CN110804634B - 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生化技术领域，公开了突酶催化法制备2,4‑二氨基丁酸的工艺。本发明以L‑天冬氨酸为起始，通过一系列的酶促反应生成天冬氨酸‑4‑磷酸、天冬氨酸半醛中间体，最后转化成目标产物2,4‑二氨基丁酸；整个反应体系还可增加四种辅酶再生体系，降低ATP、NADPH、NADH以及丙氨酸的用量，有效推动该反应至高转化率。本发明反应体系多种酶催化反应相互不干扰，反应操作简便，其最终产品转化率高，如采用固定化酶方式则可进一步提高其工业应用可行性。

Description

酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺

技术领域

本发明涉及生化技术领域，具体涉及酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺。

背景技术

2,4-二氨基丁酸是一种自然界中存在的一种非天然氨基酸，它是类似赖氨酸、鸟氨酸的二氨基氨基酸；其分子式为C₄H₁₀N₂O₂，分子量为118，CAS No:305-62-4。2,4-二氨基丁酸大量分布在植物，花、酵母及部分细菌中，它虽然不是蛋白质的基本组成，但其广泛参与多种天然多肽抗菌素的生物合成，如圈杆菌素(polypeptin)、柯密菌素(Comirin)、多黏菌素(Polymyxin)等等。2,4-二氨基丁酸同时也具有较高的工业应用价值，譬如它是生产蛇毒肽的基本原料(蛇毒肽是毒蛇蛇腺分泌的一种物质，具有镇痛、止血、抑制血栓形成及抗肿瘤等药理作用；蛇毒肽现被广泛应用在医美行业，是一种祛皱抗皱有效成份)，因而开发一种更为简便的、能批量生产2,4-二氨基丁酸的方法以降低其成本变得比较重要。

2,4-二氨基丁酸常用的制备方法有分离法及化学合成法。虽然自然界2,4-二氨基丁酸分布较广，但由于其丰度低、分子量小、水溶性大等特征导致其分离纯化非常困难；市面上大部分销售的2,4-二氨基丁酸是通过化学合成的方法制备的，比较经典的制备工艺利用L-天冬氨酸在叠氮化钠、浓硫酸及氯仿条件下直接转化成2,4-二氨基丁酸(最高收率能到90％，G.I.Tesser and J.W.Van Nispen,“NOTE ON THE PREPARATION Of L-2,4-DIAMINOBUTYRIC ACID,Synthetic communication,1971,1,285-287)，该工艺延续至今，然而由于该反应涉及多个有毒、易爆化学品，因而其规模化生产的安全风险非常大。在当今提倡安全、绿色生产的大环境下，寻找一种廉价的、环保的2,4-二氨基丁酸生产方法变得比较迫切。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺，使得所述工艺转化收率高、目标产物浓度高、产物杂质残留低，纯化工艺简单。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺，反应原料L-天冬氨酸、ATP或其盐、磷酸吡哆醛、丙氨酸、NADPH或其盐在pH值6.0-9.0的反应介质中，与天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH及转氨酶AMT进行酶催化反应，生成2,4-二氨基丁酸。

本发明针对目前的化学合成法的诸多缺陷，利用酶促反应技术提供了另外一种从L-天冬氨酸开始合成2,4-二氨基丁酸的工艺。L-天冬氨酸激酶(ASK,EC 2.7.2.4)，它能磷酸化L-天冬氨酸成L-天冬氨酸-4-磷酸；而天冬氨酸半醛氧化酶(ASADH,EC 1.2.1.11)则能在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH存在下将L-天冬氨酸-4-磷酸转化成L-天冬氨酸半醛；最后非专一性

-转氨酶(AMT,EC 2.6.1.-)在磷酸吡哆醛(PLP)存在条件下将丙氨酸上的氨基转移到L-天冬氨酸半醛，生成2,4-二氨基丁酸。

其中，所述各酶以表达各酶的宿主细胞、各酶的酶液或各酶的固定化酶形式参与酶催化反应。

在本发明具体实施方式中，所述表达各酶的宿主细胞为含有表达各酶的载体的大肠杆菌；其具体的制备过程如下：

以提取的大肠杆菌(Escherichia coliK12)、斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)染色体、ATCC购买的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2 155,ATCC700084)、伯克霍尔德菌(Burkholderia multivorans,ATCC 17616)等染色体为模板，用各酶引物PCR扩增出ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH基因片段，然后进行相应酶切、酶连接到载体质粒上；

