CN102731658A - 一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TatPTD-Endostatin重组蛋白，是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域和人内皮抑素构成的融合蛋白，其中，人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人内皮抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明蛋白保留了内皮抑素抑制新生血管的生成作用，具有转导效率高、易透过血脑屏障、眼球屏障的优点，克服了内皮抑素的穿膜效果差的局限性，可发挥更好的抑制新生血管细胞生成的作用，能够用于治疗新生血管生成引起的各种疾病，包括眼部血管增生性疾病及各种肿瘤，如糖尿病引起的视网膜病变，非小细胞肺癌等。

Description

一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明提供了一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用，属于蛋白转导领域。 
背景技术
内皮抑素（Endostatin，ES）是1997年O′Reilly等首次发现的一种内源性血管内皮细胞增殖的强效抑制剂。研究发现，ES可特异性抑制新生血管内皮细胞的生成，并对多种起源的新生血管内皮细胞生成有抑制作用，且不影响静止的血管内皮细胞，无耐药性，毒副作用小。我国已将血管内皮抑素衍生物研制成具有自主知识产权的国家一类新药Endostar(恩度，YH16)，用以治疗非小细胞肺癌。此外研究者们在ES防治眼部新生血管性疾病方面也取得一些可喜的成就。但是ES仍旧存在一些缺点，由于其体内半衰期短，入胞能力差，临床上的使用剂量较大，增加了患者的经济负担。如果能够通过一定的手段提高其稳定性、延长其体内半衰期、并增加其入胞能力达到提高其体内活性从而减少给药剂量或延长给药周期，将会大大提高ES的治疗效果，促进其在临床上的应用。 
能够穿透细胞膜的Tat蛋白可能帮助解决使药物透过眼球屏障进入作用部位问题。Tat蛋白来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子，1988年Maurice和Paul发现Tat蛋白能够跨膜递送入细胞，1997年Vives等证明Tat蛋白中有一段富含碱性氨基酸、带有正电荷的多肽片段（Tat蛋白中47-57位氨基酸序列片段）与其转导功能密切相关，并称之为Tat蛋白转导域（PTD），其序列是YGRKKRRQRRR。到目前为止研究表明，Tat PTD能够运载蛋白多肽、外源基因、脂质体、无机分子等多种物质有效进入细胞内。与其他运输载体相比，TatPTD具有其优越性：（1）转导效率不受连接物大小的限制，且对其运输的“货物分子”的活性不产生影响；（2）在一定范围内不会造成细胞损伤，不具有明显的免疫原性、抗原性和致炎性；（3）能穿透血脑屏障，有望解决大分子药物进入生物屏障结构发挥疗效的问题。此外，Tat PTD与大分子蛋白质相连以后，从结构上来看，也可以理解为对大分子蛋白质进行了一定的化学修饰，延长了肽链，有望增加蛋白质的稳定性，延长生物半衰期，也有利于提高其在治疗肿瘤等疾病的疗效。 
本发明利用穿膜肽Tat PTD的穿膜作用和内皮抑素的抑制新生血管的生成作用，将二者通过基因工程的手段融合在一起，以期获得能够穿透细胞膜甚至是血脑屏障或眼球屏障的内皮抑素，达到通过简单的局部滴眼给药预防眼部血管增生的目标。这一研究对探索大分子蛋 白质眼部给药的新途径和视网膜脉络膜病变的防治具有重要意义。 
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的： 
一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白，是由人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域和人内皮抑素构成的融合蛋白，其中，人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域（Tat PTD）的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人内皮抑素（Endostatin）的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 
本发明还提供了能够表达Tat PTD-ES融合蛋白的DNA序列，其具有SEQ ID NO.3(Tat PTD)和SEQ ID NO.4(Endostatin)所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。 
所述Tat PTD-Endostatin重组蛋白可以通过酵母或大肠杆菌体系表达，方法如下： 
采用酵母表达Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法，步骤如下： 
