEQ ID NO:1具有至少90%的同源性的多核苷酸序列获得。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的经过分离的多核苷酸分子,其选自由SEQ NOs:1、11、13、15、17、19、21和26所构成的组。
8.如权利要求1所述的经过分离的多核苷酸分子,其中所述部分核苷酸序列选自由SEQ ID NOs:5、6、7、8、9、10、23和24所构成的组。
9.一种多肽,所述多肽由前述权利要求中任意一项所述的多核苷酸编码。
10.如权利要求9所述的多肽,其包含选自由SEQ ID NO:2、12、14、16、18、20、22和27所构成的组的至少25个连续氨基酸的部分氨基酸序列。
11.如权利要求9或10所述的多肽,其中,所述部分氨基酸序列具有至少35个连续氨基酸。
12.一种重组DNA分子,所述分子用于表达具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽,所述重组DNA分子包含如权利要求1至7中任意一项所述的多核苷酸。
13.一种表达载体,其中包含如权利要求12所述的重组DNA分子。
14.一种重组生物,其已被如权利要求12所述的重组DNA和/或权利要求13的表达载体所转化。
15.如权利要求14所述的重组生物,其中,所述重组DNA至少部分整合进了染色体。
16.如权利要求14或15所述的重组生物,其选自由真菌、植物、动物和细菌细胞所构成的组。
17.如权利要求16所述的重组生物,其中所述生物是选自由Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas和Escherichia所构成的组的属的细菌。
18.一种用于从选自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物来生产L-抗坏血酸的方法,所述方法包括:
(a)在合适的培养基中繁殖如权利要求14至17中任意一项所述的重组生物,以及
(b)从所述培养基中回收和分离L-抗坏血酸。
19.一种用于从选自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物来生产L-抗坏血酸的方法,所述方法包括:
(a)在合适的培养基中繁殖编码如权利要求9中所述的多肽的非重组生物,以及
(b)从所述培养基中回收和分离L-抗坏血酸。
20.一种用于生产L-抗坏血酸的方法,所述方法包括:将选自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物与权利要求9的经过分离的多肽接触。
21.一种用于从选自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物来生产L-抗坏血酸的方法,所述方法包括:
(a)在合适的培养基中繁殖如权利要求14至17中任意一项所述的重组生物或编码如权利要求9中所述的多肽的非重组生物,
(b)分离和纯化L-山梨糖酮脱氢酶,
(c)在存在(b)的L-山梨糖酮脱氢酶的情况下,对底物进行温育;以及
(d)从反应混合物中回收及分离L-抗坏血酸。
22.一种用于生产L-山梨糖酮脱氢酶的方法,其中,在合适的培养基中繁殖包含如权利要求1至7中任意一项所述的多核苷酸的重组生物,对细胞进行破碎,以及对L-山梨糖酮脱氢酶进行分离。
23.一种用于生产L-山梨糖酮脱氢酶的方法,其中,在合适的培养基中繁殖包含如权利要求1至7中任意一项所述的多核苷酸的非重组生物,对细胞进行破碎,以及对L-山梨糖酮脱氢酶进行分离。
24.一种用于生产维生素C的方法,所述方法包括:在包含微生物静止细胞的培养基中,将底物转化为维生素C。
25.如权利要求25所述的方法,包括如下步骤:
(a)在能进行生长的条件下培养所述微生物,
(b)改变所述条件,使得所述微生物的生长速率降低,导致静止细胞产生;以及
(c)用(b)的静止细胞从底物生产维生素C。
26.如权利要求25所述的方法,其中步骤(a)和(c)进行于2个或多个分离的容器中。
27.如权利要求25所述的方法,其中步骤(a)和(c)不被任何洗涤和/或分离步骤分开。
28.如权利要求24至27中任意一项所述的方法,其中以分批、补料分批、连续或半连续方式对所述微生物进行培养。
29.如权利要求25所述的方法,其中,步骤(c)以分批、补料分批、连续或半连续方式进行。
30.如权利要求24至29中任意一项所述的方法,其中,作为600nm处的OD来测量的培养基中静止细胞的密度为至少10。
31.如权利要求24至30中任意一项所述的方法,其中,产生的维生素C的产量为至少1.8g/l。
32.如权利要求24至31中任意一项所述的方法,其中,所述微生物选自由酵母、藻类和细菌所构成的组。
33.如权利要求24至32中任意一项所述的方法,其中,所述微生物选自由Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Scyzosaccharomyces、Kluyveromyces、Chlorella、Gluconobacter、Acetobacter aceti、Pantoea、Cryptococcus、Pseudomonas、和Escherichia所构成的组。
34.如权利要求24至33中任意一项所述的方法,其中,所述底物选自由D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮-L-古洛糖酸盐/酯、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮-D-葡萄糖酸盐/酯和2,5-二酮-葡萄糖酸盐/酯所构成的组。
35.如权利要求24至34中任意一项所述的方法,其中,使用能从底物生产维生素C和2-酮-L-古洛酸的微生物,并且其中,维生素C和2-KGA浓度之间的比例大于0.1。
36.如权利要求18至21或24至35中任意一项所述的方法,进一步包括:从所述培养基中分离出维生素C,以及可选地,一个或多个纯化步骤。
37.如权利要求36所述的方法,其中所有纯化步骤都在水性环境中进行。
38.如权利要求18至21或24至37中任意一项所述的方法,进一步包括:利用电渗析从所述培养基组分中分离出维生素C。
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