通过基因测序验证正确的质粒进而转入E.coli BL21(DE3)菌株中,于LB培养液中进行培养，然后IPTG条件下诱导表达,收集各酶的湿细胞。

更为具体地，所述载体质粒为市售的pET28a质粒，各酶扩增引物见表1：

表1

通过基因测序验证正确的质粒进而转入E.coli BL21(DE3)菌株中,在37℃、5ml含50uM卡那霉素(Kanamycin)的LB培养液中进行小量培养，当细胞生长至OD 0.5-0.8加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导蛋白表达4小时,最后收集细胞、冻融法进行细胞破碎、高速离心，收集到的上清液再利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达。蛋白表达正确的菌株逐级培养至5升发酵罐，在0.5mM IPTG条件下37℃诱导表达6小时,收集各酶的湿细胞。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾，1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

在本发明具体实施方式中，所述天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH及转氨酶AMT的序列依次如SEQ ID NO.1-3所示。

在本发明具体实施方式中，所述各酶的酶液为从表达各酶的宿主细胞中提取的酶液；方法为将所收集的湿细胞经过高压破碎、高速离心收集含粗蛋白的上清液，即为含酶的酶液，也可以对上清液进一步纯化。

作为优选，本发明还包括2,4-二氨基丁酸的纯化步骤：

过色谱柱除盐，然后阴离子交换树酯除去溶液中磷酸化合物，最后收集的2,4-二氨基丁酸粗品经冻干后重结晶。其中，所述色谱柱为G25色谱柱，去离子水做洗脱液；所述阴离子交换树酯为D201阴离子交换树酯；所述重结晶采用乙醇水溶液，乙醇和水的体积比优选为3:1。

作为优选，所述反应介质为三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)，更优选为100mMpH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)。同时，在酶催化反应过程中维持体系pH值为6-9，优选为6.5-8.5。

本发明反应中由于要用到辅酶三磷酸腺苷(ATP)及NADPH，通过引入ATP再生酶(PPK,EC 2.7.4.1)与多聚磷酸，NADP再生酶(PDH,EC 1.20.11.1)与亚磷酸就可以实现其循环利用，大大降低其使用量。转氨基酶(AMT)反应为平衡反应，通过在体系中引入甲酸铵、丙氨酸脱氢酶(ADH,EC 1.4.1.1)以及甲酸脱氢酶(FDH,EC 1.17.1.9)，在催化剂量的还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下可以循环再生丙氨酸，这不仅可以降低丙氨酸的用量，使其只需要催化剂量即可，还可以有效推动该转氨反应至高转化率。与此同时，通过将本发明所涉及的酶一次性或多次性进行固定化应用则可进一步提高其稳定性及规模化生产的可操作性。

因此，本发明所述工艺还包括向反应原料中添加多聚磷酸、亚磷酸或其盐、甲酸铵、氯化钾、氯化镁(氯化钾和氯化镁参与ATP再生酶PPK的反应)、NADH或其盐，以及添加ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH进行酶催化反应；本发明整体的反应原理示意图见图1。

在本发明中，所述ATP的盐为ATP钠盐，如三磷酸腺苷二钠盐；所述NADPH盐为NADPH钠盐，如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐；所述NADH盐为NADH钠盐，如还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐；所述亚磷酸盐为亚磷酸钠盐，如亚磷酸钠；各物质的盐均可提供ATP、NADPH、NADH以及亚磷酸。

在本发明具体实施方式中，所述ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH的序列依次如SEQ ID NO.4-7所示。

按照本发明工艺制备2,4-二氨基丁酸，纯品最终收率可达70％以上，最高可达到87％，接近化学合成方法的收率，但相比经典的化学合成方法更加安全、环保和低成本。

由以上技术方案可知，本发明以L-天冬氨酸为起始，通过一系列的酶促反应生成天冬氨酸-4-磷酸、天冬氨酸半醛中间体，最后转化成目标产物2,4-二氨基丁酸；整个反应体系还可增加四种辅酶再生体系，降低ATP、NADPH、NADH以及丙氨酸的用量，有效推动该反应至高转化率。本发明反应体系多种酶催化反应相互不干扰，反应操作简便，其最终产品转化率高，如采用固定化酶方式则可进一步提高其工业应用可行性。

附图说明

图1所示为本发明反应原理示意图。

具体实施方式

本发明公开了酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明工艺已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文工艺进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所述工艺的步骤旨在清楚的描述核心的反应路线，并不限制整个反应采用一步法还是多步法进行。

