CN102276727A - IL-17RC-hFc融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人白细胞介素受体C(IL-17RC)的融合蛋白，其包含人IL-17RC与白细胞介素17A(IL-17A)、白细胞介素17F(IL-17F)结合的关键区域和人IgG1 Fc段。本发明提供的IL-17RC-hFc融合蛋白具有结合IL-17A和IL-17F的能力，并可抑制IL-17A、IL-17F刺激的炎性细胞因子IL-6的释放和RANKL分子的表达，可以用于治疗与IL-17相关的类风湿关节炎等自身免疫性疾病，发挥抑制炎症和拮抗骨破坏作用。本发明IL-17RC-hFc融合蛋白可以作为治疗性诱饵受体使用，为类风湿关节炎等疾病提供一种新的治疗途径和思路。本发明通过体外原核表达IL-17RC-hFc融合蛋白，该方法表达量高，可控性强，生产成本相对较低，容易实现大规模生产。

Description

IL-17RC-hFc融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种白细胞介素受体的融合蛋白及其应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫病，主要损伤关节滑膜、软骨和骨，以多种细胞因子介导的滑膜炎为其主要特征。随着疾病进展，炎症加重，逐渐导致骨质破坏、关节畸形，劳动能力丧失，致残率极高。该病世界范围内发病率约为1％，给个人和社会造成了沉重负担。因此，对RA的发病机制及治疗药物的研究具有重要的社会意义。现有的治疗手段多为采用缓解病变的抗风湿药(DMARDS)。上世纪90年代生物制剂开始应用，目前已有的生物制剂对部分患者的疗效并不满意，不良反应也比较常见。本发明针对RA发病中慢性炎症反应及骨破坏这两个相关联的RA关键性病理学问题，研制IL-17RC-hFc融合蛋白，为RA的治疗开辟了一种新的思路。

近年来的研究发现，IL-17是RA发生的核心炎性因子，与RA的滑膜炎症及骨损伤有密切关系。IL-17的增加可加重关节炎症的程度，故IL-17成为RA新的治疗靶点。IL-17于1993年被发现，主要由激活的记忆性T细胞、单核细胞等产生，该家族包含A～F六个成员。IL-17A是该家族的典型分子，是二硫键相连的二聚体糖蛋白，并以同型二聚体的形式发挥作用，包含155个氨基酸，分子量35KD。该家族成员中IL-17F与IL-17A同源性最高，氨基酸序列一致性占50％以上，二者可形成同源二聚体或异源二聚体并与相应受体结合。现有的研究显示两者在炎症性疾病和自身免疫病中发挥重要作用。

IL-17作为重要的炎性因子对RA的发生发展起重要作用：①RA患者关节滑液中IL-17含量增高，IL-17可以促进关节内的滑膜成纤维细胞、巨噬细胞、软骨细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF等前炎症细胞因子，并且在体外培养的单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞中加入IL-17可以刺激多种炎性细胞因子的表达，在炎症反应过程中发挥重要作用；②IL-17还可活化软骨细胞，使其释放基质降解相关的基质金属蛋白酶(MMPs)等，IL-17刺激产生的IL-1、TNF-α可增加滑膜成纤维细胞的浸润能力，侵入损伤的软骨内，并通过介导软骨凋亡，严重破坏软骨的修复功能；③正常情况下，核刺激因子受体配体(RANKL)作为激活破骨细胞前体细胞关键的和必需的因子主要表达在骨髓基质细胞和成骨细胞上并维持骨的代谢平衡，但在炎症状况及自身免疫失调情况下，RANKL的表达增加，RANKL分子进一步可与M-CSF共同活化破骨细胞前体细胞成熟为破骨细胞，造成骨的侵蚀。IL-17可以促进骨髓基质细胞、成骨细胞以及T细胞等膜表面RANKL分子(mRANKL)的表达，特异性抗体染色显示，CD4⁺T细胞、RANKL分子、血管翳在炎症骨破坏关节有相似的分布模式，IL-17与CD4⁺T细胞上RANKL分子的表达有剂量依赖性的关系。这从骨破坏角度揭示了IL-17在RA中的重要作用；④影响RANKL表达的因素有很多，在体外培养情况下，IL-6、IL-11、甲状旁腺激素(PTH)、前列腺素E2(PGE2)、1，25二羟维生素D3[1，25(OH)2D3]以及TNF-α均可促使其表达，而这些因子中很可能存在与IL-17相互促进形成正反馈环路的因子；⑤RANKL是一种跨膜蛋白，包含有受体结合的外功能区和膜锚着区，mRANKL在金属蛋白酶解聚素肿瘤坏死因子转化酶(TACE)或某种相关的金属蛋白酶作用下裂解为游离型RANKL(sRANKL)，sRANKL可能在脱落后激活破骨前体细胞，而IL-17可以促使成纤维细胞金属蛋白酶的表达，即有可能促进sRANKL的形成而介导骨破坏。

