CN101456913B - 一种抗肿瘤融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

提供一种新型的抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤融合蛋白包括至少一个生物活性分子和卷曲螺旋结构域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改构体，所述卷曲螺旋结构域源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自根据能天然形成多聚体蛋白质的卷曲结构域进行人工合成的多肽。本发明新型融合蛋白中的卷曲螺旋结构域能天然形成稳定的3α螺旋，从而促进融合蛋白形成稳定的三聚体结构，相比于天然TNFSF10，稳定性好、利于保存，在体外对多种人体肿瘤细胞具有更显著的凋亡诱导作用，其抗肿瘤活性有明显提高。

Description

一种抗肿瘤融合蛋白及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

(二)背景技术

肿瘤坏死因子超家族(TNF superfamily，FNFSF)成员众多，空间结构相似，有不同程度的同源性。配体为II型跨膜蛋白，能以膜结合或可溶性形式发挥作用；受体为I型或III型膜蛋白，受体与配体结合，启动下游信号转导，诱导细胞生长、分化和凋亡，在组织自稳、炎症的免疫调节中发挥重要作用。

TNFSF10最初是利用与FasL、TNF的同源性从人的表达序列标签(EST)文库中发现的。与TNF超家族中的其它成员一样，TNFSF10属典型的II型跨膜蛋白，由281个氨基酸组成，分子量为32KDa。N端第15-40位氨基酸残基为疏水区，形成跨膜结构；C端(胞外区)可被金属蛋白酶从细胞膜上切下，得到具有生物学活性的可溶性分子。重组人可溶性TNFSF10蛋白在体外能诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括肺癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞以及结肠癌细胞等，而对大多数正常组织细胞则无诱导凋亡作用。

研究资料表明，TNFSF10有五种受体，包括DR4(death receptor 4 orTNFSF10-R1)、DR5(TNFSF10-R2)、DCR1(TNFSF10-R3)、DCR2(TNFSF10-R4)以及OPG(osteoprotegerin)。DR4和DR5属于TNFR超家族成员中的死亡受体，细胞内区域含有高度保守的与TNFR、Fas同源的死亡结构域(DD，death domain)，可诱导细胞凋亡；DCR1和DCR2尽管细胞外区域和死亡受体高度同源，但是细胞内区域要么结构域不完整(DCR2)，要么根本就没有(DCR1)，因此，二者均不能传导凋亡信号，被称为诱骗受体；OPG则是一种特殊受体，以分泌糖蛋白形式存在；后三种受体可通过竞争性抑制TNFSF10与死亡受体的结合来调控其诱导的细胞凋亡。

为进一步研究TNFSF10蛋白的作用机理以及在抗肿瘤药物方面的应用潜力，研究人员利用基因工程重组技术，构建了多种可溶性TNFSF10蛋白，包括含胞外区95～281位氨基酸残基的TNFSF10_95-281蛋白(SEQ IDNO：2)、含胞外区114～281位氨基酸残基的TNFSF10_114-281蛋白(SEQ IDNO：3)以及融合有标签蛋白(如His、FLAG)的TNFSF10融合蛋白。动物实验表明，重组人可溶性TNFSF10蛋白对多种移植到小鼠体内的肿瘤模型有显著疗效，且对鼠科及非人灵长类动物的正常组织器官无明显毒副作用，显示出其在抗肿瘤药物领域具有巨大的应用前景。目前，重组人可溶性TNFSF10_114-281蛋白在国内外均已进入临床研究阶段。