本发明所采用的各酶可以根据序列进行人工合成，也可按照本发明提供的方法通过质粒载体搭载各酶表达基因，借助宿主细胞诱导表达。

在进行固定化时，可参照本领域常规的固定化酶制备方式，在本发明具体实施方式中，本发明利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按照ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH、FDH粗酶以活力比1：2.2:4.5:2.5:4.0:6.0:5.0进行一次性混合固定，其固定方法如下:2000-4000U混合酶溶解在1L25mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入25-65mM苯氧乙酸以及300-500克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液,室温搅拌4-8小时后过滤出固定化酶,最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温保存待用；固定化混合酶分别具有液体酶的30-70％的活性。

依照本发明工艺的反应路线，各反应物质的用量可以根据实际情况调整，为了最大效率化，本发明提供了如下各反应物质的摩尔比：

L-天冬氨酸、多聚磷酸、ATP、丙氨酸、亚磷酸、氯化镁、氯化钾、甲酸铵、NADPH、ASK、ASADH、AMT、NADH、PPK、PDH、ADH、FDH、PLP＝1:(1.1)：(0.02):(0.02):(1.1):2:5:(1.1):(0.02):(0.0002):(0.0003):(0.0005):(0.02):(0.001):(0.0005):(0.001):(0.0015):(0.00005)；

在本发明具体实施方式中，各酶以湿细胞方式参与酶催化反应时，按照12克:24克：48克：24克:48克:60克:48克的比例加入过量表达ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶的湿细胞；

各酶以含酶液方式加参与酶催化反应时，ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶液以1:2:4:2:4:6:4体积比混合后一次性加入；

各酶以固定化酶方式加参与酶催化反应时，参照上述固定化方法中的比例。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：湿细胞一锅法催化生产2,4-二氨基丁酸

在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入6.65克L-天冬氨酸(50mM),1.1克三磷酸腺苷二钠盐ATP(2mM)、5.7克多聚磷酸(Sigma,25聚,55mM单磷酸)、0.9克氯化镁(10mM)、0.75克氯化钾(10mM)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐0.76克(1.0mM)、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐0.71克(1.0mM)、亚磷酸钠6.8克(55mM)、甲酸氨3.8克(60mM)、丙氨酸89毫克(1mM)、磷酸吡哆醛0.7毫克(0.0025mM),待pH值调节到8.0后，以12克:24克：48克：24克:48克:60克:48克的比例加入过量表达ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶的湿细胞。反应过程中通过加入低浓度的HCl及NaOH水溶液维持反应体系pH 6.0-9.0之间，30℃轻微搅拌6小时后直接离心(8000rpm,12min)除去含酶细胞，反应清液通过G25色谱柱除盐(去离子水做洗脱液)，D201阴离子交换树酯(晶祥化工)除去溶液中含磷酸化合物(各种腺苷,NAD及NADP),最后收集的2,4-二氨基丁酸粗品经冻干后用乙醇及水重结晶(3:1v/v)得白色固体4.9克纯2,4-二氨基丁酸钠(最终收率70％)。

纯化后2,4-二氨基丁酸在600M Varian D₂O溶液中核磁谱图结果数据：

¹H-NMR:2.04(m,2.0H),2.65(t,2.0H),3.49(t,1.0H)；

¹³C-NMR:174.7(COOH),52.9(CH),37.5(CH₂),28.9(CH₂).

实施例2：液体酶一锅法催化生产2,4-二氨基丁酸

收集的含天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH、转氨基酶AMT、ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH细胞混合在20倍体积的25mMTris pH 8.0的缓冲液(缓冲液A)里，然后经过高压破碎、高速离心(16000rpm,45min)收集含粗蛋白的上清液,该酶粗液直接进行下一步反应制备2,4-二氨基丁酸。

与实施例1类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入26.6克L-天冬氨酸(200mM),1.1克三磷酸腺苷二钠盐ATP(2mM)、22.8克多聚磷酸(Sigma,25聚,220mM单磷酸)、0.9克氯化镁(10mM)、0.75克氯化钾(10mM)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐1.5克(2.0mM)、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐1.4克(2.0mM)、亚磷酸钠27克(220mM)、甲酸氨15.5克(240mM)、丙氨酸0.35克(4mM)、磷酸吡哆醛2.8毫克(0.01mM),待pH值调节到8.0后，ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶液以1:2:4:2:4:6:4混合后一次性加入，通过酸碱调节维持反应液pH值在6.5-8.5,30℃轻微搅拌4小时后直接加酸调节反应液pH值到1.5。充分搅拌、离心除去酶沉淀；调节反应清液至pH7.5,然后依据上述方法通过G25色谱柱除盐，D201阴离子交换树酯除含磷酸化合物,最后冻干结晶得24.3克白色固体(收率87％)。

纯化后2,4-二氨基丁酸在600M Varian D₂O溶液中核磁谱图结果数据：

¹H-NMR:2.04(m,2.0H),2.65(t,2.0H),3.49(t,1.0H)；

¹³C-NMR:174.7(COOH),52.9(CH),37.5(CH2),28.9(CH₂).

