ES2593811T3

ES2593811T3 - Producción microbiana de ácido L-ascórbico

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Publication number: ES2593811T3
Application number: ES10184019.7T
Authority: ES
Inventors: Alan Berry; Connie Lee; Anne Françoise Mayer; Masako Shinjoh
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2004-08-16
Publication date: 2016-12-13
Anticipated expiration: 2024-08-16
Also published as: EP2348113A2; ES2421294T3; EP2348113A3; WO2005017159A3; US7700723B2; EP1664303B1; WO2005017159A2; KR20060064629A; BRPI0413542A; WO2005017172A1; EA009287B1; US20100203598A1; JP2007502102A; US20130217080A1; EP1664303A2; JP4896718B2; US20070184534A1; CN104004776A; US8338144B2; KR101311562B1

Abstract

Procedimiento para la producción de un microorganismo seleccionado de Gluconobacter, Acetobacter, Pseudomonas o Escherichia capaz de expresar L-sorbosona deshidrogenasa como una forma activa in vivo y capaz de convertir directamente la L-sorbosona en vitamina C, en donde dicho microorganismo se modifica genéticamente introduciendo más de 1 copia de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido que tiene actividad de L-sorbosona deshidrogenasa capaz de convertir directamente la L-sorbosona en ácido L-ascórbico, seleccionándose dicho polinucleótido del grupo que consiste en: (a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 2, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 27; (b) polinucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 26; (c) polinucleótidos cuya cadena complementaria hibrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b); y (d) polinucleótidos que comparten al menos 80% de homología con una cadena de al menos 100 nucleótidos consecutivos del polinucleótido según la SEQ ID NO: 1.

Description

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abril, 1954; Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13693 depositada el 22 de octubre, 1975, y Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13773 depositada el 8 de diciembre, 1977. La cepa de Acetobacter sp. ATCC 15164, que también es un ejemplo de una bacteria preferida, se depositó en la ATCC. La cepa Gluconobacter oxydans (anteriormente conocidas como G. melanogenus) N44-1 como otro ejemplo de una bacteria preferida es un derivado de la cepa IFO 3293 y se describe en Sugisawa et al., Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990.

En relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, se entiende que los microorganismos mencionados antes también incluyen sinónimos o basónimos de dichas especies que tienen las mismas propiedades fisiológicas, como define el Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas. La nomenclatura de los microorganismos usada en la presente memoria es la oficialmente aceptada (en la fecha de presentación de la solicitud de prioridad) por el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas y la Sección de Bacteriología y Microbiología aplicada de la Unión Internacional de Sociedades Microbiológicas, y publicada por su vehículo oficial el International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM). Se hace referencia en particular a Urbance et al., IJSEM (2001) vol 51:1059-1070, con una notificación correctiva en IJSEM (2001) vol 51:1231-1233, que describe la reclasificación taxonímica de G. oxydans DSM 4025 como Ketogulonicigenium vulgare.

Como se usa en la presente memoria, células en reposo se refiere a células de un microorganismo que por ejemplo son viables pero no crecen activamente, o que crecen a velocidades de crecimiento específicas [µ] bajas, por ejemplo, velocidades de crecimiento inferiores a 0,02 h-1, preferiblemente inferiores a 0,01 h-1 . Las células que presentan las velocidades de crecimiento anteriores se dice que están en un "modo de célula en reposo".

El procedimiento de la presente invención como antes, que usa células en reposo de un microorganismo se puede llevar a cabo en diferentes etapas o fases: preferiblemente el microorganismo se cultiva en una primera etapa (también denominada etapa (a) o fase de crecimiento) en condiciones que permiten el crecimiento. Esta fase se termina cambiando las condiciones de modo que la velocidad de crecimiento del microorganismo se reduce conduciendo a células en reposo, también denominada etapa (b), seguido de la producción de vitamina C a partir del sustrato usando las células en reposo de (b), denominadas también fase de producción.

