CN102690353B - 肿瘤坏死因子受体ⅱ-脂联素球部融合蛋白改构体快速筛选方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明改构了可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-“脂联素”球部重组融合蛋白的基因序列，去除了肿瘤坏死因子受体Ⅱ和“脂联素”球部基因间的冗余序列，共去除18个氨基酸，形成了只含有可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ和“脂联素”球部的新的基因；并合成了改造后的基因在哺乳动物细胞中表达的偏爱密码子。经过比较，改构后的基因表达的蛋白更加稳定，优化的密码子在哺乳动物细胞中表达效率提高约4-6倍。本发明还建立了一种快速大量获得蛋白的腺病毒/BHK21表达系统，该表达系统的生产规模易于放大，适应无血清培养，可以反复多次收获目标蛋白，成功制备了有生物学活性的改造后的融合蛋白。

Description

肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白改构体快速筛选方法及其应用

 技术领     域本发明属于生物技术领域，为基因工程重组蛋白的应用。具体涉及肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白及其基因的人工重组改构和密码子优化，以期获得该重组蛋白更好的生物学效应、更高的稳定性及在哺乳动物细胞中更高效的表达产量。为此，本发明同时建立了一种利用腺病毒载体/BHK21细胞系统来表达改构体的方法。目的是将其做为一种技术手段，以便于快速筛选出活性更高、结构更稳定的肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的各种改构体。

 背景技     术类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)作为危害人类健康最常见、最难治愈的免疫疾病之一，严重影响着患者的生活质量，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因。我国现有该病患者2000万人，包括中重度活动性患者约400多万。类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，传统的综合治疗方法针对炎症及后遗症采取措施缺乏显著疗效，并且长期使用易引起严重的副作用。临床表现为多处关节滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。该病在世界范围内普遍存在，其发病率约占人群的1％-2％。因此，类风湿性关节炎已成为危害人类健康最常见、最难治的疾病之一(Toussirot Eand Wendling D.The use of TNF-alpha blocking agents in rheumatoid arthritis：an update.ExpertOpin Pharmacother.2007，8(13)：2089-2107)。

研究发现，TNFα在类风湿性关节炎的发生中起着重要作用。如：过度表达TNFα的转基因小鼠会发生侵蚀性、炎性关节炎(Keffer J，Probert L，Cazlaris H，et al.Transgenic miceexpressing human tumour necrosis factor：a predictive genetic model of arthritis.EMBO J.1991，10(13)：4025-4031)；在RA的动物模型中，胶原诱发的关节炎、佐剂诱发的关节炎等，用TNFα阻滞剂治疗可明显减轻关节的炎症与破坏；在RA患者的滑液中发现TNFα的表达量高于正常人等等(Saxne T，Jr Palladino MA，Heinegard D，et al.Detection of tumor necrosis factoralpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum.ArthritisRheum.1988，31(8)：1041-1045.)。因此去除过多的TNFα成为治疗类风湿性关节炎的目标之一(Brennan FM，Chantry D，Jackson A，et al.Inhibitory effect of TNF alpha antibodies on synovialcell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet.1989，2(8657)：244-247)。

TNFα拮抗剂作为治疗类风湿性关节炎的新型药物在缓解疼痛、改善和维持关节功能上有着明显的功效，得到了医学界的广泛重视，已成为目前治疗该病的研究热点。目前已开发的TNFα拮抗剂主要有Infliximab、Adalimumab和Etanercept三种(Landry Y and Gies JP.Drugsand their molecular targets：an updated overview.Fundam Clin Pharmacol.2008，22(1)：1-18)。其中Infliximab为嵌合性的抗TNFα抗体，Adalimumab为人源化的抗TNFα抗体，这两种抗体均能分别与TNFα结合，并均能因此中和TNFα而获得拮抗TNFα的作用。而Etanercept为TNFα的受体，也能与TNFα结合，产生拮抗TNFα的作用。

肿瘤坏死因子(TNF)的受体分为TNFRI(TNF receptor I，TNFRβ，p55)和TNFRII(TNF receptor II，TNFRα，p75)两种(Loetscher H，Schlaeger EJ，Lahm HW，et al.Purificationand partial amino acid sequence analysis of two distinct tumor necrosis factor receptors from HL60cells.J Biol Chem.1990，265(33)：20131-20138)。

TNFRI是分子量为50kD的I型跨膜蛋白，主要在除了红细胞外的所有细胞表达，其蛋白前体编码455个氨基酸，在剪切掉29个氨基酸的信号肽后成为为426个氨基酸的成熟TNFRI。成熟的TNFRI蛋白包括胞外区N端182个氨基酸，跨膜区21个氨基酸和胞浆内C端含223个氨基酸三部分。胞外区部分有3个潜在的糖基化位点，蛋白的理论的分子量为47.5kD(Rothe J，Gehr G，Loetscher H，et al.Tumor necrosis factor receptors--structure andfunction.Immunol Res.1992，11(2)：81-90)。

TNFRII分子量为75kD，主要在免疫细胞和内皮细胞表达，其cDNA编码439个氨基酸，包括跨膜区26个氨基酸，胞外区235个氨基酸和胞内区178个氨基酸。TNFRII胞外区有2个糖基化位点，蛋白理论的分子量为50kD(Schall TJ，Lewis M，Koller KJ，et al.Molecularcloning and expression of a receptor for human tumor necrosis factor.Cell.1990，61(2)：361-370)。