实施例3：固定化酶一锅法催化生产2,4-二氨基丁酸

收集的含天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH、转氨基酶AMT、ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH细胞混合在20倍体积的25mMTris pH 8.0的缓冲液(缓冲液A)里，然后经过高压破碎、高速离心(16000rpm,45min)收集含粗蛋白的上清液，往溶液中逐量加入硫酸铵固体直至其洗出(35％-55％,w/v硫酸铵/缓冲液)。该酶固体通过离心(10000rpm,12min)收集后慢慢溶入10倍体积的缓冲液A里,经过G25尺寸排阻色谱柱购于Sigma)除盐以DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离后得到初纯化酶液，以上ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH、FDH粗酶以活力比1：2.2:4.5:2.5:4.0:6.0:5.0混合,然后利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)进行一次性混合固定,其方法如下:2000-4000U混合酶溶解在1L 25mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入25-65mM苯氧乙酸以及300-500克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液,室温搅拌4-8小时后过滤出固定化酶,最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温保存待用；固定化混合酶分别具有液体酶的30-70％的活性。

与前述实施例1和实施例2类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入13.3克L-天冬氨酸(100mM),1.1克三磷酸腺苷二钠盐ATP(2mM)、11.4克多聚磷酸(Sigma,25聚,110mM单磷酸)、0.9克氯化镁(10mM)、0.75克氯化钾(10mM)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐0.76克(1.0mM)、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐0.71克(1.0mM)、亚磷酸钠13.5克(110mM)、甲酸氨7.6克(120mM)、丙氨酸0.17克(2mM)、磷酸吡哆醛1.4毫克(0.005mM),待pH值调节到8.0后，2000-4000U固定化混合酶启动反应，反应过程中通过HCl及NaOH水溶液维持pH 6.5-8.5之间，反应液在30℃搅拌5小时后直接过滤固定化酶终止反应，其回收的固定化酶具有40-75％初始活力,过滤的2,4-二氨基丁酸粗溶液通过G25色谱柱除盐，D201阴离子交换树酯除含磷酸杂质,收集的2,4-二氨基丁酸粗品经冻干后用重结晶得白色固体11克(最终收率79％)(活性单位U代表30℃每分钟转化1μM底物所需要的酶量)。

¹H-NMR:2.04(m,2.0H),2.65(t,2.0H),3.49(t,1.0H)；

13C-NMR:174.7(COOH),52.9(CH),37.5(CH2),28.9(CH2).