La fase de crecimiento y producción como se llevan a cabo en el procedimiento anterior usando células en reposo de un microorganismo se pueden llevar a cabo en el mismo recipiente, es decir, solo un recipiente, o en dos o más recipientes diferentes, con una etapa de separación celular opcional entre las dos fases. La vitamina C producida se puede recuperar de las células por cualquier medio adecuado. Medios de recuperación por ejemplo, en los que la vitamina C producida se puede separar del medio de producción. Opcionalmente, la vitamina C así producida se puede procesar posteriormente.

Para los fines de la presente invención en relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, las expresiones "fase de crecimiento", "etapa en crecimiento", "etapa de crecimiento" y "periodo de crecimiento" se usan de forma intercambiable en la presente memoria. Lo mismo se aplica para las expresiones "fase de producción", "etapa de producción", "periodo de producción".

Una forma de llevar a cabo el procedimiento anterior usando células en reposo de un microorganismo de la presente invención, puede ser un procedimiento en donde el microorganismo se desarrolla en un primer recipiente, llamado recipiente de crecimiento, como fuente para las células en reposo, y al menos parte de las células se transfieren a un segundo recipiente, llamado recipiente de producción. Las condiciones en el recipiente de producción pueden ser tales que las células transferidas desde el recipiente de crecimiento se vuelven células en reposo como se ha definido antes. La vitamina C es producida en el segundo recipiente y recuperada de este.

En relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, en un aspecto, la etapa de crecimiento se puede llevar a cabo en un medio acuoso en condiciones aerobias. El cultivo se puede llevar a cabo, por ejemplo, en modo discontinuo, discontinuo alimentado, semicontinuo o continuo. El periodo de cultivo puede variar dependiendo de la clase de células, pH, temperatura y medio nutriente que se va a usar, y puede ser por ejemplo de aproximadamente 10 h a aproximadamente 10 días, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 días, más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 días, cuando se realiza en un modo discontinuo o discontinuo alimentado, dependiendo del microorganismo. Si las células se hacen crecer en modo continuo, el tiempo de permanencia puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 h, preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 h, dependiendo del microorganismo. Si el microorganismo se selecciona de bacterias, el cultivo se puede llevar a cabo, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,0, preferiblemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 9,0, más preferiblemente aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, incluso más preferiblemente aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0. Si se usan algas o levaduras, el cultivo se puede llevar a cabo, por ejemplo, a un pH menor de aproximadamente 7,0, preferiblemente menor de aproximadamente 6,0, más preferiblemente menor de aproximadamente 5,5, y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 5,0. Un intervalo de temperatura adecuado para llevar a cabo el cultivo usando bacterias puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 13°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente de aproximadamente 18°C a aproximadamente 37°C, más preferiblemente de aproximadamente 13°C a aproximadamente 36°C, y lo más preferiblemente de aproximadamente 18°C a aproximadamente 33°C. Si se usan algas o levaduras, un intervalo de temperatura

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adecuado para llevar a cabo el cultivo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente de aproximadamente 20°C a aproximadamente 45°C, más preferiblemente de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, incluso más preferiblemente de aproximadamente 25°C a aproximadamente 38°C, y lo más preferiblemente de aproximadamente 30°C a aproximadamente 38°C. El medio de cultivo para el crecimiento habitualmente puede contener nutrientes tales como fuentes de carbono asimilables, p. ej., glicerol, D-manitol, Dsorbitol, L-sorbosa, eritritol, ribitol, xilitol, arabitol, inositol, dulcitol, D-ribosa, D-fructosa, D-glucosa, y sacarosa, preferiblemente L-sorbosa, D-glucosa, D-sorbitol, D-manitol y glicerol; y fuentes de nitrógeno digeribles tales como sustancias orgánicas, p. ej., peptona, extracto de levadura y aminoácidos. El medio puede ser con o sin urea y/o licor de maceración del maíz y/o levadura de panadería. También se pueden usar diferentes sustancias inorgánicas como fuentes de nitrógeno, p. ej., nitratos y sales de amonio. Además, el medio de crecimiento habitualmente puede contener sales inorgánicas, p. ej., sulfato magnésico, sulfato de manganeso, fosfato potásico y carbonato de calcio.

En relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, en la fase de crecimiento las velocidades de crecimiento específicas son, por ejemplo, al menos 0,02 h-1 . Para células en crecimiento en modo discontinuo, discontinuo alimentado o semicontinuo, la velocidad de crecimiento depende, por ejemplo, de la composición del medio de crecimiento, pH, temperatura, y similares. En general, las velocidades de crecimiento pueden estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 h-1 ,

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preferiblemente de aproximadamente 0,06 a aproximadamente 0,15 , y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,07 a aproximadamente 0,13 h-1 .

En otro aspecto del procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, las células en reposo se pueden proporcionar por cultivo del respectivo microorganismo en placas de agar que sirven así como recipiente de crecimiento, usando esencialmente las mismas condiciones, p. ej., periodo de cultivo, pH, temperatura, medio nutriente, descritos antes, con la adición de agar agar.

En relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, si la fase de crecimiento y producción se llevan a cabo en dos recipientes separados, entonces las células de la fase de crecimiento se pueden recoger o concentrar y transferir a un segundo recipiente, el llamado recipiente de producción. Este recipiente puede contener un medio acuoso complementado con cualquier sustrato de producción aplicable que se pueda ser convertido en ácido L-ascórbico por las células. Las células del recipiente de crecimiento se pueden recoger o concentrar por cualquier operación adecuada, tal como por ejemplo centrifugación, ultrafiltración o microfiltración de flujo cruzado con membrana, filtración, decantación, floculación. Las células así obtenidas también se pueden transferir al recipiente de producción en forma del caldo original desde el recipiente de crecimiento, sin ser recogidas, concentradas o lavadas, es decir, en forma de una suspensión celular. En una realización preferida, las células se transfieren del recipiente de crecimiento al recipiente de producción en forma de una suspensión celular sin ninguna etapa de lavado o aislamiento entremedias.

Por lo tanto, en una realización preferida del procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, la etapa (a) y (c) del procedimiento de la presente invención como se ha descrito antes, no están separadas por ninguna etapa de lavado y/o separación.

En relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, si la fase de crecimiento y producción se llevan a cabo en el mismo recipiente, las células se pueden desarrollar en condiciones adecuadas hasta la densidad celular deseada, seguido de una sustitución del medio de crecimiento por el medio de producción que contiene el sustrato de producción. Dicha sustitución puede ser, por ejemplo, la alimentación de medio de producción al recipiente al mismo tiempo y velocidad que la retirada o recogida de líquido sobrenadante del recipiente. Para mantener las células en reposo en el recipiente, se pueden usar operaciones para el reciclado o retención de células, tales como por ejemplo etapas de reciclado de células. Dichas etapas de reciclado, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a métodos que usan centrífugas, filtros, etapas de microfiltración o ultrafiltración de flujo cruzado con membrana, reactores de membrana, floculación o inmovilización celular en matrices porosas, no porosas o poliméricas adecuadas. Después de una fase de transición, el recipiente se lleva a condiciones del procedimiento en las que las células están en un modo de reposo como se ha definido antes, y el sustrato de producción es convertido eficazmente en vitamina C.

El medio acuoso en el recipiente de producción usado para la etapa de producción en relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, en lo sucesivo llamado medio de producción, puede contener solo el o los sustratos de producción para ser convertidos en ácido L-ascórbico, o puede contener por ejemplo, sales inorgánicas adicionales, p. ej., cloruro sódico, cloruro de calcio, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso, fosfato potásico, fosfato de calcio y carbonato de calcio. El medio de producción también puede contener fuentes de nitrógeno digeribles tales como por ejemplo sustancias orgánicas, p. ej., peptona, extracto de levadura, urea, aminoácidos, licor de maceración del maíz, y sustancias inorgánicas, p. ej., amoniaco, sulfato amónico y nitrato sódico, en concentraciones tales que las células se mantienen en un modo de células en reposo como se ha definido antes. El medio puede ser con o sin urea y/o licor de maceración del maíz y/o levadura de panadería. La etapa de producción se puede llevar a cabo, por ejemplo, en modo discontinuo, discontinuo alimentado, semicontinuo o continuo. En caso de modo discontinuo alimentado, semicontinuo o continuo, tanto las células del recipiente de crecimiento como del medio de producción se pueden alimentar de forma continua o intermitente al recipiente de producción a velocidades de alimentación adecuadas. Alternativamente, solo se puede

