CN103232543A - 具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4及其制备方法以及相关基因和应用。该组蛋白具有tumstatin活性片段氨基酸序列和具有CD137L胞外区氨基酸序列，tumstatin活性片段氨基酸序列选自SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列中的一种，CD137L胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。该重组蛋白兼有抑制人脐静脉内皮细胞增殖和协同刺激T细胞增殖的活性，可用于制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力等药物。

Description

具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一组具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4及其基因，以及含有该基因的表达载体以及由该载体转化的菌株，还涉及该蛋白的制备方法，同时涉及该蛋白及其基因在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病（如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌等）、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力等药物，以及该重组蛋白或基因在制备以口服或注射等相关剂型药物中的应用。

背景技术

大量研究已证明免疫原性差与丰富的血管生成是肿瘤组织的两大特征，同时也是肿瘤治疗预后差、容易复发的主要原因。基于此研究人员发现了肿瘤治疗的新契机——生物疗法，即借助生物学知识与手段实施对肿瘤组织或者肿瘤形成过程的定向打击。抑制肿瘤血管生成与肿瘤的免疫治疗是目前广受关注的两大热点。

1.抑制肿瘤血管生成

随着肿瘤血管生成理论的完善和临床研究迅速发展，抗血管生成治疗已成为肿瘤辅助治疗的一个重要组成部分。Tumstatin是近年来发现的一种能够抑制新生血管生成的蛋白药物，在抗肿瘤领域也发挥极大的作用。

Tumstatin来源于血管基底膜Ⅳ型胶原α3链C-末端的肿瘤新生血管抑制因子，由244个氨基酸组成，分子量为28kD。Tumstatin能够与内皮细胞上αVβ3整合蛋白结合，干扰其介导的信号传导，从而抑制内皮细胞粘附、迁移和内皮细胞增殖,进而抑制血管生成。其分子机制为：tumstatin经与内皮细胞膜上的αVβ3整合素结合进而抑制FAK、PI3K、PKB/AKT信号转导通路的活化，降低了哺乳动物雷帕霉素靶体(mTOR)活性，最终通过阻断真核翻译起始因子(eIF4E)和它的结合蛋白的解离来介导内皮细胞特异性的mRNA帽子依赖性的蛋白质合成，从而抑制内皮细胞的增殖、诱导内皮细胞的细胞凋亡、抑制肿瘤的血管新生和抑制肿瘤的生长和转移。

Maeshima等人(J Biol Chem.2000Jul14;275(28):21340-8)发现，tumstatin有两个不同的抗肿瘤活性区，分别具有直接和间接的抗肿瘤作用。一个是54到132位的N-末端肽（Tum-5），既能抑制血管内皮细胞增殖，又能诱导内皮细胞凋亡，从而具有抗血管生成作用。进一步研究证实第74-98位的25个氨基酸是Tum-5抗血管生成的活性中心。Tumstatin在肿瘤的基因治疗方面有一定的研究。Luo等(IUBMB Life.2006Nov;58(11):647-53)构建的双功能融合蛋白TNF-tumstatin有望克服TNF应用剂量高、毒副作用强的缺点,发挥两者联合抗肿瘤作用。Goto T等(Int J Oncol.2008Jul;33(1):33-40)选取了tumstatin的54-244位氨基酸的基因（Tum1）构建哺乳动物表达载体pSecTag2B-tum-1，然后研究者将此构建的目的基因分别转入肝癌细胞HCC cells，PLC/PRF/5，Huh-7中，通过增殖实验发现pSecTag2B-tum-1的导入能够抑制以上肝癌细胞的增殖，同时也能够明显的抑制HUVEC细胞的增殖和迁移，研究者在接种有肿瘤的小鼠细胞内进行了基因治疗实验，发现在进行相关基因治疗的小鼠中其肿瘤体积明显受到控制。

2.CD137/CD137L在肿瘤免疫治疗中的研究

T细胞的激活需要两个信号：一个是抗原递呈细胞提供的MHC-抗原肽复合物信号；另一个是由细胞膜表面黏附分子如CD28-B7提供的协同刺激信号，即第二信号。CD137/CD137L信号系统在第二信号中发挥极大的作用，如其能够刺激T细胞增殖等。