可溶性TNF受体(soluble TNF receptor，sTNFR)是TNFR受体胞外区部分脱落下来形成的，不再参与信号的传导，但能与TNF结合，可以中和TNF的活性(Rothe J，Gehr G，Loetscher H，et al.Tumor necrosis factor receptors--structure and function.Immunol Res.1992，11(2)：81-90)。

sTNFRII是TNFα的天然拮抗剂(Fernandez-Botran R.Soluble cytokine receptors：novelimmunotherapeutic agents.Expert Opin Investig Drugs.2000；9(3)：497-514)。然而研究表明，成熟的TNFα以三聚体(trimer)形式存在(Jones EY，Stuart DI and Walker NP.Structure of tumournecrosis factor.Nature.1989，338(6212)：225-228)。显而易见，增强sTNFRII与TNFα间的亲和力可以通过sTNFRII的三聚体化来实现。

Etanercept是sTNFRII与IgG的Fc段形成的二聚体化(dimer)的融合蛋白(即sTNFRII-Fc融合蛋白)。此融合蛋白不仅延长受体在体内的半衰期，并且借助于Fc的二聚化作用使融合蛋白形成同源二聚体，相比可溶性的sTNFRII单体更能有效地抑制TNFα。它用于治疗类风湿性关节炎，能有效缓解疼痛，防止或明显降低关节结构的破坏，从而改善并维持关节功能。Etanercept拮抗TNFα的能力是相应sTNFR II单体的50-1000倍(Mohler KM，Torrance DS，Smith CA，Goodwin RG，Stremler KE，Fung VP，Madani H，Widmer MB.Soluble tumor necrosisfactor receptors are effective therapeutic agents in lethal endotoxemia and function simultaneouslyas both TNF carriers and TNF antagonists.J Immunol.1993；151：1548-61)。

另外，有研究报道将T4的Fibritin E与HIV-1的外膜糖蛋白gp140结合，可以形成稳定的同源三聚体，它的耐热性和抗还原性比用GCN4修饰的三聚体更稳定(Yang X，Lee J，Mahony EM，et al.Highly Stable Trimers Formed by Human Immunodeficiency Virus Type 1Envelope Glycoproteins Fused with the Trimeric Motif of T4 Bacteriophage Fibritin.J Vriol2002，76(9)，4634-4642)。

T4噬菌体是一种有尾噬菌体，由头部和尾部组成，头部和尾部通过颈部相连。颈部由6条短的纤维状物质Fibritin形成项圈样复合物。Fibritin是一种52KD的同型三聚体，研究发现Fibritin有一系列的突变体，Fibritin E就是其中的一种突变体，为同型三聚体，包括N端结构域，中间不连续的卷曲螺旋结构和C端折叠结构域。每个亚基由Fibritin的最后119个氨基酸组成。利用Fibritin E C端27个氨基酸(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)，靠β折叠之间的疏水作用和极性作用(氢键)形成三聚体(Tao YZ，Strelkov SV，etal.Structureof bacteriophage T4 fibritin：a segmented coiled coil and the role of the C-terminal domainstructure 19975(6)：789-798)。

脂联素(adiponectin，AD)是新发现的一种脂肪细胞表达的细胞因子，它以内分泌方式循环于血液中，参与调节葡萄糖、脂肪酸代谢及抵抗炎症反应等生命活动。

脂联素是脂肪特有基因apM1(adipose most abundant gene transcript 1)的编码产物，该基因位于染色体3q27(Saito K，Tobe T，Minoshima S，et al.Organization of the gene forgelatin-binding protein(GBP28).Gene.1996，229：67-73)。脂联素只在脂肪组织中表达，它由244个氨基酸组成，包含4个结构域：N端氨基酸为分泌信号肽，之后为一个特异的超变量序列，胶原样重复序列，C端为补体C1q样球形结构域(Hu E，Liang P，Spiegelman BM.AdipoQ isa novel adipocyte specific gene dysregulated in obesity.J.Biol.Chem.1996，271：10697-10703)。

脂联素属于可溶性胶原蛋白超家族，与胶原蛋白Ⅷ，Ⅹ和补体C1q结构相似，还与肿瘤坏死因子超家族(TNF)有高度同源性(Shapiro L，Scherer PE.The crystal stucture of acomplement-1q family protein suggests an evolutionary link to tumor necrosisfactor.Curr.Biol.1998，8：335-338)。脂联素球部(gAD)为脂联素在蛋白酶裂解作用下产生，是全长脂联素的羧基端部分，可以在体内相互结合形成三聚体的形式(Shapiro L，Scherer PE.The crystal structure of a complement-1q family protein suggests an evolutionary link to tumornecrosis factor.Curr Biol.1998，8(6)：335-338)。