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳瑞德林生物技术有限公司

<120> 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺

<130> S19P2064

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 820

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg

1 5 10 15

Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln

20 25 30

Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val

35 40 45

Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile

50 55 60

Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln

85 90 95

Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly

100 105 110

Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys

115 120 125

Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn

130 135 140

Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala

165 170 175

Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala

180 185 190

Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp

195 200 205

Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu

210 215 220

Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val

225 230 235 240

Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu

245 250 255

Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro

260 265 270

Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro

275 280 285

Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu

290 295 300

Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val

305 310 315 320

Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe

325 330 335

Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser

340 345 350

Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val

355 360 365

Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu

370 375 380

Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser

385 390 395 400

Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe

405 410 415

Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln

420 425 430

Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala

435 440 445

Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln

450 455 460

Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu

465 470 475 480

Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile

485 490 495

Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn

500 505 510

Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala

515 520 525

Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr

530 535 540

His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val

545 550 555 560

Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr

565 570 575

Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu

580 585 590

Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn

595 600 605

Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn

610 615 620

Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu

625 630 635 640

Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala

645 650 655

Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp

660 665 670

Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg

675 680 685

Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val

690 695 700

Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala

705 710 715 720

Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala

725 730 735

Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp

740 745 750

Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu

755 760 765

Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr

770 775 780

Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp

785 790 795 800

Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp

805 810 815

Lys Leu Gly Val

820

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro

20 25 30

Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly

35 40 45

Gly Thr Thr Gly Thr Leu Gln Asp Ala Phe Asp Leu Glu Ala Leu Lys

50 55 60

Ala Leu Asp Ile Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Glu

65 70 75 80

Ile Tyr Pro Lys Leu Arg Glu Ser Gly Trp Gln Gly Tyr Trp Ile Asp

85 90 95

Ala Ala Ser Ser Leu Arg Met Lys Asp Asp Ala Ile Ile Ile Leu Asp

100 105 110

Pro Val Asn Gln Asp Val Ile Thr Asp Gly Leu Asn Asn Gly Ile Arg

115 120 125

Thr Phe Val Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ser Leu

130 135 140

Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr

145 150 155 160

Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu

165 170 175

Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr

180 185 190

Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr

195 200 205

Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly

210 215 220

Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Gln Leu Asp Asn Gly Gln Ser Arg

225 230 235 240

Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser

245 250 255

Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg

260 265 270

Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile

275 280 285

Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val

290 295 300

Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala

305 310 315 320

Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn

325 330 335

Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln Leu Leu

340 345 350

Trp Gly Ala Ala Glu Pro Leu Arg Arg Met Leu Arg Gln Leu Ala

355 360 365

<210> 3

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Thr Asp Ala Ala Trp Leu Asp Ala His Trp Met Pro Phe Thr

1 5 10 15

Ala Asn Arg Gln Phe Lys Ser Asp Pro Arg Met Ile Val Ser Gly Lys

20 25 30

Gly Ala Tyr Tyr Thr Asp Ala Glu Gly Arg Lys Ile Phe Asp Gly Leu

35 40 45

Ser Gly Leu Trp Cys Thr Gly Leu Gly His Gly Arg Thr Glu Ile Val

50 55 60

Glu Ala Val Ser Arg Gln Val Ala Gln Leu Asp Tyr Ala Pro Ala Phe

65 70 75 80

Gln Phe Gly His Pro Lys Ser Phe Glu Leu Ala Asn Arg Ile Lys Glu

85 90 95

Leu Thr Pro Ala Gly Leu Asp Tyr Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser

100 105 110

Glu Ala Ala Asp Thr Ser Leu Lys Met Ala Arg Ala Tyr Trp Arg Ala

115 120 125

Lys Gly Lys Gly Thr Lys Thr Arg Leu Ile Gly Arg Glu Lys Gly Tyr

130 135 140

His Gly Val Asn Phe Gly Gly Ile Ser Val Gly Gly Ile Gly Pro Asn

145 150 155 160

Arg Lys Leu Phe Gly Gln Gly Leu Asp Ala Asp Phe Leu Pro His Thr

165 170 175

Gln Leu Ala Glu Asn Lys Phe Ser Arg Gly Met Pro Glu Arg Gly Ala

180 185 190

Glu Leu Ala Asp Arg Leu Leu Asp Leu Ile Ala Leu His Asp Ala Ser

195 200 205

Asn Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Phe Ala Gly Ser Ala Gly Val

210 215 220

Ile Ile Pro Pro Gln Gly Tyr Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ile Cys Thr

225 230 235 240

Ala His Asp Ile Leu Leu Ile Phe Asp Glu Val Ile Thr Gly Phe Gly

245 250 255

Arg Ala Gly Ala Met Thr Gly Ala Glu Ala Phe Gly Val Thr Pro Asp

260 265 270

Ile Met Asn Phe Ala Lys Gln Val Thr Asn Gly Val Gln Pro Leu Gly

275 280 285

Gly Val Val Ala Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Thr Phe Met Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Pro Glu Tyr Met Leu Glu Phe Pro His Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala

305 310 315 320

His Pro Val Ala Cys Ala Ala Gly Val Ala Ala Leu Asp Leu Leu Val

325 330 335

Lys Glu Asp Ala Val Ala Arg Val Arg Glu Leu Ala Pro His Phe Glu

340 345 350

Ala Ala Val His Gly Leu Lys Gly Gln Arg His Ile Ala Asp Ile Arg

355 360 365

Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Gly Leu Thr Ile Ala Ala Leu Pro Gly Glu

370 375 380

Pro Ala Arg Arg Pro Tyr Glu Ile Ala Met Arg Cys Trp Ala Lys Gly

385 390 395 400

Phe Tyr Val Arg Tyr Gly Gly Asp Thr Ile Gln Leu Ala Pro Pro Phe

405 410 415

Ile Ala Glu Lys Arg Glu Ile Asp Asn Leu Ile Asn Ala Val Ser Asp

420 425 430

Ala Leu Asn Glu Val Asp

435

<210> 4

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Pro Met Val Ala Ala Val Glu Phe Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val

