JP2007502102A - 微生物によるl−アスコルビン酸の製造 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)使用するトランスポゾンによってコードされる抗生物質耐性を発現するコロニーを得るためにL−ソルボソンからL−アスコルビン酸を産生するグルコノバクター属株またはアセトバクター属株に属する株への、下記のようなトランスポゾン変異;
(2)基質としてL−ソルボソンを用いたスクリーニングにおけるL−アスコルビン酸非産生変異体の選択;
(3)その変異体からの染色体DNAの単離;
(4)コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、またはサザンハイブリダイゼーション、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)クローニングなどによる染色体DNAからのトランスポゾン含有DNAフラグメントのクローニング;
(5)トランスポゾンの挿入を含むDNAフラグメントのヌクレオチド配列の決定;
(6)L−ソルボソンからL−アスコルビン酸を産生する親株からのDNAフラグメントのクローニング;
(7)L−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が効率的に発現できる発現ベクターの構築;
(8)宿主細胞にDNAを導入するための適切な方法、例えば形質転換、形質導入、接合伝達および/またはエレクトロポレーションによるL−ソルボソンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する組換え生物の構築。この宿主細胞は、それによって本発明の組換え生物となる。
(i)例えばマトリックス介助レーザー脱離/イオン化(MALDI)のような方法によって、精製されたタンパク質またはそのペプチドフラグメントから部分アミノ酸配列を決定できる。そのようなタンパク質全体の単離によって、またはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)後のゲルからのペプチダーゼ処理によって、そのようなタンパク質全体またはペプチドフラグメントを調製できる。このように得られたタンパク質またはそのフラグメントは、Applied Biosystems気相自動シーケンサ470Aのようなタンパク質シーケンサにも適用できる。例えばApplied Biosystems自動DNAシーケンサ381AのようなDNA合成装置を用いてオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーを設計および調製するために、そのアミノ酸配列を利用できる。例えばサザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリダイゼーションにより、標的遺伝子を有する株の遺伝子ライブラリーから標的遺伝子を有するクローンを単離するためにこれらのプローブを使用できる。
(ii)あるいはまたさらに、遺伝子ライブラリーから標的タンパク質を発現するクローンを選択する目的で、例えば標的タンパク質に対して調製される抗体を用いた免疫学的方法を適用できる。
(iii)一組のプライマー、すなわち上記のように決定されたアミノ酸配列により合成された二つのオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって、総染色体DNAから標的遺伝子のDNAフラグメントを増幅できる。次に、例えばプローブとして前記で得られたPCR産物を用いたサザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションによって、例えば大腸菌に構築された遺伝子ライブラリーから、遺伝子全体を有するクローンを単離できる。
精製SNDHaiによるL−アスコルビン酸の産生
1.SNDHaiの精製
流加発酵(培養については実施例3参照)によって培養された、SNDHaiを産生可能な微生物の細胞を、2mM MgCl2、1mM ジチオトレイトール(DTT)、およびEDTA不含プロテアーゼ阻害剤錠(Roche Diagnostics GmbH)2〜3個を含むリン酸緩衝液(20mM、pH7.0)25mlに懸濁した。この細胞懸濁液をフレンチプレスセルで3回処理した。その後、2mM MgCl2および1M NaClを含むリン酸緩衝液(20mM、pH7.0)25mlを加え、得られた懸濁液を超遠心分離した(30000rpm、60分、4℃)。