CN102181412A - 一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用 - Google Patents
一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102181412A CN102181412A CN2011100564706A CN201110056470A CN102181412A CN 102181412 A CN102181412 A CN 102181412A CN 2011100564706 A CN2011100564706 A CN 2011100564706A CN 201110056470 A CN201110056470 A CN 201110056470A CN 102181412 A CN102181412 A CN 102181412A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dab
- dabat
- genetic engineering
- primer
- pet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- QPKGMRZHYIJPNZ-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminobutanoic acid;2-oxopentanedioic acid Chemical compound CCC(N)(N)C(O)=O.OC(=O)CCC(=O)C(O)=O QPKGMRZHYIJPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 38
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000187759 Streptomyces albus Species 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 241000640974 Streptomyces albulus PD-1 Species 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 241001446311 Streptomyces coelicolor A3(2) Species 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 6
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-VKHMYHEASA-N L-2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCC[C@H](N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000219729 Lathyrus Species 0.000 description 3
- 241000972623 Streptomyces albulus Species 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical class CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108030001141 Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001677174 Lathyrus latifolius Species 0.000 description 2
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- SXGMVGOVILIERA-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-2,3-diaminobutanoic acid Natural products CC(N)C(N)C(O)=O SXGMVGOVILIERA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710116338 Diaminobutyrate-2-oxoglutarate aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 1
- 241000589194 Rhizobium leguminosarum Species 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 231100000652 hormesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000018389 neoplasm of cerebral hemisphere Diseases 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；本发明还公开了上述酶的编码基因，如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明同时公开了包含上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的编码基因的表达载体、基因工程菌及其构建方法。本发明首次从小白链霉菌(Streptomyces albulus)中提取、测序、克隆表达的了二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因，通过构建基因工程菌，利用基因工程菌发酵生产L-2，4-二氨基丁酸，开辟了一条新的L-2，4-二氨基丁酸获取途径。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及涉及一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用。
背景技术
L-2，4-二氨基丁酸(L-2，4-diaminobutyric acid，英文缩写DABA)，也称2，4-丁二氨酸，是一种次生非蛋白质氨基酸，属于四碳化合物，其结构式为(NH2)CH2CH2CH(NH2)COOH，属于碱性氨基酸。它广泛存在于动物、植物和微生物体内，具有独特的生理功能，目前其研究处于起步阶段，尚未大规模应用。二氨基丁酸在农业和医药行业中具有良好的应用前景。在农业方面，研究发现在高等植物中，尤其是山黧豆属(Lathyrus)中，游离的二氨基丁酸含量较高，当外界环境恶劣时，二氨基丁酸含量上升，环境改善时，二氨基丁酸含量又下降，这可能与这种植物抗旱、耐瘠薄、耐盐碱、抗虫的特性有关，实验室研究表明如果外界提供氮源，固氮植物以硝酸盐的形式提供无机氮，则该植物体内二氨基丁酸含量上升，以储存多余的氮素，消除氨态氮对植物的毒害作用。美国农业部将植物抗逆性的研究作为一个研究方向，专门拨款研究林生山黧豆和其体内的二氨基丁酸。在我国，中国农业大学也在进行该方面的研究。除了水土保持，研究发现对于体内没有发现二氨基丁酸的植物来说，二氨基丁酸是一种竞争性的代谢抑制剂，国外研究者证实二氨基丁酸对莴苣、蚕豆的生长有抑制作用，对一些蝗虫的生长也有抑制作用。含有二氨基丁酸的植物在植物群落中生存力强，具有竞争力，可能就是由于释放出的二氨基丁酸对其他动植物的生长起到了抑制作用。除了抑制作用，二氨基丁酸能促进豌豆根瘤菌的生长，对土壤杆菌和其他的根瘤菌的生长也有刺激作用。在医学方面，过量的二氨基丁酸对人体有毒性，但在适当的剂量下又是一种药物，研究发现二氨基丁酸能引起高渗透压，对小鼠纤维瘤细胞有毒害性，对人体恶性神经胶质瘤细胞有溶解作用，因此，二氨基丁酸能用于脑肿瘤的防治。把抗癌药物道诺霉素制成二氨基丁酸衍生物，用它治疗白血病疗效更好，更为安全。