（1）常规方法制备含有编码Tat PTD的目的基因和编码Endostatin的目的基因的TatPTD-ES融合基因，并扩增； 
（2）用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ分别酶切质粒pGAPZαA和Tat PTD-ES融合基因，并分别回收酶切产物，然后用T4DNA连接酶连接； 
（3）上述连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin，最终获得重组表达质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin； 
（4）制备感受态的酵母菌GS115，重组表达质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin单酶切线性化后经电转化法导入感受态的GS115菌中，同时以不含Tat PTD-Endostatin的pGAPZαA电转作对照，在含Zeocin的LB平板上培养2-3天筛选转化子，挑选阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子； 
（5）上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物，即为TatPTD-Endostatin重组蛋白。 
所述步骤（4）中的酵母菌株为毕赤酵母或酿酒酵母。 
采用大肠杆菌表达Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法，步骤如下： 
（1）常规方法制备含有编码Tat PTD的目的基因和编码Endostatin的目的基因的Tat PTD-ES融合基因，并扩增； 
（2）用限制性内切酶Nde Ⅰ、BamH Ⅰ分别酶切质粒pET28a和Tat PTD-ES融合基因，并分别回收酶切产物，然后用T4DNA连接酶连接； 
（3）连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin，最终获得重组表达质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin； 
（4）制备感受态的大肠杆菌Rossetta感受态细胞，将表达质粒热激法转化入Rossetta感受态细胞中，在含卡那霉素（50μg/ml）的LB平板上培养16h，筛选转化子，挑选阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子； 
（5）上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物，即为Tat PTD-Endostatin重组蛋白。 
所述步骤（5）具体如下： 
①1挑选阳性转化子，过夜培养后，按1：100（体积比）接入LB培养基中，震荡培养至OD600为0.8-1.0（约6h），加入IPTG（加入后的浓度为0.25mmol/L）,37℃，200r/min，诱导6h，收菌； 
②将菌体超声破壁（或采用高压分散、酶裂解法破碎细胞），采用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定； 
③包涵体复性：菌体超声后离心得包涵体，采用稀释复性或透析复性或超滤复性法对包涵体进行复性； 
④分离纯化Tat PTD-Endostatin融合蛋白：将复性成功的蛋白质经亲和层析或离子交换层析进行纯化，除盐后得纯度较高的目的蛋白。 
所述③中复性的具体方法如下：菌体破壁（采用高压分散、酶裂解法或超声波法破碎细胞）后，10000g离心30min，弃去上清得到包涵体；采用含去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次去除粘附的杂蛋白（去污剂溶液的浓度使其能够溶解干扰的细胞蛋白质和膜成分而不溶解包涵体）；然后采用变性液对包涵体进行溶解（包涵体在变性条件下溶解），在室温搅拌2h后，10000g离心30min，上清为包涵体溶液；然后，将包涵体溶解的、变性的无生物活性的蛋白质复性，使其能够折叠形成可溶的、有生物活性的构象。 
所述去污剂溶液为浓度不大于2mol/L的尿素或不大于1.5M的盐酸胍，去污剂溶液中含有Tritonx-100，浓度为0.5%（v/v）。 
所述变性液为5-7M浓度的盐酸胍或6-8M浓度的尿素。 
所述变性液对包涵体的溶解在还原条件下进行。 
所述还原条件是指使用还原试剂，所使用的还原试剂为二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇。 
所述复性是通过降低变性试剂的浓度（通过缓慢地连续或逐步稀释溶解液来降低变性试剂的浓度）至无变性作用或弱变性作用的水平来复性。 
所述复性时，复性缓冲液中含有至少一种还原和氧化形式的硫醇成分，硫醇成分为GSH/GSSG。 
所述④中，复性成功后采用亲和层析或阳离子交换层析纯化目的蛋白质。 
亲和层析采用Ni离子亲和层析，缓冲液pH5-11。 
阳离子交换层析采用CM-Sepharose，SP-Sepharose，缓冲液pH7-9。 
所述除盐为：采用G25-Sephadex，超滤，或透析的方法除盐。 