CD137/CD137L信号参与多种细胞免疫，研究最为透彻的当属CD137/CD137L在T细胞免疫中所发挥的作用。当有适量抗CD3抗体存在的情况下，抗CD137的单克隆抗体、可溶性的CD137L或者能够表达CD137L的细胞均能有效的激活T细胞，且能够有效的促进T细胞增殖、释放相关的细胞因子，同时能够延长已经活化的T细胞的生存周期，从而使得T细胞的杀伤作用更加强劲。其反向信号在调节机体免疫时更加精确与快速。研究发现，CD137能够招募TRAF2（TNF受体相关因子2），激活细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1），致使JNK/SAPK，P38MAPK（P38有丝分裂丝裂原活化蛋白激酶）以及NF-κB途径的激活，从而上调抗凋亡基因bcl-xL与bfl-1的表达，保护激活的T细胞免于凋亡的命运。CD137L与抗CD137抗体类似，也可以激活CD8⁺T细胞，诱导其增殖、分泌细胞因子IFN-γ，并维持T细胞的存活。CD137/CD137L信号可以通过以上作用发挥其杀伤肿瘤细胞的作用。因而CD137/CD137L辅助信号对肿瘤治疗有重要意义。该信号不仅能辅助第一信号高效激活机体的细胞免疫，而且还能延长激活的CD8⁺T细胞的生存期，并且诱导细胞持续表达CD137分子，从而持久杀伤肿瘤细胞。

综上所述，CD137/CD137L信号通过激活T细胞免疫并维持T细胞的杀伤效应达到抑制肿瘤生长的效果，而tumstatin则通过抑制肿瘤血管生成间接阻断肿瘤的生长。目前许多研究人员分别对这两个途径作了深入的研究和探讨，然而，联合应用免疫系统与抗血管生成治疗肿瘤的研究更有意义。尽管有研究使用两种性质的疫苗达到这一效果，但是目前还没有研究将CD137L与tumstatin融合制成一个具有双功能、双靶点的蛋白。

发明内容

本发明通过短的连接肽将CD137L胞外区与tumstatin抗血管生成活性片段融合成一个同时具有增强T细胞免疫与抗血管生成的双功能、双靶点的分子，并且在本发明中选取了tumstatin不同的相关活性位点（tumstatin氨基酸序列第45-98位、第60-132位、第60-98位氨基酸序列中的一种)与CD137L胞外区蛋白氨基酸序列第50-240位通过连接肽相连接，利用原核或真核表达系统制备，此方法具有制备简单及避免了全长tumstatin的副作用问题，本发明将在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病（如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌等）、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力等药物，以及在制备以口服或注射等相关剂型药物中有很好的应用前景与市场价值。

本发明的目的是提供一组具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4。

本发明的另一个目的是提供编码上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的基因。

本发明的另一个目的是提供上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4及其基因在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病（如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌等）、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力等药物中的应用，且该组蛋白可用于制备以口服或者注射等相关剂型药物。

本发明具体技术方案如下：

一种具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4，其特征在于该蛋白具有tumstatin活性片段氨基酸序列和具有CD137L胞外区氨基酸序列，所述tumstatin活性片段氨基酸序列选自SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列中的一种，所述CD137L胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述tumstatin活性片段氨基酸序列和CD137L胞外区氨基酸序列通过连接肽氨基酸序列相连接。

上述连接肽氨基酸序列可采用本领域常规技术手段进行设计，优选SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18。

本发明所述重组蛋白Tumstatin-CD137L4氨基酸序列优选SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.12中的一种。

本发明还提供了编码上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4基因，包括编码tumstatin活性片段的基因和编码CD137L胞外区的基因，其中所述包括编码tumstatin活性片段的基因选自SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.21中的一种，所述编码CD137L胞外区的基因选自SEQ ID NO.22，编码tumstatin活性片段的基因和编码CD137L胞外区的基因通过编码连接肽的基因相连接。

上述编码连接肽的基因优选SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。

上述重组蛋白基因，其优选具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6之一的核苷酸序列。

本发明还提供了一种编码上述重组蛋白Tumstatin-CD137L4的基因，与上述的核苷酸序列相比具有70％及以上的同源性，能编码本发明所述重组蛋白或其保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。

本发明还提供了上述的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的制备方法，包括如下步骤：

（1）设计得到本发明所述编码具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4基因序列；

（2）构建含上述基因序列表达系统，包括构建表达载体再将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达本发明所述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的重组细胞；

（3）通过本领域普通技术手段培养以上所述的重组细胞，使其表达目的蛋白；

（4）分离纯化得到本发明所述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4。

上述表达系统可选用原核表达系统或真核表达系统，原核表达系统优选大肠杆菌表达系统或枯草芽孢杆菌表达系统，这两个表达系统普遍适应于本发明所述重组蛋白的表达，其中大肠杆菌系统中表达载体优选pET-11a、pET-28a或pET-22b，枯草芽孢杆菌表达系统表达载体优选pP43-tum-CD137L；真核表达系统优选酵母表达系统，表达载体优选pPIC9K、pPICZαA或pPIC9，酵母宿主细胞优选GS115或SMD1168。