IL-17受体家族的第一个成员IL-17RA于1995年被发现，随后用生物信息学方法先后确定了另外的四个受体相关分子，后命名为IL-17RB-E，均为一型跨膜蛋白。IL-17RA由293个氨基酸组成细胞外区域，跨膜区含有21个氨基酸，胞浆内是由525个氨基酸组成的胞内段。介导IL-17的信号转导需要IL-17RC(IL-17RL)的参与，IL-17RA与IL-17RC可能以异源二聚体形式发挥作用。IL-17RC存在很多剪接变体(splice forms)，其意义尚不明确。IL-17RC(IL-17RL)在人的前列腺、软骨、肾脏、肝脏、心脏和骨骼肌均有表达，新近有研究检测了IL-17A、IL-17F与IL-17RA以及IL-17RC的各种剪接变体的结合反应，结果证实了IL-17RA只能与IL-17A结合，与IL-17F的结合能力微弱。IL-17RC是IL-17F的受体，且可与IL-17A高亲和力结合。因为存在不同的剪接变体，某些亚型的分泌蛋白保持了配基的结合能力，但因其不具有跨膜蛋白和细胞内片段而丧失了信号转导功能。这就预示着，IL-17RC的可溶性胞外形式，因为不包含跨膜段和胞内段，但却可以结合IL-17A、IL-17F而阻断其与天然受体结合后的信号转导功能，进而阻止IL-17A、IL-17F所致的炎症和骨质破坏。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种IL-17RC-hFc融合蛋白及其应用。

本发明首先提供一种IL-17RC-hFc融合蛋白，其包含人IL-17RC与白细胞介素17A、白细胞介素17F结合的关键区域(外显子8-12区域)和人IgG1 Fc段。

在本发明的一个实施方案中，所述IL-17RC-hFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1；本领域技术人员可根据该片段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。如，在活性区段，将第9位的(丙氨酸(A))替换为(苏氨酸(T))或是在非活性区段，将第(164-178)位的氨基酸序列(铰链区)部分或全部缺失，或是在(164-178)位氨基酸前、中、后面增加(一个或多个脯氨酸)。因此，IL-17RC-hFc融合蛋白还包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的由SEQ ID No.1衍生得到的蛋白质。

本发明还提供编码上述融合蛋白的基因。在本发明实施方案中，编码该融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

可将本发明上述基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明融合蛋白的重组表达载体，进而可以将该表达载体导入宿主细胞，得到表达IL-17RC-hFc融合蛋白的基因工程菌。本发明所使用的表达载体可以选用各种已知的原核表达载体。本发明所使用的宿主细胞可以选用本领域公知的用于重组表达的菌株，如大肠杆菌BL21。

本发明还提供一种制备上述融合蛋白的方法，包括如下步骤：将编码IL-17RC-hFc融合蛋白的基因克隆到表达载体中，将所述表达载体转化宿主细胞，筛选阳性克隆，经菌体培养和诱导表达后，分离纯化得到该融合蛋白。

在本发明优选的实施方案中，通过构建重组基因，与pET-28a表达载体连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达融合蛋白，并通过凝胶过滤层析或离子交换层析等方法对融合蛋白进行纯化，采用SDS-PAGE、Western-blot等对融合蛋白进行理化性质鉴定。

本发明还提供所述的融合蛋白在制备治疗IL17A和/或IL17F引起的炎症性疾病和/或自身免疫性疾病中的应用。优选在制备治疗类风湿关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等疾病的药物中的应用。最优选的，本发明的融合蛋白可应用于制备治疗类风湿性关节炎的药物。

本发明提供的IL-17RC-hFc融合蛋白含有IL-17RC发挥结合作用的关键区段(外显子8-12区域)，可作为诱饵蛋白结合两种致炎因子发挥抑炎作用，添加IgG1 Fc片段可稳定蛋白结构，并有利于机体对结合后的复合物的处理。两者均为人体自身蛋白结构，不会作为异种蛋白产生抗原性，为该蛋白的安全性提供保障。