本发明的TatPTD-Endostatin融合蛋白，能够用于治疗新生血管生成引起的各种疾病，包括眼部血管增生性疾病及各种肿瘤，如糖尿病引起的视网膜病变，非小细胞肺癌等。 
本发明采用酵母和大肠杆菌表达体系表达了Tat PTD-ES融合蛋白，采用SDS-PAGE和Western Blot进行产物鉴定，并采用Ni离子亲和层析分离纯化后得到了纯度比较高的TatPTD-ES融合蛋白，并通过CCK-8法验证了其抑制人脐静脉内皮细胞（EAHY926）增殖的活性。 
本发明的Tat PTD-Endostatin融合蛋白，保留了内皮抑素抑制新生血管的生成作用，具有较强的穿过细胞膜的特性，具有穿透体内生理屏障如血脑或眼球屏障的潜力用，具有转导效率高、易透过血脑屏障、眼球屏障的优点，克服了内皮抑素的穿膜效果差的局限性，可发挥更好的抑制新生血管细胞生成的作用，可透过血脑屏障治疗脑部肿瘤，或通过简单的局部滴眼给药达到预防视网膜血管增生的目标。 
附图说明
图1为Tat PTD-ES融合基因和Endostatin基因的PCR图谱，其中泳道1为Endostatin的PCR产物，泳道2、3均为Tat PTD-Endostain基因的PCR产物，M为DNA Marker Ⅰ(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。 
图2为重组质粒的酶切后图谱，其中泳道M1为DNA MarkerM1(600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp)，泳道1、3均为pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin重组质粒酶切后产物，泳道23为pGAPZαA/Endostatin重组质粒酶切后产物，泳道M2为1kb DNALadder(10000bp8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)。 
图3为验证重组质粒时的PCR图谱，其中泳道1以重组质粒pGAPZαA/Endostatin为模板的PCR产物，泳道2、3均为以重组质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin为模板的PCR产物，泳道M为DNA Marker Ⅰ(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。 
图4为重组质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin的测序结果。 
图5为发酵液上清的SDS-PAGE电泳图谱，其中泳道1为蛋白质Marker(94.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、33.0KDa、26.0KDa、20.0KDa、14.4KDa)、2为毕赤酵母菌含空质粒发酵液的上清液，3、4为表达Tat PTD-ES的阳性毕赤酵母菌发酵的上清液，5为表达Endostatin的阳性毕赤酵母菌发酵的上清液。 
图6为重组质粒pET28a/Tat PTD-ES的测序结果。 
图7为大肠杆菌超声破壁后的SDS-PAGE结果，其中泳道1为Es包涵体；2、3.TatPTD-ES包涵体；4.空质粒；5.空菌株；6.Marker；7.空质粒上清；8.Tat PTD-ES上清；9.Es上清。 
图8为大肠杆菌包涵体经复性分离纯化后所得样品的SDS-PAGE电泳图谱，其中泳道1，泳道2为蛋白质Marker，泳道3为经分离纯化后的样品。 
图9为纯化后的重组蛋白对EAHY926细胞增殖的抑制作用。 
图10为纯化后的重组蛋白对鸡胚尿囊膜血管生成抑制作用的影响，A为生理盐水组；B为阴性对照；C为Tat PTD-ES组；D为ES组。 
图11为纯化后的重组蛋白入胞能力的考察，其中，A为ES，B为Tat PTD-ES。 
具体实施方式
下面以具体实施例方式对本发明作进一步描述，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 
实施例1采用酵母表达体系表达Tat PTD-ES融合蛋白 
a.Tat PTD-ES融合基因的扩增：将编码Tat-PTD11个氨基酸的33个密码及选定的酶切位点（EcoR Ⅰ）设计到上游引物的5′端，用PCR技术从含有Endostatin的pGAPZαA质粒（本发明人的实验室拥有，常规方法构建得到的）中扩增Tat PTD-ES融合基因，扩增得到的融合基因片段为600左右，其PCR结果见图1。 
b.构建含有Tat PTD-ES融合基因的表达质粒： 
①pGAPZαA酵母表达质粒的扩增、提取：DH5α常规活化后制备感受态，取pGAPZαA质粒DNA热激法转化DH5α，转化后将菌液涂布于含Zeocin（25μg/ml）的低盐LB平板中，次日挑取单菌落，扩增，并用试剂盒抽提质粒。 
②Tat PTD-ES基因的亚克隆：EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切含Tat PTD-ES基因融合基因及pGAPZαA空质粒，琼脂糖凝胶电泳后回收Tat PTD-ES融合基因与3kb的pGAPZαA质粒，加入T4连接酶buffer，室温连接过夜。次日取连接产物转化DH5α，并涂布于含Zeocin（25μg/ml）的低盐LB平板中。同时转化不含Tat PTD-ES基因的pGAPZαA作为空白对照。 