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En relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, en una realización de la presente invención, la vitamina C se produce por el procedimiento como se ha descrito antes que usa células en reposo de microorganismos recombinantes, tales como por ejemplo bacterias recombinantes que se seleccionan de bacterias que pueden expresar la L-sorbosona deshidrogenasa como una forma activa in vivo, es decir, bacterias del género Gluconobacter, Acetobacter, Pseudomonas y Escherichia, más preferidas de Gluconobacter, Acetobacter o

E. coli. Incluso son más preferidas por ejemplo G. oxydans y E. coli y las más preferidas se seleccionan del grupo que consiste en G. oxydans N44-1, G. oxydans IFO 3293 y G. oxydans IFO 3244. Un microorganismo recombinante puede ser cualquier microorganismo que se modifique genéticamente por técnicas conocidas para contener uno o más genes deseados en su cromosoma o un plásmido introducido en dicho microorganismo, que lleve, p. ej., a un exceso de expresión de dicho o dichos genes. El gen o genes deseados que se introducen en dicho microorganismo pueden codificar, por ejemplo, una enzima implicada en la conversión de un sustrato en vitamina C. En una realización preferida, el gen deseado codifica una L-sorbosona deshidrogenasa, que cataliza la conversión de Lsorbosona en vitamina C. Una L-sorbosona deshidrogenasa preferida usada en la presente invención es, por ejemplo, la L-sorbosona deshidrogenasa (SNDHai) de G. oxydans N44-1 (Sugisawa et al., Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990) representada por la SEQ ID NO: 2, la secuencia de nucleótidos que codifica dicha SNDHai está representada por la SEQ ID NO: 1. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que tienen una homología de al menos 80%, preferiblemente de al menos 90%, comparadas con la SEQ ID NO: 1 y que codifican enzimas que pueden catalizar la conversión de la L-sorbosona en vitamina C también son parte de la presente invención.

El microorganismo recombinante, tal como por ejemplo G. oxydans N44-1, puede comprender varias copias de SNDHai clonadas en un plásmido adecuado o integradas en su cromosoma. Las copias de plásmido que pueden ser adecuadas para la presente invención están, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 por microorganismo transformado. El número de copias de plásmido se puede determinar, por ejemplo, por comparación de la intensidad de una respectiva banda visible en SDS-PAGE.

En relación con el procedimiento anterior que usa células en reposo de un microorganismo, cuando se usan microorganismos recombinantes para el procedimiento de la presente invención, la etapa de crecimiento y producción pueden ser esencialmente las mismas descritas antes. Si se usa un microorganismo recombinante que comprende SNDHai, tal como por ejemplo G. oxydans N44-1 recombinante con mayor dosis de SNDHai, el medio de crecimiento puede contener por ejemplo D-sorbitol, L-sorbosa, glicerol o D-glucosa solos o mezclas de los mismos, una o más fuentes de nitrógeno adecuadas y sales. El medio de producción puede contener, por ejemplo, D-sorbitol y/o L-sorbosa y sales. La recogida de la vitamina C se puede llevar a cabo esencialmente como se describe en la presente memoria.