1 5 10 15

Leu Arg Val Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ala Gly Val Asp Pro Glu Ser

20 25 30

Thr Pro Gly Tyr Thr Gly Val Lys Ala Asp Gly Lys Ala Leu Leu Ala

35 40 45

Ala Gln Asp Ala Arg Leu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Leu Phe Ala Glu

50 55 60

Gly Lys Phe Gly Asn Pro Lys Arg Leu Leu Leu Ile Leu Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Lys Gly Gly Ile Val Ser His Val Val Gly Ala Met

85 90 95

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100 105 110

Glu Lys Ser His Asp Phe Leu Trp Arg Ile Glu Lys Gln Val Pro Ala

115 120 125

Ala Gly Met Val Gly Val Phe Asp Arg Ser Gln Tyr Glu Asp Val Leu

130 135 140

Ile His Arg Val His Gly Trp Ala Asp Ala Ala Glu Leu Glu Arg Arg

145 150 155 160

Tyr Ala Ala Ile Asn Asp Phe Glu Ser Arg Leu Thr Glu Gln Gly Thr

165 170 175

Thr Ile Val Lys Val Met Leu Asn Ile Ser Lys Asp Glu Gln Lys Lys

180 185 190

Arg Leu Ile Ala Arg Leu Asp Asp Pro Ser Lys His Trp Lys Tyr Ser

195 200 205

Arg Gly Asp Leu Ala Glu Arg Ala Tyr Trp Asp Asp Tyr Met Asp Ala

210 215 220

Tyr Ser Val Ala Phe Glu Lys Thr Ser Thr Glu Ile Ala Pro Trp His

225 230 235 240

Val Val Pro Ala Asn Lys Lys Trp Tyr Ala Arg Ile Ala Val Gln Gln

245 250 255

Leu Leu Leu Asp Ala Leu Gly Gly Leu Gln Leu Asp Trp Pro Lys Ala

260 265 270

Asp Phe Asp Val Ala Ala Glu Arg Ala Leu Val Val Glu Ser

275 280 285

<210> 5

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Leu Pro Lys Leu Val Ile Thr His Arg Val His Asp Glu Ile Leu

1 5 10 15

Gln Leu Leu Ala Pro His Cys Glu Leu Met Thr Asn Gln Thr Asp Ser

20 25 30

Thr Leu Thr Arg Glu Glu Ile Leu Arg Arg Cys Arg Asp Ala Gln Ala

35 40 45

Met Met Ala Phe Met Pro Asp Arg Val Asp Ala Asp Phe Leu Gln Ala

50 55 60

Cys Pro Glu Leu Arg Val Val Gly Cys Ala Leu Lys Gly Phe Asp Asn

65 70 75 80

Phe Asp Val Asp Ala Cys Thr Ala Arg Gly Val Trp Leu Thr Phe Val

85 90 95

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100 105 110

Val Gly Leu Gly Arg His Leu Arg Ala Ala Asp Ala Phe Val Arg Ser

115 120 125

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130 135 140

Asn Ala Thr Val Gly Ile Leu Gly Met Gly Ala Ile Gly Leu Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Arg Leu Gln Gly Trp Gly Ala Thr Leu Gln Tyr His Glu Ala

165 170 175

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180 185 190

Ala Cys Ser Glu Leu Phe Ala Ser Ser Asp Phe Ile Leu Leu Ala Leu

195 200 205

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210 215 220

Leu Val Arg Pro Gly Ala Leu Leu Val Asn Pro Cys Arg Gly Ser Val

225 230 235 240

Val Asp Glu Ala Ala Val Leu Ala Ala Leu Glu Arg Gly Gln Leu Gly

245 250 255

Gly Tyr Ala Ala Asp Val Phe Glu Met Glu Asp Trp Ala Arg Ala Asp

260 265 270

Arg Pro Arg Leu Ile Asp Pro Ala Leu Leu Ala His Pro Asn Thr Leu

275 280 285

Phe Thr Pro His Ile Gly Ser Ala Val Arg Ala Val Arg Leu Glu Ile

290 295 300

Glu Arg Cys Ala Ala Gln Asn Ile Ile Gln Val Leu Ala Gly Ala Arg

305 310 315 320

Pro Ile Asn Ala Ala Asn Arg Leu Pro Lys Ala Glu Pro Ala Ala Cys

325 330 335

<210> 6

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Val Gly Ile Pro Thr Glu Ile Lys Asn Asn Glu Tyr Arg Val