晶体结构显示，可溶性TNFSF10蛋白呈同源三聚体结构，一个Zn²⁺隐藏在三聚体的中心，与三个Cys230残基及一个氯原子配对，Zn²⁺的存在对维持人可溶性TNFSF10蛋白的结构和功能具有重要作用。另有研究资料表明，天然重组人可溶性TNFSF10蛋白在溶液中有多种存在形式，主要包括三聚体、二聚体以及单体，其中最主要的及活性最高的形式是同源三聚体。然而，研究表明相当一部分可溶性TNF超家族蛋白，在溶液中仅仅由细胞外区域构成的同源三聚体是不稳定的。例如，人们在比较TNFa和LT功能时就曾发现天然可溶性的TNFa三聚体在生理条件下是不稳定的；又如，人们在试图将CD40L开发成治疗药物的研究过程中发现，CD40L可溶性三聚体活性较低的重要原因之一是其在溶液中的稳定性较差。实验发现TNFSF10蛋白也存在同样的稳定性不理想的问题，这不仅影响其保存，且可能与其在动物体内的半衰期短等问题有关。

为了提高具有医疗价值蛋白质的生物学活性，包括提高单位活性、热力学稳定性、血液半衰期、保质期。人们常常对天然蛋白进行修饰。目前有多种途径可以改善药用蛋白的生物活性，一种方法是通过化学结合诸如PEG这样的试剂来提高蛋白分子量，从而提高生物学活性的方法。该法也叫PEG化，起初是为了降低免疫原性。据报道，已有多种蛋白药物进行PEG化。另一种方法是将目标蛋白和人血清白蛋白(HA)融合，形成一特殊氨基酸序列。专利WO01/79840就是用这种方法来提高hGH蛋白稳定性和半衰期，据报道其生物学活性提高是由hGH-HA融合蛋白稳定性增加造成的。

(三)发明内容

本发明目的是提高TNFSF10蛋白稳定性和抗肿瘤活性，提供一种新型的抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种抗肿瘤融合蛋白，包括至少一个生物活性分子和卷曲螺旋结构域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改构体，所述卷曲螺旋结构域源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自根据能天然形成多聚体蛋白质的卷曲结构域进行人工合成的多肽。

所述生物活性分子源自TNFSF10，是指所述生物活性分子可为TNFSF10的全部或部分氨基酸序列的片段(尤其是胞外多肽片段，优选为95～281或114～281位的多肽片段)，所述“改构体”指相对于原始TNFSF10的全部或部分多肽序列，仅涉及单个或多个氨基酸的点突变，突变后多肽的功能发生了变化，但主要的序列和结构未发生明显改变。

这里的TNFSF10蛋白是按照TNF超家族(TNFSF)统一命名法则得来的，其序列如SEQ ID NO：1所示。

所述卷曲螺旋结构域，是一种能与其它类似或相同的卷曲螺旋相互作用的肽、多肽。这里的相互作用是指能形成多肽或蛋白质多聚体的类型，这种相互作用是由多聚体结构域之间的共价健、氢键、疏水作用、范得华力以及盐桥等作用力共同作用形成的。卷曲螺旋(coiled coil)是存在于多种天然蛋白质中的结构模式，卷曲螺旋的一个共同特点是在它们的一级结构中含有多个重复的由7个氨基酸组成的“七肽单元”(abcdefg)。每个单元中的a、d位多为非极性疏水氨基酸残基，如亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)等，这些位置的氨基酸残基特异性地位于卷曲螺旋结构的内侧；e、g位多为极性带电氨基酸，如赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)等，这些氨基酸残基位于a、d位氨基酸残基相互作用所形成的疏水核心的外侧。卷曲螺旋结构域能天然形成稳定的二聚体、三聚体、多聚体。

本发明人发现，将至少一个TNFSF10多肽分子和卷曲螺旋结构域融合而构成的抗肿瘤融合蛋白，其生物学活性有明显提高。因此本发明为肿瘤治疗提供另一种潜在的可供选择的新型抗肿瘤融合蛋白。

所述“生物活性提高”包括根据本发明生产的融合蛋白比天然TNFSF10蛋白具有更高的抗肿瘤活性。

所述“生物活性提高”也包括比天然TNFSF10蛋白具有更高的热力学稳定性、制备过程抗理化因素影响能力较强、具有更长的保质期等。

所述“生物活性提高”还包括几种功能的结合，例如，新型抗肿瘤融合蛋白抗肿瘤活性提高的同时，稳定性也有明显提高。可以预料，本发明提供的融合蛋白与天然TNFSF10蛋白相比，血液半衰期也将会延长、有效用药量将会减少。

