CN113881730B

CN113881730B - L-半乳糖的合成方法

Info

Publication number: CN113881730B
Application number: CN202111090681.1A
Authority: CN
Inventors: 黄华; 潘思婷; 刘励文
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2021-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2041-09-17
Also published as: CN113881730A

Abstract

本发明公开了L‑半乳糖的合成方法，包括以下步骤：取半乳糖醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，加入甘露醇脱氢酶和NADH氧化酶反应，生成L‑半乳糖；或者取D‑半乳糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，加入甘露醇脱氢酶和D‑半乳糖还原酶反应，生成L‑半乳糖。本发明采用市面上廉价、大宗的D‑半乳糖或半乳糖醇作为原料，利用酶催化剂一步或者两步直接转化得到昂贵的L‑半乳糖。该制备方案具有多方面的工业应用优势，使用原料便宜、制备路线短、反应条件简单且废物排放低；以上这些特点都很好的符合了当今绿色工业生产的基本要求。

Description

L-半乳糖的合成方法

技术领域

本发明属于生物酶法合成领域，具体涉及L-半乳糖的合成方法。

背景技术

L-半乳糖(L-galactose)是自然界存在的一种稀有糖，它是常见D-半乳糖的L-构型。L-半乳糖存在于牛奶和甜菜中，也可由人体合成。L-半乳糖是潜在用于肾病综合征中局灶性和节段性肾小球硬化的口服治疗，它是多种生物活性皂苷(Saponin)的结构成分，这些皂苷被广泛应用于食品、化妆品及医药领域。与此同时，L-半乳糖也是多种L-核苷抗病毒类药物合成以及维他命C生物合成的基本原料。然而，其高昂的价格极大地限制了推广应用(国际知名的糖销售公司Carbosynth上的价格为：L-半乳糖￥2,300/克)。

目前L-半乳糖有多种制备方法，但都存在某些缺陷而导致其无法廉价、大规模生产应用。

在化学制备路线中，这个糖的合成需要经历多步的羟基保护、脱保护，这不仅导致其制备路线过长而且整体收率太低，同时由于制备过程中的手性消旋问题将极大地困扰后期产品的纯化。

发酵生产L-半乳糖则由于产物浓度及纯度都比较低，导致最终产品纯化成本太高而无法有效规模化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供L-半乳糖的合成方法，采用酶催化策略有效实现从廉价的D-半乳糖/半乳糖醇到L-半乳糖的直接转化，该制备路线短(一步或两步转化)，反应条件简单，转化率高，所以无论是在生产成本以及环境保护方面都具有显著的优势。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

L-半乳糖的合成方法，包括以下步骤：

取半乳糖醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺)混合，调节体系pH值为7.5-8.0，加入甘露醇脱氢酶(agMDH)和NADH氧化酶(NoxE)，20-37℃反应6-12小时，生成L-半乳糖；

所述的甘露醇脱氢酶和NADH氧化酶，其酶活比为1:(2-3)；

所述的NADH氧化酶可以是来源于闪烁梭菌(Clostridium scindens)的NADH氧化酶(简称ScNoxE，氧化产物是H₂O，Uniprot ID:B0NJW3,EC 1.6.3.1)(也即SEQ.ID.NO.2)，或者是来源于噬热栖热菌(Thermus thermophilus)的NADH氧化酶(简称TtNoxE，氧化产物是H₂O₂，Uniprot ID:Q60049,EC 1.6.99.3)(也即SEQ.ID.NO.3)；

若采用TtNoxE，则需配合过氧化氢酶(Catalase)使用；一般地，过氧化氢酶与TtNoxE的酶活比为(0.25-1.2):1，优选1:3。

优选地，所述的反应可以加压进行，特别优选在1.5个大气压下反应；

所述的甘露醇脱氢酶(agMDH)，野生型(Uniprot ID:Q38707,EC 1.1.1.255)来源于芹菜(Apium graveolens)，经过本发明基因改造提高了其在大肠杆菌内的酶表达及其稳定性，突变位点是：F14I，S47C，N93Y，T301S，S343G，其改造后的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

L-半乳糖的合成方法，包括以下步骤：

取D-半乳糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)混合，调节体系pH值为7.0-8.5(反应过程中保持该pH值范围)，加入甘露醇脱氢酶(agMDH)和D-半乳糖还原酶(aldR)，20-37℃反应5-12小时，生成L-半乳糖；