膜画分を含むペレットを2mM MgCl2および500mM NaClを含むリン酸緩衝液(20mM、pH7.0)で洗浄し、その後、2mM MgCl2を含むリン酸緩衝液(20mM、pH7.0)適量に懸濁した。次に、最終濃度2w/v%となるようにN−オクチルグルコシド(Fluka)を加え、その懸濁液を氷冷下で静かに撹拌しながら90分間インキュベートした。遠心分離(20000rpm、60分、4℃)後に、透明な赤色上清を採集し、最終濃度が15w/v%となるようにポリエチレングリコール6000(Fluka)を加えた。静かに振盪しながら4℃で60分間インキュベートした後、遠心分離(10000rpm、30分、4℃)を行い、2mM MgCl2および0.5w/v%ラウリルスルホベタイン(Fluka)を含むトリス−HCl緩衝液(20mM、pH7.6)にペレットを溶解させた。4℃で一晩静かに振盪した後、溶液を遠心分離(20000rpm、30分、4℃)した。上清を採集し、下記のようにさらに精製した。
SNDHai活性の測光測定用の反応混合物は、最終体積1.0mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に溶解した0.196mMニトロブルー塩化テトラゾリウム(NBT)、0.137mMフェナジンメトスルフェート(PMS)、20.4mM L−ソルボソン、および酵素溶液からなった。酵素を加えて反応を開始し、NBTの初期減少率として光路長1cmのキュベットで酵素活性を570nmで測定した(T=25℃)。酵素活性1単位を1分間あたり1μMのNBTの減少を触媒する酵素の量と定義した。pH7.5でのNBTの吸光係数を100mM-1cm-1とした。活性の決定にL−ソルボソン以外の上記の成分を含む一つおよび酵素溶液以外のすべての成分を含むもう一つの2種類の参照キュベットを使用した。
以下の組成を有するアッセイでL−ソルボソンからのL−アスコルビン酸の産生について、純粋なSNDHaiを含有する画分(上記参照)を直接分析した(総容積0.5ml):0.14mg/ml精製脱塩SNDHai、50mMリン酸緩衝液(pH6.5)、8mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、100mM L−ソルボソン、1mM PMS、5mM CaCl2、50μM PQQ−K2。遮光下で十分に振盪しながら(ベンチトップ振盪器で900rpm)、25℃で適切な反応管に入れてアッセイを実施した。
試験管発酵およびフラスコ発酵におけるL−ソルボースおよびD−ソルビトールからのL−アスコルビン酸の産生
3BD番の液体培地4mlに植菌するためにG.オキシダンスN44−1の細胞を使用し、220rpmで振盪しながら30℃で3日間試験管(直径18mm)内で培養した。インキュベーション時間の終了時にL−アスコルビン酸20mg/lが蓄積していた。
流加発酵におけるD−ソルビトールからのL−アスコルビン酸の産生
2l容バッフル付き振盪フラスコに入れた100g/l D−ソルビトール、0.5g/lグリセロール、15g/l酵母エキス(Fluka BioChemika、ブックス、スイス)、2.5g/l MgSO4・7H2Oおよび15g/l CaCO3を含む5番の培地200ml中で180rpmで浸透しながら30℃でG.オキシダンスN44−1の細胞を成長させた。48時間後に、20g/l D−ソルビトール、0.5g/lグリセロール、15g/l酵母エキス(Fluka BioChemika、ブックス、スイス)および2.5g/l MgSO4・7H2Oを含む培地5.3lを予め準備し、温度センサー、pHセンサーおよび溶存酸素センサーならびに制御ループを備える10l容のバイオリアクター(B. Braun ED10、メルスンゲン、ドイツ)に植菌するために、この培養液150mlを使用した。温度を30℃に制御し、28%アンモニア液を加えることによってpHを6.0に制御し、通気流は4.5l/分であり、溶存酸素を撹拌速度による多段階で30%に制御した(最小300rpm)。工程時間の6時間後に、500g/lソルビトール溶液を44時間の間、25g/時の速度で供給した。工程時間の96時間後に約1%の基質が上清に残留し、950mg/lのL−アスコルビン酸が産生していた。
細胞膜画分を用いたL−ソルボソンまたはL−ソルボースからのL−アスコルビン酸の産生
500ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れた3BD番の液体培地100ml中で30℃で220rpmで振盪しながら3日間G.オキシダンスN44−1の細胞を培養した。得られた培養液を500rpmで遠心分離してCaCO3を除去した。この工程からの上清を次に5000rpmで遠心分離して細胞をペレットにした。採集した細胞を50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)3ml中に懸濁し、900psiでフレンチプレスセル(SIM-AMINCO Spetronic Instruments、米国)を2回通過させることで細胞を破壊した。得られたホモジネートをまず5000rpmで遠心分離して細胞破壊片を除去した。次に、タンパク質3mg/mlのタンパク質最終濃度まで上清を希釈した。この希釈された試料を無細胞抽出物(CFE)と名付けた。CFEを100000×gで60分間遠心分離した。得られた上清を捨て、膜画分としてペレットを採集した。
グルコノバクターオキシダンスN44−1からのSNDHai遺伝子の単離
1. Tn5の変異誘発
Tn5を含む「自殺」ベクターであるプラスミドpSUP2021(Simon R. et al. 1983. BIO/TECHNOLOGY 1: 784-791)を下記のような接合交配法によって大腸菌HB101からG.オキシダンスN44−1に転移させた。MB液体培地5mlの入った試験管でG.オキシダンスN44−1を30℃で一晩培養した。ヘルパープラスミドpRK2013(D. H. Figurski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,1648-1652, 1979)を有する大腸菌HB101およびプラスミドpSUP2021を有する大腸菌HB101を、カナマイシン50μg/mlを有するLB培地5mlの入った試験管で37℃で一晩培養した。一晩培養後の培養液から、G.オキシダンスN44−1、大腸菌HB101(pRK2013)、および大腸菌HB101(pSUP2021)の細胞を遠心分離により別々に採集し、本来の容積になるようにMB培地に懸濁した。次に、これらの細胞懸濁液を等量ずつ混合し、得られた混合物をMB寒天平板上に置いた0.45μmニトロセルロース膜に塗布した。27℃で1日培養後、細胞を膜からかき取り、MBブロスで希釈液を調製した。次に、希釈された細胞を、ポリミキシンB10μg/mlおよびカナマイシン50μg/mlを含むMB寒天培地(MPK培地)に塗布した。ポリミキシンBは大腸菌ドナー株およびヘルパー株に対して選択し、カナマイシンはプラスミドpSUP2021で形質転換されたG.オキシダンス細胞(すなわち接合完了体)を選択する。約30000個の接合完了体が得られた。
全部で3760個の接合完了体を滅菌つまようじでMPKグリッド平板に移植し、27℃で3日間成長させた。L−ソルボソンからのL−アスコルビンの産生を試験するために、各接合完了体の細胞を滅菌つまようじでグリッド平板から釣り上げ、96穴マイクロタイタープレートに0.5%L−ソルボソン、0.3%NaCl、および1%CaCO3を含む休止細胞反応混合液50μlに懸濁した。マイクロタイタープレートを30℃で1日間振盪せずにインキュベートした。アスコルビン酸検査ストリップおよびRQFlex2装置(Merck KGaA, 64271ダルムシュタット、ドイツ)を使用してL−アスコルビン酸の形成について、得られた反応混合物それぞれ1μlを分析した。陽性対照株は、同条件で成長したG.オキシダンスN44−1であった。この方法によって、L−アスコルビン酸非産生変異体N44−1−6A9が同定された。次に、変異体N44−1−6A9の染色体DNAにTn5が存在することを確認するためにサザンブロットハイブリダイゼーション分析を行った。変異体から単離された染色体DNA2μgをApaI、ClaI、EcoRI、EcoRV、KpnI、StuI、BamHI、SalI、またはHindIIIのいずれかで分解し、アガロースゲル電気泳動に供した(0.8%アガロース)。次にゲルを0.25N HClで15分間処理し、その後0.5N NaOHで30分間処理した。急速下方転移システムTurboBlotter(Schleicher & Schuell GmbH、ドイツ)でDNAをナイロン膜に転移させた。プライマーTn2419(配列番号3)およびプライマーTn3125R(配列番号4)を使用してプラスミドpSUP2021を鋳型として用いてPCR-DIG標識キット(Roche Diagnostics GmbH、68298マンハイム、ドイツ)でプローブを調製した。707bpのPCR産物を得た。
上記第2節に記載した制限酵素による分解の結果に基づいて、ApaI、ClaI、EcoRI、およびEcoRVが、Tn5挿入部の両側に1kbを超える隣接染色体DNAを有するDNAフラグメントを発生する酵素として選択された。(Tn5のほぼ中央を切断する)SalIおよびApaIによる変異体N44−1−6A9のDNAの二重分解は、上記の707bpプローブにハイブリダイズする2本のフラグメント(6.2kbおよび3.8kb)を与えた。