③Tat PTD-ES亚克隆的筛选及鉴定：从Zeocin低盐LB平板中挑选单克隆，接种于含Zeocin的低盐LB培养基中，37℃避光培养，抽提质粒DNA，分别以酶切、PCR法筛选含有Tat PTD-ES的重组表达载体工程菌。酶切结果见图2，PCR结果见图3，筛选的阳性克隆质粒由大连宝生物公司测序，测序结果见图4，结果表明序列正确。 
c.TatPTD-ES蛋白的表达： 
①电转化实验：制备感受态的毕赤酵母菌GS115，重组酵母表达质粒pGAPZαA单酶切线性化后经电转化法导入感受态的GS115菌中，同时以不含Tat PTD-ES的pGAPZαA电转作对照。将电转后的GS115菌株涂布于含Zeocin（100μg/ml）的YPDS平板中，在30℃培养箱中培养2-3天至长出白色单菌落，从含Zeocin的LB平板上挑取单菌落至2mlYPD培养基中，30℃摇床中振荡培养至对数生长期，-80℃冻存。 
②PCR及SDS-PAGE筛选阳性表达菌：电转后的单克隆冻存菌10μl经过过夜活化后，以1：100接种于100mlYPD培养液中，30℃振荡培养，培养至第4天时，取发酵液，分别进行PCR及SDS-PAGE验证，SDS-PAGE结果见图5，由结果可得筛选的阳性菌落能表达Tat PTD-ES融合蛋白，其分子量在20KD左右。 
d.Tat PTD-ES融合蛋白的分离纯化 
取第四天的重组毕赤酵母菌发酵液高速离心（8000r/min，20min），取上清液采用镍离子亲和层析和SephadexG25从毕赤酵母表达上清液中分离纯化Tat PTD-ES融合蛋白，纯化后的样品经SDS-PAGE验证，表明采用镍离子亲和层析和SephadexG25可以将Tat PTD-ES融合蛋白从发酵液中分离出来。 
实施例2采用大肠杆菌表达Tat PTD-ES融合蛋白 
a.双酶切融合基因及空质粒：采用Nde Ⅰ、BamH Ⅰ对Tat PTD-ES融合基因（常规方法构建得到）及选用的大肠表达的pET28a进行双酶切，并分别进行片段回收。 
b.融合基因与质粒的连接：在连接体系中将回收的目的基因与质粒混匀，4℃孵育过夜，连接产物用于下一步转化。 
c.重组质粒的转化：E.coli JM109感受态细胞200μl加入上述连接反应液，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入0.8ml LB培养基，37℃孵育1h，将孵育液涂 布于LK平板上，37℃培养12~16h。 
d.阳性重组子的鉴定：随机挑选数个具有Kan抗性的转化子菌落，经LB液体培养基培养、小量扩增后，抽提重组质粒为模板，进行PCR验证，并进行测序，测序结果见图6，结果表明序列正确。 
e.重组质粒转入工程菌株中：将测序正确的重组质粒，采用热激法转入Rossetta菌株中，涂布LB平板(Kan 50μg/ml)，平板于37℃培养16-24h； 
f.待平板上长出菌落后进行阳性转化子的筛选鉴定。 
g.挑选阳性转化子，过夜培养后，按1:100接入LB培养基中，震荡培养至OD600约为0.8-1.0(约6h),加入IPTG（加入后的浓度为0.25mmol/L）,37℃，200r/min，诱导6h，收菌。 
h.将菌体超声破壁后，采用SDS-PAGE和Western Blot对目的蛋白进行鉴定。 
实施例3大肠杆菌表达的包涵体蛋白复性的工艺流程 
a.包涵体溶解：菌体破壁超声后，10000g离心30min，弃去上清得到包涵体；采用含去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次以去除粘附的杂蛋白；然后采用变性液对包涵体进行溶解，在室温搅拌2h后，10000g离心30min，上清为包涵体溶液。去污剂溶液为浓度2mol/L的尿素，去污剂溶液中还含有Triton x-100，浓度为0.5%(v/v)。变性液含有20-100mmol/LTris/HCl、8mol/L尿素、5mmol/LEDTA及10mmol/LDTT。SDS-PAGE结果如图7所示。 
b.蛋白复性：复性缓冲液经过滤后，将包涵体裂解液在搅拌得同时缓慢滴入复性缓冲液中，复性体系的蛋白终浓度为0.01-0.2mg/ml，然后将混合物置于4℃下复性10-50h。复性缓冲液为：pH7.0-9.0，20-100mmol/Ltris/HCl、2mol/L尿素、5mmol/L EDTA、1mmol/L GSSG、0.2mmol/L GSH。 
c.分离纯化Tat PTD-ES融合蛋白：将复性成功的蛋白质经Ni离子交换层析进行纯化，除盐后得纯度较高的目的蛋白，如图8所示。 
实施例4Tat PTD-ES融合蛋白的生物活性研究 
考察TatPTD-ES抑制内皮细胞的活性：以Es为阴性对照，采用CCK-8法考察纯化后的Tat PTD-ES抑制血管内皮细胞的活性，具体实施步骤如下： 