脂联素在发现之初就确定其作用与胰岛素相关(Scherer PE，Williams S，Fogliano M，et al.Anovel serum protein similar toC1q，produced exclusively in adipocytes.J.Biol.Chem.1995，270：26746-26749)，并参与调节能量的平衡，包括营养的吸收，碳水化合物和脂类的代谢。此后的研究也证实了这一点，认为脂联素是由脂肪细胞特异性分泌的一种蛋白类激素，可以增加机体对胰岛素的敏感性，参与人体多种代谢过程；相比其他激素，它在血液中的含量比较丰富，但在肥胖和Ⅱ型糖尿病病人血液中含量减少(Ukkola O，Santaniemi M.Adiponectin：a link between excess adiposity and associated comorbidities？J.Mol.Med.2002.80：696-702)。Yokota等发现脂联素在造血和免疫防御方面的作用：抑制骨髓单核细胞系的分化，抑制吞噬细胞的吞噬作用以及抑制脂多糖诱导产生的TNF-α(Yokota T，OritaniK，Takahashi I，et al.Adiponectin，a new member of the family of soluble defensecollagens，negatively regulates the growth of myelomonocytic progenitors and the functions ofmacrophages.Blood.2000，96：1723-1732)。动物和人类研究都以证实脂联素与血管内皮细胞间的密切联系，它可以促进内皮依赖的血管舒张，抑制动脉粥样硬化，抑制血管粘附分子受体的表达(Ouchi N，ohishi M，Kihara S，et al.Association of Hypoadiponectinemia With ImpairedVasoreactivity.Hypertension.2003，42：231-234)。因此推断，脂联素具有抗炎，抗糖尿病，抗动脉粥样硬化的作用，它积极的参与了人体的多种生理过程，如能量代谢，机体对胰岛素敏感性，免疫反应和脉管系统的稳态等。

在中国专利(专利号ZL200510100468.9)中，我们提出了通过构建脂联素胶原状区域和球状结构域与sTNFRII融合基因的策略来获得三聚体化的sTNFRII，即sTNFRII-gAD重组蛋白。该专利是利用了脂联素球部自动形成三聚体的特性而设计的，结果证明获得的三聚体化sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性将比二聚体化sTNFRII-Fc更高。然而，由于原核表达的蛋白容易形成包涵体(Nash PT and Florin TH.Tumour necrosis factor inhibitors.Med J Aust.2005，183(4)：205-208)，需要变复性，不能对蛋白质进行翻译后修饰，因此获得有活性的蛋白效率较低。因此本发明涉及用哺乳动物表达系统来制备目的蛋白。

发明概述     本发明是中国专利(专利号ZL200510100468.9)的进一步延伸。具体地，本案去除了原基因结构中sTNFRII和gAD之间的酶切位点和胶原的基因序列，共计18个碱基，编码6个氨基酸，使其三聚体化的表达产物获得更高的稳定性；并且将改造后的基因进行了密码子优化，使其在哺乳动物细胞中更高效的表达。这样，经过改造的基因表达出的融合蛋白具有更好的稳定性和生物学活性。为了快速和大量的制备融合蛋白，建立了一种利用腺病毒载体/BHK21细胞系统来表达改构体的方法。在证明了腺病毒可以感染哺乳动物细胞BHK-21/c022后，我们构建了三种携带目的基因的质粒载体，然后用AdMax腺病毒载体系统制备携带上述融合基因的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD，rAd5-sTNFRII-gAD-new和rAd5-sTNFRII-gAD-opti。将这三种腺病毒分别以MOI为1000感染BHK-21/c022细胞，获得的上清经western blotting检测这三种蛋白的表达效率和热稳定性。最后，我们用MOI为100的腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD-opti感染转瓶里的细胞，多次收集上清以大量制备蛋白sTNFRII-gAD-opti。利用纯化出的蛋白sTNFRII-gAD-opti分析超速离心和进行生物大分子之间的相互作用，比较这种蛋白和未改构的蛋白sTNFRII-gAD之间的生物学活性。

发明详述     本发明是中国专利(专利号ZL200510100468.9)的进一步延伸。

首先，为了进一步提高重组蛋白sTNFRII-gAD(序列见专利ZL200510100468.9)的稳定性，增加三聚体蛋白的含量，我们对原专利(ZL200510100468.9)中描述的原专利中sTNFRII-gAD融合蛋白的基因进行了改造：去除冗余序列。在设计上去掉融合基因中脂联素的胶原区和连接部位的酶切位点，一共18个碱基，具体为aagcttcctggagaaggt，其编码的6个氨基酸的相应的氨基酸序列为Lys-Leu-Pro-Gly-Glu-Gly，其中Lys-Leu为Hind III位点，Pro-Gly-Glu-Gly为脂联素的胶原区蛋白。这样操作处理后，融合蛋白的氨基酸数量由原来的400个变成本案的394个。用重叠延伸PCR方法(见实施例1)获得了只含有sTNFRII基因和脂联素球部基因的新的融合基因sTNFRII-gAD-new，基因序列见(SEQ ID NO.1)。氨基酸序列见(SEQ ID NO.2)。这样做可以使其三聚体化的表达产物获得更高的稳定性。

此外，本发明还将原专利中的原核表达系统改换成哺乳动物表达系统。为了提高融合蛋白的表达水平，适应哺乳动物细胞的表达特点，我们按照哺乳动物细胞中表达的偏爱密码子合成了改构后的蛋白的编码基因，将这个优化后的基因称为sTNFRII-gAD-opti，基因序列见(SEQ ID NO.3)。

目前，利用哺乳动物表达系统生产高生物学活性的蛋白是获得重组蛋白最为广泛的方式。其中应用最普遍的是CHO/dhfr-表达系统。CHO细胞很少分泌内源蛋白，这比较有利于外源蛋白的表达和分离纯化。而且，这样表达的外源蛋白能最大限度地保持天然的空间结构和生物学活性。所以CHO表达系统常用于长期稳定表达重组蛋白(Mary P.Rossera，Wei Xiab，Steven Hartsellc，et al.Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension：a rapid mammalian protein expression system.Protein Expression and Purification.Volume 40，Issue 2，April 2005，Pages 237-243)。这样的策略的不利方面是，为获得高效、稳定表达重组蛋白的CHO细胞株，需要进行漫长的CHO细胞株加压过程，不能满足短期快速得到蛋白纯品的要求。