L−ソルボソンからL−アスコルビン酸を産生する細菌のサザンブロット分析
グルコノバクターオキシダンスIFO3293、IFO3292、IFO3244、IFO3287、グルコノバクターフラトゥリIFO3260およびIFO3265、グルコノバクターセリナスIFO3266およびIFO3269、アセトバクターアセチ亜種オルレアナスIFO3259、アセトバクターアセチ亜種キシリナムIFO13693およびIFO13773、アセトバクター種ATCC15164、ならびに大腸菌K−12の細胞から染色体DNAを調製した。IFO13693株およびIFO13773株を、5g/lバクトペプトン(Difco)、5g/L酵母エキス(Difco)、5g/Lグルコース、5g/Lマンニトール、1g/L MgSO4・7H2O、5ml/Lエタノール、および15g/L寒天を含む350番の培地で27℃で3日間成長させた。他のすべてのアセトバクター株およびすべてのグルコノバクター株を、 25g/lマンニトール、5g/l酵母エキス(Difco Laboratories、デトロイト、ミシガン州、米国)、3g/lバクトペプトン(Difco)、および18g/l寒天(Difco)を含むマンニトールブロス(MB)寒天培地で27℃で3日間成長させた。大腸菌K−12をルリアブロス(Luria Broth)寒天培地で成長させた。実施例5に記載したようなストリンジェントな条件でのサザンブロットハイブリダイゼーションに、染色体DNA調製物を使用した。染色体DNA調製物をClaI(Nドメイン領域を分析する場合)またはEcoRI(Cドメイン領域を分析する場合)で分解し、DNAフラグメント1μgをアガロースゲル電気泳動(1%アガロース)で分離した。ゲルを0.25N HClで15分間処理してから、0.5N NaOHで30分間処理し、次に供給業者の指示書にしたがってVacuum Blotterモデル785(BIO-RAD Laboratories AG、スイス)を用いてナイロン膜に転写した。表2に記載するようなプライマーセットを使用することによって、PCR-DIG標識キット(Roche Diagnostics)でプローブを調製した。PCR産物P1は、Nドメイン(可能な膜貫通領域)と称されるSNDHaiの領域に対応し、PCR産物P2は、Cドメイン(可能な一次デヒドロゲナーゼ領域)と称されるSNDHaiの領域に対応する。
グルコノバクターオキシダンスN44−1のSNDHai遺伝子のオーソログのPCR増幅および配列分析
(実施例6に記載したように調製した)染色体DNA調製物を、表2に示す4つのプライマーセットを用いたPCRのための鋳型として使用した。染色体DNA5〜100ngを一反応あたりに使用した(総容積50μl)。特に指定しない限り、Expand High Fidelity PCRシステム(Roche Diagnostics)を使用した。PCR条件は以下のとおりであった。
プライマーSNDH1391F(配列番号10)およびSNDH2364R(配列番号8)ならびに鋳型としてG.オキシダンスIFO3292由来染色体DNAを用いた増幅により得られたPCR産物(約1kb)を、プライマーSNDH1391F(配列番号10)を用いた配列分析に使用した。決定された771bpのヌクレオチド配列(配列番号11)は、G.オキシダンスN44−1由来SNDHai配列(配列番号1)のヌクレオチド1431〜2201と98.7%(761/771)の相同性を示した。アミノ酸256個の推定されるアミノ酸配列(配列番号12)は、G.オキシダンスN44−1由来SNDHのアミノ酸配列(配列番号2)のアミノ酸478〜733と100%の同一性を示した。
プライマーSNDH1F(配列番号5)およびSNDH420R(配列番号6)ならびに鋳型としてG.オキシダンスIFO3287由来染色体DNAを用いた増幅により得られたPCR産物(約0.4kb)を、プライマーSNDH420R(配列番号6)を用いた配列決定に使用した。決定された350bpのヌクレオチド配列(配列番号13)は、配列番号1のヌクレオチド31〜380と97.4%(341/350)の相同性を示した。推定される116残基のアミノ酸配列(配列番号14)は、配列番号2のアミノ酸11〜126と100%の同一性を示した。