优选的，所述生物活性分子为具有下列氨基酸序列的多肽之一：①SEQ ID NO：1(TNFSF10)；②SEQ ID NO：2(TNFSF10_95-281)；③SEQ IDNO：3(TNFSF10_114-281)。

优选的，所述卷曲结构域源自人肺表面活性蛋白D(Surfactant Protein D)，或者源自根据人肺表面活性蛋白D的卷曲结构域人工合成的多肽。所述卷曲螺旋结构域还可以来源于其它能天然形成多聚体的蛋白质，包括tetranectin、collectin等蛋白家族中的卷曲螺旋结构域。

优选的，所述卷曲结构域为具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽或其改构体。所述“改构体”指相对于SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，仅涉及单个或多个氨基酸的点突变，突变后多肽的功能发生了变化，但主要的序列和结构未发生明显改变。

优选的，所述卷曲螺旋结构域来自人SPD蛋白中的卷曲螺旋结构，简称SPDcc。该结构域能形成三聚化的α螺旋卷曲螺旋结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所述。该卷曲螺旋的三聚化作用是通过一个SPDcc中的卷曲螺旋和另外两个SPDcc中的卷曲螺旋形成3α螺旋三聚体，该三聚体出人意料的在相对较宽的pH条件下仍很稳定。术语SPDcc也可指SPD蛋白家族中天然卷曲螺旋的改构体，包括不损害其形成α螺旋三聚体能力、在氨基酸序列上有变化的改构体。由此，本发明中的融合蛋白可以包含SPD中的卷曲螺旋结构域，具有氨基酸序列同SEQ ID NO：4至少有72％同源的多肽，优选79％，进一步优选85％，更优选95％，最优选为99％。

优选的，所述卷曲结构域为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列编码的多肽。

优选的，所述抗肿瘤融合蛋白具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。在已知其氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可按照本领域常规方法方便的合成所需要的融合蛋白、达到相应技术效果。

优选的，所述抗肿瘤融合蛋白为SEQIDNO：7所示核苷酸序列编码的多肽。

生物活性分子连接于所述卷曲螺旋结构域的N端或C端，所述生物活性分子与所述卷曲螺旋结构域之间可通过柔性连接链共价连接，所述连接链为1～20个氨基酸组成的多肽，优选连接链为2～10个氨基酸残基，更优选为3～7个氨基酸残基。连接链在本质上是无免疫原性的，不易被蛋白酶水解以及不含易与其它残基发生作用的氨基酸(如Gly)。优选的，连接链不损害连接蛋白的功能，或至少不明显损害连接蛋白中的一种蛋白功能。更加优选的连接链被用于连接包含卷曲螺旋结构的蛋白。

下面是连接链的实例，据信这些连接链适合TNFSF10蛋白与卷曲螺旋结构域之间的连接。

基于Fibronectin的连接链：优选的氨基酸序列为：PGTSGQQPSVGQQ，对应于Fibronectin第2037-2049位氨基酸残基，更加优选的片断为GTSGQ，对应第2038-2042位氨基酸残基。这种构建的优点是公认对蛋白酶水解具有很强抗性，同时因为Fibronectin在血液中浓度高，因此被认为不会产生很高的免疫原性。

基于人IgG3铰链上面部分的连接链：来源于IgG3铰链区上面部分的10个氨基酸残基，PKPSTPPGSS，已被应用于通过卷曲螺旋形成二聚体的抗体。该序列被认为在人体中不会产生免疫原性。

可能的连接链还包括SGGTSGSTSGTGST、AGSSTGSSTGPGSTT或GGSGGAP。这些序列以前已被应用于卷曲螺旋和其它蛋白结构域之间的连接。

本发明融合蛋白可按照本技术领域常规方法进行制备，具体为：利用基因工程技术将具有生物学活性的多肽或蛋白与卷曲螺旋结构域重组为一特殊氨基酸序列，其中所述的卷曲螺旋结构域能天然形成稳定的3α螺旋，从而促进并维持整个新型融合蛋白形成稳定的三聚体或多聚体结构。