所述的甘露醇脱氢酶和D-半乳糖还原酶，其酶活比为(2-3):1，优选2.5:1；

本发明所使用的D-半乳糖还原酶(aldR)，其野生型(Uniprot ID:A0A2S9ZVX5,EC1.1.1.21)来源于Rhodotorula toruloides，野生型辅酶是NADPH，通过本发明定点改造后，该酶能有效利用NADH，突变位点是：K247W，S248L，R253M，其改造后的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

上述两种方法中，所述反应完成后，除去或回收酶，反应体系调节pH值至中性后过阴离子交换树脂除杂，再过渗透膜除盐后浓缩、结晶，得到L-半乳糖。

所述的酶是液体酶或固定化酶；

若采用液体酶，则反应后调节反应体系pH值至强酸性，沉淀蛋白，并离心除去；

若采用固定化酶，则反应后过滤回收。

优选地，所述的反应物加入到三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)缓冲液或3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液中反应；但是磷酸盐缓冲体系在此处不能用，高浓度磷酸对反应酶有抑制作用。

所述的固定化酶，由以下步骤制得：

按既定的活力比将所需的酶混合溶解在50mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40mM苯氧乙酸以及LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌5小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用；

agMDH/ScNoxE固定化混合酶具有对应液体酶的70-91％的活性。aldR/agMDH固定化混合酶具有液体酶的78-89％的活力。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明采用市面上廉价、大宗的D-半乳糖或半乳糖醇作为原料，利用酶催化剂一步或者两步直接转化得到昂贵的L-半乳糖。该制备方案具有多方面的工业应用优势，使用原料便宜、制备路线短、反应条件简单且废物排放低；以上这些特点都很好的符合了当今绿色工业生产的基本要求。

2、本发明方法的路线一以半乳糖醇(￥1200/kg,aladdin试剂网)作为原料利用甘露醇脱氢酶(agMDH,EC 1.1.1.255)将半乳糖醇末端羟基氧化成L-半乳糖；该制备过程中需要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的参与，通过在该反应体系中引入NADH氧化酶(NoxE,EC 1.6.99.3)不仅可以有效地循环再生NAD⁺，同时还大大的提高了整个反应的转化率。

3、本发明方法的另一路线以更为廉价的D-半乳糖(￥480/kg,aladdin试剂网)作为原料，通过耦合D-半乳糖还原酶(aldR,EC 1.1.1.21)与路线一的甘露醇脱氢酶就可以实现D-半乳糖到L-半乳糖的连续转化，第一步反应采用D-半乳糖还原酶(aldR,EC 1.1.1.21)可以利用NADH作为辅酶生成NAD⁺，而第二步脱氢酶则又可将NAD⁺还原成NADH,从而有效实现辅酶在两步反应中的循环再生，而无需添加额外的辅酶再生系统；这不仅进一步简化工艺，同时有效提高两步的转化率。

附图说明

图1是L-半乳糖的HPLC图谱。

图2是L-半乳糖的1H-NMR谱图。

图3是所制备酶的SDS-PAGE凝胶检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：以半乳糖醇作为原料，液体酶(agMDH,ScNoxE)制备L-半乳糖

在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入27.3克半乳糖醇(150mM)，1.42克氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺,2mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入粗酶液(1500U agMDH、3000U ScNoxE)，随后将反应液转入耐压反应器中维持1.5个大气压的氧气压力下30℃缓慢搅拌反应6小时。反应结束后加HCl水溶液调节pH到1.0变性、沉淀蛋白并高速离心除去，然后再将溶液pH调节到pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂(天津允开树脂科技有限公司)除杂，最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得22克L-半乳糖(无色颗粒状固体,收率82％)。

对所得产物做HPLC分析。Phenomenex(菲罗门)Rezex RHM系列单糖分析色谱柱(7.8mm x 300mm,8μm)，用纯水做流动相，流速0.2ml/min，在35℃用折射率检测器(Agilent,1100Series,G1362A)检测。HPLC图谱如图1所示。