1 5 10 15

Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Ala Glu Leu Thr Arg Arg Gly His Glu

20 25 30

Val Ile Ile Gln Ala Gly Ala Gly Glu Gly Ser Ala Ile Ser Asp Arg

35 40 45

Asp Phe Lys Ala Ala Gly Ala Glu Ile Val Asn Thr Ala Asp Gln Val

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65 70 75 80

Glu Tyr Ser Arg Met Arg Lys Gly Gln Thr Leu Phe Thr Tyr Leu His

85 90 95

Leu Ala Ala Ser Lys Pro Cys Thr Asp Ala Leu Leu Ala Ser Gly Thr

100 105 110

Thr Ser Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu Pro

115 120 125

Leu Leu Ala Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Leu Ser Ala Gln Val

130 135 140

Gly Ala Tyr His Leu Met Arg Ser Tyr Gly Gly Arg Gly Val Leu Met

145 150 155 160

Gly Gly Val Pro Gly Val Ala Pro Ala Glu Val Val Val Ile Gly Ala

165 170 175

Gly Thr Ala Gly Tyr Asn Ala Ala Arg Val Ala Ala Gly Met Gly Ala

180 185 190

His Val Thr Val Phe Asp Leu Asn Ile Asn Thr Leu Arg Arg Val Asp

195 200 205

Gly Glu Phe Gly Gly Arg Ile Glu Thr Arg Tyr Ser Ser Ser Leu Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ala Val Lys Lys Ala Asp Leu Val Ile Gly Ala Val Leu

225 230 235 240

Val Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Asn Ser Thr Val Ala

245 250 255

His Met Lys Pro Gly Ala Val Leu Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly

260 265 270

Gly Cys Phe Glu Asp Ser Arg Pro Thr Thr His Asp Glu Pro Thr Phe

275 280 285

Lys Val His Asp Thr Ile Phe Tyr Cys Val Ala Asn Met Pro Gly Ala

290 295 300

Val Pro Arg Thr Ser Thr Phe Ala Leu Thr Asn Ser Thr Met Pro Tyr

305 310 315 320

Val Leu Lys Leu Ala Asp Lys Gly Trp Gln Ala Ala Cys Ala Ser Asp

325 330 335

Ser Ala Leu Ala Lys Gly Leu Ser Thr His Asp Gly Lys Leu Leu Ser

340 345 350

Glu Ala Val Ala Lys Asp Leu Asp Leu Pro Phe Thr Asp Ala Ala Gln

355 360 365

Phe Leu Ala

370

<210> 7

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Lys Val Val Thr Val Cys Pro Tyr Cys Ala Ser Gly Cys Lys

1 5 10 15

Ile Asn Leu Val Val Asp Asn Gly Lys Ile Val Arg Ala Glu Ala Ala

20 25 30

Gln Gly Lys Thr Asn Gln Gly Thr Leu Cys Leu Lys Gly Tyr Tyr Gly

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

Gly Asn Glu Thr Asn Tyr Val Met Gln Lys Phe Ala Arg Ala Val Ile

115 120 125

Gly Thr Asn Asn Val Asp Cys Cys Ala Arg Val Ser His Gly Pro Ser

130 135 140

Val Ala Gly Leu His Gln Ser Val Gly Asn Gly Ala Met Ser Asn Ala

145 150 155 160

Ile Asn Glu Ile Asp Asn Thr Asp Leu Val Phe Val Phe Gly Tyr Asn

165 170 175

Pro Ala Asp Ser His Pro Ile Val Ala Asn His Val Ile Asn Ala Lys

180 185 190

Arg Asn Gly Ala Lys Ile Ile Val Cys Asp Pro Arg Lys Ile Glu Thr

195 200 205

Ala Arg Ile Ala Asp Met His Ile Ala Leu Lys Asn Gly Ser Asn Ile

210 215 220

Ala Leu Leu Asn Ala Met Gly His Val Ile Ile Glu Glu Asn Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Lys Ala Phe Val Ala Ser Arg Thr Glu Gly Phe Glu Glu Tyr Arg