プライマーSNDH1F(配列番号5)およびSNDH420R(配列番号6)ならびに鋳型としてA.種ATCC15164由来染色体DNAを用いた増幅により得られたPCR産物(約0.4kb)を、プライマーSNDH420R(配列番号6)を用いた配列分析に使用した。決定された360bpのヌクレオチド配列(配列番号19)は、配列番号1のヌクレオチド31〜390と97.8%(352/360)の相同性を示した。推定される120残基のアミノ酸配列(配列番号20)は、配列番号2のアミノ酸11〜130と100%の同一性を示した。
G.オキシダンスIFO3244のSNDHaiオーソログ遺伝子の完全ヌクレオチド配列を、鋳型としてG.オキシダンスIFO3244の染色体DNAおよび以下のプライマーセットを用いて得られたPCR産物を使用することによって決定した:SNDH1F(配列番号5)およびSNDH420R(配列番号6)、SNDH501F(配列番号7)およびSNDH1530R(配列番号9)、SNDH1391F(配列番号10)およびSNDH2364R(配列番号8)、SNDH382(配列番号23)およびSNDH1530R(配列番号9)、SNDH1F(配列番号5)およびSNDH689R(配列番号24)。BglIIおよびBamHIで分解し、連結した染色体DNAを、以下のプライマーセットを用いたさらに2回のPCRに使用した:SNDH420R(配列番号6)およびSNDH501F(配列番号7)およびSNDH1530R(配列番号9)およびIS−50.3(配列番号25)。完全ヌクレオチド配列(配列番号26)は、G.オキシダンスN44−1(配列番号1)由来SNDHaiのヌクレオチド配列と98.4%の相同性を示した。推定されるアミノ酸配列(配列番号27)は、配列番号2のアミノ酸配列と100%の同一性を示した。
SNDHaiの遺伝子の量を増加させることによるL−ソルボソンからのL−アスコルビン酸産生の増加
上流および下流に隣接領域を有するSNDHai遺伝子を、鋳型としてN44−1株の染色体DNAおよびプライマーセットN1(配列番号28)およびN2(配列番号29)を用いたPCRによって増幅させた。
マンニトールブロス寒天培地上で成長した休止細胞を使用したL−ソルボソンからのL−アスコルビン酸の産生
IFO株3293、3292、3244、3260、3266、3287、3259、13693、および13773ならびにアセトバクター種ATCC15164およびIFO3293株の派生株であるグルコノバクターオキシダンスN44−1を 、L−ソルボソンからのL−アスコルビン酸の産生に使用した。
3BD寒天培地上で成長した休止細胞を使用したD−ソルビトール、L−ソルボースまたはL−ソルボソンからのL−アスコルビン酸の産生
G.オキシダンスN44−1の細胞を、70g/l L−ソルボース、0.5g/lグリセロール、7.5g/l酵母エキス(Difco)、2.5g/l MgSO4・7H2O、10g/l CaCO3および18g/l寒天(Difco)を含む3BD番の寒天培地上で27℃で3日間成長させた。休止細胞の反応(10ml容試験管に入れた反応混合物1ml)を、実施例9に記載したように2%D−ソルビトール、2%L−ソルボース、または1%L−ソルボソンを用いて30℃で24時間行った。N44−1株は、D−ソルビトール、L−ソルボース、およびL−ソルボソンからそれぞれ280、400および1780mg/lのL−アスコルビン酸を産生した。
液体培地中で成長した休止細胞を使用したD−ソルビトールからのL−アスコルビン酸の産生
G.オキシダンスN44−1の細胞を、2l容のバッフル付き振盪フラスコに入れた100g/l D−ソルビトール、0.5g/lグリセロール、15g/l酵母エキス(Fluka BioChemika、ブックス、スイス)、2.5g/l MgSO4・7H2Oおよび15g/l CaCO3を含む5番の培地200ml中で30℃、180rpmで振盪しながら成長させた。24時間後に培養液を3220gで遠心分離し(Eppendorf 5810R、ハンブルグ、ドイツ)、細胞を0.9%NaCl溶液に再懸濁し、再び3220gで遠心分離し、得られた細胞ペレットを、完全成長培地(100g/l D−ソルビトール、0.5g/lグリセロール、15g/l酵母エキス、2.5g/l MgSO4・7H2Oおよび15g/l CaCO3)50mlを含む500ml容バッフル付き振盪フラスコ1本および生産培地(100g/l D−ソルビトール、3g/l NaCl、10g/l CaCO3)50mlを含む別の500ml容バッフル付き振盪フラスコに植菌するために使用した。600nmでの光学密度(OD600)として測定された両フラスコでの初期細胞密度は10であった。両フラスコを、30℃、180rpmで振盪しながらインキュベートした。48時間後に成長培地および生産培地中の細胞懸濁液は、それぞれ1.06および1.18g/lのL−アスコルビン酸を蓄積していた。インキュベーション時間の間に完全培地ではさらなる成長は観察されなかった。