所得产物的1H-NMR谱图如图2所示，Varian 600兆核磁，D2O为溶剂。

综合图1、图2，可以确认所得产物为L-半乳糖。

实施例2：以半乳糖醇作为原料，固定化酶(agMDH,ScNoxE)制备L-半乳糖

与实施例1类似，但混合固定的agMDH、ScNoxE酶而非液体酶被用来催化，反应结束后固定化酶可以回收使用。

在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18.2克半乳糖醇(100mM)，1.42克氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺，2mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入固定化混合酶(5000U，agMDH、ScNoxE活性单位比1:5)，随后将反应液转入耐压反应器中维持2个大气压的氧气压力下30℃缓慢震荡反应12小时。待反应完成后过滤回收固定化酶(固定化酶用50mM pH 8.0Tris缓冲液洗涤三次后4℃保存备用)，滤液pH值调节到7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得14.9克L-半乳糖(收率83％)，过滤回收的固定化混合酶具有74％的初始酶活力。

所得产物的HPLC图谱同图1，1H-NMR谱图同图2，可以确认所得产物为L-半乳糖。

实施例3：以半乳糖醇作为原料，液体酶(agMDH,TtNoxE,Catalase)制备L-半乳糖

在1L 100mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18.2克半乳糖醇(100mM)，1.42克氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺,2mM)，然后调节溶液pH值到7.5后，加入粗酶液(1000U agMDH、3000U TtNoxE、1000U catalase)，随后将反应液转入耐压反应器中维持2个大气压的氧气压力下30℃缓慢搅拌反应8小时。反应结束后加HCl水溶液调节pH到1.0变性、沉淀蛋白并高速离心除去，然后再将溶液pH调节到pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂(天津允开树脂科技有限公司)除杂，最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得12.8克L-半乳糖(无色颗粒状固体,收率71％)。

实施例4：以D-半乳糖作为原料，液体酶(aldR,agMDH)制备L-半乳糖

在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18克D-半乳糖(100mM),0.71克还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH,1mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入粗酶液(800U aldR、2000U agMDH)启动反应，维持反应液在25℃缓慢搅拌5个小时，在反应过程中通过添加酸碱来维持反应体系pH 7.0～8.5。反应结束后加入HCl水溶液调节pH到1.0终止反应、沉淀蛋白，然后调节反应液至pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得15.1克L-半乳糖(无色颗粒状固体，收率84％)。

实施例5：以D-半乳糖作为原料，固定化酶(aldR,agMDH)制备L-半乳糖

与实施例4类似，但混合固定的aldR、agMDH酶而非液体酶被用来催化，反应结束后固定化酶可以回收使用。

同样在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18克D-半乳糖(100mM),0.71克还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH,1mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入3000U固定化酶(aldR与agMDH活性比为1:3)启动反应，维持反应液在25℃缓慢搅拌12个小时，反应过程中维持体系pH 7.0～9.0。待反应完成后过滤回收固定化酶(固定化酶用50mM pH 8.0Tris缓冲液洗涤三次后4℃保存备用)，滤液pH值调节到7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得14.2克L-半乳糖(收率79％)，过滤回收的固定化混合酶具有83％的初始酶活力。

实施例6：酶的发酵生产

本发明所用酶均为实验室发酵生产(除了过氧化氢酶Catalase购于诺维信)，以下是制备酶的基本操作流程。

首先通过基因公司(安徽通用生物)合成该酶所对应的基因序列(SEQ.ID.NO.5～SEQ.ID.NO.8)，然后通过NdeI/XhoI酶切位点亚克隆到pET28a质粒上，并将该质粒转入E.coli(BL21)(擎科生物)细胞进行平板培养，最后挑单克隆进行液体逐级放大培养。

以下是细胞逐级放大培养的基本流程，首先将平板上的单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，最后再转入5L培养发酵罐里进行培养；当细胞OD600约为20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)26℃诱导蛋白表达6小时，然后离心(4000rpm,15min)收集湿细胞30-55g。

为验证酶的表达，首先取少量细胞与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM,pH 8.0)混合均匀，随后利用冻融法破碎细胞，高速离心后取上清液跑SDS-PAGE蛋白凝胶(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)确定蛋白可溶表达(图3)；确认正确的剩余细胞先与缓冲液混匀(10克湿细胞与约200ml上市缓冲液混合)，然后进行高压破碎细胞、高速离心(16000rpm,45min)除细胞壁，最后所获得含酶清液(即为粗酶液)直接进行后续使用(该液体粗酶活力在180～400U/ml,U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)或进一步纯化后固定化使用(固体酶反应时)。

LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

实施例7：酶的混合固定

向实施例6收集的甘露醇脱氢酶(agMDH)、NADH氧化酶(ScNoxE)、半乳糖还原酶(aldR)粗酶液中逐量加入硫酸铵固体直至酶析出(30％-60％,w/v硫酸铵/缓冲液)。该酶固体随后通过离心收集(10000rpm,12min)，并缓慢溶入25mM pH 8.0的Tris缓冲液中,最后经G25尺寸排阻色谱柱脱盐(购于Sigma)以及利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化液体酶agMDH、ScNoxE、aldR，该酶液可以直接被用来进行后续的酶固定。

在agMDH/ScNoxE酶的混合固定中，初纯化酶aldR、ScNoxE利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)进行混合固定。

固定的基本方法是:按活力单位比例将酶溶解在2L 50mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40mM苯氧乙酸以及600克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌5小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用；agMDH/ScNoxE固定化混合酶具有对应液体酶的70-91％的活性。

同样的方法可以对aldR/agMDH酶进行混合固定，固定化酶具有液体酶的78-89％的活力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> L-半乳糖的合成方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> agMDH

<400> 1

Met Ala Lys Ser Ser Glu Ile Glu His Pro Val Lys Ala Ile Gly Trp

1 5 10 15

Ala Ala Arg Asp Thr Thr Gly Leu Leu Ser Pro Phe Lys Phe Ser Arg

20 25 30

Arg Ala Thr Gly Glu Lys Asp Val Arg Leu Lys Val Leu Phe Cys Gly

35 40 45

Val Cys His Ser Asp His His Met Ile His Asn Asn Trp Gly Phe Thr

50 55 60

Thr Tyr Pro Ile Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Val Val Thr Glu

65 70 75 80

Val Gly Ser Lys Val Glu Lys Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Gly Ile

85 90 95

Gly Cys Leu Val Gly Ser Cys Arg Ser Cys Glu Ser Cys Cys Asp Asn

100 105 110

Arg Glu Ser His Cys Glu Asn Thr Ile Asp Thr Tyr Gly Ser Ile Tyr

115 120 125

Phe Asp Gly Thr Met Thr His Gly Gly Tyr Ser Asp Thr Met Val Ala

130 135 140

Asp Glu His Phe Ile Leu Arg Trp Pro Lys Asn Leu Pro Leu Asp Ser

145 150 155 160

Gly Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Lys

165 170 175

Tyr Tyr Gly Leu Asp Lys Pro Gly Thr Lys Ile Gly Val Val Gly Leu

180 185 190

Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Met Ala Lys Ala Phe Gly Ala

195 200 205

Gln Val Thr Val Ile Asp Ile Ser Glu Ser Lys Arg Lys Glu Ala Leu

210 215 220

Glu Lys Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Leu Asn Ser Asp Gln Glu Gln

225 230 235 240

Met Lys Gly Ala Arg Ser Ser Leu Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Pro

245 250 255

Val Asn His Pro Leu Ala Pro Leu Phe Asp Leu Leu Lys Pro Asn Gly

260 265 270

Lys Leu Val Met Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Phe Glu Leu Pro Val

275 280 285

Phe Ser Leu Leu Lys Gly Arg Lys Leu Leu Gly Gly Ser Ile Asn Gly

290 295 300

Gly Ile Lys Glu Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Ala Ala Lys His Asn

305 310 315 320

Ile Thr Ala Asp Val Glu Val Ile Pro Met Asp Tyr Val Asn Thr Ala

325 330 335

Met Glu Arg Leu Val Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asp

340 345 350

Ile Ala Asn Thr Met Arg Thr Glu Glu Ser Leu Gly Ala

355 360 365

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> 闪烁梭菌(Clostridium scindens)

<220>

<223> ScNoxE

<400> 2

Met Gly Ala Ala Tyr Cys Val His Gly Gly Arg Tyr Arg Lys Val Ser

1 5 10 15

Asp Arg Ile Ile Val Ile Gly Ala Asn His Ala Gly Thr Ala Ala Leu

20 25 30

Asn Thr Ile Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Lys Asp Val Thr Ala Phe Asp