本研究采用了BHK-21/c022株细胞作为重组蛋白的生产细胞。BHK-21/c022细胞是我们从BHK21细胞中单克隆化挑选并且无血清驯化的悬浮适应细胞株，具有生长迅速，适应性强，抗凋亡能力强，既可以在含有血清的培养液中贴壁生长，又可以在无血清的培养液中悬浮生长等特点。(见实施例7)。

为了比较sTNFRII-gAD、sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti三种融合基因表达产物的生物学特性和表达水平，本案建立了一种重组5型腺病毒载体/BHK-21/c022细胞表达系统，用于快速表达和制备融合蛋白。该表达系统的特点是腺病毒表达载体系统安全性好、高效感染哺乳动物细胞、高效表达外源基因，感染的细胞在不需要转染和加压筛选的情况下能高效而长时间的表达外源基因，有利于快速制备目的蛋白。

为了获得携带目的蛋白基因的腺病毒，我们将3种基因(sTNFRII-gAD、sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti等基因)分别插入腺病毒穿梭质粒pDC316(Microbix公司)中，构建成pDC316-sTNFRII-gAD、pDC316-sTNFRII-gAD-new和pDC316-sTNFRII-gAD-opti(见实施例3)。

然后我们用AdMax腺病毒载体系统制备携带上述融合基因的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD、rAd5-sTNFRII-gAD-new和rAd5-sTNFRII-gAD-opti(见实施例4)。

腺病毒载体最多见用于基因治疗和疫苗研究中，也有报道用腺病毒载体感染HEK293细胞来制备重组蛋白(Invitrogen公司)。用复制缺陷型5型腺病毒感染HEK293细胞过程中，不仅重组腺病毒能高效复制和产生子代病毒，外源基因也得到高效表达。但是对于制备重组蛋白而言，重组腺病毒的高效复制和子代病毒的产生有2个方面的缺陷：1)生产细胞会因病毒大量复制而出现细胞病变(CPE)，因此只能一次性感染收获上清；2)腺病毒复制产生大量的病毒自身蛋白和子代病毒对于下游纯化是多余的“杂质”，因而对于生产细胞而言也是不必要的额外负担。因此本发明利用不能支持E1缺陷的重组腺病毒复制的细胞BHK-21/c022作为生产细胞，建立了重组腺病毒/BHK21表达系统。

首先，我们用携带EGFP报告基因的重组腺病毒rAd5-EGFP感染BHK-21/c022细胞，检测了感染复数与表达水平的关系(见实施例6)。结果表明随着腺病毒用量(MOI)的增高，表达EGFP蛋白的BHK-21/c022细胞数量和亮度明显增加；MOI在0至100之间被感染的BHK-21/c022细胞未表现出明显的细胞毒性，MOI为1000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。

在证明了BHK-21/c022可以被腺病毒高效感染后，我们用腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD、rAd5-sTNFRII-gAD-new和rAd5-sTNFRII-gAD-opti以MOI为1000感染BHK-21/c022细胞，换成无血清培养液后48小时收取上清。为了比较三种蛋白的表达水平，我们将三种蛋白做western blotting分析(见实施例8)。通过比较，我们看出经过密码子优化后的基因sTNFRII-gAD-opti表达的蛋白水平明显提高，大约4～6倍。经过优化的基因有助于表达效率的提高。

为了比较三种蛋白的热稳定性，将三种蛋白置于37℃水浴中72小时，之后再经过westernblotting分析，结果未经改造的融合蛋白出现了降解，即sTNFRII-gAD在sTNFRII和gAD在连接处出现断裂(sTNFRII抗体检测出一条降解条带，见图7)，经过改造的sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti则没有见到降解的条带。说明改构的蛋白sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti的热稳定性明显高于未改构的sTNFRII-gAD。

虽然腺病毒MOI为1000时蛋白的产量高，但是对细胞的伤害较大，不能连续多次收取上清，为了快速制备较大量的目的蛋白，我们用以MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD-opti感染转瓶培养的BHK-21/c022细胞以收获蛋白。每个转瓶待细胞长满后改换无血清培养液，每48h收获上清一次并换液，反复6次收取培养上清。将上清收集后，经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD-opti融合蛋白(见实施例10)。

我们通过改构前后的sTNFRII-gAD-opti融合蛋白和sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα，减少TNFα对L929细胞的杀伤作用来体外比较两种蛋白的生物学活性。TNFα对细胞有直接的杀伤作用，加入我们的制备的目的蛋白后，TNFα能被拮抗掉，不能对L929细胞起到杀伤作用。细胞通过四唑盐(MTT)比色法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色的结晶物，溶液颜色的深浅与所含甲瓒量成正比，再用酶标仪测定OD值，以此测得成活的细胞数。通过比较，改构后蛋白sTNFRII-gAD-opti的生物学活性是改构前蛋白sTNFRII-gAD的3-4倍(见实施例11)。

为了证明我们所得到的蛋白是三聚体，我们将纯化好的蛋白sTNFRII-gAD-opti做分析超速离心(Analytical Ultra-centrifuge)(见实施例12)。离心作为一种手段，具有许多优点。例如，超速离心是在低温下操作，保护了生物大分子的活性。制备型的离心机负载量大，一次可分离提纯几克样品，比层析、电泳上的样品量大得多。分析离心机不仅可测物质的分子量，最重要的特性是它可以检验物质的纯度、构象、沉降系数等。因此离心技术在生物学研究中占有重要的地位，是分离、纯化细胞、病毒、蛋白、核酸和酶的最方便最有效的工具。