研究结果表明，IL-17RC-hFc融合蛋白具有结合IL-17A、IL-17F的功效，并可在细胞水平抑制炎性细胞因子IL-6的释放和膜表面RANKL分子的表达，发挥抑制炎症和减轻骨破坏作用，可进一步用于类风湿关节炎等疾病治疗的研究。

本发明的IL-17RC-hFc融合蛋白可以作为治疗性诱饵受体使用，为类风湿关节炎等疾病提供了一种新的治疗途径和思路。本发明通过体外表达IL-17RC-hFc融合蛋白，表达量高，可控性强，生产成本相对较低，容易实现大规模生产。

附图说明

图1显示本发明所选用的表达载体pET-28a(+)质粒结构示意图。

图2为IL-17RC-hFc重组基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，图2A为重组基因的IL-17RC段PCR扩增结果，泳道1：分子量Marker；泳道2-5：IL-17RC(exon8-12)序列扩增结果，目的基因全长(489bp)；图2B为重组基因的hFc段PCR扩增结果，泳道1：分子量Marker；泳道2-5：人IgG1 Fc段(hinge-CH2-CH3)目的基因全长(696bp)；图2C为上述两片段经重叠PCR构建IL-17RC-hFc重组基因PCR结果，泳道5：分子量Marker；泳道1-4：上述两片段拼接结果，目的基因全长(1185bp)。

图3为连接后表达质粒双酶切鉴定结果：连接后的表达质粒经双酶切后(Nco I、EcoR I)；泳道3：分子量Marker；泳道1：pET-28a-IL-17RC-hIgG Fc重组表达质粒；泳道2：pET-28a-IL-17RC-hIgG Fc双酶切(Nco I和EcoR I)；酶切后的小片段与目的序列大小一致。

图4为IL-17RC-hFc融合蛋白表达状况SDS-PAGE电泳图谱分析；其中，泳道1：Marker；泳道2：诱导培养的菌液；泳道3：裂菌后上清；泳道4：4M尿素洗涤后上清；泳道5：4M尿素洗涤后沉淀；泳道6：2M尿素洗涤后上清。显示重组蛋白大量表达。

图5显示的是IL-17RC-hFc融合蛋白经凝胶过滤层析纯化样本分析：泳道1：分子量Marker；泳道2-6：变性蛋白依次洗脱样本。

图6显示的是Western-blot分析IL-17RC-hFc融合蛋白，以抗人IL-17RC多克隆抗体检测显示，大量表达的蛋白为目的蛋白。

图7显示的是目的蛋白与IL-17A，IL-17F的体外结合能力检测。其中，图7A是IL-17RC-hFc与IL-17A结合能力ELISA检测；图7B是IL-17RC-hFc与IL-17F结合能力ELISA检测。

图8显示的是IL-17RC-hFc融合蛋白对IL-17A/IL-17F刺激小鼠成纤维细胞NIH/3T3产生炎症因子IL-6的抑制作用，加入融合蛋白的组分泌IL-6的量明显减少，差异有统计学意义。

图9显示的是IL-17RC-hFc融合蛋白对IL-17A/IL-17F刺激小鼠成骨细胞MC/3T3-E1表达膜表面RANKL分子的抑制作用，其中图9A是MC/3T3-E1细胞的空白对照；图9B为融合蛋白对该细胞的作用；图9C，D为IL-17A，IL-17F对膜表面RANKL分子的表达刺激作用，显示细胞膜表面及胞浆内荧光强度明显增加，图9E，F为融合蛋白分别对IL-17A，IL-17F的抑制作用，显示荧光强度减弱，图9G，H为IL-17A，IL-17F的抗体对照，荧光强度同样减低。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 IL-17RC-hFc重组基因原核表达载体的构建

依据IL-17RC-hFc融合蛋白重组片段(IL-17RC P208-371，IgG1 FcP98-330)对应的基因序列和pET-28a(+)表达载体的特征设计引物(见下表)，以购自Invitrogen并经测序正确的pDONR223-IL-17RC ORF克隆质粒为模板，3和4为引物，进行IL-17RC-hFc蛋白IL-17RC段编码序列的PCR扩增(图2A)；以含人IgG1 Fc基因序列质粒pCMV6-XL4-IgG1 Fc为模板(购买自Origene公司，货号：SC117595)，5和6为引物进行人IgG1 Fc段的扩增(图2B)；然后以扩增后的两段PCR产物为模板，3和6为引物，进行重叠PCR扩增，得到编码重组蛋白IL-17RC-hFc的基因片段(图2C)，后双酶切克隆入pET-28a(+)构建得到表达载体为pET-28a(+)-IL-17RC-hFc。相应的重组基因序列如SEQ ID No.2所示。