上述制备方法的一种优选方案为：将编码上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的基因通过Ndel及Nhel双酶切，然后连接至表达载体pET-11a的相应酶切位点，再转化大肠杆菌BL21(DE3)，经液体培养工程菌获得包涵体形式的目的蛋白。通过将包涵体进行稀释复性的方法，即用含低浓度尿素的溶液多次洗涤包涵体蛋白，然后用含8M尿素的变性液在50℃溶解包涵体，最后用含0.4M L-Arg的复性液稀释复性包涵体，本发明中复性所得重组蛋白即为纯度较高的蛋白，无需再另外纯化。从而得到本发明所述重组蛋白。

上述制备方法的一种优选方案为：将编码上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的基因通过EcoR1及Notl双酶切，然后连接至表达载体pPICZαA的相应酶切位点，再转化酵母宿主细胞SMD1168中，通过胞外分泌表达得到三聚体形式的目的蛋白，然后在分别通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析柱(DEAE-Sepharose)手段获得纯的目的蛋白。

上述制备方法的一种优选方案为：将编码上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的基因通过PstⅠ和HindⅢ双酶切，构建表达载体pP43-tum-CD137L，再转化枯草芽孢杆菌中，通过胞外分泌表达得到三聚体形式的目的蛋白，然后在分别通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析柱(DEAE-Sepharose)手段获得纯的目的蛋白。

本发明还提供了上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力药物中的应用。

本发明还提供了上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4基因在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力药物中的应用。

上述应用中，本发明所述的重组蛋白可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明所述的重组蛋白和可药用载体。较佳的，药物组合物有0.1-99.9%重量百分比的作为活性成分本发明所述的重组蛋白。“可药用载体”不会破坏本发明重组蛋白的药学活性，同时其有效用量，即能够起药物载体作用时的用量对人体无毒。

“可药用载体”包括但不限于：离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统（SEDDS）如d-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活性剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、环糊精如α-、β-、γ-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明所述重组蛋白的药物传递。

其他可药用辅料如填充剂（如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖）、粘合剂（如微晶纤维素）、崩解剂（如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP）、润滑剂（如硬脂酸镁）、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。

在上述的药物组合物中，没有限制可以任选使用的任何剂型。例如，可举例说明的有口服给药形式如片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂或液体制剂，或胃肠外给药形式如注射、局部产品或栓剂，他们可以以常规方法配制或非常规方法如脂质体等。

当使用本发明所述重组蛋白作为治疗剂时，其使用量对于成人大致每天0.01mg至1g的范围内，这取决于各患者的年龄、性别、体重和症状程度，并且日剂量可分为几个剂量。

本发明所述的重组蛋白还包括采用现有技术领域常规方法对本发明所述重组蛋白进行修饰的修饰蛋白。

对于蛋白质和肽类药物，在多数情况下，机体内的氨肽酶及羧肽酶很容易从常见的直链肽的两端进行逐步的切割分解，使直链肽被降解。多肽修饰是改变肽链主链结构和侧链基团的重要手段，已有大量文献表明经过修饰后的多肽药物可以显著降低免疫原性、减少毒副作用、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况等等，明显改善药物的疗效。

本发明所述重组蛋白常用修饰方法包括中间残基的修饰、氨基酸替换、糖基化修饰及PEG修饰等，基本原理都是增加多肽分子的相对分子量和空间位阻，提高其对多肽水解酶的稳定性，减少肾小球的滤过作用。替换肽链中的某几个氨基酸是另一种推迟酶降解使多肽药物的半衰期延长的方式，替换对象通常为肽链中的易酶解的氨基酸。具体的说，可对重组蛋白中间残基进行糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、硝基化、磺酸化或者连接PEG修饰或者偶联蛋白质，其中：

糖基化修饰最常用的为N-糖基化和O-糖基化。糖基化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Tyr、Ser或Thr残基上的氧与糖相连或本发明所述重组蛋白的氨基酸序列中的一个或多个天冬酰胺侧链的酰胺氮与糖相连。

磷酸化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Tyr、Ser或Thr位点进行磷酸化。

甲基化修饰肽包括侧链甲基化修饰肽和N端甲基化修饰肽，侧链甲基化优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Lys、Tyr或Arg侧链上进行甲基化，如Lys(For),Lys(Me),Lys(Me)2,Lys(Me)3,Arg(Me)2symmetrical,D-Tyr(Me),D-Tyr(Et)；

乙酰化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Lys或Ser侧链进行乙酰化，如Ser(Ac)或Lys(Ac)。