本案利用分析离心的这一特点，最终得到提供蛋白质的分子量是159kD，大约是单体蛋白52kD的三倍，该结果可以证明，本案所构建的融合蛋白的基因的表达产物确实可以在体内借助脂联素球部的作用形成三聚体。

此外，为了比较我们设计的三聚体化的融合蛋白sTNFRII-gAD-opti和现在已经上市的二聚体化的sTNFRII-Fc融合蛋白(商品名Etanercept)与TNFα的亲和力的差异，我们还利用仪器BIACORE3000对我们制备的蛋白sTNFRII-gAD-opti进行生物大分子之间的相互作用分析。结果分析显示结合相同摩尔质量的TNFα，sTNFR-Fc的用量约为sTNFRII-gAD-opti的2.4倍(见实施例13)。即用较少的sTNFRII-gAD-opti蛋白，就可以起到与sTNFR-Fc相同的效果。由此我们推测，蛋白sTNFRII-gAD-opti可用于治疗类风湿性关节炎，并且可以使用较少的剂量，从而获得更好的治疗效果。

附图说明

 图1：可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合基因(sTNFRII-gAd-new)改构示意图。图中，Ⅰ是改构前的示意图，Ⅱ是改构后的示意图。A是信号肽，B是sTNFRII基因，C是Hind III酶切位点，D是胶原序列，E是gAD基因。

 图2：pDC316-sTNFRII-gAD-new质粒的酶切鉴定。1是pDC316-sTNFRII-gAD-new质粒；2是用Xba I和Hind III双酶切pDC316-sTNFRII-gAD得到的大小为3777bp和1327bp的基因片段；3是用Sal I和EcoR I双酶切pDC316-sTNFRII-gAD-new质粒得到3883bp和1221bp的基因片段；4是DNA marker。

 图3：共转染pDC316-sTNFRII-gAD-new和pBHGlox(delta)E1，3Cre后产生重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD-new。

 图4：不同MOI的rAd5-EGFP对BHK21 c022细胞的转导效率。A是荧光显微镜下观察的结果，B是电子显微镜下观察的结果1到5的MOI分别为0，1，10，100，1000。

 图5：BHK21c022单克隆细胞。

 图6：重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD、Ad5-sTNFRII-gAD-new和Ad5-sTNFRII-gAD-opti感染BHK-21/c022细胞后，细胞培养上清中蛋白western blotting检测。1是Ad5-sTNFRII-gAD感染细胞得到的蛋白；2是Ad5-sTNFRII-gAD-new感染细胞得到的蛋白；3是蛋白Marker；4是Ad5-sTNFRII-gAD-opti感染细胞得到的蛋白。A所指就是目的蛋白sTNFRII-gAD。

 图7：融合蛋白sTNFRII-gAD的热稳定性检测(sTNFRII抗体检测)。A所指是三聚体目的蛋白，B是单体目的蛋白，C是降解的条带。

 图8：sTNFRII-gAD-opti融合蛋白的分子筛层析。峰1是蛋白sTNFRII-gAD-opti多聚体峰；峰2是蛋白sTNFRII-gAD-opti的三聚体峰。

 图9：融合蛋白超速分析离心结果。

 图10：融合蛋白亲合力测定结果。

 图11：改构前后蛋白的生物学活性比较。横轴是倍比稀释的蛋白浓度，A是100ng/mL，B是50ng/mL，C是25ng/mL，D是12.5ng/mL，E是6.25ng/mL，F是3.85ng/mL，G是1.925ng/mL，H是0.9625ng/mL。纵轴是酶标仪在570nm处的吸光度(OD)。

 图12：pDC316质粒图。

 图13：pDC316-sTNFRII-gAD质粒图。

以下实施例对本发明的腺病毒载体介导的重组蛋白快速表达和制备过程作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。

 实施例1 sTNFRII-gAD-new融合基因的制备

将中国专利(专利号ZL200510100468.9)中描述的可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合基因的结构进行改造：去掉了可溶性肿瘤坏死因子受体和脂联素之间的酶切位点以及脂联素除球部之外的胶原序列AAGCTTCTTCCACAAGGT，使整个融合基因表达的蛋白质的结构更加紧凑，有利于三聚体的形成(见图1)。利用重叠PCR的方法，设计以下引物将原序列中的酶切位点和胶原序列突变掉。设计引物为：

P1：5’aatgtcgacgccaccatggcgcccgtcgccgtc3’

P2：5’gcggtatacataggcgtcgccagtgctccc3’

P3：5’cggggatccttagttggtgtcatggta3’

P4：5’gggagcactggcgacgcctatgtataccgc3’

P1和P2为扩增sTNFRII的引物，P3和P4为扩增gAD的引物，两个反应体系在如下的循环条件下反应25个循环：变性95℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃1min，延伸72℃10min。将两个反应体系的PCR产物胶回收，利用天根胶回收试剂盒，按照说明书胶回收目的片段。

胶回收后的sTNFRII和gAD片段再通过PCR反应将两段连接在一起。使用的反应引物为P1和P3。在下述的反应条件下循环反应25个循环：变性95℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃1min15s，延伸72℃10min。得到的PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶进行鉴定，在1200bp左右有一条很亮的条带，与预期的1185bp的目的产物的大小相似。利用天根的胶回收试剂盒把目的片段回收。共得到sTNFRII-gAD-new的DNA约3微克。