増加したSNDHai遺伝子量を有する組換え微生物の休止細胞によるL−ソルボソンまたはD−ソルビトールからのL−アスコルビン酸の産生
上流および下流に隣接領域を有するG.オキシダンスN44−1(配列番号1)のSNDHai遺伝子を、鋳型としてN44−1株の染色体DNAならびにプライマーセットN1(配列番号28)およびN2(配列番号29)を用いたPCRによって増幅させた。
大腸菌の休止細胞におけるL−ソルボソンからのL−アスコルビン酸の産生
配列番号1のヌクレオチド1〜2364に対応する、SNDHai−1と名付けた、停止コドンを有さないSNDHai遺伝子を、プライマー対SNDHai−Nde(配列番号30)およびSNDHaiHis−X(配列番号31)を使用したPCR(Roche High Fidelity Kit)によってN44−1株の染色体DNAから増幅させた。
増加したSNDHai遺伝子量を有する組換え微生物の休止細胞によるD−ソルビトールからのL−アスコルビン酸の産生
SNDHaiを過剰発現するG.オキシダンスN44−1の細胞を、500ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れた100g/l D−ソルビトール、0.5g/lグリセロール、15g/l酵母エキス(Fluka BioChemika、ブックス、スイス)、2.5g/l MgSO4・7H2Oおよび15g/l CaCO3を含む5番の培地50ml中で30℃、180rpmで振盪しながら48時間成長させた。得られた細胞懸濁液を、100g/l D−ソルビトール、15g/l酵母エキス(Fluka BioChemika、ブックス、スイス)、2.5g/l MgSO4・7H2O、0.3g/l KH2PO4および0.12g/l CaSO4からなる培地1.25lを含む成長容器(Biostat-MD、B. Braun Melsungen、メルスンゲン、ドイツ)と呼ばれる2L容のバイオリアクターに植菌するために使用した。細胞を30℃、通気速度1l/分で培養し、25%Na2CO3溶液でpHを5.7に制御し、撹拌速度を変動させることによって溶存酸素を10%飽和に制御した。24時間後、600nmでの吸光単位として測定された細胞密度は20であった。この時点で、100g/l D−ソルビトール、15g/l酵母エキス(Fluka BioChemika、ブックス、スイス)、2.5g/l MgSO4・7H2O、0.3g/l KH2PO4および0.12g/l CaSO4を含む供給溶液を125ml/時の供給速度で成長容器に供給し、採取速度125ml/時でブロスを連続的に採取した。これによって、成長容器中の体積を1.25lの一定に保持した。他の工程パラメータを、上に言及したように制御し続けた。
下流の加工処理工程による休止細胞反応から産生したL−アスコルビン酸の精製
16g/1のL−アスコルビン酸を含む実施例14の採取流をキレート樹脂(Amberlite IRC 748、Rohm and Haas、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、米国)に供給して、流液から二価陽イオンを除去した。次に、それを冷却容器(供給容器)に採集し、10lを採集したときにバイポーラ膜電気透析ユニット(Eurodia Industries、Wissous、フランス製、7 Neosepta BP1/CMB膜を含むスタック、総膜面積0.14m2)を通過する回分法でそれらを加工処理した。この溶液を電気透析ユニットの供給区画を介して200l/時の速度で汲み出し、供給容器に再循環させた。最初に2g/l NaOH溶液5lを含む別の冷却容器(濃縮容器)から、バイポーラ膜電気透析ユニットの濃縮区画を介して100l/時でポンプで液を流動させた。最大電圧25Vおよび最大電流20Aを適用することによって、供給区画からのナトリウム陽イオンを濃縮区画に移動させ、よって供給流に存在するナトリウム型のL−アスコルビン酸を対応する遊離酸型に転換した。90%の転換効率に達した後、工程を停止した。濃縮容器において、7.5g/l NaOHを含む溶液6lを希釈容器から採集し、ナトリウム塩型から遊離酸型への転換効率を約99%まで増加させるために約16g/l L−アスコルビン酸を遊離酸型で、および1.6g/l L−アスコルビン酸をナトリウム塩型で含む溶液9lを陽イオン交換樹脂(Amberlite FPC 21 H、Rohm and Haas、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、米国)でさらに加工処理した。あるいはまた、電気透析工程からのナトリウム塩型の16g/l L−アスコルビン酸を含む溶液10lを陽イオン交換樹脂で直接処理し、99%の収率で遊離酸型に転換させた。上記の方法のいずれかによって得られた遊離酸型のL−アスコルビン酸の流液を、次に一連の以下の工程によってさらに加工処理した:陰イオン交換、活性炭処理、濃縮、結晶化、結晶の濾過、および乾燥。得られた結晶の最終純度は、98%であり、下流の加工処理工程の組み合わせで得られた収率は80%であった。