硝基化或磺酸化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Tyr侧链上进行硝基化或磺酸化，Tyr(3-NO₂)，Tyr(SO₃H₂)。

中间残基的PEG修饰优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Lys侧链的氨基进行PEG修饰，PEG分子量优选为2000-10000。

或者，将本发明所述重组蛋白或其上述修饰蛋白的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸替换成相应的氨基酸衍生物或特殊氨基酸，如将丙氨酸替换成β-丙氨酸、高苯丙氨或萘基丙氨酸，将脯氨酸替换成羟脯氨酸，亮氨酸替换成正亮氨酸，缬氨酸替换成正缬氨酸，苏氨酸替换成别苏氨酸，异亮氨酸替换成别异亮氨酸，天冬酰胺替换成2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基天冬酰胺（Asn（GlcNac(Ac)3-β-D）），赖氨酸替换成Lys（palmitoyl）。

或者，将本发明所述重组蛋白或其上述修饰蛋白的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸替换成相应的D型氨基酸。

本发明中编码上述具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的基因（Tumstatin GenBank:AAF72632.1，含有CD137L全长序列的质粒由本实验室保存,参考Wang S,Tan A,Lv J,Wang P,Yin X,Chen Y.Soluble expression of recombinant human CD137ligand in Escherichia coli by co-expression of chaperones.J Ind Microbiol Biotechnol.2012Mar;39(3):471-6.doi:10.1007/s10295-011-1045-1.制得）通过常规方法通过全基因合成、PCR方法或其两者结合的方法获得。

本发明所述重组蛋白的体外生物学活性进行初步检测和分析结果表明可以抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖，同时辅助刺激小鼠T细胞的增殖及存活。

综上所述，本发明提供了一组具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4，体外活性实验表明表达的重组蛋白Tumstatin-CD137L4能很好的抑制HUVEC细胞增殖，因而提示该重组蛋白可能有效抑制体内异常血管生成，并且截短的Tumstatin片段可以避免全长Tumstatin蛋白在体内实验中引起的副作用。同时，该重组蛋白Tumstatin-CD137L4能有效辅助抗CD3抗体刺激T细胞增殖，因而可以增强T细胞介导的获得性免疫应答。另外，本发明中的重组蛋白使用大肠杆菌表达，该表达系统具有表达量大、操作简单、纯化简便等优点，可以有效的大批量生产。因此，本发明可为大规模生产重组蛋白Tumstatin-CD137L4提供新的、安全的途径，为开发新的高效、无毒、双靶向性抗肿瘤药物奠定了扎实的基础，本发明具有广阔的应用价值及市场前景。

附图说明

图1为氨基酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在酵母中的表达。

图2所示为Western blot鉴定目的蛋白在酵母中确已表达。

图3为氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在枯草芽孢杆菌中的表达。

图4为氨基酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在大肠杆菌中的表达。

图5为具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的包涵体在包涵体溶解液中溶解及变性蛋白在复性液中复性情况。

图6为具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的包涵体在包涵体溶解液中溶解及变性蛋白在复性液中复性情况。

图7为具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的包涵体在包涵体溶解液中溶解及变性蛋白在复性液中复性情况。

图8为本发明所述重组蛋白Tumstatin-CD137L4对HUVEC细胞增殖的影响。（左图中SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12分别代表具有此氨基酸序列的重组蛋白。其中右图为阳性对照TNP-470作用效果，其浓度分别为1μg/ml,5μg/ml）

图9为本发明所述重组蛋白Tumstatin-CD137L4刺激T细胞增殖实验结果。（SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12代表具有此所包含的氨基酸序列的蛋白）。

具体实施方式

实验材料和试剂：

本发明共设计6种具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4表达载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示序列，翻译编码氨基酸序列为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.12所示序列。该组蛋白具有tumstatin第45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列中的任一种，并具有全长CD137L胞外区蛋白的50-240位氨基酸序列，两者通过Linker连接肽连接融合而成，其中Linker氨基酸序列如SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.18所示。本发明在连接有上述Tumstatin活性片段基因（如SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.21所示）和连接肽基因的5’端和3’设计EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点，交由上海捷瑞生物工程有限公司进行全合成，并由连入具有相应酶切位点pbluescriptⅡSK(-)载体，重组载体由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