 实施例2 sTNFRII-gAD-opti融合基因的制备

sTNFRII-gAD-opti融合基因是根据我们提供的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，请德国GeneArt公司依据哺乳动物细胞(CHO细胞)偏爱的密码子优化合成基因片段，并克隆到载体上获得pMA-sTNFRII-gAD-opti。

 实施例3 穿梭质粒pDC316-sTNFRII-gAD，pDC316-sTNFRII-gAD-new和pDC316-sTNFRII-gAD-opti的构建，酶切鉴定和质粒的提取。

用BamH I、Sal I双酶切融合基因sTNFRII-gAD和sTNFRII-gAD-new，这两个基因都是第一个实施例中回收的DNA。再用Bgl II和Sal I双酶切载体pDC316(见图12)。BamH I和Bgl II是同尾酶，有相同的粘性末端，可以通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来。用T4连接酶将上述目的基因片段和pDC316片段连接，得到重组穿梭质粒pDC316-sTNFRII-gAD和pDC316-sTNFRII-gAD-new(见图13)。并转化进大肠杆菌DH5α，提取质粒。

用Bgl II和EcoRⅠ双酶切质粒pMA-sTNFRII-gAD-opti和载体pDC316，用T4连接酶将上述目的基因片段和pDC316片段连接，得到重组穿梭质粒pDC316-sTNFRII-gAD-opti。然后转化进大肠杆菌DH5α，提取质粒。质粒分别用Xba I，Hind III和Sal I，EcoR I酶切鉴定。(见图2)

感受态的制备：

(1)从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个DH5α单菌落(直径2～3mm)接种于5mL的LB培养液中，培养16～18小时。将培养好的菌液按1∶100的比例接种于200mL的LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.3～0.4。

(2)菌液放入50mL无菌离心管中，冰浴10min后，4000rpm，4℃，离心10min。

(3)弃上清，倒置沥干。以10mL用冰浴冷的0.1M CaCl₂重悬离心管中沉淀。

(4)4000rpm，4℃，离心10min，弃上清，沥干。

(5)每50mL初始培养物加入2mL用冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

(6)取200μL分装到1.5mL EP管中。保存于4℃备用，或于-70℃长期保存。

质粒转化：

(1)取感受态细胞50μL，加入连接液5μL，混匀，冰浴30min。

(2)42℃热击90s，不要摇动试管。

(3)快速将管转移至冰水中，使细胞冷却2min。

(4)加入LB 150μL，放置于摇床中，200转/分，45min。

(5)将上述菌液200μL均匀涂布在预制干燥的含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃，过夜。

质粒提取：

从氨苄抗性的LB固体平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄抗性的LB液体中，37℃培养过夜。按质粒抽提试剂盒说明书提取质粒。1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提的浓度和纯度。

实施例4 重组腺病毒的制备

将腺病毒基因组质粒pBHGlox(delta)E1，3Cre分别和pDC316-sTNFRII-gAD，pDC316-sTNFRII-gAD-new，pDC316-sTNFRII-gAD-opti共转染HEK293细胞，用磷酸钙共沉淀法进行转染。在6孔细胞培养板中接种HEK293细胞，5×10⁵个细胞/孔，培养过夜；转染前4～6h换新鲜培养基(含10％FBS的DMEM培养基)；取4μg的DNA与水混合成总体积为67.5μL的液体加入到EP管中。然后加入2.5M CaCl2 7.5μL，混匀后在4℃孵育20min；向EP管中贴壁加入2×HBS(4℃保存)75μL，轻柔地混匀后室温静置5min。最后将150μL液体加入准备好的6孔细胞培养板中，轻轻混匀。镜下观察可以看到十分细小而均匀的颗粒；37℃5％CO₂培养箱中进行培养。9d后见到病毒噬斑，分别收集病变细胞和上清作为Ad5-sTNFRII-gAD，Ad5-sTNFRII-gAD-new，Ad5-sTNFRII-gAD-opti的毒种。(见图3)

实施例5 重组腺病毒的扩增与纯化

将获得的Ad5-sTNFRII-gAD毒种，Ad5-sTNFRII-gAD-new毒种和Ad5-sTNFRII-gAD-opti的毒种在HEK293细胞上进行扩增和纯化，得到滴度为1×10¹²vg/mL的纯化病毒。用TCID50方法测定腺病毒的感染性滴度。

实施例6 Ad5-EGFP对BHK-21/c022细胞的感染

在24孔细胞培养板中接种BHK-21/c022细胞(含10％FBS的DMEM培养基)，1×10⁵个细胞/孔，同时按梯度加入重组腺病毒Ad5-EGFP(MOI分别为0、1、10、100、1000)，共5个孔。12h后换成无血清培养基，继续培养48h后，荧光显微镜下观察，在相同的曝光时间(1/3s)观察各孔中细胞的荧光强弱以及细胞的形态变化。随着MOI的增大，荧光细胞数量和亮度逐渐增强，表明腺病毒载体能够有效转染BHK-21/c022细胞，并且表达量与病毒用量呈正相关。但在MOI达到1000时，出现细胞变长、少数细胞死亡的现象。(见图4)

实施例7 BHK-21/c022细胞单克隆的挑取

将贴壁的BHK21细胞消化后，用4倍比稀释法将细胞稀释，加入到6孔板中，使每个孔的细胞数5-10个。待细胞贴壁后继续生长3-4天，就会在电镜下看到成簇的细胞团，那是由单个细胞增殖生长而来。然后将培养的上清吸出，铺入琼脂(5％琼脂∶培养基约为1∶8)使细胞固定于孔板底部。之后在显微镜下用枪头吸取一个成簇的细胞团，加入到96孔板中培养，这一个96孔中扩增出的细胞就可以看做是由一个细胞分裂而来，他们的各种特征都是相同的稳定的。我们共挑取了90个单克隆细胞(c001-c090)，观察他们的生长形态和生长速度，最终选择了c022作为腺病毒感染的细胞。(见图5)