本课题组在筛选具有聚赖氨酸能力的菌株时发现一株能同时生产聚赖氨酸及聚二氨基丁酸的菌株Streptomyces albulus PD-1(CCTCC NO：M2011043)。目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：武汉武汉大学，邮编：430072， 登记入册的编号是CCTCC NO：M2011043，保藏日期是：2011年2月21日，详见中国专利2011100499868。
二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶(diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase，简称DABAT，EC 2.6.1.76)在L-2，4-二氨基丁酸的合成中起重要作用，天冬氨酸的衍生物天冬氨酸-β-半醛和谷氨酸在该酶催化下生成L-2，4-二氨基丁酸和α-酮戊二酸。目前L-2，4-二氨基丁酸尚未大规模生产，作为精细化工品，只能通过有机合成的方法得到，价格昂贵，价格达900元/克。山黧豆属的植物中，L-2，4-二氨基丁酸占种子干重的1％-3％，含量低，直接从种子中提取在技术角度、经济角度上都不可行。因此，本发明从微生物合成的角度研究如何发酵生产L-2，4-二氨基丁酸，为L-2，4-二氨基丁酸高产基因工程菌的构建及L-2，4-二氨基丁酸的生产开辟了一条新的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶。
本发明还要解决的技术问题是提供编码上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因序列。
本发明还要解决的技术问题是提供包含上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因的表达载体及基因工程菌。
本发明还要解决的另一个技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌在制备L-2，4-二氨基丁酸的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。包含422个氨基酸。其来源于小白链霉菌(Streptomyces albulus)PD-1(菌种保藏号：CCTCC NO：M2011043，关于上述小白链霉菌具体见中国专利2011100499868)。
一种权利要求1所示二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的编码基因，它具有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，其含有1269bp碱基。。
一种表达载体，包含权利要求2所述的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因。
其中，所述的表达载体为pET28a(+)。
一种基因工程菌，它包含权利要求3所述的表达载体。
上述基因工程菌优选为包含有重组质粒pET-dabat的E.coli BL21(DE3)。
上述基因工程菌的构建方法，包含如下步骤：
(1)二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因dabat扩增：
根据GeneBank公布的Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组序列，设计如下一对引物：
引物1：5’-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3’
引物2：5’-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3’
在上述引物的5’端的下划线部分分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，以小白链霉菌PD-1(Streptomyces albulus PD-1，CCTCC NO：M2011043)总DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应物组成如下(25μl体系)：2.5μl 10×Ex Taq Buffer，2μl dNTP，2.5μl MgCl2，2μl DMSO，2μl模板，引物1和引物2各2μl，0.5μl Ex Taq，9.5μl ddH2O，PCR反应程序为：95℃变性5min，然后94℃30s，58℃60s，72℃90s，共30个循环，72℃延续10min。将PCR产物克隆测序。
(2)重组表达质粒pET-dabat的构建：
将步骤(1)得到的PCR产物纯化后用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-dabat；
(3)将该重组质粒pET-dabat转化至宿主细胞中：
将重组质粒pET-dabat转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养18～24h得到初步阳性克隆；
(4)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：
分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-dabat，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。对重组质粒pET-dabat进行测序，结果表明插入片段为一个含有1269bp，编码422个氨基酸组成的蛋白质。
上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的表达方法：将包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以2～10％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养5-7h后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，IPTG的终浓度为0.2～ 1mmol/L，降温至25～30℃，继续表达12～20h后，离心收集菌体。
上述基因工程菌在发酵生产L-2，4二氨基丁酸中的应用。
具体方法为：将基因工程菌在含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中30～40℃液体培养8-20h，按2～10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基培养5～7h后，加入终浓度为0.2～1mmol/L的乳糖诱导，降温至25～30℃再诱导培养12～20h。其中，所述的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖10～50g/L，(NH4)2SO4 5～10g/L，NaCl 5～10g/L，KH2PO41～3g/L，MgSO4 0.1～1g/L，溶剂为水。
有益效果：本发明首次从小白链霉菌(Streptomyces albulus)中提取、测序、克隆表达的了二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因，将该基因上传至NCBI上进行同源性比对，其与Streptomyces coelicolor A3(2)中的Aminotransferase基因具有最高同源性86％，通过构建基因工程菌，利用基因工程菌发酵生产L-2，4-二氨基丁酸，开辟了一条新的L-2，4-二氨基丁酸获取途径。
附图说明
图1：是本发明的产L-2，4-二氨基丁酸的大肠杆菌基因工程菌的构建示意图。
图2：是本发明重组表达质粒pET-dabat的构建示意图。
图3：是重组的DABAT酶SDS-PAGE图谱，最左边泳道为标准蛋白分子量，自上向下的条带分别为(kDa)：116，66，45，35，25。其中，第1、2泳道是工程菌，3、4泳道是对照菌。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：小白链霉菌(Streptomyces albulus)PD-1基因组DNA的提取。