DH5α和BL21（DE3）菌株由天根生化有限公司购得，pMD18-T载体、solutionⅠ连接酶、限制性内切酶均购自TaKaRa公司，pET-11a由Novagen公司购得，pPICZαA载体由Invitrogen公司购得，含有CD137L全长序列的质粒由本实验室保存(参考Wang S,Tan A,Lv J,Wang P,Yin X,Chen Y.Soluble expression of recombinant human CD137ligand inEscherichia coli by co-expression of chaperones.J Ind Microbiol Biotechnol.2012Mar;39(3):471-6.doi:10.1007/s10295-011-1045-1.制得)，核苷酸序列测序由南京思普金生物工程有限公司完成，RPMI1640培养基、胎牛血清等购自Gibco公司。抗CD3和抗CD28单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

人T细胞富集试剂盒购自Stem cell公司。其他试剂均为国产分析纯。

实施例1：具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在酵母表达系统中的表达纯化

（1）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4酵母表达载体的构建

本发明共设计6种具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4表达载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示序列，氨基酸序列为SEQ ID NO.7至SEQ IDNO.12所示序列。该组蛋白或多肽由三组不同活性位点的tumstatin(三组具有全长tumstatin45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列)与CD137L(具有全长CD137L胞外区蛋白的50-240位氨基酸序列)分别通过Linker连接肽连接融合而成。其中Linker氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS或AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA。其中tumstatin及Linker相关序列（具有SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.30所示序列）由上海捷瑞生物公司合成，CD137L胞外区蛋白(具有全长CD137L胞外区蛋白的50-240位氨基酸序列)由PCR方法扩增得到。以含有CD137L全长序列的质粒为模板，PCR反应体系为：

模板DNA：     1μl

10×Buffer:   5μl

dNTP:         4μl

上游引物：    1μl

下游引物：    1μl

Taq:          0.5μl

ddH2O:        37.5μl

Total:        50μl

上游引物为：5’-CGGGATCCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTC-3’

下游引物为：5’-GCGGCCGCCACCCGGAAGAGTCCCAAGAC-3’

以上上游引物带有BamHⅠ酶切位点，下游引物带有NotⅠ酶切位点。

反应条件：先95℃预变性2min，然后以94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，反应循环进行30次，最后于72℃再延伸10min。将PCR产物回收后，与pMD-18T载体连接。连接体系为：

目的片段：  3μl

pMD-18T：    2μl

溶液Ⅰ：     5μl

Total:       10μl

连接条件为16℃连接16h。转化入大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄的LB培养基上过夜培养后挑取单克隆提取质粒并测序，将测序正确的质粒分别用BamH Ⅰ及NotⅠ酶切，回收双酶切产物，再与含有SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的pbluescriptⅡSK(-)-Tumstatin-Linker的载体进行连接，连接体系及反应条件同上。进而转化入大肠杆菌DH5α中提取质粒交由南京思普金测序公司测序。获得正确的测序质粒后通过EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切，然后连接至表达载体pPICZαA的相应酶切位点，再转化入酵母SMD1168宿主菌中，筛选并得到阳性菌株。

（2）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在酵母表达系统中的表达纯化

从酵母YPD平板上挑选已经筛选的阳性菌株，接种于装有10ml YPD培养基的100ml摇瓶中，于28°C～30°C/250rpm～300rpm培养至OD₆₀₀=2～6。取300μl菌液接种于装300mlBMGY培养基的1L摇瓶中，28°C～30°C/250rpm～300rpm培养至OD₆₀₀=2～6。将摇瓶中菌液转移至50ml离心管中，室温下1500×g～3000×g离心5min，收集菌体。用适量的无菌水重悬细胞，室温下1500×g～3000×g离心5min，收集菌体。用适量的BMMY培养基重悬细胞，将菌液转移至1L摇瓶中，BMMY培养基补足300ml，28°C～30°C/250rpm～300rpm培养。每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5%。取72h样品4℃，13000rpm离心3min，留上清，待SDS-PAGE分析。经SDS-PAGE分析发现目的蛋白确已在酵母中表达，并且目的蛋白是以三聚体的形式表达的，如图1所示，其中A）图为具有SEQ ID NO.7氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，B）图为具有SEQ ID NO.8氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，C）图为具有SEQ ID NO.9氨基酸序列蛋白表达状况，泳道3为阴性对照，泳道1-2箭头所示即为目的蛋白表达情况，D）图为具有SEQ ID NO.10氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，E）图为具有SEQ ID NO.11氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，F）图为具有SEQ ID NO.12氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况。表达的蛋白经western blot及质谱分析鉴定确是目的蛋白。Western blot结果如图2所示。目的蛋白随后分别经别硫酸沉淀、阴离子交换层析柱(DEAE-Sepharose)进行纯化。