35 40 45

Ala Asn Ser Asn Ile Ser Phe Leu Gly Cys Gly Met Ala Leu Trp Ile

50 55 60

Gly Arg Gln Ile Ser Gly Pro Glu Gly Leu Phe Tyr Ser Asp Lys Glu

65 70 75 80

Thr Leu Glu Gly Lys Gly Ala Lys Val Phe Leu Glu Thr Lys Val Ser

85 90 95

Arg Ile Asp Phe Glu Lys Lys Thr Val Tyr Ala Met Asp Lys Glu Gly

100 105 110

Glu Glu Ile Glu Ala Asn Tyr Asp Lys Leu Ile Leu Ala Thr Gly Ser

115 120 125

Leu Pro Ile Gln Pro Lys Val Lys Gly Met Glu Leu Lys Asn Val Gln

130 135 140

Phe Val Lys Leu Tyr Gln Asn Ala Ala Asp Val Ile Glu Lys Leu Glu

145 150 155 160

Asp Pro Ser Ile Gln Lys Val Thr Ile Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly

165 170 175

Val Glu Leu Ala Glu Ala Phe Ala Arg Asn Gly Arg Lys Thr Thr Leu

180 185 190

Val Asp Cys Ala Asp Thr Cys Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Glu Phe

195 200 205

Cys Lys Ile Met Glu Glu Asn Leu Arg Glu Asn Gly Val Arg Thr Ala

210 215 220

Phe Gly Glu Met Val Gln Glu Ile Gln Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg

225 230 235 240

Val Val Thr Asp Lys Asp Ser Tyr Asp Thr Asp Met Ala Val Phe Cys

245 250 255

Ile Gly Phe Arg Pro Asn Thr Gln Tyr Ala Asp Gly Ser Leu Glu Leu

260 265 270

Phe Arg Asn Gly Ala Phe Leu Val Asp Leu His Gln Gln Ala Ser Arg

275 280 285

Pro Glu Val Tyr Ala Ile Gly Asp Cys Ala Thr Val Phe Asn Asn Ala

290 295 300

Thr Gln Arg Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Ser

305 310 315 320

Gly Ile Ile Ala Ala His Asn Ala Cys Gly Thr Pro Leu Glu Ser Ala

325 330 335

Gly Val Gln Gly Ser Asn Ala Ile Cys Ile Trp Gly Leu Asn Met Val

340 345 350

Ser Thr Gly Ile Ser Leu Lys Lys Ala Leu Glu Leu Gly Tyr Glu Ala

355 360 365

Ala Ala Ala Asp Tyr Glu Asp Trp Gln Lys Ala Gly Phe Ile Glu Ser

370 375 380

Gly Asn Glu Lys Val Arg Ile Arg Ile Val Tyr Asp Lys Lys Thr Arg

385 390 395 400

Ile Val Leu Gly Ala Gln Met Cys Ser Lys Tyr Asp Ile Ser Met Gly

405 410 415

Ile His Met Phe Ser Leu Ala Ile Gln Glu Gln Val Thr Ile Asp Lys

420 425 430

Leu Lys Leu Leu Asp Leu Phe Phe Leu Pro His Phe Asn Gln Pro Tyr

435 440 445

Asn Tyr Ile Thr Met Ala Ala Leu Lys Ala Glu

450 455

<210> 3

<211> 205

<212> PRT

<213> 噬热栖热菌(Thermus thermophilus)

<220>

<223> TtNoxE

<400> 3

Met Glu Ala Thr Leu Pro Val Leu Asp Ala Lys Thr Ala Ala Leu Lys

1 5 10 15

Arg Arg Ser Ile Arg Arg Tyr Arg Lys Asp Pro Val Pro Glu Gly Leu

20 25 30

Leu Arg Glu Ile Leu Glu Ala Ala Leu Arg Ala Pro Ser Ala Trp Asn

35 40 45

Leu Gln Pro Trp Arg Ile Val Val Val Arg Asp Pro Ala Thr Lys Arg

50 55 60

Ala Leu Arg Glu Ala Ala Phe Gly Gln Ala His Val Glu Glu Ala Pro

65 70 75 80

Val Val Leu Val Leu Tyr Ala Asp Leu Glu Asp Ala Leu Ala His Leu

85 90 95

Asp Glu Val Ile His Pro Gly Val Gln Gly Glu Arg Arg Glu Ala Gln

100 105 110

Lys Gln Ala Ile Gln Arg Ala Phe Ala Ala Met Gly Gln Glu Ala Arg

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Lys Ala Trp Ala Ser Gly Gln Ser Tyr Ile Leu Leu Gly Tyr Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Glu Ala Tyr Gly Leu Gly Ser Val Pro Met Leu Gly Phe