按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的小白链霉菌PD-1(Streptomyces albulus PD-1，CCTCC NO：M2011043)的基因组DNA，并用8g/L琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。
实施例2，二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因(dabat)的克隆和重组菌构建。
2.1dabat的PCR扩增：
根据GeneBank公布的Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组序列，设计如下一对引物：
引物1：5’-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3’
引物2：5’-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3’
在上述引物的5’端的下划线部分分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，以小白链霉菌PD-1(Streptomyces albulus PD-1，CCTCC NO：M2011043)总DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应物组成如下(25μl体系)：2.5μl 10×Ex Taq Buffer，2μl dNTP，2.5μl MgCl2，2μl DMSO，2μl模板，引物1和引物2各2μl，0.5μl Ex Taq，9.5μl ddH2O，PCR反应程序为：95℃变性5min，然后94℃30s，58℃60s，72℃90s，共30个循环，72℃延续10min。将扩增条带切胶后用Axygen公司柱式割胶回收试剂盒纯化回收，连接于Takara公司pMD18-T载体上并转化大肠杆菌JM109。通过在氨苄青霉素LB平板上结合质粒单双酶切验证，鉴定出阳性克隆，并在南京金斯瑞生物科技公司进行序列测定。
2.2dabat基因的表达
利用pET-28a(+)质粒(Novagen)，构建表达载体，表达目的基因，进一步确认基因克隆的正确性。
2.2.1限制性酶切反应，纯化及连接反应
将PCR产物纯化，用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的内切酶进行酶切反应，同时，将pET-28a(+)质粒(Novagen)进行酶切反应。本实验中，所用的酶是EcoRI和Hind III。酶切体系为：PCR产物或pET-28a(+)质粒溶液50μL，EcoRI 3μL，Hind III3μL，10×缓冲液10μL，ddH2O 34μL，总体积100μL。
由于所选用的两个酶切位点在pET-28a(+)空质粒上相距很近(约20bp)，因此，酶切之后的PCR产物和质粒载体只需要经过PCR清洁试剂盒即可达到纯化的目的。
经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体，可以用于连接反应。连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物4μL，酶切纯化的质粒4μL，T4连接酶1μL，10×连接酶缓冲液1μL。连接后获得重组质粒pET-dabat，其主要结构如图2所示。
2.2.2质粒制备与转化
质粒抽提采用Axyprep plasmid miniprep Kit(Axygen，杭州)，参照生产商的说明书进行操作。质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞使用热激法。
2.2.3重组质粒pET-dabat的转化
(1)取0.1-1μg重组质粒pET-dabat DNA于200μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟。
(2)42℃水浴热激90秒，快速置于冰上1-3分钟。
(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45分钟。
(4)取200μL菌体涂布于含有25μg/mL卡那霉素的LB平板表面。37℃培养12-16个小时至单菌落出现。
2.2.4重组子的鉴定
将阳性菌落接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中进行培养并提取质粒，按照实施例2.2.1中的酶切体系和条件分别用EcoRI和Hind III对重组质粒进行单-双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒pET-dabat，含此重组质粒pET-dabat的重组大肠杆菌，即为转化的重组工程菌E.coli BL21-pET-dabat。测序结果显示插入片段含有一个长1269bp的开放阅读框架。
实施例3：二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的诱导表达。
将重组大肠杆菌BL21-pET-dabat接种于5mL添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到装有100mL LB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养至OD600约为0.6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度1mmol/L)，降温至25～30℃，继续表达12小时后，离心收集菌体。
实施例4、工程菌E.coli BL21-pET-dabat中二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的表达分析。
1、SDS-PAGE分析
如实施例2.2.2-2.2.4所述步骤，将没有经过酶切的空质粒pET-28a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到包含pET-28a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)，将该菌作为对照菌，命名为E.coli BL21-pET。
将重组大肠杆菌BL21-pET-dabat和对照菌E.coli BL21-pET接种于5mL添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到装有100mL LB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养至OD600约为0.6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度1mmol/L)，降温至25～30℃，继续表达12小时后，各取样1.5mL，离心，TE溶液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM)洗涤两次，再加入100μl TE溶液和20μl 10mg/ml的溶菌酶(购自华美生物工程公司)处理1个小时，煮沸3min，离心，取上清即可使用。SDS-PAGE凝胶制备好后点样，每个点5-15μl，然后电泳、染色及脱色，SDS-PAGE结果表明：二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶在工程菌E.coli BL21-pET-dabat中获得了可溶性表达，而对照菌E.coli BL21-pET则没有。
2，二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的酶活测定