PCR反应条件：94℃预变性5min，按下述参数循环35次：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，最后72℃延伸5min。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳观察其大小，通过重组表达质粒的PCR鉴定和双酶切鉴定(图3)，PCR扩增出预期大小的目的条带，且双酶切鉴定重组质粒含有的目的基因片段为预期大小，说明本发明成功构建了IL-17RC-hFc融合蛋白的原核表达载体。

表1相关引物

实施例2 IL-17RC-hFc融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将测序正确的重组克隆质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单菌落接种于10mL LB培养基(含50mg/L的卡那霉素)，37℃，250rpm振荡过夜培养。次日按1∶100的比例将过夜培养物转接于1000ml的2×YT培养基(含50mg/L的卡那霉素)中，培养至OD600约0.6时，加入IPTG使之终浓度为0.1mM，于30℃，250rpm继续振荡诱导培养5h后，3000rpm离心15min，收集菌体。对菌体裂解后的沉淀(包涵体)进行SDS-PAGE及Western-blot分析，表明经0.1mM IPTG诱导后可得到大量的融合蛋白，见图4中泳道5，图6。

实施例3 IL-17RC-hFc融合蛋白的制备

1.IL-17RC-hFc包涵体的洗涤

诱导后的菌液沉淀每升用40ml TE缓冲液[10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1mmol/L EDTA]重悬菌体，在冰浴上超声裂解菌体15min，4℃、15000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。将沉淀(即包涵体)依次用PBS、1％Triton X-100各20ml洗涤一次，用25ml PBS重悬沉淀，逐滴加入25ml 8M尿素使尿素的终浓度为4M，并持续搅拌30min，15000rpm离心30min收集沉淀。将沉淀用PBS洗涤两遍后，加入4ml裂解缓冲液[PBS(pH6.8)、10mmol/L DTT、1mmol/L EDTA、2％SDS]，于4℃冰箱内在磁力搅拌下过夜，以溶解经洗涤后的包涵体。4℃，12000rpm离心45min，取上清。上清再经0.45μm的微孔滤膜过滤，即为含目的蛋白变性液，见图4。

2.IL-17RC-hFc包涵体的纯化

以Buffer A[PBS(pH6.8)、1mmol/L DTT、1mmol/L EDTA、0.2％SDS]平衡Superdex 75柱，取过夜裂解的包涵体溶解液，17000rpm离心30min，取上清，经0.45μm滤膜过滤后，上样2ml，流速为1.5ml/min，起峰时开始收集，流速调整为1.0ml/min，每管收集1.2ml；随后用SDS-PAGE分析各组分的纯度，如图5。

3.IL-17RC-hFc包涵体蛋白的复性

将收集的各组分经SDS-PAGE分析后合并较纯的组分。按尿素浓度逐步递减(4mol/L～3mol/L～2.25mol/L～1.7mol/L～1.3mol/L～0.9mol/L～0.7mol/L～0.5mol/L～0.4mol/L～0mol/L)的方法配好复性液。透析袋DM-16(MD-25)12-14KD经处理后，将浓缩的蛋白变性液置于透析袋内，透析袋置于20倍体积的复性液中，4℃缓慢搅拌透析，约4h更换一次尿素浓度逐渐降低的透析液。根据透析过程中蛋白是否析出以及析出量的多少确定最佳透析条件，对蛋白变性液进行稀释复性。复性后的蛋白最后溶解于pH7.2的磷酸盐缓冲液中，过滤除菌后分装冻存。

实施例4重组蛋白与目标蛋白的体外结合实验

(1)以不同浓度梯度的IL-17RC-hFc包被96孔板，首孔100μg，依次倍比稀释至第12孔，100μl/孔，室温孵育过夜。

(2)ELISA洗涤液洗板3次。

(3)加入封闭液(PBS-1％BSA)300μl/孔，37℃孵育2小时。

(4)洗板3次。

(5)加入IL-17A、IL-17F至96孔板，100μl(5ng/ml)/孔。

(6)室温下，500rpm震荡孵育2小时。

(7)洗板3次。

(8)加入binding buffer稀释的生物素标记的羊抗人IL-17A、IL-17F抗体，100μl/孔，室温孵育2小时。

(9)洗板3次。

(10)加入1∶200稀释的链霉亲和素-HRP，100μl/孔，室温孵育30min.