实施例8 重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD，Ad5-sTNFRII-gAD-new，Ad5-sTNFRII-gAD-opti感染BHK-21/c022细胞和蛋白和western blotting检测

用MOI为1000的重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD感染BHK-21/c022细胞，12h后换成无血清培养基。48h后收取细胞无血清培养上清。将上清和无水乙醇按1∶3的比例混合到一起，-70℃放置半个小时。13000r/min离心5min。倒掉上清，用少量(一般为收取上清体积的十分之一)PBS溶液溶解沉淀，用于western blotting实验。重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD-new和Ad5-sTNFRII-gAD-opti用相同的方法操作，收集上清，浓缩的蛋白后用于western blotting检测。(见图6)

取浓缩10倍的上清10μL加入10μL 2×loading buffer，一共20μL。100℃沸水煮5min，20μL样品上样，12％分离胶进行SDS-PAGE分离，然后用湿胶转移仪将蛋白转移至NC膜。取出NC膜，用封闭液(5％脱脂牛奶，PBS配制)37℃封闭NC膜1h。弃去封闭液，加入1∶500(用封闭液稀释)的鼠抗人TNFRII的单抗，37℃孵育1h。PBS洗涤NC膜3次后，加入1∶1000(用封闭液稀释)的马抗小鼠IgG/磷酸酶标记抗体37℃孵育1h。PBS洗涤NC膜3次后，加入BCIP/NBT，避光显色。约15～30min后弃去显色液，用超纯水洗涤NC膜中止反应。结果显示，经过哺乳动物细胞密码子优化后的基因表达效率高于未优化的。

实施例9三种蛋白的稳定性比较

将三种腺病毒表达的蛋白置于37度水浴中72小时，然后做western blotting检测各种蛋白的存在状态。结果显示未经过改构的蛋白，有一条降解的条带，是sTNFRII和gAD在连接处断裂的条带，经sTNFRII抗体检测出，而经过改构的蛋白没有降解的条带，大大提高了目的蛋白的稳定性，为下一步的纯化提供了基础。(见图7)

实施例10 sTNFRII-gAD-opti蛋白大量生产和蛋白的浓缩、纯化

用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD-opti感染5个转瓶培养的BHK-21/c022细胞来大量制备sTNFRII-gAD-opti融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100mL，每48h收获上清一次并换液，反复6次收取培养上清。共得到约3L含有融合蛋白的细胞培养上清。向上清中缓慢均匀的加入硫酸铵粉末(w/v＝40％)。用磁力搅拌器在4℃冷库中搅拌24h，13000g，1h离心后弃去上清。用少量的PBS溶解沉淀(3～5mL)。然后将溶液进行透析，除去多余的硫酸铵，得到重组融合蛋白的粗纯品。依据Hiload 16/60Superdex 200prep grade的说明书对得到的粗纯品进行凝胶过滤层析。将层析后各个收集峰进行免疫印迹分析，收集含有目标融合蛋白的峰合并获到融合蛋白纯品。(见图8)

实施例11 改构前后融合蛋白的活性比较

96孔细胞培养板中铺入L929细胞，1.5～1.8×10⁴个细胞/孔，37℃5％CO₂培养箱中培养过夜。第二天，分别将sTNFRII-gAD融合蛋白和sTNFRII-gAD-opti融合蛋白纯品，用含放线菌素D 20μg/mL，TNFα20U/mL的DMEM培养液进行2倍比梯度稀释，各稀释8个梯度；弃去96孔板中L929细胞的上清，加入前面已倍比稀释好的两种蛋白样品，每孔100μL，每个梯度做3个复孔；同时加入放线菌素D 20μg/mL与TNFα20U/mL的DMEM培养液(两者结合杀伤性最大)作为阴性对照。继续培养24h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，再培养4h后，将96孔中的120μL液体吸出，换入100μL DMSO终止培养。检测各孔的OD₅₇₀值。(见图11)

实施例12 融合蛋白的分析超速离心

我们将纯化好的蛋白sTNFRII-gAD-opti拿到中国科学院生物物理所做分析超速离心。将过分子筛纯化后得到的蛋白超速分析离心，58000转/分钟，离心三个小时，结果测得三聚体蛋白的分子量大小是159.7kD。(见图9)

实施例13 融合蛋白亲和力BIACORE实验

我们还在中科院生物物理所利用BIACORE3000做生物大分子之间的相互作用分析，将过分子筛纯化后得到的sTNFRII-gAD-opti蛋白与sTNFRII-Fc相比较同肿瘤坏死因子的亲和力。

具体步骤如下：

(1)将芯片CM5用PBST(PBS+0.005％TWEEN)冲洗两遍，100μL/min，5min。

(2)NHS、EDC各取60μL混匀，10μL/min，共注射70μL。

(3)用PH＝4.0的10Mm NaAc稀释TNFα，得到50μg/mL的TNFα，10μL/min，共注射35μL。

(4)封闭液ETH(乙醇胺)10μL/min，共注射70μL。

至此，蛋白TNFα偶联到芯片上，准备工作完成。

(5)开始上样，首先注射融合蛋白，30μL/min，1min。

(6)然后洗脱，20mM的NaOH 30μL/min，共注射12μL。

(7)最后平衡，PBST 30μL/min，共注射20μL。

(8)继续注射下一个样品，步骤同(5)。

从结果中可以看到TNFR-Fc和TNFα结合的上升阶段比较平缓，证明结合能力相对强，但是下降的迅速，说明解离快。而sTNFRII-gAD-opti和TNFα结合上升的比较缓慢，结合能力相对较弱，但下降比较平缓，解离过程比较慢。(见图10)