En un aspecto adicional, el procedimiento de la presente invención se puede combinar con otras etapas de separación y/o purificación de la vitamina C producida, de otros componentes contenidos en la corriente de recolección, es decir, las llamadas etapas de procesamiento corriente abajo. Estas etapas pueden incluir cualquier medio conocido para el experto en la técnica, tal como, por ejemplo, concentración, cristalización, precipitación, adsorción, intercambio iónico, electrodiálisis, electrodiálisis con membranas bipolares y/o ósmosis inversa. La vitamina C se puede purificar además en la forma del ácido libre o cualquiera de sus formas de sal conocidas, mediante operaciones tales como por ejemplo el tratamiento con carbón activado, intercambio iónico, adsorción y elución, concentración, cristalización, filtración y secado. Específicamente, se puede llevar a cabo una primera separación de la vitamina C de otros componentes en la corriente de recolección por cualquier combinación o repetición adecuada de, por ejemplo, los siguientes métodos: electrodiálisis de dos o tres compartimentos, electrodiálisis con membranas bipolares, ósmosis inversa o adsorción sobre, por ejemplo, resinas de intercambio iónico o resinas no iónicas. Si la forma resultante de la vitamina C es una sal del ácido L-ascórbico, la conversión de la forma de sal en la forma de ácido libre se puede llevar a cabo, por ejemplo, por electrodiálisis con membranas bipolares, intercambio iónico, técnicas cromatográficas en lecho móvil simulado, y similares. También se puede usar combinación de las etapas mencionadas, p. ej., electrodiálisis y electrodiálisis con membranas bipolares en una etapa, así como la combinación de las etapas mencionadas, p. ej., varias etapas de intercambio iónico usando métodos cromatográficos en lecho móvil simulado. Cualquiera de estos procedimientos solos o en combinación constituyen un medio conveniente para aislar y purificar el producto, es decir, la vitamina C. El producto así obtenido se puede aislar además de una forma tal como, p. ej., por concentración, cristalización, precipitación, lavado y secado de los cristales y/o purificar además, por ejemplo, por tratamiento con carbón activado, intercambio iónico y/o recristalización.

En una realización preferida, la vitamina C se purifica de la corriente de recolección por una serie de etapas de procesamiento corriente abajo, como se ha descrito antes, sin tener que ser transferida a una solución no acuosa en cualquier momento de este procesamiento, es decir, todas las etapas se llevan a cabo en un entorno acuoso. Dicho procedimiento de procesamiento corriente abajo preferido puede incluir, por ejemplo, la concentración de la corriente de recolección que viene del recipiente de producción mediante electrodiálisis de dos o tres compartimentos, conversión de vitamina C en su forma de sal presente en la solución concentrada en su forma ácida mediante electrodiálisis con membranas bipolares y/o intercambio iónico, purificación por métodos tales como por ejemplo el tratamiento con carbón activado, resinas de intercambio iónico o no iónicas, seguido de una etapa de concentración adicional y cristalización. Estos cristales se pueden separar, lavar y secar. Si es necesario, los cristales se pueden

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Tabla 3. Detección de señales de hibridación en diferentes cepas obtenidas por hibridación por transferencia Southern con sondas para los dominios N y C de SNDHai (sondas P1 y P2)

Cepa: P1 P2

G. oxydans IFO 3293: + +

G. oxydans IFO 3292: + +

G. oxydans IFO 3244: + +

G. frateurii IFO 3260: nd tr

G. frateurii IFO 3265: nd tr

G. cerinus IFO 3266: nd tr

G. oxydans IFO 3269: nd tr

G. oxydans IFO 3287: + +

A. aceti subsp. orleanus IFO 3259: nd nd

A. aceti subsp. xylinum IFO 13693: nd nd

A. aceti subsp. xylinum IFO 13773: nd tr

Acetobacter sp. ATCC 15164: + +

E. coli K-12: nd nd

Tr, trazas; nd, no detectado. Las sondas P1 y P2 se sintetizaron (como productos de la PCR marcados con DIG) con los conjuntos de cebadores especificados en la tabla 2.