具体的，本发明提供了一种新型抗肿瘤融合蛋白的制备方法，即将编码人肺表面活性蛋白卷曲螺旋结构域的核苷酸序列和编码TNFSF10细胞外114～281位氨基酸序列的cDNA以及一个哺乳动物蛋白基因表达载体连接起来，转化或转染到宿主细胞，然后通过发酵培养制得，该融合蛋白命名为SPDcc-TNFSF10，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

所述“载体”是指能在宿主细胞中扩增的任何核酸实体。因此，该载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，该载体可以是导入宿主细胞时整合进宿主细胞基因且与其所整合的染色体一起复制的载体。载体的选择通常取决于其将要导入的宿主细胞。载体包括，但不限于质粒、噬菌体、病毒或粘粒。

所述“宿主”包括细菌、酵母以及高等动物和植物细胞。

本发明中“肽”、“多肽”和“蛋白质”在全文可以相互交换使用。本发明所述的多肽的氨基酸位点序列号遵循天然完整蛋白的常规序列计数方法。

本发明还涉及所述的抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。所述应用包括用根据本发明提供的抗肿瘤融合蛋白即多肽复合物治疗哺乳动物疾病以及作为治疗药物的一种成分。

经实验验证，本发明提供的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10蛋白在体外的稳定性明显优于天然TNFSF10。

经实验验证，本发明提供的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10蛋白在体外对多种人体肿瘤细胞具有显著的凋亡诱导作用，且其抗肿瘤活性明显优于天然TNFSF10。具体的，本发明提供的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10蛋白对接种于裸鼠体内的人结肠癌(HCT-8)具有明显地肿瘤生长抑制作用，且其抗肿瘤效果优于天然TNFSF10。剂量为10mg/kg的SPDcc-TNFSF10蛋白的抗肿瘤活性与30mg/kg的天然TNFSF10相当。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种新型融合蛋白，其中卷曲螺旋结构域能天然形成稳定的3α螺旋，从而促进融合蛋白形成稳定的三聚体结构，相比于天然TNFSF10，稳定性好、半衰期长、利于保存，在体外对多种人体肿瘤细胞具有更显著的凋亡诱导作用，其抗肿瘤活性有明显提高。

(四)附图说明

图1为pET-28a-SPDcc-TNFSF10质粒的酶切鉴定；其中M表示Marker，1表示没有酶切的pET-28a-SPDcc-TNFSF10质粒，2表示双酶切后的pET-28a-SPDcc-TNFSF10质粒。

图2为新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白制备及纯度分析。其中M表示蛋白Marker，1诱导前菌体总蛋白；2表示诱导6h后菌体总蛋白；3～6表示纯化过程中的SPDcc-TNFSF10融合蛋白；7表示纯化后的SPDcc-TNFSF10融合蛋白，经Bio-red凝胶成像分析软件分析，其纯度为96.2％(上样量30ug，考马斯亮兰染色)。

图3稳定性比较。正方形和圆形曲线分别代表SPDcc-TNFSF10和天然TNFSF10，纵坐标表示在4℃保存不同时间后溶液上清残余蛋白浓度。

图4为不同肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性比较。图4A：HL-60，图4B：A549，图4C：HCT-8；正方形和圆形曲线分别代表SPDcc-TNFSF10和天然TNFSF10，横坐标表示加入样品的浓度，纵坐标表示样品加入后作用72h的抑瘤率。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：一种新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白基因工程菌的构建

按大肠杆菌密码子偏好性人工合成编码人SPD蛋白N端221～252位氨基酸序列的核苷酸序列(见SEQ ID NO：8)，其5’端包含一个NcoI酶切位点和一个起始氨基酸Met的序列，3’端包含编码TNFSF10胞外114～118位氨基酸序列的核苷酸序列。