145 150 155 160

Asp Pro Glu Arg Val Arg Ala Ile Leu Gly Leu Pro Ser His Ala Ala

165 170 175

Ile Pro Ala Leu Val Ala Leu Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Gly Tyr Pro

180 185 190

Ser His Arg Leu Pro Leu Glu Arg Val Val Leu Trp Arg

195 200 205

<210> 4

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> aldR

<400> 4

Met Gly Ala Glu His Ala Val Ala Ser Pro Phe Thr Leu Ala Ser Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Arg Asn Gly Ala Gln Met Pro Arg Leu Gly Phe Gly Val

20 25 30

Phe Gln Ser Thr Asn Ala Lys Ala Ser Thr Ala His Ala Leu Thr Met

35 40 45

Gly Tyr Arg His Ile Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr His Asn Glu Glu Glu

50 55 60

Val Cys Ala Ala Val Gln Lys Phe Ser Gly Gly Asn Leu Pro Asn Glu

65 70 75 80

Gly Thr Gly Lys Val Trp Leu Thr Thr Lys Val Met Gly Gln Glu His

85 90 95

Gly Thr Asp Gln Thr Asn Lys Ala Val Asp Glu Ser Val Ala Ile Ala

100 105 110

Lys Lys Tyr Gly Leu Thr Trp Asp Leu Phe Leu Leu His Asp Pro Thr

115 120 125

Ala Gly Lys Gln Lys Arg Leu Glu Ala Trp Lys Val Leu Ile Glu Lys

130 135 140

Arg Asp Gln Gly Leu Ile Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Gly Val

145 150 155 160

Lys His Leu Glu Gln Ile Lys Glu Ala Gly Leu Glu Thr Pro Glu Val

165 170 175

Asn Gln Ile Glu Leu His Pro Phe Leu Gln Gln Arg Asp Ile Val Glu

180 185 190

Tyr Cys Glu Lys Glu Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Cys Pro Ile Leu

195 200 205

Arg Gly Lys Arg Phe Asp Asp Pro Thr Leu Val Glu Leu Ser Lys Lys

210 215 220

His Ser Val Thr Val Pro Gln Ile Leu Ile Arg Trp Ser Leu Gln Lys

225 230 235 240

Gly Phe Val Pro Leu Pro Trp Leu Asp Thr Pro Gly Met Ile Gln Ala

245 250 255

Asn Ala Asp Leu Trp Asp Phe Glu Leu Asp Glu Gly Asp Met Gln Gln

260 265 270

Met Glu Lys Leu Asp Glu Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Pro Val Asn