Ejemplo 7: Amplificación por PCR y secuenciación de ortólogos del gen de SNDHai de Gluconobacter oxydans N441

Se usaron preparaciones de ADN cromosómico (preparadas como se describe en el ejemplo 6) como moldes para la PCR con los cuatro conjuntos de cebadores mostrados en la tabla 2. Se usaron de cinco a 100 ng de ADN cromosómico por reacción (volumen total, 50 µl). Salvo que se especifique de otra forma se usó el sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics). Las condiciones de la PCR eran las siguientes:

Incubación a 94°C durante 2 min; 30 ciclos de (i) etapa de desnaturalización a 94°C durante 15 s, (ii) etapa de reasociación a 60°C durante 30 s, (iii) etapa de síntesis a 72°C durante 45 a 120 s (el tiempo para la etapa de síntesis para los conjuntos de cebadores P1, P2, P3 y P4 era 45 s, 120 s, 90 s y 90 s, respectivamente); extensión a 72°C durante 7 min.

Se separaron muestras de las reacciones de PCR por electroforesis en gel de agarosa y las bandas se visualizaron con un transiluminador después de tinción con bromuro de etidio. Los resultados de las reacciones de la PCR se resumen en la tabla 4.

Tabla 4. Detección de los productos de la PCR P1, P2, P3 y P4 en diferentes cepas obtenidas con los conjuntos de cebadores de la tabla 2 (productos visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa)

Cepa: P1 P2 P3 P4

G. oxydans IFO 3293: + +* ne +

G. oxydans IFO 3292: + nd nd +

G. oxydans IFO 3244: + + + +

G. frateurii IFO 3260: nd nd nd nd

G. cerinus IFO 3266: nd nd nd nd

G. oxydans IFO 3287: + + nd +

A. aceti subsp. orleanus IFO 3259: nd nd nd nd

A. aceti subsp. xylinum IFO 13693: nd nd nd nd

A. aceti subsp. xylinum IFO 13773: nd nd nd nd

Acetobacter sp. ATCC 15164: + + nd nd

E. coli K-12: nd nd ne nd

+, detectado; nd, no detectado; ne, no ensayado. *Esta PCR se hizo con el sistema de PCR rico en GC (Roche Diagnostics) con el mismo ciclo de reacciones usado para el sistema de PCR Expand High Fidelity.

Cuando se observaron bandas de PCR claras en el gel de agarosa (tabla 4), los productos de la PCR se usaron directamente para la secuenciación de nucleótidos usando métodos convencionales. Las secuencias de nucleótidos obtenidas para los diferentes productos de la PCR, y las correspondientes secuencias de aminoácidos de los péptidos codificados, se compararon con la secuencia de longitud completa del gen de SNDHai y la proteína de G. oxydans N44-1.

Ortólogo de SNDHai de Gluconobacter oxydans IFO 3292

El producto de la PCR (aproximadamente 1 kb) obtenido tras amplificación con los cebadores SNDH1391F (SEQ ID NO: 10) y SNDH2364R (SEQ ID NO:8) y ADN cromosómico de G. oxydans IFO 3292 como molde, se usó para la secuenciación con el cebador SNDH1391F (SEQ ID NO: 10). La secuencia de nucleótidos determinada de 771 pb

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electroporación usando métodos convencionales (Electrocell manipulator ECM600, BTX Inc., San Diego, CA, EE.UU.).

Células de las cepas de G. oxydans N44-1 y N44-1 que llevaban el plásmido pVK-P-SNDHai-T se cultivaron en 50 ml de medio Nº 5 que contenía D-sorbitol 100 g/l, glicerol 0,5 g/l, extracto de levadura 15 g/l (Difco), MgSO4·7H2O 2,5 g/l, y CaCO3 15 g/l en un matraz de agitación con deflectores de 500 ml a 30°C con agitación a 200 rpm. Después de 48 h de cultivo, las cantidades medidas de ácido L-ascórbico en el líquido sobrenadante por HPLC en los dos matraces eran 110 mg/l y 200 mg/l, respectivamente.