(11)洗板3次。

(12)加入1∶1混合的显色底物A液和B液，100μl/孔，室温孵育20～30min.

(13)加入反应终止液50μl/孔。

(14)读取OD₄₅₀值。

结果显示IL-17RC-hFc具备与IL-17A、IL-17F结合的能力，数据如图7所示。IL-17RC-hFc与IL-17A结合能力ELISA检测结果表明，随着包被剂量的增加，孔内结合IL-17A的量不断上升，与对照组(未加入IL-17A，排除重组蛋白与抗体的非特异性结合)有明显差异(图7A)。IL-17RC-hFc与IL-17F结合能力ELISA检测结果与IL-17A的相似，显示重组蛋白与两种致病的细胞因子均有结合效应(图7B)。

实施例5重组蛋白对IL-17A，F的抑制作用实验

培养小鼠成纤维细胞NIH/3T3和成骨细胞MC/3T3-E1细胞(购自北京协和细胞资源中心)。

NIH/3T3：用含10％胎牛血清、1％氨苄青霉素、1％硫酸链霉素的DMEM-H培养基调整细胞密度为4×10⁵后加入12孔培养板，3ml/孔，于37℃、5％CO₂条件下培养1天，弃去原培养基，更换新鲜的含2.5％血清的培养基，培养基中添加刺激因子IL-17A(或IL-17F)10ng/ml与受体重组蛋白IL-17RC-hFc(150ng/ml，5倍摩尔浓度)，同时设立IL-17A抗体或IL-17F抗体对照(2倍摩尔浓度)，24h后收取细胞上清用ELISA检测IL-6含量。

细胞处理组如下：

结果如图8所示，小鼠成纤维细胞NIH/3T3在IL-17A、IL-17F刺激下，IL-6的分泌量增加，而同时加入IL-17RC-hFc可抑制IL-17A和IL-17F刺激IL-6生成的作用，差异有统计学意义，其作用类似于抗IL-17A抗体和抗IL-17F抗体的作用。

MC/3T3-E1：用含2.5％胎牛血清、1％氨苄青霉素、1％硫酸链霉素的α-MEM培养基(培养基中添加刺激因子IL-17A、IL-17F(10ng/ml)与受体重组蛋白IL-17RC-hFc(150ng/ml，5倍摩尔浓度)，同时设立IL-17A、IL-17F抗体对照(2倍摩尔浓度)调整细胞密度为2×10⁴后加入8孔激光共聚焦专用培养板，200μl/孔，于37℃、5％CO₂条件下培养1天，弃去原培养基，PBS洗涤2次，加入4％多聚甲醛固定后，按照常规方法对贴壁细胞的RANKL分子进行荧光标记，而后在激光共聚焦显微镜下照相并分析荧光强度。

结果如图9所示，其中图9A是MC/3T3-E1细胞的正常状态；图9B为融合蛋白对该细胞的作用；图9C，D为IL-17A，IL-17F对膜表面RANKL分子的表达刺激作用，显示细胞膜表面及胞浆内荧光强度明显增加，图9E，F为融合蛋白分别对IL-17A，IL-17F的抑制作用，显示荧光强度减弱，图9G，H为IL-17A，IL-17F的抗体对照，荧光强度同样减低。这些结果表明IL-17RC-hFc融合蛋白能抑制IL-17A/IL-17F刺激的小鼠成骨细胞MC/3T3-E1 RANKL分子的表达。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.IL-17RC-hFc融合蛋白，其包含人IL-17RC中与白细胞介素17A、白细胞介素17F结合的关键区域和人IgG1 Fc段。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为：

1)由SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的蛋白；或，

2)SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸衍生的并具有与1)所述蛋白具有同等功能的蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。

6.含有权利要求5所述表达载体的宿主细胞。

7.一种制备权利要求1或2所述融合蛋白的方法，其包括如下步骤：将权利要求3或4所述的基因克隆到表达载体，将所述表达载体转化宿主细胞，筛选阳性克隆，经菌体培养和诱导表达后，分离纯化得到该融合蛋白。

8.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备治疗IL17A和/或IL17F引起的炎症性疾病和/或自身免疫性疾病中的应用。

9.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

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