275 280 285

Val Glu

290

<210> 5

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> agMDH

<400> 5

atggcgaaaa gcagcgaaat tgaacatccg gtgaaagcga ttggctgggc ggcgcgcgat 60

accaccggcc tgctgagccc gtttaaattt agccgccgcg cgaccggcga aaaagatgtg 120

cgcctgaaag tgctgttttg cggcgtgtgc catagcgatc atcatatgat tcataacaac 180

tggggcttta ccacctatcc gattgtgccg ggccatgaaa ttgtgggcgt ggtgaccgaa 240

gtgggcagca aagtggaaaa agtgaaagtg ggcgattatg tgggcattgg ctgcctggtg 300

ggcagctgcc gcagctgcga aagctgctgc gataaccgcg aaagccattg cgaaaacacc 360

attgatacct atggcagcat ttattttgat ggcaccatga cccatggcgg ctatagcgat 420

accatggtgg cggatgaaca ttttattctg cgctggccga aaaacctgcc gctggatagc 480

ggcgcgccgc tgctgtgcgc gggcattacc acctatagcc cgctgaaata ttatggcctg 540

gataaaccgg gcaccaaaat tggcgtggtg ggcctgggcg gcctgggcca tgtggcggtg 600

aaaatggcga aagcgtttgg cgcgcaggtg accgtgattg atattagcga aagcaaacgc 660

aaagaagcgc tggaaaaact gggcgcggat agctttctgc tgaacagcga tcaggaacag 720

atgaaaggcg cgcgcagcag cctggatggc attattgata ccgtgccggt gaaccatccg 780

ctggcgccgc tgtttgatct gctgaaaccg aacggcaaac tggtgatggt gggcgcgccg 840

gaaaaaccgt ttgaactgcc ggtgtttagc ctgctgaaag gccgcaaact gctgggcggc 900

<210> 6

<211> 1380

<212> DNA

<213> 闪烁梭菌(Clostridium scindens)

<220>

<223> ScNoxE

<400> 6

atgggcgcgg cgtattgcgt gcatggcggc cgctatcgca aagtgagcga tcgcattatt 60

gtgattggcg cgaaccatgc gggcaccgcg gcgctgaaca ccattctgga taactatacc 120

gataaagatg tgaccgcgtt tgatgcgaac agcaacatta gctttctggg ctgcggcatg 180

gcgctgtgga ttggccgcca gattagcggc ccggaaggcc tgttttatag cgataaagaa 240

accctggaag gcaaaggcgc gaaagtgttt ctggaaacca aagtgagccg cattgatttt 300

gaaaaaaaaa ccgtgtatgc gatggataaa gaaggcgaag aaattgaagc gaactatgat 360

aaactgattc tggcgaccgg cagcctgccg attcagccga aagtgaaagg catggaactg 420

aaaaacgtgc agtttgtgaa actgtatcag aacgcggcgg atgtgattga aaaactggaa 480

gatccgagca ttcagaaagt gaccattatt ggcgcgggct atattggcgt ggaactggcg 540

gaagcgtttg cgcgcaacgg ccgcaaaacc accctggtgg attgcgcgga tacctgcctg 600

agcgcgtatt atgatccgga attttgcaaa attatggaag aaaacctgcg cgaaaacggc 660

gtgcgcaccg cgtttggcga aatggtgcag gaaattcagg gccaggaact ggtggaacgc 720

gtggtgaccg ataaagatag ctatgatacc gatatggcgg tgttttgcat tggctttcgc 780

ccgaacaccc agtatgcgga tggcagcctg gaactgtttc gcaacggcgc gtttctggtg 840

gatctgcatc agcaggcgag ccgcccggaa gtgtatgcga ttggcgattg cgcgaccgtg 900

tttaacaacg cgacccagcg caaagattat attgcgctgg cgaccaacgc ggtgcgcagc 960

ggcattattg cggcgcataa cgcgtgcggc accccgctgg aaagcgcggg cgtgcagggc 1020

agcaacgcga tttgcatttg gggcctgaac atggtgagca ccggcattag cctgaaaaaa 1080

gcgctggaac tgggctatga agcggcggcg gcggattatg aagattggca gaaagcgggc 1140

tttattgaaa gcggcaacga aaaagtgcgc attcgcattg tgtatgataa aaaaacccgc 1200

attgtgctgg gcgcgcagat gtgcagcaaa tatgatatta gcatgggcat tcatatgttt 1260

agcctggcga ttcaggaaca ggtgaccatt gataaactga aactgctgga tctgtttttt 1320

ctgccgcatt ttaaccagcc gtataactat attaccatgg cggcgctgaa agcggaatag 1380

<210> 7

<211> 618

<212> DNA

<213> 噬热栖热菌(Thermus thermophilus)