Ejemplo 9: Producción de ácido L-ascórbico a partir de L-sorbosona usando células en reposo cultivadas en medio agar-caldo de manitol

Se usaron las cepas IFO 3293, 3292, 3244, 3260, 3266, 3287, 3259, 13693, y 13773 así como Acetobacter sp. ATCC 15164 y Gluconobacter oxydans N44-1, un derivado de la cepa IFO 3293, para la producción de ácido Lascórbico a partir de L-sorbosona.

Las cepas IFO 13693 y IFO 13773 se cultivaron a 27°C durante 3 días en medio Nº 350 que contenía Bactopeptona 5 g/l (Difco), extracto de levadura 5 g/l (Difco), glucosa 5 g/l, manitol 5 g/l, MgSO4·7H2O 1 g/l, etanol 5 ml/l, y agar 15 g/l. Todas las demás cepas de Acetobacter y todas las cepas de Gluconobacter se cultivaron a 27°C durante 3 días en medio agar-caldo de manitol (MB) que contenía manitol 25 g/l, extracto de levadura 5 g/l (Difco Laboratories, Detroit, Mich., EE.UU.), Bactopeptona 3 g/l (Difco), y agar 18 g/l (Difco).

Las células se rasparon de las placas de agar, se suspendieron en agua destilada y se usaron para las reacciones de las células en reposo llevadas a cabo a 30°C durante 20 h en tubos de 5 ml con agitación a 230 rpm. Las mezclas de reacción (0,5 ml) contenían 1% de L-sorbosona, 0,3% de NaCl, 1% de CaCO3 y células en una concentración final de 10 unidades de absorbancia a 600 nanómetros (OD600). Al final del periodo de incubación, las mezclas de reacción se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) usando un sistema de HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies, Wilmington, EE.UU.) con una columna LiChrospher-100-RP18 (125 x 4,6 mm) (Merck, Darmstadt, Alemania) unida a una columna Aminex-HPX-78H (300 x 7,8 mm) (Biorad, Reinach, Suiza). La fase móvil era ácido sulfúrico 0,004 M y el caudal era 0,6 ml/min. Se registraron dos señales usando un detector de UV (longitud de onda de 254 nm) en combinación con un detector del índice de refracción. Además, la identificación del ácido L-ascórbico se hizo usando una amino-columna (YMC-Pack Polyamine-II, YMC, Inc., Kyoto, Japón) con detección UV a 254 nm. La fase móvil era NH4H2PO4 50 mM y acetonitrilo (40:60).

Se usó un sistema de HPLC-espectrometría de masas (MS) Agilent Series 1100 para identificar el ácido L-ascórbico. La MS se hizo en el modo de ion positivo usando la interfaz de electropulverización. La separación se llevó a cabo usando una columna LUNA-C8(2) (100 x 4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, EE.UU.). La fase móvil era una mezcla de ácido fórmico al 0,1% y metanol (96:4). El ácido L-ascórbico eluía con un tiempo de retención de 3,1 minutos. La identidad del ácido L-ascórbico se confirmó por el tiempo de retención y la masa molecular del compuesto.

Para excluir la presencia de ácido D-isoascórbico, la identificación del ácido L-ascórbico se hizo además por el tiempo de retención usando una amino-columna (YMC-Pack Polyamine-II, YMC, Inc., Kyoto, Japón) con detección UV a 254 nm. La fase móvil era NH4H2PO4 50 mM y acetonitrilo (40:60).

Las cepas Gluconobacter y Acetobacter producían ácido L-ascórbico a partir de L-sorbosona como se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Producción de ácido L-ascórbico a partir de L-sorbosona

Cepa: ácido L-ascórbico (mg/l)

G. oxydans IFO 3293: 1740

G. oxydans N44-1: 570

G. oxydans IFO 3292: 410

G. oxydans IFO 3244: 1280

G. frateurii IFO 3260: 50

G. cerinus IFO 3266: 140

G. oxydans IFO 3287: 60

A. aceti subsp. Orleanus IFO 3259: 30

A. aceti subsp. Xylinum IFO 13693: 40

A. aceti subsp. Xylinum IFO 13693: 120

Acetobacter sp. ATCC 15164: 310

Blanco: No detectado

Blanco; la reacción se hizo en la mezcla de reacción sin células.