Claims (37)
- 配列番号1のうち少なくとも20個の連続するヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列を含むL−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから誘導可能な単離されたポリヌクレオチド分子。
- 配列番号1の部分ヌクレオチド配列が、少なくとも50個の連続するヌクレオチドを有する、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 配列番号1の部分ヌクレオチド配列が、少なくとも100個の連続するヌクレオチドを有する、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 部分ヌクレオチド配列が、少なくとも100個の連続するヌクレオチドを比較して、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項3記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 部分ヌクレオチド配列が、配列番号1と少なくとも80%の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項1〜4のいずれか1項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 部分ヌクレオチド配列が、配列番号1と少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列から誘導可能である、請求項1〜5のいずれか1項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 配列番号1、11、13、15、17、19、21および26からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 部分ヌクレオチド配列が、配列番号5、6、7、8、9、10、23、および24からなる群より選択される、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド。
- 配列番号2、12、14、16、18、20、22、および27からなる群より選択される少なくとも25個の連続するアミノ酸の部分アミノ酸配列を含む、請求項9記載のポリペプチド。
- 部分アミノ酸配列が、少なくとも35個の連続するアミノ酸を有する、請求項9または10記載のポリペプチド。
- L−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの発現のための組換えDNA分子であって、請求項1〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む組換えDNA分子。
- 請求項12記載の組換えDNA分子を含む発現ベクター。
- 請求項12記載の組換えDNAおよび/または請求項13記載の発現ベクターで形質転換された組換え生物。
- 組換えDNAが染色体に少なくとも部分的に組込まれている、請求項14記載の組換え生物。
- 真菌細胞、植物細胞、動物細胞および細菌細胞からなる群より選択される、請求項14または15記載の組換え生物。
- 生物がグルコノバクター(Gluconobacter)、アセトバクター(Acetobacter)、シュードモナス(Pseudomonas)およびエシェリキア(Escherichia)からなる群より選択される属の細菌である、請求項16記載の組換え生物。
- D−ソルビトール、L−ソルボースおよびL−ソルボソンより選択される基質からのL−アスコルビン酸の製造方法であって、
(a)適切な培地中で請求項14〜17のいずれか1項記載の組換え生物を増殖させ;そして
(b)該培地からL−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。 - D−ソルビトール、L−ソルボースおよびL−ソルボソンより選択される基質からのL−アスコルビン酸の製造方法であって、