实施例2：具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在枯草芽孢杆菌中的表达纯化

（1）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4枯草芽孢杆菌表达载体的构建

本发明共设计6种具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4表达载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示序列，氨基酸序列为SEQ ID NO.7至SEQ IDNO.12所示序列。该组蛋白或多肽由三组不同活性位点的tumstatin(三组具有全长tumstatin45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列)与CD137L(具有全长CD137L胞外区蛋白的50-240位氨基酸序列)分别通过Linker连接肽连接融合而成。其中Linker氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS或AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA。以实施例1中构建的含有目的基因的质粒pPICZαA为模板，扩增得到目的基因。PCR反应体系为：

模板DNA：     1μl

10×Buffer:   5μl

dNTP:         4μl

上游引物：    1μl

下游引物：    1μl

Taq:          0.5μl

ddH2O:        37.5μl

Total:        50μl

SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.4上游引物为：5’-CCTGCAGGGTTTTTCTTTCTTATTTGTT-3’

SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6上游引物为：

5’-CCTGCAGCAAGATTTAGGTACTTTGGG-3’

6组菌株共同使用以下下游引物：

下游引物为：5’-AAGCTTCACCCGGAAGAGTCCCAAGAC-3’

以上上游引物带有Pst Ⅰ酶切位点，下游引物带有Hind Ⅲ酶切位点。

反应条件：先95℃预变性2min，然后以94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，反应循环进行30次，最后于72℃再延伸10min。将PCR产物回收后，与pMD-18T载体连接。连接体系为：

目的片段：  3μl

pMD-18T：  2μl

溶液Ⅰ：   5μl

Total:     10μl

连接条件为16℃连接16h。转化入大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄的LB培养基上过夜培养后挑取单克隆提取质粒并测序，将测序正确的质粒分别用Pst Ⅰ及Hind Ⅲ酶切，回收双酶切产物，然后连接至穿梭表达载体pP43-tum-CD137L中，再转化入枯草芽孢杆菌中，筛选并得到阳性菌株。

（2）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在枯草芽孢杆菌中的表达纯化

将以上筛选得到的阳性克隆菌在2×YT培养基（pH7.0）中37℃的条件下培养96h后提取发酵液上清成分。通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，经对照确定蛋白确已表达，如图3所示，泳道1为阴性对照，泳道2、3箭头所示即为目的蛋白表达情况，其他几种重组蛋白表达同上，可为本领域普通技术实现。表达的蛋白经western blot及质谱分析鉴定确是目的蛋白。目的蛋白随后分别经硫酸沉淀、阴离子交换层析柱(DEAE-Sepharose)进行纯化得到纯化。

实施例3：具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在大肠杆菌表达载体的表达及包涵体蛋白复性、纯化

（1）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4大肠杆菌表达载体中的构建

本发明共设计6种具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4表达载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示序列，氨基酸序列为SEQ ID NO.7至SEQ IDNO.12所示序列。该组蛋白或多肽由三组不同活性位点的tumstatin(三组具有全长tumstatin45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列)与CD137L(具有全长CD137L胞外区蛋白的50-240位氨基酸序列)分别通过Linker连接肽连接融合而成。其中Linker氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS或AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA。以实施例1中构建的含有目的基因的质粒pPICZαA为模板，扩增得到目的基因。PCR反应体系为：

模板DNA：   1μl

10×Buffer: 5μl

dNTP:       4μl

上游引物：  1μl

下游引物：  1μl

Taq:      0.5μl

ddH2O:    37.5μl

Total:    50μl

SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.4上游引物为：5’-CCATATGGGTTTTTCTTTCTTATTTGTT-3’

SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6上游引物为：

5’-CCATATGCAAGATTTAGGTACTTTGGG-3’

6组菌株共同使用以下下游引物：

下游引物为：5’-GCTAGCCACCCGGAAGAGTCCCAAGAC-3’

以上上游引物带有Nde Ⅰ酶切位点，下游引物带有Nhe Ⅰ酶切位点。

反应条件：先95℃预变性2min，然后以94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，反应循环进行30次，最后于72℃再延伸10min。将PCR产物回收后，与pMD-18T载体连接。连接体系为：

目的片段：    3μl

pMD-18T：     2μl

溶液Ⅰ：      5μl

Total:        10μl

连接条件为16℃连接16h。转化入大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄的LB培养基上过夜培养后挑取单克隆提取质粒并测序，将测序正确的质粒分别用Nde Ⅰ及Nhe Ⅰ酶切，回收双酶切产物，然后连接至表达载体pET-11a的相应酶切位点，再转化大肠杆菌BL21(DE3)。