将人脐静脉内皮细胞（EAHY926）的冻存液在37℃水浴锅内快速融化，1000r/min离心15min，弃上清，沉淀细胞用培养液重悬并轻轻吹打混匀，形成细胞悬液，于细胞计数板上进行细胞计数，然后接种于培养瓶中，置于CO2恒温培养箱（5%CO2，37℃）培养24h，换液，以后每2~3天换液一次。待细胞长至融合状态时，细胞用PBS清洗两遍，然后加入0.25% 胰蛋白酶1~2mL，在倒置显微镜下观察，待细胞间隙增大，细胞回缩变圆时，立即将胰蛋白酶吸出或倒掉，加入含15%小牛血清的培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打瓶壁上的细胞，使大部分细胞脱落形成细胞悬液，于倒置显微镜下计数，然后以105/mL密度接种于新的培养瓶中，恒温培养箱继续培养。 
采用CCK-8法测定纯化后ES抑制血管内皮细胞的活性。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为1.0×104/孔，分于96孔板，每孔200μL，置于37℃、5%CO2的CO2恒温培养箱中培养使细胞贴壁；加入药物（纯化后的Tat PTD-ES设6个浓度梯度：5μg/mL、20μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，用培养基稀释，每个浓度设5个平行孔），继续培养48h；小心吸取上清，PBS洗涤，再次离心，弃上清,加入200μL新鲜培养基；每孔加入CCK-8溶液10μL，37℃继续培养2h后终止培养，用酶联免疫检测仪于波长490nm处测定各孔吸光度（A490）值，并计算其抑制率：抑制率=[1-（实验组A490/对照组A490）]×100%。重复实验五次，取平均值。 
不同浓度纯化后的Tat PTD-ES对HUVEC内皮细胞增殖的抑制作用见图9，结果显示纯化后的Tat PTD-ES融合蛋白对HUVEC有明显的抑制作用，随着浓度的增大抑制作用增强，具有浓度依赖性，当浓度增大到200μg/mL时，内皮细胞大部分被抑制，抑制率达到86.45%。 
实施例5Tat PTD-ES鸡胚绒毛尿囊膜血管（CAM）生成的作用 
a.孵育CAM的方法，方法如下：选择来源于受精率大于90%的种鸡厂、生长良好的白皮种蛋（表面清洁光滑、蛋壳均匀、蛋形规范、气孔气室均匀），用温水清洗3次后，在1‰的苯扎溴酚溶液中浸泡1min消毒后置于隔热式电热恒温培养箱中培养，温度（37±1）℃，培养箱内放入水盘以保持40%~60%相对空气湿度，并保持一定的通风换气条件。鸡蛋气室向上，长轴与蛋托约呈70°-80°角。每天转蛋3次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45°为宜。鸡胚孵育3天后，用照蛋灯照蛋，挑选出发育良好的鸡胚。将其移至超净台内，用75%酒精消毒后晾干。用牙科钻或砂轮在蛋壳表面划刻出凹痕，用尖针在种蛋气室表面扎一小孔，在凹痕处滴少量生理盐水，用吸耳球对准气室表面的小孔轻轻吸气，此时可看到凹陷处的生理盐水下陷，即该处CAM下陷，形成假气室（区别于蛋自身的气室）。用灭菌透明胶带封闭假气室，制备假气室后稳定48h。 
b.给药方法：将鸡胚按重量随机分组，生理盐水组，阴性对照组：bFGF 20μL（50AU）/只Es组：Es(50μg/mL)100μL+bFGF 20μL（50AU）/只；Tat PTD-ES(50μg/mL)+bFGF 20μL（50AU）/只。将稳定48h的种蛋假气室上的透明胶带揭开，按上述剂量将供试液直接加到鸡胚绒毛尿囊膜上，注意小心加药，尽量使药物集中于一点上。加药后用无菌透明胶带封口， 标记后放入温度（37±1）℃的培养箱中，保持40％-60％的相对空气湿度，继续培养48h后观察结果。 
Tat PTD-ES鸡胚绒毛尿囊膜血管（CAM）生成的作用结果见图10，与阴性对照组相比，Tat PTD-ES组的血管数目明显小于阴性对照组，表明Tat PTD-ES能明显抑制CAM血管的生成，且与Es没有显著性差异。 
实施例6荧光显微镜考察重组蛋白进入细胞的能力 
将EAHY926内皮细胞接种于12孔板中(1×104cells/well)，加入无血清DMEM培养基（内含FITC-Es、FITC-Tat PTD-ES,各用药组按照蛋白浓度100μg protein/mL）1mL。置于37℃二氧化碳培养箱中孵育，孵育2h后用冰冻的PBS漂洗3次，荧光显微镜观察Tat PTD-ES及ES的入胞情况。 
Tat PTD-ES的入胞结果见图11，由结果可得，Tat PTD-ES进入细胞的能力较好，具有能够穿透生理屏障的潜力。 
上述活性实验研究证明本发明表达的TatPTD-ES融合蛋白保留了Endostatin的抑制血管内皮细胞增殖的作用，有望用于治疗由新生血管生成引起的各种疾病，包括眼部血管增生性疾病及各种肿瘤，如糖尿病引起的视网膜病变，非小细胞肺癌等，甚至有望比Endostatin更好的发挥疗效。 
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Figure IDA00001639759100021
Figure IDA00001639759100031

Claims (10)