(a)適切な培地中で請求項9記載のポリペプチドをコードする非組換え微生物を増殖させ;そして
(b)該培地からL−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。 - D−ソルビトール、L−ソルボースおよびL−ソルボソンより選択される基質を請求項9記載の単離されたポリペプチドと接触させることを含む、L−アスコルビン酸の製造方法。
- D−ソルビトール、L−ソルボースおよびL−ソルボソンより選択される基質からのL−アスコルビン酸の製造方法であって、
(a)適切な培地中で請求項14〜17のいずれか1項記載の生物の組換え体または請求項9記載のポリペプチドをコードする非組換え微生物を増殖させ;
(b)L−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離および精製し;
(c)(b)のL−ソルボソンデヒドロゲナーゼの存在下で該基質をインキュベートし;そして
(d)反応混合物からL−アスコルビン酸を回収および分離すること
を含む方法。 - 適切な培地中で請求項1〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む組換え生物を増殖し、細胞を破壊し、かつL−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離する、L−ソルボソンデヒドロゲナーゼの製造方法。
- 適切な培地中で請求項1〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む非組換え微生物を増殖し、細胞を破壊し、かつL−ソルボソンデヒドロゲナーゼを単離する、L−ソルボソンデヒドロゲナーゼの製造方法。
- 微生物の休止細胞を含む培地中で基質をビタミンCに転換することを含む、ビタミンCの製造方法。
- (a)成長を可能にする条件下で微生物を培養し;
(b)該微生物の成長速度を低減して休止細胞をもたらすような条件に変更し;そして
(c)(b)の休止細胞を使用して基質からビタミンCを産生する
工程を含む、請求項25記載の方法。 - 工程(a)および(c)が、二つ以上の別個の容器において行われる、請求項25記載の方法。
- 工程(a)および(c)がいかなる洗浄工程および/または単離工程によっても隔てられない、請求項25記載の方法。
- 微生物を、回分法、流加法、連続法、または半連続法で成長させる、請求項24〜27のいずれか1項記載の方法。
- 工程(c)を、回分法、流加法、連続法、または半連続法で行う、請求項25記載の方法。
- 600nmでのODとして測定される、培地中の休止細胞の密度が少なくとも10である、請求項24〜29のいずれか1項記載の方法。
- 産生するビタミンCの収量が、少なくとも1.8g/lである、請求項24〜30のいずれか1項記載の方法。
- 微生物が、酵母、藻類、および細菌からなる群より選択される、請求項24〜31のいずれか1項記載の方法。
- 微生物が、カンジダ(Candida)、サッカロミセス(Saccharomyces)、チゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、スキゾサッカロミセス(Scyzosaccharomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、クロレラ(Chlorella)、グルコノバクター、アセトバクターアセチ(Acetobacter aceti)、パントエア(Pantoea)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、シュードモナスおよびエシェリキアからなる群より選択される、請求項24〜32のいずれか1項記載の方法。
- 基質が、D−グルコース、D−ソルビトール、L−ソルボース、L−ソルボソン、2−ケト−L−グロナート、D−グルコナート、2−ケト−D−グルコナートおよび2,5−ジケト−グルコナートからなる群より選択される、請求項24〜33のいずれか1項記載の方法。
- 基質からビタミンCおよび2−ケト−L−グロン酸の両方を産生できる微生物を使用し、ビタミンCおよび2−KGAの濃度の比が0.1を超える、請求項24〜34のいずれか1項記載の方法。
- 培地からのビタミンCの単離、および場合により一つまたは複数の精製工程をさらに含む、請求項18〜21または請求項24〜35のいずれか1項記載の方法。
- すべての精製工程が水性環境で行われる、請求項36記載の方法。
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