设计引物扩增SPDcc-TNFSF10融合序列(见SEQ ID NO：9)，引物为：

P1：5’AAAATTCCATGGTTGCTTCTCTGCGT

P2：5’ACCTCTTTCTCTCACAGGGAACAACTCA

P3：5’TGAGTTGTTCCCTGTGAGAGAAAGAGGT

P4：5’CGCCCGAATTCTTAGCCAACTAAAAA

利用重叠PCR技术扩增SPDcc-TNFSF10融合序列，即先以人工合成的人SPD螺旋结构域(见SEQ ID NO：8)为模板，用P1、P2扩增SPD螺旋结构域序列；再以pET-28a-TNFSF10为模板，用P3、P4扩增TNFSF10cDNA片断。将扩增得到的片段割胶回收，然后以回收得到的两个从cDNA片断为模板、以P1、P4为引物扩增融合序列。

融合序列的5’和3’端分别包含Nco I和Eco R I酶切位点。融合序列和原核表达载体pET-28a经酶切、回收、连接后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性转化克隆，抽提质粒，经双酶切、DNA测序等方法鉴定，得到阳性重组表达载体质粒pET-28a-SPDcc-TNFSF10，(图1，图1为pET-28a-SPDcc-TNFSF10质粒的鉴定)。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达SPDcc-TNFSF10融合蛋白的工程菌。挑取大量单菌落，经诱导、筛选，最终得到一株稳定的、表达量高的工程菌，命名为pET-28a-SPDcc-TNFSF10-BL21(DE3)。

实施例2：新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白的制备

发酵培养基组成：

甘油              2.5mL

蛋白胨            10g

酵母提取物        5g

NaCl              5g

K₂HPO₄            4g

KH₂PO₄            2g

Na₂HPO₄           7g

MgSO₄.7H₂O        1g

泡敌(GPE)         1.5mL

自来水定容至1L。

发酵培养过程：

种子培养：取-80℃保存的pET-28a-SPDcc-TNFSF10-BL21(DE3)工程菌保藏液1支，从中挑取1环，划线至含Kan(Kan)的LB平板，37℃培养过夜。次日挑取一个边缘整齐、生长良好的单菌落接种到含50μg/mLKan的LB液体培养基中，培养基装量为摇瓶的20％，摇床转速200rpm，37℃培养12h。

罐上发酵：按1:50接种量将过夜培养物接种到含3.5L发酵培养基的NBS Bioflo110发酵罐中发酵，37℃培养至OD600达到0.6～0.8左右后，加IPTG至终浓度为1mM诱导表达，同时添加ZnSO4至终浓度为80uM。继续培养6h放罐。中途补料约200mL25％(v/v)甘油、150mL17％(w/v)的酵母提取物和150mL17％(w/v)的蛋白胨，发酵过程中pH控制在7.0、溶氧控制在50％。

每升发酵液可得50～80g湿菌体，目标蛋白的表达量占菌体总蛋白的50％以上。将100g菌体用10倍体积的50mM Tris-HCl(pH7.0)破壁缓冲液悬浮，超声破碎，离心、去除沉淀。上清先用0.45uM膜过滤，再用3KDPall超虑膜超虑至200ml，用200ml50mM PB(pH6.4)稀释后继续超虑至200ml，重复上述步骤直至溶液pH达到6.4为止。将超虑后的样品上到已用50mM PB(pH6.4)缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，待样品上完后分别用50mM PB(pH6.4)和50mM PB(pH6.4)+300mM NaCl两种缓冲液清洗去杂，然后用50mM PB(pH6.4)+600mM NaCl缓冲液将目标蛋白洗脱下来。往SP柱洗脱样品缓慢添加硫酸铵至60％饱和度，4℃静置2h，10000rpm离心20min，去上清；蛋白沉淀用20mMPB(pH7.5)重悬，用0.45uM膜过滤后，分多次上到已用同样缓冲液平衡好的Superdex75分子筛上，收集洗脱峰。通过上述纯化步骤得到的新型重组人可溶性TNFSF10-SPD融合蛋白(见SEQ ID NO：5)电泳纯度达96.2％(见图2，图2为新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白制备及纯度分析)。