1.一种TatPTD-Endostatin重组蛋白，其特征在于：是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域和人内皮抑素构成的融合蛋白，其中，人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人内皮抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种表达Tat-ES融合蛋白的DNA序列，其特征在于：其具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。
3.一种采用酵母表达Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）常规方法制备含有编码Tat PTD的目的基因和编码Endostatin的目的基因的TatPTD-ES融合基因；
（2）用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ分别酶切质粒pGAPZαA和Tat PTD-ES融合基因，并分别回收酶切产物，然后用T4DNA连接酶连接；
（3）上述连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin，最终获得重组表达质粒pGAPZαA/TatPTD-Endostatin；
（4）制备感受态的酵母菌GS115，重组表达质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin单酶切线性化后经电转化法导入感受态的GS115菌中，在含Zeocin的LB平板上培养2-3天筛选转化子，挑选阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子；
（5）上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物，即为Tat PTD-Endostatin重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的酵母菌株为毕赤酵母或酿酒酵母。
5.一种采用大肠杆菌表达Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）常规方法制备含有编码Tat PTD的目的基因和编码Endostatin的目的基因的Tat-ES融合基因，并扩增；
（2）用限制性内切酶Nde Ⅰ、BamH Ⅰ分别酶切质粒pET28a和Tat PTD-ES融合基因，并分别回收酶切产物，然后用T4DNA连接酶连接；
（3）连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin，最终获得重组表达质粒pET28a/TatPTD-Endostatin；
（4）制备感受态的大肠杆菌Rossetta感受态细胞，将表达质粒热激法转化入Rossetta感受态细胞中，在含卡那霉素的LB平板上培养16h，筛选转化子，挑选阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子；
（5）上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物，即为Tat PTD-Endostatin重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）具体如下：
①挑选阳性转化子，过夜培养后，按1：100接入LB培养基中，震荡培养至OD600为0.8-1.0，加入IPTG，37℃，200r/min，诱导6h，收菌；
②将菌体破壁，采用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定；
③包涵体复性：菌体超声后离心得包涵体，采用稀释复性或透析复性或超滤复性法对包涵体进行复性；
④分离纯化Tat PTD-Endostatin融合蛋白：将复性成功的蛋白质经亲和层析或离子交换层析进行纯化，除盐后得目的蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述③中复性的具体方法如下：菌体破壁后，10000g离心30min，弃去上清得到包涵体；采用含去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次去除粘附的杂蛋白；采用变性液对包涵体进行溶解，在室温搅拌2h后，10000g离心30min，上清为包涵体溶液；然后，将包涵体溶解的、变性的无生物活性的蛋白质复性，使其能够折叠形成可溶的、有生物活性的构象。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述④中，采用G25-Sephadex、超滤或透析的方法除盐。
9.权利要求1所述的Tat PTD-Endostatin融合蛋白在治疗癌症或新生血管生成引起的疾病中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述新生血管生成引起的疾病为非小细胞肺癌、糖尿病引起的视网膜病变、老年性黄斑盘状变性引起的脉络膜血管增生。
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