<220>

<223> TtNoxE

<400> 7

atggaagcga ccctgccggt gctggatgcg aaaaccgcgg cgctgaaacg ccgcagcatt 60

cgccgctatc gcaaagatcc ggtgccggaa ggcctgctgc gcgaaattct ggaagcggcg 120

ctgcgcgcgc cgagcgcgtg gaacctgcag ccgtggcgca ttgtggtggt gcgcgatccg 180

gcgaccaaac gcgcgctgcg cgaagcggcg tttggccagg cgcatgtgga agaagcgccg 240

gtggtgctgg tgctgtatgc ggatctggaa gatgcgctgg cgcatctgga tgaagtgatt 300

catccgggcg tgcagggcga acgccgcgaa gcgcagaaac aggcgattca gcgcgcgttt 360

gcggcgatgg gccaggaagc gcgcaaagcg tgggcgagcg gccagagcta tattctgctg 420

ggctatctgc tgctgctgct ggaagcgtat ggcctgggca gcgtgccgat gctgggcttt 480

gatccggaac gcgtgcgcgc gattctgggc ctgccgagcc atgcggcgat tccggcgctg 540

gtggcgctgg gctatccggc ggaagaaggc tatccgagcc atcgcctgcc gctggaacgc 600

gtggtgctgt ggcgctaa 618

<210> 8

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> aldR

<400> 8

atgggcgcgg aacatgcggt ggcgagcccg tttaccctgg cgagcagcgt gaaactgcgc 60

aacggcgcgc agatgccgcg cctgggcttt ggcgtgtttc agagcaccaa cgcgaaagcg 120

agcaccgcgc atgcgctgac catgggctat cgccatattg atagcgcgcg ctattatcat 180

aacgaagaag aagtgtgcgc ggcggtgcag aaatttagcg gcggcaacct gccgaacgaa 240

ggcaccggca aagtgtggct gaccaccaaa gtgatgggcc aggaacatgg caccgatcag 300

accaacaaag cggtggatga aagcgtggcg attgcgaaaa aatatggcct gacctgggat 360

ctgtttctgc tgcatgatcc gaccgcgggc aaacagaaac gcctggaagc gtggaaagtg 420

ctgattgaaa aacgcgatca gggcctgatt aaaagcattg gcgtgagcaa ctttggcgtg 480

aaacatctgg aacagattaa agaagcgggc ctggaaaccc cggaagtgaa ccagattgaa 540

ctgcatccgt ttctgcagca gcgcgatatt gtggaatatt gcgaaaaaga aggcattgtg 600

gtggaagcgt attgcccgat tctgcgcggc aaacgctttg atgatccgac cctggtggaa 660

ctgagcaaaa aacatagcgt gaccgtgccg cagattctga ttcgctggag cctgcagaaa 720

ggctttgtgc cgctgccgtg gctggatacc ccgggcatga ttcaggcgaa cgcggatctg 780

tgggattttg aactggatga aggcgatatg cagcagatgg aaaaactgga tgaaggctat 840

gcggtgagct ggaacccggt gaacgtggaa tga 873

Claims

1.L-半乳糖的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

取半乳糖醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，调节体系pH值为7.5-8.0，加入甘露醇脱氢酶（agMDH）和NADH氧化酶（NoxE），25-37^oC反应6-12小时，生成L-半乳糖；

上述反应在三羟甲基氨基甲烷盐酸、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或 3-吗啉丙磺酸缓冲液中进行；

所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；

所述的NADH氧化酶是来源于闪烁梭菌(Clostridium scindens)的NADH氧化酶（ScNoxE）或者是来源于噬热栖热菌(Thermus thermophilus)的NADH氧化酶（TtNoxE）；若采用TtNoxE，则配合过氧化氢酶使用；

所述来源于闪烁梭菌(Clostridium scindens)的NADH氧化酶的氨基酸序列如SEQ.ID. NO. 2所示；

所述来源于噬热栖热菌(Thermus thermophilus)的NADH氧化酶的氨基酸序列如SEQ.ID. NO. 3所示。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述的甘露醇脱氢酶和NADH氧化酶，其酶活比为1:(2-3)。

3.L-半乳糖的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

取D-半乳糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，调节体系pH值为7.0-8.5，加入甘露醇脱氢酶（agMDH）和D-半乳糖还原酶（aldR），20-30℃反应5-12小时，生成L-半乳糖；

所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；

所述D-半乳糖还原酶的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述的甘露醇脱氢酶和D-半乳糖还原酶，其酶活比为(2-3): 1。

5.根据权利要求1或3所述的合成方法，其特征在于：所述反应完成后，除去或回收酶，反应体系调节pH值至中性后过阴离子交换树脂除杂，再过渗透膜除盐后浓缩、结晶，得到L-半乳糖。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于：

所述的酶是液体酶或固定化酶；

若采用固定化酶，则反应后过滤回收。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于：所述的固定化酶，由以下步骤制得：

按活力比将所需的酶混合溶解在50 mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40 mM苯氧乙酸以及LX-1000 EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌5小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及 25 mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用。