Ejemplo 10: Producción de ácido L-ascórbico a partir de D-sorbitol, L-sorbosa o L-sorbosona usando células en reposo cultivadas en medio agar 3BD

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concentrado de la unidad de electrodiálisis a una velocidad de 200 l/h, y se bombea fuera del recipiente una corriente de recolección constante. Las soluciones de alimentación se bombean a la pila de electrodiálisis usando bombas peristálticas (7518-00, Masterflex, EE.UU.), y la recirculación de soluciones a través de cada compartimento de electrodiálisis se hace con ayuda de bombas rotatorias (MD-20, IWAK, Tokyo, Japón). Durante todo el procedimiento, se aplican 14 V a la pila de electrodiálisis (fuente de alimentación FuMATech TS001/5, St. Ingbert, Alemania). La concentración del ácido L-ascórbico en la corriente de recogida es 16 g/l.

Ejemplo 15: Purificación del ácido L-ascórbico producido por una reacción de células en reposo por etapas de procesamiento corriente abajo

La corriente de recolección del ejemplo 14 que contiene 16 g/l de ácido L-ascórbico se alimenta a una resina de quelación (Amberlite IRC 748, Rohm and Haas, Philadelphia, PA, EE.UU.) para eliminar los cationes divalentes de la corriente. Después se recoge en un recipiente enfriado (recipiente de alimentación), y cuando se han recogido 10 litros, se procesan en un modo discontinuo a través de una unidad de electrodiálisis de membrana bipolar (pila que contiene 7 membranas Neosepta BP1 / CMB, área total de membranas 0,14 m2, de Eurodia Industries, Wissous, Francia). Esta solución se bombea a 200 l/h a través del compartimento de alimentación de la unidad de electrodiálisis, y se recicla al recipiente de alimentación. Otro recipiente enfriado (recipiente de concentrado) que contiene inicialmente 5 litros de solución de NaOH 2 g/l se bombea a 100 l/h a través del compartimento de concentrado de la unidad de electrodiálisis de membrana bipolar. Aplicando un voltaje máximo de 25 V y corriente eléctrica máxima de 20 A, los cationes de sodio del compartimento de alimentación se transfieren al compartimento de concentrado, y así la forma sódica del ácido L-ascórbico presente en la corriente de alimentación se convierte en la correspondiente forma ácida. Después de alcanzar rendimientos de 90%, se detiene el procedimiento. En el recipiente de concentrado, 6 litros de solución que contiene NaOH 7,5 g/l se recogen en el recipiente de diluido, 9 litros de solución que contiene aproximadamente 16 g/l de ácido L-ascórbico en su forma de ácido libre y 1,6 g/l de ácido L-ascórbico en su forma de sal de sodio son procesados además a través de la resina de intercambio catiónico (Amberlite FPC 21 H, Rohm and Haas, Philadelphia, PA, EE.UU.), con el fin de aumentar el rendimiento de conversión de la sal de sodio en la forma de ácido libre a aproximadamente 99%. Alternativamente, la solución de 10 litros que contiene 16 g/l de ácido L-ascórbico en su forma de sal de sodio que viene de la etapa de electrodiálisis se trata directamente mediante la resina de intercambio catiónico, convirtiéndose en la forma de ácido libre con 99% de rendimiento. La corriente de ácido L-ascórbico en forma del ácido libre, obtenida por cualquiera de los métodos descritos antes, después se procesa además por una secuencia de las siguientes etapas: intercambio aniónico, tratamiento con carbón activado, concentración, cristalización, filtración de los cristales y secado. La pureza final de los cristales obtenidos es 98%, y el rendimiento obtenido con la etapa de procesamiento corriente abajo combinada es 80%.

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Claims

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