（2）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

无菌条件下，在50ML LB培养基（含有100μg/ml的氨苄青霉素）中接种上述BL21(DE3)菌种，置于37℃，250rpm条件下培养过夜，作为活化菌种。将活化后的菌种转接入适量新的LB培养基（含有100μg/ml的氨苄青霉素）中，转接种量为1%转接量，待OD值达到0.8-1.0时加入0.1mM的IPTG，37℃培养4h-5h后离心收菌。收菌完毕后按菌体湿重1g加10mlPBS吹悬，使用高压细胞破碎仪破菌，收集破碎液，4℃，1000rpm离心50min，弃上清，留沉淀备做包涵体变性用。具体表达情况见图4，其中A）图为具有SEQ ID NO.7氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，B）图为具有SEQ ID NO.8氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，C）图为具有SEQ ID NO.9氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，D）图为具有SEQ ID NO.10氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，E）图为具有SEQID NO.11氨基酸序列蛋白表达状况，泳道1为阴性对照，泳道2箭头所示即为目的蛋白表达情况，F）图为具有SEQ ID NO.12氨基酸序列蛋白表达状况，泳道2为阴性对照，泳道5箭头所示即为目的蛋白表达情况。由图可见以上所述蛋白均已在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。表达的蛋白经western blot及质谱分析鉴定确是目的蛋白。

（3）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的变性溶解

将上述离心后的沉淀分别用以下两种溶液各洗涤两次：

溶液A：50mM Tris-HCl,5mMEDTA,0.5M NaCl pH8.5

溶液B：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl,2M尿素,2%Triton pH8.5

将以上溶液洗涤之后，10000rpm,40min离心，弃上清留沉淀，将沉淀于以下溶液中50℃过夜溶解，变性液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl,8M尿素pH8.5。过夜溶解后于13000rpm，离心20min,取上清，进行SDS-PAGE检测包涵体蛋白变性情况。包涵体蛋白变性具体情况见图5-图7。由图可见以上所述包涵体蛋白变性溶解情况良好，且变性蛋白纯度较纯，可以进行包涵体复性研究。

（4）具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4包涵体复性

本发明中所涉及的蛋白包涵体复性方法均采用稀释复性进行，稀释复性液为：

20mM Tris-HCl，0.4M L-精氨酸，3mM还原型谷胱甘肽，0.9mM氧化型谷胱甘肽，1mMEDTA,2M尿素，pH8.5

将变性后蛋白取约15μl每隔30秒加入约200ml复性液中，并在冰浴条件下使用磁力搅拌器适当搅拌复性液，待加入合适量的变性蛋白后，冰浴条件下搅拌过夜。16h后于4℃，4100rpm,离心浓缩蛋白。浓缩后将其置换入细胞培养PBS中，4℃保存，备活性鉴定用。变性后复性蛋白具体复性情况见图5-图7。图5中泳道1、泳道2、泳道3为包涵体在包涵体溶解液中溶解情况，泳道4、泳道5、泳道6为变性蛋白在复性液中复性情况。泳道1、泳道4包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，泳道2、泳道5包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，泳道3、泳道6包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，泳道M为蛋白标准分子量；图6中其中泳道1、泳道2为包涵体在包涵体溶解液中溶解情况，泳道3、泳道4为变性蛋白在复性液中复性情况。泳道1、泳道3包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，泳道2、泳道4包含SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，泳道M为蛋白标准分子量；图7中泳道1为包涵体在包涵体溶解液中溶解情况，泳道2为变性蛋白在复性液中复性情况。泳道1、泳道2包含SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，泳道M为蛋白标准分子量。由图可见以上所述变性包涵体蛋白复性情况良好。

包涵体复性后的蛋白纯度约在90%-98%之间，可进行下一步研究。

实施例4：氨基酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.12所示的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4对HUVEC细胞增殖的影响

人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞）用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。

接下来使用MTT比色法测定实施例1-3所述方法制得的氨基酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.12所示的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4对HUVEC细胞增殖的影响。取对数生长期的细胞，以每孔约5000个细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μl，于细胞培养箱中过夜培养（约12h），待细胞贴壁后加入100μl不同浓度的重组蛋白，使其终浓度为：10μg/ml、20μg/ml阳性对照为TNP-470，负对照组加入相同体积的PBS，每组设3个复孔，分别处理48h。培养结束后4h于96孔培养板中加入5g/L的MTT液20μl，置培养箱中继续培养4h后轻轻吸去培养基，然后每孔加入DMSO150μl，震荡10min使蓝紫色沉淀充分溶解，于酶标仪490nm下测定吸光值。以上实验重复3次。实验表明如图8所示，表达的重组蛋白Tumstatin-CD137L4能很好的抑制HUVEC细胞增殖，且不同菌株之间有一定差异。

实施例6：氨基酸序列如SEQ ID NO.×至SEQ ID NO.×所示的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4对小鼠外周血T细胞增殖的影响