实施例3：稳定性比较

将天然TNFSF10蛋白和实施例2得到的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白分别用20mM PBS(pH7.4)稀释到3mg/ml，用0.2μm膜过滤除菌后，置于4℃冰箱中保存。分别于不同时间取样，10000rpm离心20min，测上清中残余的蛋白浓度。结果(图3，稳定性比较)表明，天然TNFSF10蛋白在4℃保存一天后，浓度由3mg/ml快速降到1.3mg/ml，而新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白在整个实验观察期内蛋白浓度无明显变化。表明添加SPD蛋白螺旋结构域后，TNFSF10蛋白稳定性在4℃中有显著提高。

实施例4：体外生物学活性

将对数生长期的肿瘤细胞(人白血病细胞HL-60，人肺癌细胞A549以及人结肠癌细胞HCT-8)，用0.25％胰酶消化后，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，吹打细胞使形成细胞悬液，计数，以1×10⁵cell/ml重新接种于96孔细胞培养板，100μl/孔。同时加入对倍连续稀释的实施例2得到的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白。37℃培养72小时后，弃上清加入MTT，继续孵化6小时，加入DMSO，振荡10分钟，用酶标仪测570nm处的OD值。结果(图4，图4为体外抗肿瘤活性比较)显示二者对不同肿瘤细胞的生长均有一定程度的抑制作用，并呈剂量依赖性。虽然对细胞生长的抑制效果和肿瘤类型有关，但是SPDcc-TNFSF10的抗肿瘤效果均明显强于天然TNFSF10。SPDcc-TNFSF10抑制50％人白血病细胞HL-60生长所需的浓度只需约1ng/ml，而天然TNFSF10则需要10ng/ml左右。

实施例5：体内动物实验

无菌条件下取生长旺盛的人体肠癌HCT-8体内第三代肿瘤模型，采用插块法约2mm³肿瘤组织/鼠，异种移植于T细胞免疫缺陷裸小鼠右腋皮下，裸小鼠置于层流架中饲养，所用的饲料、垫料、笼具及接触的器械等均应高压消毒后使用。待肿瘤生长至50～70mm³后(肿瘤接种后7天)，开始给药：空白对照(生理盐水，连续给药10天)、实施例2得到的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10(30、10mg/kgiv连续10天)以及阳性对照天然TNFSF10(30、10mg/kg iv连续10天)。其间每3～5天体外对肿瘤(以卡尺测量肿瘤长径a、短径b，肿瘤体积＝a×b2)进行动态测量。结果显示SPDcc-TNFSF10分别给药30和10mg/kg静脉注射连续给药10天后，人体肠癌HCT-8异种移植于T细胞免疫缺陷裸小鼠模型的相对肿瘤增长率分别为22.97％和30.07％；而天然TNFSF10分别30mg/kg和10mg/kg静脉注射连续给药10天后，相对肿瘤增长率分别38.22％和64.22％，表明SPDcc-TNFSF10体内抗肿瘤效果明显优于天然TNFSF10。

序列表_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>一种抗肿瘤融合蛋白及其应用

<130>

<160>9

<170>PatentIn version3.4

<210>1

<211>281

<212>PRT

<213>Human astrovirus

<400>1

<210>2

<211>187

<212>PRT

<213>Human astrovirus

<400>2

<210>3

<211>168

<212>PRT

<213>Human astrovirus

<400>3

<210>4

<211>32

<212>PRT

<213>Human astrovirus

<400>4

<210>5

<211>200

<212>PRT

<213>Human astrovirus

<400>5

<210>6

<211>96

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工合成

<400>6

<210>7

<211>600

<212>DNA

<213>Human astrovirus

<400>7

<210>8

<211>118

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>8

<210>9

<211>632

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>9

Claims (3)

1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于所述抗肿瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：5所示。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于所述抗肿瘤融合蛋白为SEQID NO：7所示核苷酸序列编码的多肽。

3.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

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