将重组大肠杆菌BL21-pET-dabat接种于5mL添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到装有100mL LB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养至OD600约为0.6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度1mmol/L)，降温至25～30℃，继续表达12小时后，各取样1.5mL，离心，TE溶液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM)洗涤两次，再加入100μl TE溶液和20μl 10mg/ml的溶菌酶(购自华美生物工程公司)处理1个小时，离心后去上清液作为酶液，参照Hisato Ikai等报道的方法进行二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶酶活测定(Ikai，H，and S.Yamamoto.Identification and analysis of a gene encoding L-2，4-diaminobutyrate：2-ketoglutarate 4-aminotransferase involved in the1，3-diaminopropane production pathway in Acinetobacter baumannii.J.Bacteriol.1997(179)：5118-5125.)，重复测定酶活三次。结果显示，本发明克隆的基因工程菌的酶活为5.6U/mg，而对照菌E.coli BL21-pET几乎检测不到酶活，说明本发明克隆的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因在大肠杆菌中得到了活性表达。
3，本发明的基因工程菌BL21-pET-dabat的发酵性能测试
将活化好的工程菌BL21-pET-dabat接种到装有100mL LB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养过夜，按5％(v/v)的接种量转接至装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中(葡萄糖50g/L，(NH4)2SO4 8g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为水。)培养5-7h后，加入终浓度为1mmol/L的乳糖诱导， 降温至25～30℃，继续培养12h。离心弃去菌体，收集培养液。参照沈黎明等改进的方法测定培养液中L-2，4-二氨基丁酸含量(沈黎明，吴显荣，林生山黧豆体内的一种特异游离氨基酸-丁二氨酸，北京农业大学学报，1992，18(4)：347-351)，结果表明，摇瓶培养液中L-2，4-二氨基丁酸含量达5.6g/L，相信经过发酵条件优化，有望实现二氨基丁酸的工业化发酵生产。
Claims (10)
1.一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶，其特征在于它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所示二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的编码基因，其特征在于它具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为pET-28a(+)。
5.一种基因工程菌，其特征在于它包含权利要求3所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌为包含有重组质粒pET-dabat的E.coli BL21(DE3)。
7.权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于它包含如下步骤：
(1)二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因dabat扩增：
根据GeneBank公布的Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组序列，设计如下一对引物：
引物1：5’-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3’
引物2：5’-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3’
在上述引物的5’端的下划线部分分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，以小白链霉菌PD-1(Streptomyces albulus PD-1，CCTCC NO：M2011043)总DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应物组成如下：25μl体系，2.5μl 10×Ex Taq Buffer，2μl dNTP，2.5μl MgCl2，2μl DMSO，2μl模板，引物1和引物2各2μl，0.5μl Ex Taq，9.5μl ddH2O，PCR反应程序为：95℃变性5min，然后94℃30s，58℃60s，72℃90s，共30个循环，72℃延续10min；将PCR产物克隆测序；
(2)重组表达质粒pET-dabat的构建：
将步骤(1)得到PCR产物纯化后用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-dabat；
(3)将该重组质粒pET-dabat转化至宿主细胞中：
将重组质粒pET-dabat转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养18～24h得到初步阳性克隆；
(4)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：
分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-dabat，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。
8.权利要求6所述的基因工程菌在发酵生产L-2，4二氨基丁酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将基因工程菌在含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中30～40℃液体培养8-20h，按2～10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基培养5～7h后，加入终浓度为0.2～1mmol/L的乳糖诱导，降温至25～30℃再诱导培养12～20h。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖10～50g/L，(NH4)2SO4 5～10g/L，NaCl 5～10g/L，KH2PO4 1～3g/L，MgSO4 0.1～1g/L，溶剂为水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100564706A CN102181412B (zh) | 2011-03-09 | 2011-03-09 | 一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100564706A CN102181412B (zh) | 2011-03-09 | 2011-03-09 | 一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102181412A true CN102181412A (zh) | 2011-09-14 |
| CN102181412B CN102181412B (zh) | 2012-12-12 |
Family