经软件分析，可以得出sTNFRII-gAD-opti与TNFα的亲和力约为5.63nm，而TNFR-Fc与TNFα的亲和力约为13.4nm。即结合相同摩尔质量的TNFα，TNFR-Fc的用量约为sTNFRII-gAD-opti的2.4倍。

序列表

<110>温州医学院

<110>北京五加和分子医学研究所有限公司

<120>肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白改构体快速筛选方法及应用

<160>3

<210>1

<211>1185

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>改构的可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部(sTNFRII-gAD-new)融合基因SEQ IDNO.1

<400>1

atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg    60

cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc    120

cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc    180

caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac    240

agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt    300

agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc    360

aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg    420

cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg    480

tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg    540

ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc    600

acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg    660

tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc    720

ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cgcctatgta    780

taccgctcag cattcagtgt gggattggag acttacgtta ctatccccaa catgcccatt    840

cgctttacca agatcttcta caatcagcaa aaccactatg atggctccac tggtaaattc    900

cactgcaaca ttcctgggct gtactacttt gcctaccaca tcacagtcta tatgaaggat    960

gtgaaggtca gcctcttcaa gaaggacaag gctatgctct tcacctatga tcagtaccag    1020

gaaaataatg tggaccaggc ctccggctct gtgctcctgc atctggaggt gggcgaccaa    1080

gtctggctcc aggtgtatgg ggaaggagag cgtaatggac tctatgctga taatgacaat    1140

gactccacct tcacaggctt tcttctctac catgacacca actaa                    1185

<210>2

<211>394

<212>PROTEIN

<213>人工序列

<220>

<223>改构的可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部(sTNFRII-gAD-new)的氨基酸序列SEQ ID NO.2

<400>2

MAPVAVWAAL AVGLELWAAA HALPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG    60

QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQLWNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC    120

RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTETSDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR    180

PHQICNVVAI PGNASMDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STRSQHTQPT PEPSTAPSTS    240

FLLPMGPSPP AEGSTGDAYV YRSAFSVGLE TYVTIPNMPI RFTKIFYNQQ NHYDGSTGKF    300

HCNIPGLYYF AYHITVYMKD VKVSLFKKDK AMLFTYDQYQ ENNVDQASGS VLLHLEVGDQ    360

VWLQVYGEGE RNGLYADNDN DSTFTGFLLY HDTN                                394

<210>3

<211>1215

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>改构后的蛋白在哺乳动物细胞中表达的偏爱密码子sTNFRII-gAD-opti融合基因SEQID NO.3

<400>3

gagctcgaat tcgccaccat ggcccccgtg gccgtgtggg ccgctctggc tgtgggactg    60

gaactgtggg ctgccgctca cgctctgcct gctcaggtgg ccttcacccc ctacgcccct    120

gagcctggct ctacctgccg gctgagagag tactacgacc agaccgccca gatgtgctgc    180

tccaagtgct cccctggcca gcacgccaag gtgttctgca ccaagacctc cgataccgtg    240

tgcgactcct gcgaggactc cacctacacc cagctgtgga actgggtgcc cgagtgcctg    300

tcctgcggct ccagatgctc ctccgaccag gtggaaaccc aggcctgcac cagagagcag    360

aaccggatct gcacctgtcg gcctggctgg tactgcgccc tgtccaagca ggaaggctgc    420

agactctgcg cccctctgcg gaagtgcaga cctggcttcg gcgtggccag acccgggacc    480

gagacatctg acgtcgtgtg caagccctgt gcacctggca ccttctccaa caccacctcc    540

tccaccgaca tctgccggcc tcaccagatt tgcaacgtgg tggccatccc cggcaacgcc    600

tccatggacg ccgtgtgcac ctccacatcc cccaccagat ccatggcccc tggcgccgtc    660

catctgcctc agcctgtgtc tacccggtcc cagcacaccc agcctacccc cgaaccttct    720

accgccccct ctaccagctt cctgctgccc atggggccta gtcctccagc tgagggctct    780

accggcgacg cctacgtgta cagatccgcc ttctccgtgg gcctggaaac ctacgtgacc    840

atccccaaca tgcccatccg gttcaccaag attttctaca accagcagaa ccactacgac    900

ggctccaccg gcaagttcca ctgcaacatc cctggcctgt actacttcgc ctaccacatc    960

accgtgtaca tgaaggacgt gaaggtgtcc ctgttcaaga aagacaaggc catgctgttc    1020

acctacgacc agtaccagga aaacaacgtc gaccaggcct ccggctccgt gctgctgcat    1080

ctggaagtgg gcgaccaggt ctggctgcag gtctacggcg agggcgagcg gaatggcctg    1140

tacgccgaca acgacaacga ctctaccttc accggctttc tgctgtacca cgacaccaac    1200

tgaagatctg gtacc                                                     1215

Claims (3)

1.一种经改构的肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部的融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的经改构的融合蛋白的优化基因，其特征在于，碱基序列如SEQID NO.3所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的基因，利用重组5型腺病毒作为出发载体。

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