245 250 255

Lys Ile Val Glu Gly Tyr Thr Pro Glu Ser Val Glu Asp Ile Thr Gly

260 265 270

Val Ser Ala Ser Glu Ile Arg Gln Ala Ala Arg Met Tyr Ala Gln Ala

275 280 285

Lys Ser Ala Ala Ile Leu Trp Gly Met Gly Val Thr Gln Phe Tyr Gln

290 295 300

Gly Val Glu Thr Val Arg Ser Leu Thr Ser Leu Ala Met Leu Thr Gly

305 310 315 320

Asn Leu Gly Lys Pro His Ala Gly Val Asn Pro Val Arg Gly Gln Asn

325 330 335

Asn Val Gln Gly Ala Cys Asp Met Gly Ala Leu Pro Asp Thr Tyr Pro

340 345 350

Gly Tyr Gln Tyr Val Lys Asp Pro Ala Asn Arg Glu Lys Phe Ala Lys

355 360 365

Ala Trp Gly Val Glu Ser Leu Pro Ala His Thr Gly Tyr Arg Ile Ser

370 375 380

Glu Leu Pro His Arg Ala Ala His Gly Glu Val Arg Ala Ala Tyr Ile

385 390 395 400

Met Gly Glu Asp Pro Leu Gln Thr Asp Ala Glu Leu Ser Ala Val Arg

405 410 415

Lys Ala Phe Glu Asp Leu Glu Leu Val Ile Val Gln Asp Ile Phe Met

420 425 430

Thr Lys Thr Ala Ser Ala Ala Asp Val Ile Leu Pro Ser Thr Ser Trp

435 440 445

Gly Glu His Glu Gly Val Phe Thr Ala Ala Asp Arg Gly Phe Gln Arg

450 455 460

Phe Phe Lys Ala Val Glu Pro Lys Trp Asp Leu Lys Thr Asp Trp Gln

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Ile Ile Ser Glu Ile Ala Thr Arg Met Gly Tyr Pro Met His Tyr Asn

485 490 495

Asn Thr Gln Glu Ile Trp Asp Glu Leu Arg His Leu Cys Pro Asp Phe

500 505 510

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530 535 540

Lys Glu Lys Phe Asp Thr Pro Asn Gly Leu Ala Gln Phe Phe Thr Cys

545 550 555 560

Asp Trp Val Ala Pro Ile Asp Lys Leu Thr Asp Glu Tyr Pro Met Val

565 570 575

Leu Ser Thr Val Arg Glu Val Gly His Tyr Ser Cys Arg Ser Met Thr

580 585 590

Gly Asn Cys Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Asp Glu Pro Gly Tyr Ala

595 600 605

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610 615 620

Leu Val Trp Val His Ser Arg Lys Gly Lys Ile Ile Thr Arg Ala Gln

625 630 635 640

Val Ser Asp Arg Pro Asn Lys Gly Ala Ile Tyr Met Thr Tyr Gln Trp

645 650 655

Trp Ile Gly Ala Cys Asn Glu Leu Val Thr Glu Asn Leu Ser Pro Ile

660 665 670

Thr Lys Thr Pro Glu Tyr Lys Tyr Cys Ala Val Arg Val Glu Pro Ile

675 680 685

Ala Asp Gln Arg Ala Ala Glu Gln Tyr Val Ile Asp Glu Tyr Asn Lys

690 695 700

Leu Lys Thr Arg Leu Arg Glu Ala Ala Leu Ala

705 710 715

Claims (1)

1.一种酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺，其特征在于，反应原料L-天冬氨酸、ATP或其盐、磷酸吡哆醛、丙氨酸、NADPH或其盐在pH值6.0-9.0的反应介质中，与天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH及转氨酶AMT进行酶催化反应，生成2,4-二氨基丁酸；所述天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH及转氨酶AMT的序列依次如SEQ ID NO.1-3所示；

同时还包括：向反应原料中添加多聚磷酸、亚磷酸或其盐、甲酸铵、氯化镁、氯化钾、NADH或其盐，以及添加ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH进行酶催化反应；所述ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH的序列依次如SEQ ID NO.4-7所示；

所述各酶以表达各酶的宿主细胞、各酶的酶液或各酶的固定化酶形式参与酶催化反应；

所述表达各酶的宿主细胞为含有表达各酶的载体的大肠杆菌；

所述各酶的酶液为从表达各酶的宿主细胞中提取的酶液；

还包括2,4-二氨基丁酸的纯化步骤：

过色谱柱除盐，然后阴离子交换树酯除去溶液中磷酸化合物，最后收集的2,4-二氨基丁酸粗品经冻干后重结晶；

所述反应介质为Tris.HCl。

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