ID=44567700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011100564706A Expired - Fee Related CN102181412B (zh) | 2011-03-09 | 2011-03-09 | 一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102181412B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586204A (zh) * | 2011-11-14 | 2012-07-18 | 广东溢多利生物科技股份有限公司 | 一种新型酸性果胶酶pec2及其基因和应用 |
| CN110804634A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-18 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007105203A2 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Method and composition for protecting neuronal tissue from damage induced by elevated glutamate levels |
| WO2009014699A1 (en) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Eastman Kodak Company | Preventing stress transfer in oled display components |
-
2011
- 2011-03-09 CN CN2011100564706A patent/CN102181412B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007105203A2 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Method and composition for protecting neuronal tissue from damage induced by elevated glutamate levels |
| WO2009014699A1 (en) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Eastman Kodak Company | Preventing stress transfer in oled display components |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《Genbank》 20101025 GI:297195114 diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase [Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486] 全文 1-6 , * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586204A (zh) * | 2011-11-14 | 2012-07-18 | 广东溢多利生物科技股份有限公司 | 一种新型酸性果胶酶pec2及其基因和应用 |
| CN110804634A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-18 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺 |
| CN110804634B (zh) * | 2019-12-04 | 2022-02-25 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102181412B (zh) | 2012-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101381695B (zh) | 鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株及其构建方法 | |
| CN104031873B (zh) | 用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌及构建和应用 | |
| CN104560927A (zh) | 一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用 | |
| CN107828806A (zh) | 一种新型耐葡萄糖的β‑葡萄糖苷酶基因及其应用 | |
| CN105368767A (zh) | D-丙氨酸缺陷型筛选表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 | |
| CN109628427A (zh) | 一种高效制备甘草次酸的重组酶及方法 | |
| CN102181412B (zh) | 一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用 | |
| CN106119145A (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌突变株与应用 | |
| CN103484419A (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用 | |
| CN103436538A (zh) | 一种抗菌肽及其制备方法与应用 | |
| CN101565686B (zh) | 一种融合菌株及其应用 | |
| CN102676561A (zh) | 一种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法 | |
| CN104263709A (zh) | 鸡蛋清溶菌酶及其制备方法 | |
| CN104195152A (zh) | 一种钙调磷酸酶催化亚基基因及其应用 | |
| CN102604993B (zh) | 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法 | |
| CN101875940B (zh) | 一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌nsm18及其专用基因簇 | |
| CN102898512B (zh) | 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途 | |
| CN106834180B (zh) | 改良黄瓜叶围微生态防治霜霉病的肠杆菌3bh19及其应用 | |
| CN103233035B (zh) | 中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法 | |
| CN102731658A (zh) | 一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN102732456A (zh) | 耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体和应用 | |
| CN104946577A (zh) | 基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 | |
| CN104593393A (zh) | 红林蚁AChE基因、红林蚁AChE及其制备方法 | |
| CN108165559A (zh) | 一种c2h2型转录因子基因及其应用 | |
| CN104928313B (zh) | 阿维链霉菌rex基因在提高阿维菌素产量中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121212 Termination date: 20180309 |