1.包被平板

5μg/mL抗CD3抗体（或与不同浓度人重组tumstatin-CD137L4蛋白）包被96孔板，50μL/孔，4℃过夜。

2.分离小鼠脾淋巴细胞

(1)将6～8周清洁级BALB/c小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；

(2)将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露腹膜，用眼科剪剪开腹膜，小心取出脾脏，置于盛有10mL PBS的无菌平皿中；

(3)将脾脏置于200目细胞筛上剪碎，使用玻璃注射器针芯适度研磨过滤；

(4)收集细胞悬液再缓慢过滤一次200目尼龙网，将滤液转移至离心管中，1000rpm10min收集细胞；

(5)将细胞沉淀重悬于10mL PBS中，洗涤1次，1000rpm10min；

(6)用4mL含2%FBS的PBS重悬细胞，计数，调整至10⁸个/mL。

3.富集小鼠T淋巴细胞

(1)取2mL细胞悬液至离心管中，加100μL小鼠血清，100μL

Mouse TCell Enrichment Cocktail，混匀，4℃15min；

(2)加200μL

Biotin Selection Cocktail，混匀，4℃15min；

(3)将

Magnetic Nanoparticles吹悬数次，取100μL，混匀，4℃15min；

(4)将上述离心管置于磁铁中，静置5min；

(5)倾斜离心管，将细胞悬液一次性倒出；

(6)将所得细胞计数，稀释至10⁶个/mL，100μL/孔铺板。

4.刺激T细胞增殖

加入终浓度为2μg/mL的抗CD28抗体（或与不同浓度CD137L蛋白），37℃培养箱孵育140h后加10μL AlamarBlue/孔，4h后测定A570和A600。根据如下公式计算细胞增殖率：

其中：A570和A600为不同浓度tumstatin-CD137L4蛋白或等量体积Buffer联合抗CD3和CD28单克隆抗体刺激组在570nm和600nm下的吸光度；P570和P600分别为抗CD3和CD28抗体联合刺激组（CD3+CD28）在570nm和600nm下的吸光度。

实验结果如图9所示，表明本发明重组蛋白Tumstatin-CD137L4能有效辅助抗CD3抗体刺激T细胞增殖，因而可以增强T细胞介导的获得性免疫应答。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方法，是结合具体的优选实施方法对本发明所作的进一步详细说明，不能因此理解为本发明的具体实施只局限于这些说明。除此之外，实施例仅选取了不同活性位点的tumstatin基因与CD137L胞外区相连接，不能理解为本发明中的tumstatin基因只与CD137L胞外区相连接，其也能够与其他蛋白或多肽相连接,或者不与其他蛋白基因相连接。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，对实施例做出的若干简单推演或替换，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4，其特征在于该蛋白具有tumstatin活性片段氨基酸序列和具有CD137L胞外区氨基酸序列，所述tumstatin活性片段氨基酸序列和CD137L胞外区氨基酸序列通过连接肽氨基酸序列相连接，所述tumstatin活性片段氨基酸序列选自SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列中的一种，所述CD137L胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

2.如权利要求1所述的重组蛋白Tumstatin-CD137L4，其特征在于所述连接肽氨基酸序列选自SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18。

3.如权利要求2所述的重组蛋白Tumstatin-CD137L4，其特征在于具有SEQ ID NO.7至SEQID NO.12所述的氨基酸序列。

4.编码如权利要求1-3任一项所述的Tumstatin活性的重组蛋白基因，其特征在于包括编码tumstatin活性片段的基因和编码CD137L胞外区的基因，其中所述包括编码tumstatin活性片段的基因选自SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.21中的一种，所述编码CD137L胞外区的基因选自SEQ ID NO.22。

5.如权利要求4所述的重组蛋白基因，其特征在于还包括编码连接肽的基因，选自SEQ IDNO.23或SEQ ID NO.24。

6.如权利要求5所述的重组蛋白基因，其特征在于具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6之一的核苷酸序列。

7.一种编码重组蛋白Tumstatin-CD137L4的基因，其特征在于与权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列相比具有70％及以上的同源性。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）设计得到如权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列；

（2）构建含如权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4的重组细胞；

（3）培养以上含有4-6任一项所述的核苷酸序列表达系统的重组细胞，使其表达目的蛋白；

（4）分离纯化得到如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述表达系统为原核表达系统或真核表达系统，所述原核表达系统选自大肠杆菌表达系统或芽孢杆菌表达系统；所述真核表达系统选自酵母表达系统。

10.如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力药物中的应用。

11.如权利要求4-6任一项所述的具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4基因在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力药物中的应用。

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